大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途。本發(fā)明采用基因重組質粒表達大腸桿菌表面蛋白TolC，通過SELEX過程篩選與其特異性結合的核酸適配體群，測序分析適配體群的堿基序列。該序列可作為大腸桿菌表面蛋白TolC的特異性結合的探針，用于設計和制備大腸桿菌快速檢測標識物及外排泵抑制劑等。
【專利說明】大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途
[0001] 本發(fā)明是于2013年2月28日申請的申請?zhí)枮?01310062950. 2、發(fā)明名稱為"大 腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途"的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學微生物【技術領域】，涉及大腸桿菌外膜蛋白TolC核 酸適配體的序列及用途。

【背景技術】
[0003] 大腸桿菌（Escherichia coli)是埃希氏菌屬的代表菌，是構成人類腸道中的正常 菌群之一，又是重要的條件致病菌，極易通過多種形式和途徑侵入腸道外的組織和器官，造 成各種嚴重感染。隨著抗菌藥物的臨床廣泛應用，誘導了大量該菌屬耐藥菌株的產生，并 形成了該菌對單一抗菌藥物耐藥到對多種抗菌藥物同時耐藥，由低耐藥率到高耐藥率的發(fā) 展，給臨床治療帶來了極大的困難，導致較高的病死率。目前國內外對大腸桿菌的耐藥性機 理展開了深入的研究。研究表明，主動外排泵為大腸桿菌多重耐藥的重要機制。大腸桿菌 外排泵包括：RND、MFS、ABC、SMR、MATE五類，其中前三者必須與外膜蛋白（OMP) TolC構成轉 運共同體，才能完成對多種藥物的外排，由此可見TolC是構成大腸桿菌外排泵的重要組成 成分。TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端為開放結構，以便給外排底物提供泵出的寬闊通 道；下端為封閉結構。外排泵三聯復合物構象的改變，可使孔道定期開放或閉合。TolC結 構的改變會引起它們三者相互作用的減弱甚至三聯復合物的解體。在關于大腸桿菌外膜蛋 白的研究報導中，很多結果提示了 TolC蛋白在大腸桿菌的多重耐藥機制中起到至關重要 的作用。但目前沒有報道通過改變該蛋白結構來抑制耐藥性。
[0004] 適配體（Aptamers)的研究是一個新的熱點領域，它是能夠與許多目標分子（蛋 白，藥物，無機或有機分子）發(fā)生高親合性和特異性結合的一類單鏈核酸（DNA or RNA)。至 今發(fā)現高親和特異性適配體的方法是配體指數富集系統(tǒng)展開（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)。由于適配體與配體分子結合的高特異性 以及高親和性，在醫(yī)學研究中被廣泛應用于檢測和藥物研究等方面。Yuan等（Yuan L，et al，Anal Chem，2007,79(3) :1082)利用等離子體表面共振成像與適配子技術建立蛋白質芯 片，檢測該蛋白質芯片上吸附的蛋白抗體凝血酶、血管內皮生長因子（VEGF)復合物。Cao等 (Cao X，et al，Nucleic Acids Res，2009,37(14) :4621-8)利用篩選出的針對金黃色葡萄 球菌的適配子來檢測金黃色葡萄球菌。
[0005]目前國內外大部分從事核酸適配體研究的科學家和生物技術公司主要將適配體 運用于病毒感染、癌癥、自身免疫病、血管性疾病的臨床治療，并成為較為理想的臨床治療 的新手段。其治療機制主要是通過折疊成一定的三維結構直接與病理學相關蛋白質特異性 結合，抑制這些蛋白質的活性，以達到治療目的。Feng Η等（Feng H，et al，PL〇S One，2011， 6(11) :e27862)篩選出了能與乙型肝炎病毒高親和力結合，干擾病毒Ρ-ε復合物形成的適 配體。但迄今尚無針對細菌外膜蛋白的適配體報道或公開，因此實有必要開發(fā)一種可特異 性結合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明擬考慮將核酸適配體應用于改變TolC蛋白結構來有效阻塞大腸桿菌外排 泵外排活性。開發(fā)可特異性結合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體，為抑制大腸桿菌多 重耐藥提供有力支持，具有重要的臨床價值。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種可特異結合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。該 適配體具有如下序列：SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0 : 5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO: 17、SEQIDN0:18、SEQIDN0:19*SEQIDN0:20。
