大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途。本發(fā)明采用基因重組質(zhì)粒表達(dá)大腸桿菌表面蛋白TolC，通過SELEX過程篩選與其特異性結(jié)合的核酸適配體群，測(cè)序分析適配體群的堿基序列。該序列可作為大腸桿菌表面蛋白TolC的特異性結(jié)合的探針，用于設(shè)計(jì)和制備大腸桿菌快速檢測(cè)標(biāo)識(shí)物及外排泵抑制劑等。
【專利說明】大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途
[0001] 本發(fā)明是于2013年2月28日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?01310062950. 2、發(fā)明名稱為"大 腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途"的分案申請(qǐng)。 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及大腸桿菌外膜蛋白TolC核 酸適配體的序列及用途。 【背景技術(shù)】
[0003] 大腸桿菌（Escherichia coli)是埃希氏菌屬的代表菌，是構(gòu)成人類腸道中的正常 菌群之一，又是重要的條件致病菌，極易通過多種形式和途徑侵入腸道外的組織和器官，造 成各種嚴(yán)重感染。隨著抗菌藥物的臨床廣泛應(yīng)用，誘導(dǎo)了大量該菌屬耐藥菌株的產(chǎn)生，并 形成了該菌對(duì)單一抗菌藥物耐藥到對(duì)多種抗菌藥物同時(shí)耐藥，由低耐藥率到高耐藥率的發(fā) 展，給臨床治療帶來了極大的困難，導(dǎo)致較高的病死率。目前國內(nèi)外對(duì)大腸桿菌的耐藥性機(jī) 理展開了深入的研究。研究表明，主動(dòng)外排泵為大腸桿菌多重耐藥的重要機(jī)制。大腸桿菌 外排泵包括：RND、MFS、ABC、SMR、MATE五類，其中前三者必須與外膜蛋白（OMP) TolC構(gòu)成轉(zhuǎn) 運(yùn)共同體，才能完成對(duì)多種藥物的外排，由此可見TolC是構(gòu)成大腸桿菌外排泵的重要組成 成分。TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端為開放結(jié)構(gòu)，以便給外排底物提供泵出的寬闊通 道；下端為封閉結(jié)構(gòu)。外排泵三聯(lián)復(fù)合物構(gòu)象的改變，可使孔道定期開放或閉合。TolC結(jié) 構(gòu)的改變會(huì)引起它們?nèi)呦嗷プ饔玫臏p弱甚至三聯(lián)復(fù)合物的解體。在關(guān)于大腸桿菌外膜蛋 白的研究報(bào)導(dǎo)中，很多結(jié)果提示了 TolC蛋白在大腸桿菌的多重耐藥機(jī)制中起到至關(guān)重要 的作用。但目前沒有報(bào)道通過改變?cè)摰鞍捉Y(jié)構(gòu)來抑制耐藥性。
[0004] 適配體（Aptamers)的研究是一個(gè)新的熱點(diǎn)領(lǐng)域，它是能夠與許多目標(biāo)分子（蛋 白，藥物，無機(jī)或有機(jī)分子）發(fā)生高親合性和特異性結(jié)合的一類單鏈核酸（DNA or RNA)。至 今發(fā)現(xiàn)高親和特異性適配體的方法是配體指數(shù)富集系統(tǒng)展開（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)。由于適配體與配體分子結(jié)合的高特異性 以及高親和性，在醫(yī)學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)和藥物研究等方面。Yuan等（Yuan L，et al，Anal Chem，2007,79(3) :1082)利用等離子體表面共振成像與適配子技術(shù)建立蛋白質(zhì)芯 片，檢測(cè)該蛋白質(zhì)芯片上吸附的蛋白抗體凝血酶、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)復(fù)合物。Cao等 (Cao X，et al，Nucleic Acids Res，2009,37(14) :4621-8)利用篩選出的針對(duì)金黃色葡萄 球菌的適配子來檢測(cè)金黃色葡萄球菌。
