共載紫杉醇和增敏劑的納米脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及共載紫杉醇和增敏劑納米脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用，另外也涉及一種結(jié)構(gòu)新穎的增敏劑3-(2-噻吩基)苯并[5,6]香豆素。本發(fā)明的制備過(guò)程簡(jiǎn)單快捷，原料易得，所制備的PTX/ThBC納米脂質(zhì)體粒徑較均一，穩(wěn)定性佳，包封率≥94%。該制劑相對(duì)于傳統(tǒng)的PTX注射液，具有明顯的緩釋性能，毒副作用降低；相對(duì)于已有的PTX納米脂質(zhì)體，由于ThBC的增敏作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞增殖抑制活性更佳。
【專(zhuān)利說(shuō)明】共載紫杉醇和增敏劑的納米脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗腫瘤藥，具體涉及一種共載紫杉醇和增敏劑的納米脂質(zhì)體及其制備 方法與應(yīng)用。另外也涉及一種結(jié)構(gòu)新穎的增敏劑3-(2-噻吩基）苯并[5, 6]香豆素。

【背景技術(shù)】
[0002] 紫杉醇（Pac I i taxe 1，或Taxo 1，縮寫(xiě)PTX )，最初是由兩位美國(guó)化學(xué)家Wani和 Wall于1963年從生長(zhǎng)在美國(guó)西部大森林中的一種被稱(chēng)為太平洋杉的樹(shù)皮和木材中分 離得到，并發(fā)現(xiàn)它具有廣泛的抗惡性腫瘤作用（Wani MC，Taylor HL，Wall ME，ei a人 Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J Am Chem Soc, 1971， 93(9): 2325- 2327.)。該活性成分在植物中含量極低，直到1971年，通過(guò)X-射線(xiàn)衍射分 析才確定了其結(jié)構(gòu)。1994年7月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)PTX作為一種新型抗微管、抗癌藥物進(jìn)入市 場(chǎng)。現(xiàn)已作為治療多種腫瘤，如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌等的一線(xiàn)用藥，對(duì)宮頸癌、大 腸癌、原發(fā)性肝癌、直腸癌也有比較顯著的療效。研究發(fā)現(xiàn)，PTX與β微管蛋白結(jié)合，影響 α、β微管蛋白二聚體與微管間的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)微管蛋白組裝成微管，并使已組裝的微 管凝結(jié)、聚集，阻滯其解聚成亞單位，使細(xì)胞周期停滯于G 2/M期（Rowinsky EK, Donehower RC. Paclitaxel (taxol). N Engl J Med, 1995, 332(15): 1004-1014. )〇
[0003] 然而，PTX難溶于水（〈0· 3 μ g/mL)，制成注射劑有一定的困難（Kakinoki A, Kaneo Y, Tanaka T, et al. Synthesis and evaluation of water-soluble poly (vinyl alcohol)-paclitaxel conjugate as a macromolecular prodrug. Biol Pharm Bull, 2008，31(5): 963-969.)。目前臨床使用的PTX注射液有國(guó)產(chǎn)的紫素，泰素，進(jìn)口的紫 杉醇注射液（美國(guó)BMS公司），Anzatax (澳大利亞Fauliding公司）等產(chǎn)品，這些產(chǎn) 品均采用了表面活性劑增溶法，即以非離子表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL) 與乙醇以1 : 1的比例組成的混合液來(lái)穩(wěn)定和溶解制劑中的PTX，解決PTX不溶于水的 缺點(diǎn)，達(dá)到靜脈給藥目的（Zhang JA, Anyarambhatla G, Ma L, ei a人 Development and characterization of a novel Cremophor EL free liposome-based paclitaxel (LEP-ETU) formulation. 2005，59(1): 177-187·)。但是，該劑 型伴隨很多難以解決的臨床問(wèn)題：（1)由于聚氧乙烯蓖麻油會(huì)引起體內(nèi)組胺釋放，產(chǎn)生過(guò) 敏反應(yīng)、超過(guò)敏反應(yīng)，如出現(xiàn)藥物性皮疹，呼吸急促，支氣管痙攣，低血壓等。有超過(guò)2 %的嚴(yán) 重過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生而引起死亡。（2)PTX的聚氧乙烯蓖麻油溶液存在穩(wěn)定性和相容性的問(wèn)題， 如藥物一經(jīng)稀釋PTX就易發(fā)生沉淀。（3)制劑使用過(guò)程繁瑣，病人順應(yīng)性差。（4) PTX利用 率低，靶向性差，有一定的神經(jīng)毒性。由于這類(lèi)PTX制劑缺乏靶向性，易造成藥物全身分布 引起全身毒性；為了能夠清除腫瘤細(xì)胞或病灶，不得不加大給藥劑量，導(dǎo)致毒副作用增加。 因此臨床上迫切需要研制出不含聚氧乙烯蓖麻油的PTX新型給藥系統(tǒng)，以克服目前PTX劑 型的缺陷。