[0008] 具體的，所述 SEQ ID NO :1 為：5' -TGCGTGTTTACGTGTCGATGTCCGGGTACCCTCGG-3' ；
[0009] 所述 SEQ ID NO :2 為：5' -CTCTTAGCCATTTTGGTATGCGTATTGCTCTACAG-3' ；
[0010] 所述 SEQ ID NO :3 為：5, -ATATATTGCTCTGATCGTACTCTTATTAGGTTAGT-3,；
[0011] 所述 SEQ ID NO :4 為：5' -ATGACGCTGTGGTATTACGTCCTCCTGTATTTGCC-3' ；
[0012] 所述 SEQ ID NO :5 為：5' -TCTAAGTGGAATCTACCACCAACGTATTTTTCCTC-3,；
[0013] 所述 SEQ ID NO :6 為：5' -TCCGCCTATTCGGGAGGGAATATTGCTGATTTGTA-3' ；
[0014] 所述 SEQ ID NO :7 為：5' -CTCTTCAGTTTTAGACAATGCACGTTTCAGCGGTG-3,；
[0015] 所述 SEQ ID NO :8 為：5, -TCCAGGCTATAATTTCTTGGAACTCCCTCCGTTAG-3,；
[0016] 所述 SEQ ID NO :9 為：5, -CTTTCGAAGGGACTTTAACGGGTATATCCGGTTTT-3,；
[0017] 所述 SEQ ID NO :10 為：5' -ATTACATGCTCTGAGCTTTTTGTATGAGAAATGAT-3,；
[0018] 所述 SEQ ID NO :11 為：5, -CGCTTAGCTTGTGATTTCATCTTTCACACAAGAAT-3,；
[0019] 所述 SEQ ID NO :12 為：5' -CGGAGATCTGTTACACTTCGGTACGTCTTAGTTTG-3' ；
[0020] 所述 SEQ ID NO :13 為：5' -CTACCATGTTCAGTGGTTTTGGGATTTTCATACAT-3' ；
[0021] 所述 SEQ ID NO :14 為：5' -TGAGATCGGTGAGTTAGTATCTTTTATTCAGTTTT-3' ；
[0022] 所述 SEQ ID NO :15 為：5' -GCATTGCGTGACATGGCCTTGCTATCCCTGTTCGT-3' ；
[0023] 所述 SEQ ID NO :16 為：5, -TCCTAAAAGCTAGTTATAGTAAATTGAAAACTTAG-3' ；
[0024] 所述 SEQ ID NO :17 為：5' -TGGAGCTTAGATTTTGAAGCAGTTACATTTCCCGA-3' ；
[0025] 所述 SEQ ID NO :18 為：5' -TACTGCGAGCTTCATTTTTACTTGGTAGTGTTGTG-3' ；
[0026] 所述 SEQ ID NO :19 為：5, -CGAACGAATATAATTATGGCGTCCCCGGGGTTTCG-3,；
[0027] 所述 SEQ ID NO :20 為：5' -CTAGTTATGACATTTGTGTCATTTATCCCACGCTG-3'
[0028] 本發(fā)明之大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體序列，通過下述方法制得：
[0029] 采用核酸適配體的體外SELEX篩選技術，以大腸桿菌外膜蛋白TolC為篩選靶標， 從體外合成的隨機寡聚 DNA 文庫（5'-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGG ATC-3'）中篩選出與TolC蛋白特異結合的核酸適配體。
[0030] 優(yōu)選的，所述大腸桿菌外膜蛋白TolC采用如下方法純化得到：
[0031] 采用分子克隆技術，根據大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設計特異引物，所 述特異引物之上游引物Pa為5 ' -CGGGATCCATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTT - 3 '，其下游引物Pb 為 5' - CCGCTCGAGGTTACGGAAAGGGTTATGACCGTT - 3'，以全長 cDNA 為模板，PCR 擴增，得到目 的基因經Bam Η I和Xho I雙酶切，同樣處理PET-30a質粒，再用T4連接酶連接制得含有 TolC基因的重組質粒；重組質粒轉化感受態(tài)細胞BL21，從轉化的平板挑單克隆到液體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，IPTG誘導表達，經固液分離，取沉淀用Tris-HCl溶液吹散，超聲粉碎，然后電泳； 柱層析分離純化蛋白質。
