對于肺部病癥的治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及對于肺部病癥的治療。具體而言，本發(fā)明涉及治療個體的諸如支氣管肺發(fā)育不良或缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓的肺部病癥的方法和組合物，其包括向所述個體給藥有效量的一氧化氮前體，如瓜氨酸。
【專利說明】對于肺部病癥的治療
[0001] 本申請是2009年2月2日提交的發(fā)明名稱為"對于肺部病癥的治療"的中國專利 申請200980109150. 3的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請信息
[0003] 本專利申請基于2008年1月31日提交的美國臨時專利申請第61/025, 157號，并 要求其優(yōu)先權(quán)，該臨時專利申請的全部內(nèi)容援引加入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004] 本發(fā)明涉及肺部病癥，如例如嬰兒的支氣管肺發(fā)育不良（BPD)和慢性缺氧誘發(fā)的 肺動脈高壓的治療。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 支氣管肺發(fā)育不良（BPD)通常發(fā)生在嬰兒，尤其是早產(chǎn)兒身上，其特征為氧氣和/ 或機(jī)械通氣對肺的急性損傷，這導(dǎo)致了對肺泡和血管發(fā)育的干擾或抑制（Jobe等人（2001) Am J Respir Crit Care Medl63:1723-1729)。在動物模型中，吸入的N0促進(jìn)氣體交換和 肺結(jié)構(gòu)發(fā)育，但是對面臨BH)風(fēng)險的嬰兒使用這一療法是有爭議的（Ballard等人（2006)N Engl J Med355:343-353) 〇
[0007] 患有慢性肺病和紫紺型先天性心臟病的嬰兒通?；加腥毖?。由于慢性 缺氧對存在和發(fā)育中的肺動脈的作用，其導(dǎo)致肺循環(huán)功能和結(jié)構(gòu)的進(jìn)行性改變。 Shimoda L 等人，Physiol Res (2000) 49 :549-560 ;Subhedar，N.V.，Acta Paediatr suppl (2004) 444:29-32。最終，慢性缺氧導(dǎo)致嚴(yán)重的肺動脈高壓，其最終引發(fā)右側(cè)心力衰竭 和死亡。
[0008] 因此，治療諸如BH)和慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓的肺部病癥，尤其是在例如嬰 兒中的上述病癥的方法代表了本領(lǐng)域中長期和持續(xù)的需求。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明提供了治療個體的諸如支氣管肺發(fā)育不良（BPD)和慢性缺氧誘發(fā)的肺動 脈高壓的肺部病癥的方法和組合物。
[0011] 在某些實(shí)施方案中，向患有Bro和/或相關(guān)并發(fā)癥和/或面臨患有Bro和/或與 Bro有關(guān)的并發(fā)癥的風(fēng)險的個體給藥有效量的一氧化氮前體。在某些實(shí)施方案中，所述一氧 化氮前體包括瓜氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生瓜氨酸的前體、其藥學(xué)可接受的鹽及其組合中的至少一 種。在某些實(shí)施方案中，將諸如瓜氨酸的一氧化氮前體口服給藥。在某些實(shí)施方案中，將諸 如瓜氨酸的一氧化氮前體靜脈內(nèi)給藥。
[0012] 在某些實(shí)施方案中，向患有慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓和/或相關(guān)并發(fā)癥和/或 面臨患有慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓和/或與慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓有關(guān)的并發(fā)癥 的風(fēng)險的個體給藥有效量的一氧化氮前體。在某些實(shí)施方案中，所述一氧化氮前體包括瓜 氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生瓜氨酸的前體、其藥學(xué)可接受的鹽及其組合中的至少一種。在某些實(shí)施方 案中，將諸如瓜氨酸的一氧化氮前體口服給藥。在某些實(shí)施方案中，將諸如瓜氨酸的一氧化 氮前體靜脈內(nèi)給藥。