[〇〇〇5]目前國內(nèi)外大部分從事核酸適配體研究的科學(xué)家和生物技術(shù)公司主要將適配體 運(yùn)用于病毒感染、癌癥、自身免疫病、血管性疾病的臨床治療，并成為較為理想的臨床治療 的新手段。其治療機(jī)制主要是通過折疊成一定的三維結(jié)構(gòu)直接與病理學(xué)相關(guān)蛋白質(zhì)特異性 結(jié)合，抑制這些蛋白質(zhì)的活性，以達(dá)到治療目的。Feng Η等（Feng H，et al，PL〇S One，2011， 6(11) :e27862)篩選出了能與乙型肝炎病毒高親和力結(jié)合，干擾病毒Ρ-ε復(fù)合物形成的適 配體。但迄今尚無針對(duì)細(xì)菌外膜蛋白的適配體報(bào)道或公開，因此實(shí)有必要開發(fā)一種可特異 性結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明擬考慮將核酸適配體應(yīng)用于改變TolC蛋白結(jié)構(gòu)來有效阻塞大腸桿菌外排 泵外排活性。開發(fā)可特異性結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體，為抑制大腸桿菌多 重耐藥提供有力支持，具有重要的臨床價(jià)值。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種可特異結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。該 適配體具有如下序列：SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0 : 5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO: 17、SEQIDN0:18、SEQIDN0:19*SEQIDN0:20。
[0008] 具體的，所述 SEQ ID NO :1 為：5' -TGCGTGTTTACGTGTCGATGTCCGGGTACCCTCGG-3' ；
[0009] 所述 SEQ ID NO :2 為：5' -CTCTTAGCCATTTTGGTATGCGTATTGCTCTACAG-3' ；
[0010] 所述 SEQ ID NO :3 為：5, -ATATATTGCTCTGATCGTACTCTTATTAGGTTAGT-3,；
[0011] 所述 SEQ ID NO :4 為：5, -ATGACGCTGTGGTATTACGTCCTCCTGTATTTGCC-3,；
[0012] 所述 SEQ ID NO :5 為：5' -TCTAAGTGGAATCTACCACCAACGTATTTTTCCTC-3,；
[0013] 所述 SEQ ID NO :6 為：5' -TCCGCCTATTCGGGAGGGAATATTGCTGATTTGTA-3' ；
[0014] 所述 SEQ ID NO :7 為：5' -CTCTTCAGTTTTAGACAATGCACGTTTCAGCGGTG-3,；
[0015] 所述 SEQ ID NO :8 為：5, -TCCAGGCTATAATTTCTTGGAACTCCCTCCGTTAG-3,；
[0016] 所述 SEQ ID NO :9 為：5' -CTTTCGAAGGGACTTTAACGGGTATATCCGGTTTT-3' ；
[0017] 所述 SEQ ID NO :10 為：5' -ATTACATGCTCTGAGCTTTTTGTATGAGAAATGAT-3,；
[0018] 所述 SEQ ID NO :11 為：5, -CGCTTAGCTTGTGATTTCATCTTTCACACAAGAAT-3,；
[0019] 所述 SEQ ID NO :12 為：5' -CGGAGATCTGTTACACTTCGGTACGTCTTAGTTTG-3' ；
[0020] 所述 SEQ ID NO :13 為：5' -CTACCATGTTCAGTGGTTTTGGGATTTTCATACAT-3' ；
[0021] 所述 SEQ ID NO :14 為：5' -TGAGATCGGTGAGTTAGTATCTTTTATTCAGTTTT-3' ；
[0022] 所述 SEQ ID NO :15 為：5, -GCATTGCGTGACATGGCCTTGCTATCCCTGTTCGT-3,；
[0023] 所述 SEQ ID NO :16 為：5, -TCCTAAAAGCTAGTTATAGTAAATTGAAAACTTAG-3' ；
[0024] 所述 SEQ ID NO :17 為：5' -TGGAGCTTAGATTTTGAAGCAGTTACATTTCCCGA-3' ；
[0025] 所述 SEQ ID NO :18 為：5' -TACTGCGAGCTTCATTTTTACTTGGTAGTGTTGTG-3' ；
[0026] 所述 SEQ ID NO :19 為：5, -CGAACGAATATAATTATGGCGTCCCCGGGGTTTCG-3,；
[0027] 所述 SEQ ID NO :20 為：5' -CTAGTTATGACATTTGTGTCATTTATCCCACGCTG-3'
[0028] 本發(fā)明之大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體序列，通過下述方法制得：
[0029] 采用核酸適配體的體外SELEX篩選技術(shù)，以大腸桿菌外膜蛋白TolC為篩選靶標(biāo)， 從體外合成的隨機(jī)寡聚 DNA 文庫（5'-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGG ATC-3'）中篩選出與TolC蛋白特異結(jié)合的核酸適配體。