[0032] 在一個具體實施例中，本發(fā)明之大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體序列的制備 方法是：
[0033] 采用分子克隆技術，根據大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設計特異引物，在 一個具體實施例中，該特異引物為上游引物Pa，下游引物Pb，以全長cDNA為模板，PCR擴增。 得到目的基因經Bam Η I和Xho I雙酶切，同樣處理PET-30a質粒，再用T4連接酶連接制 得含有TolC基因的重組質粒。
[0034] 重組質粒轉化感受態(tài)細胞BL21，從轉化的平板挑單克隆到1. 5ml LB液體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，IPTG(0. 5mM)誘導表達，取lml誘導的菌液，12000rpm，離心lmin，棄上清，沉淀用 50-100 μ 110mM Tris-HCl (pH8.0)溶液吹散（加入緩沖液的量視菌體量而定），超聲粉碎 (500W，30 次，每次 10s，間隔 15s)。加入 50μ 12Xloading buffer，100°C煮 5min，電泳。
[0035] 過鎳柱蛋白質純化，分別收集蛋白峰，電泳檢測蛋白純化效果（純化結果見圖2)。
[0036] 隨后利用適配體的SELEX體外篩選技術，以收集純化后的TolC為篩選靶標， 從體外合成的隨機寡聚 DNA 文庫（5 ' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGC CCGGATC-3'）中篩選出與TolC蛋白特異結合的核酸適配體，將篩選出來的序列用引物 Pl(5' GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3'）和引物 P2(5' -GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3'）進行擴 增。將PCR擴增產物純化后取1μ 1，與載體PGM-T在T4DNA連接酶的作用下連接，再將其轉 化到感受態(tài)細胞，取適當體積均勻涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素（Amp)的LA平板，12? 16小時后用接種環(huán)挑取篩選平板上的單個白色菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過 夜。取菌液lml于離心管中，封膜后送上海生工生物技術有限公司（以下簡稱上海生工） 測序。
[0037] 所述序列選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來源的同樣的序列。
[0038] 本發(fā)明進一步提供所述核酸適配體序列的用途，例如該序列在制備藥物或制品中 的應用。在一個具體實施例中，本發(fā)明提供所述序列在制備大腸桿菌外排泵抑制劑中的應 用。
[0039] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述核酸適配體序列在制備檢測TolC蛋白的探針或 靶點中的應用。
[0040] 本發(fā)明還提供所述適配體在制備大腸桿菌外排泵抑制劑中的應用。
[0041] 本發(fā)明還提供所述適配體在制備檢測TolC蛋白的探針或靶點中的應用。
[0042] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種抑制大腸桿菌外排泵外排活性或減少大腸桿菌 外排泵外排的方法，包括給予有效量的所述的適配體。
[0043] 本發(fā)明中，所述的核酸序列構成的適配體可與大腸桿菌外膜蛋白TolC特異性結 合，可用于外排泵抑制劑藥物的設計和制備。所述的核酸序列構成的適配體也可以作為檢 測TolC蛋白的探針或靶點。本發(fā)明所提供的核酸適配體序列與作為靶標的大腸桿菌外膜 蛋白TolC具有非常強的親和性，因而所述序列具有特異性強的優(yōu)點；此外，所述序列可以 大量快速地在體外合成，且制備方法簡單，因而比較容易獲得。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖1為適配體抑制大腸桿菌外排泵作用機理；
[0045] 圖2為大腸桿菌外膜蛋白TolC純化電泳圖；

【專利附圖】