[0013] 因此，本發(fā)明旨在提供對個體的肺部病癥的治療。
[0014] 當(dāng)與附圖和下文詳細(xì)描述的實(shí)施例相聯(lián)系時，會隨著說明書的進(jìn)行而清楚本發(fā)明 的上述目的、其它目的。
[0015] 附圖簡述
[0016] 圖1為尿素循環(huán)的示意圖。
[0017] 圖2為實(shí)施例中所采用的研究步驟的流程圖。
[0018] 圖3為表示在對照小豬（η = 6)、慢性缺氧小豬（η = 11)和用L-瓜氨酸治療的 慢性缺氧小豬（η = 6)中的平均肺動脈壓的測量結(jié)果的條形圖。所有值均為平均值+SEM。 *與對照不同；+與慢性缺氧不同；Ρ〈〇· 05,事后比較檢驗(yàn)（post-hoc comparison test)的 AN0VA〇
[0019] 圖4為表示在對照小豬（η = 6)、慢性缺氧小豬（η = 11)和用L-瓜氨酸治療的慢 性缺氧小豬（η = 6)中計算的肺血管阻力的條形圖。所有值均為平均值+SEM。#與對照不 同；+與慢性缺氧不同；Ρ〈〇. 05,事后比較檢驗(yàn)的AN0VA。
[0020] 圖5為表示在對照小豬（η = 6)、慢性缺氧小豬（η = 11)和用L-瓜氨酸治療的 慢性缺氧小豬（η = 5)中呼出的一氧化氮的條形圖。所有值均為平均值+SEM。#與對照不 同；+與慢性缺氧不同；Ρ〈〇. 05,事后比較檢驗(yàn)的AN0VA。
[0021] 圖6為表示在對照小豬（η = 17)、慢性缺氧小豬（η = 9)和用L-瓜氨酸治療的慢 性缺氧小豬（η = 5)的肺灌注液中的亞硝酸鹽/硝酸鹽積累的條形圖。所有值均為平均值 +SEM。#與對照不同；+與慢性缺氧不同；ρ〈0.05,事后比較檢驗(yàn)的AN0VA。
[0022] 圖7Α為對照小豬（η = 3)、慢性缺氧小豬（η = 3)和用L-瓜氨酸治療的慢性缺氧 小豬（η = 3)的肺組織的肌動蛋白再探測的eNOS蛋白的免疫印跡圖像。
[0023] 圖7B為表示對照小豬（η = 3)、慢性缺氧小豬（η = 3)和用L-瓜氨酸治療的慢性 缺氧小豬（η = 3)的肺組織的歸一化為肌動蛋白的eNOS的光密度測定的條形圖。
[0024] 發(fā)明詳述
[0025] 早產(chǎn)是產(chǎn)科學(xué)和新生兒學(xué)的主要挑戰(zhàn)，其是新生兒中大部分的圍產(chǎn)期死亡率和 長期神經(jīng)病變的原因。Bro是可以與早產(chǎn)有關(guān)的許多并發(fā)癥之一。BH)可以與早產(chǎn)兒住 院時間延長、在生命最初的幾年中多次再住院和發(fā)育遲緩有關(guān)。幸運(yùn)的是，BPD目前在出 生體重超過l，200g或孕期超過30周的情況下并不常見（Jobe等人（2001)Am J Respir Crit Care Medl63:1723-1729)。定義為在末次月經(jīng)年齡36周時的氧需求的BPD的發(fā)病 率對于出生體重<l，〇〇〇g的嬰兒為約30% (Jobe等人（2001)Am J Respir Crit Care Medl63:1723-1729)。這些嬰兒中的一些患有嚴(yán)重的肺病，需要通氣和/或補(bǔ)充氧氣達(dá)數(shù)月 或者甚至數(shù)年之久。
[0026] 多種因素促成了 BPD，并且可能進(jìn)行累加或協(xié)同作用來促成損傷。傳統(tǒng)的觀 點(diǎn)認(rèn)為，BH)主要是由氧化劑介導(dǎo)的損傷和通氣介導(dǎo)的損傷引起的（Jobe等人（2001) Am J Respir Crit Care Medl63:1723-1729)。機(jī)械通氣和氧氣可以干擾早產(chǎn)兒的 肺泡和血管發(fā)育，并且促成了BH)的產(chǎn)生（Jobe等人（2001)Am J Respir Crit Care Medl63:1723-1729)。肺泡數(shù)目的減少可以導(dǎo)致表面積的大量減少，其與異形肺微血管系 統(tǒng)（dysmorphic pulmonary microvasculature)的減少有關(guān)。這些解剖學(xué)變化與呼吸道 樣品中白細(xì)胞和細(xì)胞因子水平的持續(xù)增加有關(guān)（Jobe等人（2001)Am J Respir Crit Care Medl63:1723-1729)。