[0030] 優(yōu)選的，所述大腸桿菌外膜蛋白TolC采用如下方法純化得到：
[0031] 采用分子克隆技術(shù)，根據(jù)大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設(shè)計(jì)特異引物，所 述特異引物之上游引物Pa為5 ' -CGGGATCCATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTT - 3 '，其下游引物Pb 為 5' - CCGCTCGAGGTTACGGAAAGGGTTATGACCGTT - 3'，以全長 cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增，得到目 的基因經(jīng)Bam Η I和Xho I雙酶切，同樣處理PET-30a質(zhì)粒，再用T4連接酶連接制得含有 TolC基因的重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到液體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)固液分離，取沉淀用Tris-HCl溶液吹散，超聲粉碎，然后電泳； 柱層析分離純化蛋白質(zhì)。
[0032] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明之大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體序列的制備 方法是：
[0033] 采用分子克隆技術(shù)，根據(jù)大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設(shè)計(jì)特異引物，在 一個(gè)具體實(shí)施例中，該特異引物為上游引物Pa，下游引物Pb，以全長cDNA為模板，PCR擴(kuò)增。 得到目的基因經(jīng)Bam Η I和Xho I雙酶切，同樣處理PET-30a質(zhì)粒，再用T4連接酶連接制 得含有TolC基因的重組質(zhì)粒。
[0034] 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到1. 5ml LB液體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，IPTG(0. 5mM)誘導(dǎo)表達(dá)，取lml誘導(dǎo)的菌液，12000rpm，離心lmin，棄上清，沉淀用 50-100 μ 110mM Tris-HCl (pH8.0)溶液吹散（加入緩沖液的量視菌體量而定），超聲粉碎 (500W，30 次，每次 10s，間隔 15s)。加入 50μ 12Xloading buffer，100°C煮 5min，電泳。
[0035] 過鎳柱蛋白質(zhì)純化，分別收集蛋白峰，電泳檢測(cè)蛋白純化效果（純化結(jié)果見圖2)。
[0036] 隨后利用適配體的SELEX體外篩選技術(shù)，以收集純化后的TolC為篩選靶標(biāo)， 從體外合成的隨機(jī)寡聚 DNA 文庫（5 ' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGC CCGGATC-3'）中篩選出與TolC蛋白特異結(jié)合的核酸適配體，將篩選出來的序列用引物 Pl(5' GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3'）和引物 P2(5' -GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3'）進(jìn)行擴(kuò) 增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后取1μ 1，與載體PGM-T在T4DNA連接酶的作用下連接，再將其轉(zhuǎn) 化到感受態(tài)細(xì)胞，取適當(dāng)體積均勻涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素（Amp)的LA平板，12? 16小時(shí)后用接種環(huán)挑取篩選平板上的單個(gè)白色菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過 夜。取菌液lml于離心管中，封膜后送上海生工生物技術(shù)有限公司（以下簡稱上海生工） 測(cè)序。
[〇〇37] 所述序列選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來源的同樣的序列。
[0038] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述核酸適配體序列的用途，例如該序列在制備藥物或制品中 的應(yīng)用。在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供所述序列在制備大腸桿菌外排泵抑制劑中的應(yīng) 用。