【附圖說明】 [0046] ：
[0047] 圖2橫坐標代表：泳道1為TolC上清；泳2為TolC沉淀；泳道Μ為蛋白marker ; 圖2縱坐標代表：蛋白質的分子量，單位kD。

【具體實施方式】
[0048] 以下配合本發(fā)明的優(yōu)選實施例，進一步闡述本發(fā)明為達成預定發(fā)明目的所采取的 技術手段。
[0049] 本發(fā)明擬考慮將核酸適配體應用于改變TolC蛋白結構來有效阻塞大腸桿菌外排 泵外排活性，阻塞原理如圖1所示。開發(fā)針對大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體，將為 抑制大腸桿菌多重耐藥提供有力支持，具有重要的臨床價值。
[0050] 實施例1 :外臘蛋白TolC某閔擴增
[0051] 采用分子克隆技術，根據大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設計特異引物（上 游引物Pa，其下游引物Pb)，以全長cDNA為模板，PCR擴增。PCR反應條件：94°C，預變性 5min，然后以94 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s，進行30個循環(huán)，最后72 °C延伸 10min。PCR產物經lwt%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。
[0052] 實施例2 :重纟目表汰質粒的構律
[0053] (1)得到目的基因經Bam Η I和Xho I雙酶切，酶切體系如下：25 μ 1質粒，2 μ 1 Bam Η Ι，2μ1 Xho I，8yllOXBuffer，43yl ddH20，混合物 37°C過夜反應，用快速膠回收 試劑盒純化酶切產物。
[0054] (2)PET-30a質粒經Bam Η I和Xho I雙酶切，酶切體系如下：5μ 1載體（pET-30a) 質粒，2μ1 BamH Ι，2μ1 Xho I，8yllOXBuffer，63yl ddH20，混合物 37°C 過夜反應，用快 速膠回收試劑盒純化酶切產物。
[0055] (3)用T4連接酶連接大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因和PET_30a載體，獲得重 組質粒。連接體系如下：lul載體（pET30a)，3ul PCR回收產物，4ul連接酶（Takara，DNA ligation Kit Ver2.0)，混勻，在室溫下反應30min以上。
[0056] (4)重組質粒轉化感受態(tài)細胞BL21。取出一 80°C溫度保存的感受態(tài)細胞（BL21)， 放在冰上緩慢解凍。調2臺水浴鍋至水溫分別為42°C和37°C。將感受態(tài)細胞BL21加入連 接產物，冰上放置30分鐘。42°C熱激90秒。放回冰上，2分鐘后加入800ul無抗性的LB培 養(yǎng)基（卡那霉素）（購自上海生工）。放入37°C搖床中45分鐘，8000rpm離心3分鐘，棄大 部分上清，留約100-150ul重懸，選擇有相應抗性的LB平板，涂板。晾干，于37°C培養(yǎng)箱中 倒置培養(yǎng)過夜。
[0057] 實施例3 :TolC蛋白在大腸桿菌中的表汰
[0058] 從轉化的平板挑單克隆到1. 5ml LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，200rpm培養(yǎng)。將 培養(yǎng)的菌液轉接到500mL LB液體培養(yǎng)基混合，37 °C，200rpm，培養(yǎng)至0D = 0. 6-0. 8， IPTG(0. 5mM)誘導4h。用400m大離心筒，6000rpm，離心5min，取上清。沉淀用20-30mll0mM Tris-HCl (pH8. 0)溶液吹散，超聲粉碎（500W，30次，每次10s，間隔15s)。取100 μ 1超聲后 的菌懸液，12000rpm，離心lOmin，分別得TolC上清和TolC沉淀，取50 μ ITolC上清至另一 EP管，TolC沉淀用50μll0mMTris-HClpH8·0)溶液吹散，加入50μl2Xloadingbuffer， 100°C煮5min，電泳。電泳圖如圖2所示。結果顯示在52kD處泳道1和2即TolC上清和 TolC沉淀均有一明顯增粗的蛋白質條帶（如圖2所示）Μ為電泳技術常規(guī)的標準分子量 marker,目的條帶和Marker的那條帶位置相同就可以確定目的條帶的分子量，結果表明目 的蛋白在上清和沉淀中均有表達。
[0059] 實施例4 :蛋白質鈍仆,