[0027] 炎癥也可以在BPD的產(chǎn)生中起到作用。多種促炎癥和趨化性因子存在于通氣的 早產(chǎn)兒的氣腔中，并且在隨后產(chǎn)生BPD的嬰兒的氣腔中發(fā)現(xiàn)了更高濃度的這些因子（Jobe 等人（2001)Am J Respir Crit Care Medl63:1723-1729)。被認(rèn)為對 BPD 的產(chǎn)生具有重 要性的其它因素包括：鈴蟾肽樣肽、高氧、缺氧、營養(yǎng)不良、糖皮質(zhì)激素治療以及腫瘤壞死因 子-a、TGF- a、IL-6 或 IL-11 等細(xì)胞因子的過表達(dá)（Jobe 等人（2001) Am J Respir Crit Care Medl63:1723-1729)。
[0028] 診斷Bro通常包括在生命的初始幾周內(nèi)監(jiān)測嬰兒的呼吸，以發(fā)現(xiàn)肺部發(fā)育延緩以 及連續(xù)和/或增加的對輔助呼吸的依賴性的征兆。為了輔助BPD的診斷而進(jìn)行的診斷測 試可以包括：血氧測試、胸透和超聲心動圖。在月經(jīng)后36周時，當(dāng)嬰兒需要補(bǔ)充供氧時，通 常診斷為患有BPD。在BPD的診斷和定義中所用的較新的定義包括"輕微"、"中等"和"嚴(yán) 重" BPD 的具體標(biāo)準(zhǔn)（Ryan, R.M. (2006) J Perinatology26:207 - 209)。
[0029] 治療BH)可以包括多方面的治療所述病癥的癥狀并為嬰兒的肺部提供發(fā)育機(jī)會 的方法。目前可用的治療可以包括：給藥表面活性劑以改善肺通氣、用機(jī)械呼吸機(jī)補(bǔ)償呼吸 衰竭、補(bǔ)充供氧以確保充足的血氧、用支氣管擴(kuò)張藥物治療改善肺部氣流、用皮質(zhì)類固醇減 少呼吸道的腫脹和炎癥、通過流體控制以避免肺水腫、治療動脈導(dǎo)管未閉和適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)。
[0030] 通過吸入給藥一氧化氮對肺部發(fā)育的改善已在動物幼仔模型中得到證實(shí) (Ballard等人（2006)N Engl J Med355:343-353)。然而，通過吸入給藥N0對人類個體是 有爭議的。因此，根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，向患有BPD的個體給藥瓜氨酸或其他N0前 體從而增加體內(nèi)的N0合成可以為BH)治療提供N0吸入的替代選擇。
[0031] 由于慢性缺氧對存在和發(fā)育中的肺動脈的作用，其導(dǎo)致肺循環(huán)功能和結(jié)構(gòu)的 進(jìn)行性改變。Shimoda L 等人，Physiol Res (2000) ;49:549-560 ;Subhedar，N.V.，Acta Paediatr suppl(2004) ;444:29-32。最終，慢性缺氧導(dǎo)致嚴(yán)重的肺動脈高壓，其最終引發(fā) 右側(cè)心力衰竭和死亡。目前用于患有與持續(xù)性或間斷性缺氧有關(guān)的慢性心肺病癥的嬰兒的 肺動脈高壓的療法主要局限于改善根本的心肺病癥并試圖實(shí)現(xiàn)充分的氧合。Abman，S.H.; Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed(2002)87:F15-F18 ；Allen, J. and ATS subcommittee AoP, Am J Respir Crit Care Med(2003) 168:356-396 ；Mupanemunda, R. H. , Early Human Development(1997)47:247-262 ；Subhedar, N. V. , Acta Paediatr suppl (2004)444:29-32〇 因此，根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，提供了新的治療方法，其包括向患有慢性缺氧誘發(fā)的肺 動脈高壓的個體給藥瓜氨酸。
[0032] 瓜氨酸是尿素循環(huán)和產(chǎn)生一氧化氮（N0)的關(guān)鍵中間體。在尿素循環(huán)中，瓜氨酸是 從頭合成精氨酸的前體。可以通過精氨酸酶使精氨酸脫氨以產(chǎn)生尿素，其隨后可以被排泄 以清除身體的廢氮，特別是氨。或者，精氨酸可以通過一氧化氮合酶產(chǎn)生N0。就這點(diǎn)而論， 完整的尿素循環(huán)功能不僅對氨的排泄是重要的，而且對維持充分的精氨酸（N0前體）組織 水平也是重要的。