[0039] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述核酸適配體序列在制備檢測(cè)TolC蛋白的探針或 靶點(diǎn)中的應(yīng)用。
[0040] 本發(fā)明還提供所述適配體在制備大腸桿菌外排泵抑制劑中的應(yīng)用。
[0041] 本發(fā)明還提供所述適配體在制備檢測(cè)TolC蛋白的探針或靶點(diǎn)中的應(yīng)用。
[0042] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種抑制大腸桿菌外排泵外排活性或減少大腸桿菌 外排泵外排的方法，包括給予有效量的所述的適配體。
[0043] 本發(fā)明中，所述的核酸序列構(gòu)成的適配體可與大腸桿菌外膜蛋白TolC特異性結(jié) 合，可用于外排泵抑制劑藥物的設(shè)計(jì)和制備。所述的核酸序列構(gòu)成的適配體也可以作為檢 測(cè)TolC蛋白的探針或靶點(diǎn)。本發(fā)明所提供的核酸適配體序列與作為靶標(biāo)的大腸桿菌外膜 蛋白TolC具有非常強(qiáng)的親和性，因而所述序列具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；此外，所述序列可以 大量快速地在體外合成，且制備方法簡單，因而比較容易獲得。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖1為適配體抑制大腸桿菌外排泵作用機(jī)理；
[0045] 圖2為大腸桿菌外膜蛋白TolC純化電泳圖；
【專利附圖】

【附圖說明】 [0046] ：
[0047] 圖2橫坐標(biāo)代表：泳道1為TolC上清；泳2為TolC沉淀；泳道Μ為蛋白marker ; 圖2縱坐標(biāo)代表：蛋白質(zhì)的分子量，單位kD。 【具體實(shí)施方式】
[〇〇48] 以下配合本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的 技術(shù)手段。
[0049] 本發(fā)明擬考慮將核酸適配體應(yīng)用于改變TolC蛋白結(jié)構(gòu)來有效阻塞大腸桿菌外排 泵外排活性，阻塞原理如圖1所示。開發(fā)針對(duì)大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體，將為 抑制大腸桿菌多重耐藥提供有力支持，具有重要的臨床價(jià)值。
[0050] 實(shí)施例1 :外臘蛋白TolC某閔擴(kuò)增
[0051] 采用分子克隆技術(shù)，根據(jù)大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設(shè)計(jì)特異引物（上 游引物Pa，其下游引物Pb)，以全長cDNA為模板，PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94°C，預(yù)變性 5min，然后以94 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)lwt%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。
[0052] 實(shí)施例2 :重纟目表汰質(zhì)粒的構(gòu)律
[0053] (1)得到目的基因經(jīng)Bam Η I和Xho I雙酶切，酶切體系如下：25μ 1質(zhì)粒，2μ IBam Η Ι，2μ1 Xho I，8yllOXBuffer，43yl ddH20,混合物37°C過夜反應(yīng)，用快速膠回收試劑 盒純化酶切產(chǎn)物。
[0054] (2)PET-30a質(zhì)粒經(jīng)Bam Η I和Xho I雙酶切，酶切體系如下：5μ 1載體（pET-30a) 質(zhì)粒，2μ1 BamH Ι，2μ1 Xho I，8yllOXBuffer，63yl ddH20,混合物 37°C 過夜反應(yīng)，用快 速膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。
[0055] (3)用T4連接酶連接大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因和PET_30a載體，獲得重 組質(zhì)粒。連接體系如下：lul載體（pET30a)，3ul PCR回收產(chǎn)物，4ul連接酶（Takara，DNA ligation Kit Ver2.0)，混勻，在室溫下反應(yīng)30min以上。
[0056] (4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21。取出一 80°C溫度保存的感受態(tài)細(xì)胞（BL21)， 放在冰上緩慢解凍。調(diào)2臺(tái)水浴鍋至水溫分別為42°C和37°C。將感受態(tài)細(xì)胞BL21加入連 接產(chǎn)物，冰上放置30分鐘。42°C熱激90秒。放回冰上，2分鐘后加入800ul無抗性的LB培 養(yǎng)基（卡那霉素）（購自上海生工）。放入37°C搖床中45分鐘，8000rpm離心3分鐘，棄大 部分上清，留約100-150ul重懸，選擇有相應(yīng)抗性的LB平板，涂板。晾干，于37°C培養(yǎng)箱中 倒置培養(yǎng)過夜。