[0060] 用純水洗鎳柱至pH7. 0，后掛鎳至pH2-3。純水洗柱至pH7. 0， 用lOOmlTris-HCldOmM，pH8. 0)溶液平衡鎳柱，再用50ml含0. 5M氯化鈉的 10mMTris-HCl(pH8. 0)溶液平衡鎳柱。將樣品外膜蛋白TolC稀釋上樣，上樣結束后用0. 5M 氯化鈉的10mM Tris-HCl pH8. 0)溶液洗柱，分別用含15mM咪唑、60mM咪唑、300mM咪唑的 10mM Tris-HCl (pH8. 0)(含0. 5M氯化鈉）溶液洗脫，收集300mM咪唑洗脫的蛋白峰。
[0061] 實施例5 :核酸適配體篩誅.（一輪）
[0062] 上海生工合成78個nt長度的隨機ssDNA文庫，上游為23個nt的引物結合位點， 下游為20個nt的引物結合位點，中間為35個nt的隨機序列，庫容量為4 35。ssDNA的序列 為：
[0063] 5 ' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ' 篩選過程中用于 PCR擴增的DNA引物分別為：引物P1，引物P2。
[0064] (l)TolC蛋白溶于200μ 1PBS后加入96孔ELISA板中，4°C過夜。
[0065] (2)蛋白包被孔用PBS洗滌6次后，加入200 μ 13% BSA(購自上海生工），孵育2 小時。同時，空白96孔ELISA板中加入200 μ 13% BSA37°C孵育2小時。
[0066] (3)將隨機ssDNA文庫（首輪用量為800pmol)溶于200μ 11XSHCMK，95°C變性 5min。立即置于冰上10min，使其迅速降至室溫，避免ssDNA復性成雙鏈。
[0067] (4)將ssDNA加入PBS洗滌6次的空白ELISA孔中，37°C孵育2小時。
[0068] (5)上清轉入PBS洗滌6次的蛋白包被孔中，37°C孵育2小時后PBS洗滌6次。
[0069] (6)結合了 ssDNA的酶標孔用200 μ 1洗脫緩沖液重懸，95°C加熱5min，取上清，經 過乙醇沉淀DNA，溶于Millipore水中，作為下一輪篩選的模板。
[0070] (8)取5μ 1PCR產物上樣于5wt%瓊脂糖（購自上海生工），觀察條帶位置是否正 確。從首輪之后，投入的ssDNA次級庫的量逐漸減少，如此反復進行12個循環(huán)。
[0071] 實施例6 :核酸話配體克降
[0072] 第12輪篩選產物的擴增和純化：將第12輪篩選得到的ssDNA序列，用引物P1，弓丨 物P2進行擴增。100μ 1PCR擴增后體系加入500pl結合液BB(20mmol/L Η印es(pH7. 35)， 120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/L CaC12，lmmol/LMgC12，l%BSA)，充分混勻。將上一 步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置lmin，12000rpm離心30? 60s，倒掉收集管中的廢液。加入700pmol漂洗WB (結合液ΒΒ+0. 05 % Tween20)，12000rpm 離心30s，棄掉廢液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄掉廢液。將吸附柱EC 放回空收集管中，12000rpm離心2min。取出吸附柱EC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜 的中間部位加ΖΟρηιοΙθδ?水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12, OOOrpm離心lmin。 將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心lmin。
[0073] PCR純化產物的克?。喝? μ 1擴增產物，與載體PGM-T在T4DNA連接酶的作用下連 接，再將其轉化到感受態(tài)細胞，取適當體積均勻涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素（Amp)(它 們分別購自于上海生工）的LA平板，倒置培養(yǎng)皿，于37°C培養(yǎng)12-16小時進行"藍-白斑 篩選"。
[0074] 測序：用接種環(huán)挑取篩選平板上的單個白色菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37°C 培養(yǎng)過夜。取菌液lml于離心管中，封膜后送上海生工測序。測序結果發(fā)現其中有20個核 酸適配體序列與大腸桿菌外膜蛋白TolC具有非常強的親和性，該20個序列分別是：
[0075] 5'-TGCGTGTTTACGTGTCGATGTCCGGGTACCCTCGG-3'（SEQ ID NO :1);
[0076] 5' -CTCTTAGCCATTTTGGTATGCGTATTGCTCTACAG-3'（SEQ ID NO :2);
