本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

癌癥的治療一直備受關(guān)注。光熱療法和光動(dòng)力學(xué)療法是近幾十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的非手術(shù)治療各種惡性腫瘤的有效方法，具有微創(chuàng)、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。光熱療法和光動(dòng)力學(xué)療法組成的聯(lián)合治療方法在更大程度上克服了彼此的局限性，同時(shí)大大地提高了對(duì)腫瘤的殺傷作用，降低了副反應(yīng)的發(fā)生。

光聲成像(Photoacoustic Imaging,PAI)是將光學(xué)成像和超聲成像的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)的一種非侵入式成像技術(shù)。脈沖激光照射到生物組織部位，組織的光吸收域?qū)a(chǎn)生相應(yīng)的光聲信號(hào)，通過(guò)此信號(hào)可以重建出組織中的光吸收分布圖像。光聲成像可以測(cè)量與跟蹤癌癥模型中的腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)和轉(zhuǎn)移情況，對(duì)于腫瘤的研究有極大的幫助。

熒光成像(Fluorescence imaging)基于熒光物質(zhì)被特定的外界能量所激發(fā)(如近紅外線等)，引起其電子軌道像高能軌道躍遷，再釋放能量回歸最終的基態(tài)的過(guò)程中產(chǎn)生可被檢測(cè)的熒光信號(hào)?；铙w生物熒光成像技術(shù)能夠直接快速的測(cè)量各種癌癥模型中的腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)藥物的反應(yīng)，可使腫瘤病灶被無(wú)創(chuàng)傷、高靈敏度的檢測(cè)出。

近些年來(lái)，由于納米材料良好的物理化學(xué)性質(zhì)特征，其作為藥物遞送系統(tǒng)用于癌癥治療的研究被賦予極大的關(guān)注。然而，很多納米材料在生物相容性、載藥量、細(xì)胞攝取率等方面存在局限性。而介孔硅納米棒(Mesoporous silica nanorods,MSNRs)憑借其較大的表面積，可調(diào)節(jié)的孔徑，良好的生物相容性，更高的載藥量，良好的細(xì)胞攝取率以及易于修飾等特征在潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中得到廣泛的研究。而較大粒徑的介孔二氧化硅納米棒通常會(huì)有聚集的不穩(wěn)定現(xiàn)象，并且存在像大部分載體一樣的藥物提前泄漏問(wèn)題。因此采用適當(dāng)?shù)暮?jiǎn)潔制備方法克服以上問(wèn)題，開(kāi)發(fā)出一種適用度更好的介孔硅納米載體對(duì)腫瘤的治療及納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。

金納米棒(AuNRs)具有較高的光熱能量轉(zhuǎn)換率，易于調(diào)節(jié)的長(zhǎng)徑比以及較寬的光譜吸收范圍，常被用作腫瘤的光熱治療。當(dāng)吸收連續(xù)發(fā)射的近紅外低能輻射后，金納米棒內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生電子躍遷，當(dāng)恢復(fù)至穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的熱，以此可以對(duì)腫瘤組織起到有效的殺傷作用。但是，金納米棒的單獨(dú)使用會(huì)造成長(zhǎng)徑比的改變，從而降低治療效果。同時(shí)，大多數(shù)與光敏劑的聯(lián)合使用需要多波長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換，使治療過(guò)程繁瑣。

二氫卟吩e6作為第二代光敏劑，不僅具有卟啉環(huán)所特有的光物理性質(zhì)，而且在光療窗口中的最大吸收波長(zhǎng)移至660nm處，此時(shí)對(duì)細(xì)胞的穿透力較強(qiáng)，摩爾吸收系數(shù)也有了明顯的提高。相比較一代光敏劑而言，作用深度增加，產(chǎn)生的單線態(tài)氧較多，提高了腫瘤殺傷效能同時(shí)降低了毒副反應(yīng)。但是由于其存在長(zhǎng)時(shí)間的皮膚光敏效應(yīng)并且不能靶向到腫瘤部位，這在治療過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定的毒副作用。目前尚未有金納米棒包覆參雜Ce6的介孔硅納米棒的組成用于光療與成像的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物的制備方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物，用AuNRs-Ce6-MSNRs所示，所述AuNRs為金納米棒的縮寫，所述Ce6為二氫卟吩e6的縮寫，所述MSNRs為介孔二氧化硅納米棒的縮寫。