[0057] 實(shí)施例3 :TolC蛋白在大腸桿菌中的表汰
[0058] 從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到1. 5ml LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，200rpm培養(yǎng)。將 培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到500mL LB液體培養(yǎng)基混合，37 °C，200rpm，培養(yǎng)至0D = 0. 6-0. 8， IPTG(0. 5mM)誘導(dǎo)4h。用400m大離心筒，6000rpm，離心5min，取上清。沉淀用20-30mll0mM Tris-HCl (pH8. 0)溶液吹散，超聲粉碎（500W，30次，每次10s，間隔15s)。取100 μ 1超聲后 的菌懸液，12000rpm，離心lOmin，分別得TolC上清和TolC沉淀，取50 μ ITolC上清至另一 EP管，TolC沉淀用50μll0mMTris-HClpH8·0)溶液吹散，加入50μl2Xloadingbuffer， 100°C煮5min，電泳。電泳圖如圖2所示。結(jié)果顯示在52kD處泳道1和2即TolC上清和 TolC沉淀均有一明顯增粗的蛋白質(zhì)條帶（如圖2所示）Μ為電泳技術(shù)常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)分子量 marker,目的條帶和Marker的那條帶位置相同就可以確定目的條帶的分子量，結(jié)果表明目 的蛋白在上清和沉淀中均有表達(dá)。
[0059] 實(shí)施例4 :蛋白質(zhì)鈍仆,
[0060] 用純水洗鎳柱至pH7. 0，后掛鎳至pH2-3。純水洗柱至pH7. 0， 用lOOmlTris-HCldOmM，pH8. 0)溶液平衡鎳柱，再用50ml含0. 5M氯化鈉的 10mMTris-HCl(pH8. 0)溶液平衡鎳柱。將樣品外膜蛋白TolC稀釋上樣，上樣結(jié)束后用0. 5M 氯化鈉的10mM Tris-HClpH8. 0)溶液洗柱，分別用含15mM咪唑、60mM咪唑、300mM咪唑的 10mM Tris-HCl (pH8. 0)(含0. 5M氯化鈉）溶液洗脫，收集300mM咪唑洗脫的蛋白峰。
[0061] 實(shí)施例5 :核酸適配體篩誅.（一輪）
[0062] 上海生工合成78個(gè)nt長度的隨機(jī)ssDNA文庫，上游為23個(gè)nt的引物結(jié)合位點(diǎn)， 下游為20個(gè)nt的引物結(jié)合位點(diǎn)，中間為35個(gè)nt的隨機(jī)序列，庫容量為435。ssDNA的序 列為：
[0063] 5 ' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ' 篩選過程中用于 PCR擴(kuò)增的DNA引物分別為：引物P1，引物P2。
[0064] (l)TolC蛋白溶于200μ 1PBS后加入96孔ELISA板中，4°C過夜。
[0065] (2)蛋白包被孔用PBS洗滌6次后，加入200 μ 13% BSA(購自上海生工），孵育2 小時(shí)。同時(shí)，空白96孔ELISA板中加入200 μ 13% BSA37°C孵育2小時(shí)。
[0066] (3)將隨機(jī)ssDNA文庫（首輪用量為800pmol)溶于200μ 11XSHCMK，95°C變性 5min。立即置于冰上10min，使其迅速降至室溫，避免ssDNA復(fù)性成雙鏈。
[0067] (4)將ssDNA加入PBS洗滌6次的空白ELISA孔中，37°C孵育2小時(shí)。
[0068] (5)上清轉(zhuǎn)入PBS洗滌6次的蛋白包被孔中，37°C孵育2小時(shí)后PBS洗滌6次。
[0069] (6)結(jié)合了 ssDNA的酶標(biāo)孔用200 μ 1洗脫緩沖液重懸，95°C加熱5min，取上清，經(jīng) 過乙醇沉淀DNA，溶于Millipore水中，作為下一輪篩選的模板。
[0070] (8)取5μ 1PCR產(chǎn)物上樣于5wt%瓊脂糖（購自上海生工），觀察條帶位置是否正 確。從首輪之后，投入的ssDNA次級(jí)庫的量逐漸減少，如此反復(fù)進(jìn)行12個(gè)循環(huán)。
[0071] 實(shí)施例6 :核酸話配體克降