[0004] 香豆素類(lèi)化合物廣泛存在于天然產(chǎn)物及合成藥物中，具有多種生理活性，例如：抗 炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血等作用（Riveiro ME, De Kimpe N, Moglioni A, ei al. Coumarins: old compounds with novel promising therapeutic perspectives. 2010，17(13): 1325-1338.)。近幾年，香豆素的抗腫瘤作用成為研究的 熱點(diǎn)，人們已經(jīng)建立多種細(xì)胞模型，并逐步深入到分子機(jī)制上，如發(fā)現(xiàn)其主要是通過(guò)作用 于細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及阻斷多種信號(hào)等途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖（Zhou Y，Zhao ff, Xie G, et al. Induction of Nur77-dependent apoptotic pathway by a coumarin derivative through activation of JNK and p38 MAPK. Carcinogenesis，2014, Epub ahead of print.)。然而，到目前為止，具有臨床應(yīng)用價(jià)值的實(shí)用性香豆素類(lèi)抗腫瘤化合 物鮮有報(bào)道(馬龍，張波，陳耀等，具有抗腫瘤活性的香豆素類(lèi)化合物，CN 103172606 A.)。一方面，該類(lèi)化合物中的絕大多數(shù)抗腫瘤作用弱，活性低，單獨(dú)成藥的可能不大。另一 方面，同PTX -樣，諸多香豆素類(lèi)化合物水溶性差，制劑困難；此外，部分化合物結(jié)構(gòu)中的內(nèi) 酯環(huán)對(duì)PH變化很敏感，易于水解，導(dǎo)致穩(wěn)定性不佳。
[0005] 脂質(zhì)體（Liposomes)的迅猛發(fā)展為解決PTX等難溶性藥物提供了良好的應(yīng)用平 臺(tái)。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇組成的類(lèi)似生物膜的雙分子層結(jié)構(gòu)。由于其結(jié)構(gòu)類(lèi)似生 物膜，可包封水溶性和脂溶性藥物，具有提高藥物穩(wěn)定性、減少藥物用量、降低毒性；減輕 變態(tài)反應(yīng)和免疫反應(yīng)；延緩釋放、降低體內(nèi)消除速度；改變藥物在體內(nèi)的分布等優(yōu)點(diǎn)而得 到廣泛的應(yīng)用。脂質(zhì)體常作為藥物的儲(chǔ)庫(kù)，用于腫瘤、感染性疾病、心血管疾病等治療中 (Sempkowski M, Locke T, Stras S, et al. Liposome-based approaches for delivery of mainstream chemotherapeutics: preparation methods, liposome designs, therapeutic efficacy, TfeF 2014, 19(3-4): 177-221·)。但是，月旨質(zhì)體的穩(wěn) 定性差已成為其應(yīng)用中的主要問(wèn)題：脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)后，由于受血液中的蛋白、抗體等各種 因素作用，易發(fā)生破裂，包封藥物快速滲漏，并很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別、吸收，限制了它在 臨床上的應(yīng)用。
[0006] 納米脂質(zhì)體（Nanoliposomes，或 Nano-liposomes、Nano-lipo)是在常規(guī)脂質(zhì)體基 礎(chǔ)上結(jié)合納米技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種新型給藥系統(tǒng)。納米脂質(zhì)體的粒徑小，包封率高，祀向作 用強(qiáng)，同時(shí)具有輔料相容性好、體外釋放可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。研究表明：紫杉醇納米脂質(zhì)體制 劑與傳統(tǒng)的注射劑相比，療效相似，但可避免聚氧乙烯蓖麻油復(fù)合溶媒帶來(lái)的不良反應(yīng)，穩(wěn) 定性顯著提高，藥物不易滲漏；同時(shí)納米脂質(zhì)體的天然生物膜結(jié)構(gòu)在體內(nèi)具有被動(dòng)靶向性， 可以改善PTX在動(dòng)物體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)，降低毒副作用，患者順應(yīng)性佳。