用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)Ce6-APTES的制備：按比例，將2.0-3.0mg的Ce6溶于1mL的DMSO中，加入5.0-7.0mg的EDC·HCL，在常溫下攪拌20-30min，加入4.0-5.0mg的HOBT，在常溫下反應(yīng)30-50min，加入10-15μL APTES反應(yīng)10-14h；Ce6是二氫卟吩e6的縮寫；DMSO是二甲基亞砜的縮寫；EDC·HCL是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽的縮寫；HOBT是1-羥基苯并三唑的縮寫；APTES是3-氨丙基三乙氧基硅烷的縮寫；

(2)Ce6-MSNRs的制備：取10mL用氨水調(diào)節(jié)pH值在10-11間的水，在50-55℃攪拌條件下加入12.0-13.0mg CTAB，逐滴加入100-150μL步驟(1)獲得的溶液，再逐滴加入12-18μL的TEOS，攪拌20-30min，加入15-20μL的Si-PEG，40-60℃攪拌條件下回流22-26h，12000-14000rpm離心5-10min，沉淀用無(wú)水乙醇洗3-4遍，加入30-40mL無(wú)水乙醇，在60-65℃攪拌條件下回流36-48h，除去模版劑CTAB，固液分離，固體用無(wú)水乙醇洗3-4次，每次12000-14000rpm離心5-10min，最后分散在10mL水中；MSNRs是介孔二氧化硅納米棒的縮寫；CTAB是十六烷基三甲基溴化銨的縮寫；TEOS是正硅酸乙酯的縮寫；Si-PEG是2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的縮寫；

(3)AuNRs-Ce6-MSNRs的制備：取1mL步驟(2)獲得的Ce6-MSNRs分散液，加入1-2mL220μg/mL的AuNRs水分散液，常溫下攪拌反應(yīng)5-7h，離心除去未吸附的AuNRs，沉淀分散在水中；AuNRs是金納米棒的縮寫；

上述用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明所使用的光敏劑Ce6，Ce6的量一方面影響著介孔二氧化硅的形狀，一方面發(fā)揮其光動(dòng)力學(xué)治療的作用，同時(shí)還作為熒光劑起到熒光示蹤的作用；

(2)本發(fā)明所制備的Ce6-MSNRs，供價(jià)連接方式解決了藥物未達(dá)到靶部位提前泄漏的問(wèn)題，適宜長(zhǎng)度的棒狀介孔二氧化硅納米粒子更有助于在腫瘤部位的聚集及細(xì)胞的攝??；

(3)本發(fā)明中所用的AuNRs，長(zhǎng)度適宜，與MSNRs相匹配，同時(shí)吸收波長(zhǎng)與Ce6相近，因此可以采用同一近紅外激發(fā)光(660nm)觸發(fā)光熱與光動(dòng)力學(xué)效果，使治療更加簡(jiǎn)便可行，其作為光聲造影劑，還可起到光聲成像作用；

(4)本發(fā)明的AuNRs-Ce6-MSNRs可采用單光源激發(fā)，實(shí)現(xiàn)光熱治療與光動(dòng)力學(xué)治療，光聲成像與熒光成像一體化，生物相容性良好，大大提高了腫瘤治療的療效，降低了毒副反應(yīng)，制備與應(yīng)用過(guò)程簡(jiǎn)單易行。

本發(fā)明運(yùn)用聚乙二醇修飾的介孔二氧化硅納米棒作為藥物載體，具有光聲成像和光熱治療作用的金納米棒與具有熒光成像和光動(dòng)力學(xué)治療作用的二氫卟吩e6有效地結(jié)合，實(shí)現(xiàn)治療與追蹤診斷一體化。制備方法簡(jiǎn)單可行，可日后可大量制備。

附圖說(shuō)明

圖1(a)為實(shí)施例2制備的Ce6-MSNRs透射電鏡圖；圖1(b)為實(shí)施例2制備的AuNRs-Ce6-MSNRs透射電鏡圖；

圖2為實(shí)施例2制備的Ce6-MSNRs的粒徑分布圖；

圖3為實(shí)施例2制備的Ce6-MSNRs，AuNRs-Ce6-MSNRs及AuNRs的紫外可見(jiàn)光譜圖；

圖4為實(shí)施例2制備的Ce6-MSNRs出去模版前與除去模版后的紅外光譜圖；

圖5為實(shí)施例2制備的AuNRs-Ce6-MSNRs的光熱升溫趨勢(shì)圖；

圖6為實(shí)施例2制備的AuNRs-Ce6-MSNRs產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力，紫外測(cè)定下DPBF濃度變化趨勢(shì)圖；