[0077] 5' -ATATATTGCTCTGATCGTACTCTTATTAGGTTAGT-3'（SEQ ID NO :3);
[0078] 5, -ATGACGCTGTGGTATTACGTCCTCCTGTATTTGCC-3'（SEQ ID NO :4);
[0079] 5' -TCTAAGTGGAATCTACCACCAACGTATTTTTCCTC-3'（SEQ ID NO :5);
[0080] 5' -TCCGCCTATTCGGGAGGGAATATTGCTGATTTGTA-3'（SEQ ID NO :6);
[0081] 5'-CTCTTCAGTTTTAGACAATGCACGTTTCAGCGGTG-3'（SEQ ID NO :7);
[0082] 5' -TCCAGGCTATAATTTCTTGGAACTCCCTCCGTTAG-3'（SEQ ID NO :8);
[0083] 5' -CTTTCGAAGGGACTTTAACGGGTATATCCGGTTTT-3'（SEQ ID NO :9);
[0084] 5'-ATTACATGCTCTGAGCTTTTTGTATGAGAAATGAT-3'（SEQ ID NO :10);
[0085] 5'-CGCTTAGCTTGTGATTTCATCTTTCACACAAGAAT-3'（SEQ ID NO :11);
[0086] 5,-CGGAGATCTGTTACACTTCGGTACGTCTTAGTTTG-3'（SEQ ID NO :12);
[0087] 5,-CTACCATGTTCAGTGGTTTTGGGATTTTCATACAT-3,（SEQ ID NO :13);
[0088] 5,-TGAGATCGGTGAGTTAGTATCTTTTATTCAGTTTT-3'（SEQ ID NO :14);
[0089] 5,-GCATTGCGTGACATGGCCTTGCTATCCCTGTTCGT-3,（SEQ ID NO :15);
[0090] 5,-TCCTAAAAGCTAGTTATAGTAAATTGAAAACTTAG-3'（SEQ ID NO :16);
[0091] 5'-TGGAGCTTAGATTTTGAAGCAGTTACATTTCCCGA-3'（SEQ ID NO :17);
[0092] 5,-TACTGCGAGCTTCATTTTTACTTGGTAGTGTTGTG-3,（SEQ ID NO :18);
[0093] 5,-CGAACGAATATAATTATGGCGTCCCCGGGGTTTCG-3'（SEQ ID NO :19);
[0094] 5' -CTAGTTATGACATTTGTGTCATTTATCCCACGCTG-3'（SEQ ID NO :20);
[0095] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，雖 然本發(fā)明已以優(yōu)選實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術人 員，在不脫離本發(fā)明技術方案的范圍內，當可利用上述揭示的技術內容作出些許更動或修 飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術方案的內容，依據本發(fā)明的技術實 質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術方案的范圍 內。
[0001] 序列表 <1]0湖南中醫(yī)藥大學 〈120.大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途 <160 20 <170 Patentln version 3. 5 <210- 1 <211 35 <212、 PRT 核酸適配體 <400- 1 TGCGTGTTTA CGTGTCGATG TCCGGGTACC CTCGG 35 <210 2 <211 35 <212N PRT <213核酸適配體 <400 2 CTCTTAGCCA TTTTGGTATG CGTATTGCTC TACAG 35 <210, 3 <211 35 <21PRT 〈21^核酸適配體 <400 3 ATATATTGCT CTGATCGTAC TCTTATTAGG TTAGT 35 <210 4 <211 35 <212 PRT <213核酸適配體 <400 4 ATCtACGCTCtT GGTATTACGT CCTCCTGTAT TTGCC 35 <210 5 <211 35 <212、 PRT <213核酸適配體 <400> 5