[0007] 將紫杉醇和增敏劑香豆素類(lèi)化合物共同載入納米脂質(zhì)體中，則可以解決PTX臨床 使用中以下幾個(gè)難題：（1)將PTX載于脂質(zhì)體，免除了產(chǎn)生毒副作用的表面活性劑的使用。 (2) 將其制成納米脂質(zhì)體制劑，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，使PTX在體內(nèi)產(chǎn)生一定的儲(chǔ)庫(kù)效 應(yīng)和靶向性，藥物在納米脂質(zhì)體中停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，有利于腫瘤組織及病理部位的吸收。 (3) 納米脂質(zhì)體中引入增敏劑香豆素類(lèi)化合物，可顯著增強(qiáng)PTX對(duì)某些腫瘤細(xì)胞的增殖抑 制作用；這樣，臨床使用時(shí)，可在保證療效的前提下，減少PTX用藥劑量，從而降低其毒副作 用，達(dá)到"增敏減毒"PTX之目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了將紫杉醇和增敏劑香豆素類(lèi)化合物共同載入納米脂質(zhì)體中，達(dá)到"增敏減 毒"PTX之目的，本發(fā)明提供一種不含聚氧乙烯蓖麻油的新型給藥系統(tǒng)一共載紫杉醇和增敏 劑的納米脂質(zhì)體。本發(fā)明的另一目的在于提供該納米脂質(zhì)體的制備方法，本發(fā)明的第三個(gè) 目的在于提供上述納米脂質(zhì)體作為制備抑制腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的共載紫杉醇和增敏劑納米脂質(zhì)體，以下述配比的原料制成：紫杉醇：10 mg;注射用大豆卵磷脂：η大豆I卩磷脂：η紫杉醇=33?70 : 1;膽固醇：]^固醇：η大豆卵磷脂=0.05? 0. 15 : 1;增敏劑Iijewij: ?3 : 1;凍干保護(hù)劑：用量為注射用大豆卵磷脂及膽固 醇總質(zhì)量的5%?10% ;磷酸鹽緩沖液：pH7. 2?7. 4,用量為40?80 mL ; 其中η為摩爾數(shù)。
[0010] 為了計(jì)算方便，將有關(guān)原料的信息在這里列出。紫杉醇分子式C47H51NO14，分子量理 論值為853. 92,注射用大豆卵磷脂分子式為C42H8tlNO8P，分子量理論值為758. 06,膽固醇分 子量理論值為386. 6535。
[0011] 進(jìn)一步，增敏劑為T(mén)hBC，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式（I)所示： (I)

【權(quán)利要求】
1. 共載紫杉醇和增敏劑的納米脂質(zhì)體，其特征是以下述配比的原料制成：紫杉醇： 10 mg;注射用大豆卵磷脂：n大豆麵脂：n紫杉醇=33?70 : 1;膽固醇：11)33固醇：n大豆麵脂= 0? 05?0? 15 : 1 ;增敏劑n增敏劑：11紫_ =1?3 : 1 ;凍干保護(hù)劑：用量為注射用大豆卵磷 脂及膽固醇總質(zhì)量的5%?10% ;磷酸鹽緩沖液：pH7. 2?7. 4,用量為40?80 mL ; 其中n為摩爾數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體，其特征在于：增敏劑為T(mén)hBC，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式 (I)所示：
(I)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體，其特征在于：所述的凍干保護(hù)劑可為蔗糖、乳 糖、葡萄糖、甘露醇和/或海藻糖。
4. 權(quán)利要求1所述的共載紫杉醇和增敏劑納米脂質(zhì)體的制備方法包括： 將注射用大豆卵磷脂、膽固醇、紫杉醇及增敏劑用有機(jī)溶劑溶解，并混勻； 55 °C下水浴蒸發(fā)成膜，除去溶劑，真空干燥； 加入磷酸鹽緩沖液及凍干保護(hù)劑，攪拌，充分溶脹至薄膜脫落，得到黃色混懸液；然后 冰水浴下分散，得到黃色略帶熒光的懸液，再經(jīng)0.22 濾器過(guò)濾除菌整粒，即得納米脂質(zhì) 體懸液；分裝至西林瓶，冷凍干燥，得到共載紫杉醇/增敏劑納米脂質(zhì)體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：還包括一種增敏劑ThBC的合成，其 步驟包括如下： 向反應(yīng)器中依次加入噻吩-2-乙酸，乙酸酐和2-羥基-1-萘甲醛，室溫下攪拌，使固 體溶解后，加入三乙胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入冰水，攪拌，析 出固體，抽濾，濾餅用冰水洗滌至中性，再加入CH2Cl2，過(guò)濾，去除不溶物，濃縮，硅膠柱層析 分離，得黃色固體，即目標(biāo)產(chǎn)物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：硅膠柱層析分離采用Kiigis : Kwm=1: 4的乙酸乙酯-石油醚混合流動(dòng)相。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：注射用大豆卵磷脂及膽固醇一起用 5?8 mL的乙醚或三氯甲烷溶解；紫杉醇用1?4 mL乙醇或三氯甲烷溶解；增敏劑用1? 4 mL二氯甲烷或三氯甲烷溶解。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：分散的方法為超聲波細(xì)胞破碎儀間 歇超聲法或高壓乳勻法。
9. 權(quán)利要求1所述的共載紫杉醇和增敏劑納米脂質(zhì)體的在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng) 用，其中所述腫瘤包括宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：藥物劑型為靜脈注射劑。
【文檔編號(hào)】A61K31/337GK104337807SQ201410595772
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】陳家念, 傅曉波, 李亭, 沈星燦, 王先富, 吳德文, 蔣邦平, 紀(jì)仕辰, 覃江克, 劉冬成, 黃春秋 申請(qǐng)人:廣西師范大學(xué)