圖7為MTT法檢測(cè)實(shí)施例2制備的AuNRs-Ce6-MSNRs與其他對(duì)照組Ce6，Ce6-MSNRs的細(xì)胞相對(duì)存活率；

圖8為實(shí)施例7中AuNRs-Ce6-MSNRs與對(duì)照組Ce6注射到腫瘤模型小鼠后的光聲與熒光成像圖；

圖9為實(shí)施例8中AuNRs-Ce6-MSNRs與對(duì)照組PBS和Ce6注射到腫瘤模型小鼠后的光熱成像圖；

圖10為實(shí)施例9中檢測(cè)治療效果，AuNRs-Ce6-MSNRs與其他對(duì)照組(PBS組，Ce6組,Ce6-MSNRs組)分別注射到各組小鼠體內(nèi)后的腫瘤體積及體重變化趨勢(shì)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例和具體情況對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。除特別標(biāo)明外，所用試劑和測(cè)試設(shè)備均為市售(Si-PEG購(gòu)買自英國(guó)Fluorochem公司；AuNRs購(gòu)買自香港NanoSeedz公司)。

在各實(shí)施例中：

AuNRs為金納米棒的縮寫；

Ce6為二氫卟吩e6的縮寫；

MSNRs為介孔二氧化硅納米棒的縮寫；

DMSO是二甲基亞砜的縮寫；

EDC·HCL是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽的縮寫；

HOBT是1-羥基苯并三唑的縮寫；

APTES是3-氨丙基三乙氧基硅烷的縮寫；

MSNRs是介孔二氧化硅納米棒的縮寫；

CTAB是十六烷基三甲基溴化銨的縮寫；

TEOS是正硅酸乙酯的縮寫；

Si-PEG是2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的縮寫；

實(shí)施例1

用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)Ce6-APTES的制備：將2.0mg的Ce6溶于1mL的DMSO中，加入5.0mg的EDC·HCL，在常溫下攪拌20min，加入4.0mg的HOBT，在常溫下反應(yīng)30min，加入10μL APTES反應(yīng)10h；

(2)Ce6-MSNRs的制備：取10mL用氨水調(diào)節(jié)pH值在10-11間的水，在50℃攪拌條件下加入12.0mg CTAB，逐滴加入100μL步驟(1)獲得的溶液，再逐滴加入12μL的TEOS，攪拌20min，加入15μL的Si-PEG(CH₃O(C₂H₄O)_9-12(CH₂)Si(OCH₃)₃)，40℃條件下回流22h，12000rpm離心5min，沉淀用無(wú)水乙醇洗3遍，加入30mL無(wú)水乙醇，在60℃磁力攪拌條件下回流36h，除去模版劑CTAB，固液分離，固體用無(wú)水乙醇洗3次，每次12000rpm離心5min，最后分散在10mL水中；

(3)AuNRs-Ce6-MSNRs的制備：取1mL步驟(2)獲得的Ce6-MSNRs分散液，加入1mL220μg/mL的AuNRs水分散液，常溫下攪拌反應(yīng)5h，離心除去未吸附的AuNRs，沉淀分散在水中。

實(shí)施例2

用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)Ce6-APTES的制備：將2.5mg的Ce6溶于1mL的DMSO中，加入6.0mg的EDC·HCL，在常溫下攪拌25min，加入4.5mg的HOBT，在常溫下反應(yīng)40min，加入12μL APTES反應(yīng)12h；

(2)Ce6-MSNRs的制備：取10mL用氨水調(diào)節(jié)pH值在10-11間的水，在52℃攪拌條件下加入12.5mg CTAB，逐滴加入125μL步驟(1)獲得的溶液，再逐滴加入15μL的TEOS，攪拌25min，加入17μL的Si-PEG(CH₃O(C₂H₄O)_9-12(CH₂)Si(OCH₃)₃)，50℃攪拌條件下回流24h，13000rpm離心7min，沉淀用無(wú)水乙醇洗4遍，加入35mL無(wú)水乙醇，在62℃攪拌條件下回流42h，除去模版劑CTAB，固液分離，固體用無(wú)水乙醇洗4次，每次13000rpm離心7min，最后分散在10mL水中；(見(jiàn)圖1，(a)，圖2，圖4)