[0002] TCTAAGTGGA ATCTACCACC AACGTATTTT TCCTC 35 <210 6 <211> 35 <212N PRT dlf核酸適配體 <400> 6 TCCGCCTATT CGGGAGGGAA TATTGCTGAT TTGTA 35 <210 7 <211 35 <212^ PRT 核酸適配體 <400 7 CTCTTCAGTT TTAGACAATG CACGTTTCAG CGGTG 35 <210 8 <211 35 <212N PRT <21$ 酸適配體 <400 8 TCCAGGCTAT AATTTCTTGG AACTCCCTCC GTTAG 35 <210 9 <211 35 <212、 PRT <213核酸適配體 <400 9 CTTTCGAAGG GACTTTAACG GGTATATCCG GTTTT 35 <210 10 <211 35 <212, PRT 〈2l3核酸適配體 <400 10 ATTACATGCT CTGAGCTTTT TGTATGAGAA ATGAT 35 <210 11 <211 35 <212 PRT 核酸適配體
[0003] <4〇α> 11 CGCTTAGCTT GTGATTTCAT CTTTCACACA AGAAT 35 <210 V2 <211 35 <212N> PRT <213核酸適配體 <400 12 CTtCtAOATCTG TTACACTTCG aTACGTCTTA GTTTG 35 <210 13 <211/ 35 <212、 PRT <Sl干核酸適tl體 <400 13 CTACCATGTT CAGTGGTTTT GGGATTTTCA TACAT 35 <210 14 <211 35 <212N PRT 核酸適配體 <400 14 TGAGATCGGT CtAGTTAGTAT CTTTTATTCA GTTTT 35 <210 15 <211. 35 <212 PRT <213核酸適配體 <100 15 C.CATTGCOTG ACATGGCCTT GCTATCCCTG TTCOT 35 <210 16 <21Γ 35 <212'、PRT 核酸適配體 <400 16 TCCTAAAAGC TAGTTATAGT AAATTGAAAA CTTAG 35 <210 17 <211 3n <212 - PRT
[0004] <213核酸適配體 <400 17 TGGAGCTTAG ATTTTGAAGC AGTTACATTT CCCGA 35 <210 18 <211. 35 <212、 PRT 核酸適配體 <400 18 TACTGCGAGC TTCATTTTTA CTTGGTAGTG TTGTG 35 <210 19 <21L· 35 <212、 PRT 核酸適配體 <400 19 CGAACGAATA TAATTATGGC GTCCCCGGGG TTTCG 35 <210 20 <211 35 <212、 PRT <21^核酸適配體 <400 20 CTAGTTATGA CATTTGTGTC ATTTATCCCA CGCTG 35
【權利要求】
1. 特異結合大腸桿菌外膜蛋白Toic的核酸適配體，所述核酸適配體如SEQ ID NO :2所 示序列。
2. 按權利要求1所述的適配體，其特征在于，所述大腸桿菌外膜蛋白TolC采用如下方 法純化得到： 采用分子克隆技術，根據大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設計特異引物，所述特 異引物之上游引物Pa為5' -CGGGATCCATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTT - 3'，其下游引物Pb為 5' -CCGCTCGAGGTTACGGAAAGGGTTATGACCGTT - 3'，以全長 cDNA 為模板，PCR 擴增，得到目的基 因經Bam Η I和Xho I雙酶切，同樣處理PET-30a質粒，再用T4連接酶連接制得含有TolC 基因的重組質粒；重組質粒轉化感受態(tài)細胞BL21，從轉化的平板挑單克隆到液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，IPTG誘導表達，經固液分離，取沉淀經超聲粉碎，然后電泳；再采用柱層析純化所述 大腸桿菌外膜蛋白TolC。
3. 按權利要1或2所述的適配體，其特征在于，所述序列為人工合成的序列，或任何其 他來源的同樣的序列。
4. 一種權利要求1-3中任一項所述的適配體在制備大腸桿菌外排泵抑制劑中的應用。
5. -種權利要求1-3中任一項所述的適配體在制備檢測TolC蛋白的探針或靶點中的 應用。
6. -種權利要求1所述的適配體在制備大腸桿菌外排泵抑制劑或制備檢測TolC蛋白 的探針或靶點中的應用。
【文檔編號】A61K31/7088GK104099335SQ201410332605
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年2月28日 優(yōu)先權日:2013年2月28日
【發(fā)明者】葛金文, 陳伶利, 李 杰 申請人:湖南中醫(yī)藥大學