[0072] 第12輪篩選產(chǎn)物的擴(kuò)增和純化：將第12輪篩選得到的ssDNA序列，用引物P1，弓丨 物P2進(jìn)行擴(kuò)增。100μ 1PCR擴(kuò)增后體系加入500pl結(jié)合液BB(20mmol/L Η印es(pH7. 35)， 120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/L CaC12，lmmol/LMgC12，l%BSA)，充分混勻。將上一 步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置lmin，12000rpm離心30? 60s，倒掉收集管中的廢液。加入700pmol漂洗WB (結(jié)合液ΒΒ+0. 05 % Tween20)，12000rpm 離心30s，棄掉廢液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄掉廢液。將吸附柱EC 放回空收集管中，12000rpm離心2min。取出吸附柱EC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜 的中間部位加 ΖΟρηιοΙθδ?水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12, OOOrpm離心lmin。 將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心lmin。
[0073] PCR純化產(chǎn)物的克?。喝? μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物，與載體PGM-T在T4DNA連接酶的作用下連 接，再將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，取適當(dāng)體積均勻涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素（Amp)(它 們分別購自于上海生工）的LA平板，倒置培養(yǎng)皿，于37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)進(jìn)行"藍(lán)-白斑 篩選"。
[0074] 測(cè)序：用接種環(huán)挑取篩選平板上的單個(gè)白色菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37°C 培養(yǎng)過夜。取菌液lml于離心管中，封膜后送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有20個(gè)核 酸適配體序列與大腸桿菌外膜蛋白TolC具有非常強(qiáng)的親和性，該20個(gè)序列分別是：
【權(quán)利要求】
1. 特異結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白Toic的核酸適配體，所述核酸適配體如SEQ ID NO :6所 示序列。
2. 按權(quán)利要求1所述的適配體，其特征在于，所述大腸桿菌外膜蛋白TolC采用如下方 法純化得到： 采用分子克隆技術(shù)，根據(jù)大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設(shè)計(jì)特異引物，所述特 異引物之上游引物Pa為5' -CGGGATCCATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTT - 3'，其下游引物Pb為 5' -CCGCTCGAGGTTACGGAAAGGGTTATGACCGTT - 3'，以全長 cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增，得到目的基 因經(jīng)Bam Η I和Xho I雙酶切，同樣處理PET-30a質(zhì)粒，再用T4連接酶連接制得含有TolC 基因的重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)固液分離，取沉淀經(jīng)超聲粉碎，然后電泳；再采用柱層析純化所述 大腸桿菌外膜蛋白TolC。
3. 按權(quán)利要1或2所述的適配體，其特征在于，所述序列為人工合成的序列，或任何其 他來源的同樣的序列。
4. 一種權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的適配體在制備大腸桿菌外排泵抑制劑中的應(yīng)用。
5. -種權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的適配體在制備檢測(cè)TolC蛋白的探針或靶點(diǎn)中的 應(yīng)用。
6. -種權(quán)利要求1所述的適配體在制備大腸桿菌外排泵抑制劑或制備檢測(cè)TolC蛋白 的探針或靶點(diǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK104087589SQ201410332602
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月28日
【發(fā)明者】李 杰, 陳伶利, 葛金文 申請(qǐng)人:湖南中醫(yī)藥大學(xué)