(3)AuNRs-Ce6-MSNRs的制備：取1mL步驟(2)獲得的Ce6-MSNRs分散液，加入1.5mL220μg/mL的AuNRs水分散液，常溫下攪拌反應(yīng)6h，離心除去未吸附的AuNRs，沉淀分散在水中。(見(jiàn)圖1，(b)，圖3)

實(shí)施例3

用于光療與成像的金納米-介孔硅納米棒復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)Ce6-APTES的制備：按比例，將3.0mg的Ce6溶于1mL的DMSO中，加入7.0mg的EDC·HCL，在常溫下攪拌30min，加入5.0mg的HOBT，在常溫下反應(yīng)50min，加入15μL APTES反應(yīng)14h；

(2)Ce6-MSNRs的制備：取10mL用氨水調(diào)節(jié)pH值在10-11間的水，在55℃攪拌條件下加入13.0mg CTAB，逐滴加入150μL步驟(1)獲得的溶液，再逐滴加入18μL的TEOS，攪拌30min，加入20μL的Si-PEG(CH₃O(C₂H₄O)_9-12(CH₂)Si(OCH₃)₃)，60℃攪拌條件下回流26h，14000rpm離心10min，沉淀用無(wú)水乙醇洗3遍，加入40mL無(wú)水乙醇，在65℃攪拌條件下回流48h，除去模版劑CTAB，固液分離，固體用無(wú)水乙醇洗3次，每次14000rpm離心10min，最后分散在10mL水中；

(3)AuNRs-Ce6-MSNRs的制備：取1mL步驟(2)獲得的Ce6-MSNRs分散液，加入2mL220μg/mL的AuNRs水分散液，常溫下攪拌反應(yīng)7h，離心除去未吸附的AuNRs，沉淀分散在水中。

實(shí)施例4：

測(cè)試AuNRs-Ce6-MSNRs的(實(shí)施例2制備)光熱升溫趨勢(shì)

取0.8ml的AuNRs-Ce6-MSNRs分散液到1.5mL的EP管中，用660nm，1.0W/cm²功率的激光照射器照射樣品5分鐘，并利用配有熱電偶微探針的溫度監(jiān)測(cè)器記錄下0-5分鐘內(nèi)的溫度變化。AuNRs-Ce6-MSNRs的光熱升溫趨勢(shì)圖如圖5所示，可見(jiàn)AuNRs-Ce6-MSNRs在近紅外激光的照射下升溫效果明顯，可以有效地用于光熱治療。

實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)施例1、3制備的AuNRs-Ce6-MSNRs在在近紅外激光的照射下升溫效果明顯。

實(shí)施例5：

測(cè)試AuNRs-Ce6-MSNRs(實(shí)施例2制備)產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力

以1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)作為單線態(tài)氧的捕獲劑測(cè)量單線態(tài)氧的產(chǎn)生。

將3mL AuNRs-Ce6-MSNRs分散液與3mL AuNRs水分散(220μg/mL)分別與100μL的1.0μg/mL DPBF甲醇溶液混合，然后用660nm波長(zhǎng)，1.0W/cm²功率的激光照射器照射5分鐘，并在不同的時(shí)間點(diǎn)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DPBF在410nm波長(zhǎng)處的吸光值。如圖6所示，3分鐘內(nèi)，AuNRs-Ce6-MSNRs的DPBF在410nm處的紫外吸收明顯降低，說(shuō)明AuNRs-Ce6-MSNRs產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力極強(qiáng)，可以較好地用于腫瘤的光動(dòng)力學(xué)治療。

實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)施例1、3制備的AuNRs-Ce6-MSNRs產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力極強(qiáng)。

實(shí)施例6：

細(xì)胞相對(duì)存活率實(shí)驗(yàn)，AuNRs-Ce6-MSNRs為實(shí)施例2制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞以5×10⁴個(gè)/孔接種于96孔板，每孔100μL，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)(大致貼壁80％)后給予藥物培養(yǎng)，依次加入pH＝7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)，不同濃度的Ce6組、實(shí)施例2制備的Ce6-MSNRs組與AuNRs-Ce6-MSNRs組(Ce6的濃度從小到大：0.3μg/mL，0.6μg/mL，1.2μg/mL，2.4μg/mL，4.8μg/mL，9.6μg/mL)。給藥物后孵育6h，用660nm激光照射(1.0W/cm²)，再繼續(xù)孵育至24h，每孔中加入20μL的5mg/mL四甲基偶氮唑鹽(MTT)(溶劑為pH＝7.4PBS)溶液，4h后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200μL二甲基亞砜(DMSO)，避光置搖床上低速振蕩10min，使紫色結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀在490nm處測(cè)量吸光值，計(jì)算各組的細(xì)胞相對(duì)存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，Ce6組和Ce6-MSNRs組對(duì)細(xì)胞的殺傷作用相當(dāng)，而AuNRs-Ce6-MSNRs組的細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)，說(shuō)明AuNRs-Ce6-MSNRs在近紅外激光照射下的光熱與光動(dòng)力學(xué)的聯(lián)合治療對(duì)癌癥細(xì)胞更具殺傷能力，可以更加有效地應(yīng)用于腫瘤治療當(dāng)中。

實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)施例1、3制備的AuNRs-Ce6-MSNRs在近紅外激光照射下的光熱與光動(dòng)力學(xué)的聯(lián)合治療對(duì)癌癥細(xì)胞更具殺傷能力。

實(shí)施例7：

實(shí)施例2制備的AuNRs-Ce6-MSNRs注射到腫瘤模型小鼠后的光聲與熒光成像(圖中US為超聲，PA為光聲)

通過(guò)尾靜脈向接種有4T1細(xì)胞的腫瘤模型小鼠體注射200μL的Ce6和AuNRs-Ce6-MSNRs(Ce6濃度均為9.6μg/mL)，在注射后2h，6h，12h，24h記錄其熒光成像圖像，觀察各個(gè)時(shí)間點(diǎn)熒光成像分布情況。如圖8b所示，注射12h后，AuNRs-Ce6-MSNRs在腫瘤部位達(dá)到最大聚集，且24h后仍有部分未被代謝。在注射Ce6、AuNRs-Ce6-MSNRs 12h后，進(jìn)行光聲成像的掃描，如圖8a所示，與對(duì)照組Ce6相比，AuNRs-Ce6-MSNRs在腫瘤部位顯示出更強(qiáng)的光聲信號(hào)。兩種成像結(jié)果均表明AuNRs-Ce6-MSNRs具有良好的腫瘤部位聚集效果，具有極大意義的治療作用與診斷作用。

實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)施例1、3制備的AuNRs-Ce6-MSNRs具有良好的腫瘤部位聚集效果。

實(shí)施例8：

實(shí)施例2制備的AuNRs-Ce6-MSNRs注射到腫瘤模型小鼠后的熱成像

注射200μL對(duì)照組pH＝7.4PBS，Ce6,AuNRs-Ce6-MSNRs(Ce6濃度均為9.6μg/mL)12小時(shí)后，對(duì)腫瘤局部用660nm激光進(jìn)行照射，并用近紅外成像儀觀察腫瘤部位在5分鐘內(nèi)特定時(shí)間點(diǎn)的升溫情況。如圖9所示，相對(duì)照組PBS組和Ce6組相比較，AuNRs-Ce6-MSNRs的體內(nèi)升溫效果明顯，說(shuō)明AuNRs-Ce6-MSNRs具有良好的光熱治療效果，對(duì)臨床的腫瘤治療具有極大意義。

實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)施例1、3制備的AuNRs-Ce6-MSNRs體內(nèi)升溫效果明顯。

實(shí)施例9：

治療效果研究，AuNRs-Ce6-MSNRs為實(shí)施例2制備

接種有4T1細(xì)胞的腫瘤模型小鼠被分為四組(每組12只)，分別通過(guò)尾靜脈注射pH＝7.4PBS，Ce6,Ce6-MSNRs,AuNRs-Ce6-MSNRs(Ce6濃度均為9.6μg/mL)，注射藥物12h后給予激光照射，每隔一天給藥一次并記錄各組腫瘤模型小鼠的體重和腫瘤體積變化情況。如圖10所示，相比較而言，注射AuNRs-Ce6-MSNRs組的小鼠腫瘤體積和體重變化均較穩(wěn)定，說(shuō)明該處方具有優(yōu)異的抑制腫瘤作用。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，本發(fā)明制備所制備的光熱與光動(dòng)力聯(lián)合治療處方AuNRs-Ce6-MSNRs擁有良好的抗腫瘤作用和較低的副反應(yīng)。