[0033] -氧化氮是利用精氨酸作為底物通過一氧化氮合酶合成的。N0合成的限速因素是 細(xì)胞精氨酸的利用率，并且用于N0合成的精氨酸的優(yōu)選來源是從瓜氨酸從頭合成。精氨酸 的體內(nèi)合成途徑以鳥氨酸開始。鳥氨酸與氨甲酰磷酸結(jié)合產(chǎn)生瓜氨酸，其又在三磷酸腺苷 的存在下與天冬氨酸結(jié)合產(chǎn)生精氨琥珀酸。在最終步驟中，延胡索酸從精氨琥珀酸斷開產(chǎn) 生精氨酸。精氨酸的降解途徑是通過精氨酸酶的水解作用產(chǎn)生鳥氨酸和尿素。這些反應(yīng)形 成了尿素循環(huán)。還參見圖1。
[0034] 作為用于尿素合成的降解的替代選擇，精氨酸可以通過一氧化氮合酶提供合成N0 所需的底物。另外，外源瓜氨酸可以進(jìn)入尿素循環(huán)并提供精氨酸的體內(nèi)合成，其隨后可以提 供N0合成。因此，向個體給藥瓜氨酸可以增加精氨酸合成，并且隨后增加 N0產(chǎn)生，從而預(yù)防 和/或治療Bro或慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓，所述個體包括但不限于對BH)或慢性缺氧 誘發(fā)的肺動脈高壓敏感或者診斷為患有Bro或慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓的個體。還可以 提供在體內(nèi)產(chǎn)生瓜氨酸的瓜氨酸前體。作為對瓜氨酸的替代選擇，可以提供其它N0前體。 例如，可以提供作為N0前體的精氨酸或在體內(nèi)產(chǎn)生精氨酸的前體。
[0035] I.治療方法
[0036] 本發(fā)明提供了增加個體中的N0合成的方法和組合物。在某些實(shí)施方案中，向個體 給藥有效量的瓜氨酸或其它N0前體以增加 N0合成。在某些實(shí)施方案中，所述N0前體選自 包括但不限于瓜氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生瓜氨酸的前體、精氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生精氨酸的前體或其組 合的組。在某些實(shí)施方案中，將瓜氨酸或其它N0前體口服給藥。在某些實(shí)施方案中，將瓜 氨酸或其它N0前體靜脈內(nèi)給藥。
[0037] 本發(fā)明還提供了治療個體的BH)和/或相關(guān)并發(fā)癥的方法和組合物。在某些實(shí)施 方案中，向患有Bro和/或相關(guān)并發(fā)癥和/或面臨患有與BH)有關(guān)的并發(fā)癥的風(fēng)險的個體 給藥有效量的瓜氨酸或其它N0前體。在某些實(shí)施方案中，所述N0前體選自包括但不限于 瓜氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生瓜氨酸的前體、精氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生精氨酸的前體或其組合的組。在某 些實(shí)施方案中，將瓜氨酸或其它N0前體口服給藥。在某些實(shí)施方案中，將瓜氨酸或其它N0 前體靜脈內(nèi)給藥。在某些實(shí)施方案中，待治療個體為患有與Bro有關(guān)的急性病癥的個體。上 文中公開了這些病癥的代表性實(shí)例。
[0038] 本發(fā)明還提供了治療個體的慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓和/或相關(guān)并發(fā)癥的方 法和組合物。在某些實(shí)施方案中，向患有慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓和/或相關(guān)并發(fā)癥和 /或面臨患有與慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓有關(guān)的并發(fā)癥的風(fēng)險的個體給藥有效量的瓜氨 酸或其它N0前體。在某些實(shí)施方案中，所述N0前體選自包括但不限于瓜氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生 瓜氨酸的前體、精氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生精氨酸的前體或其組合的組。在某些實(shí)施方案中，將瓜 氨酸或其它N0前體口服給藥。在某些實(shí)施方案中，將瓜氨酸或其它N0前體靜脈內(nèi)給藥。 在某些實(shí)施方案中，待治療個體為患有與慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓有關(guān)的急性病癥的個 體。上文中公開了這些這樣的病癥的代表性實(shí)例。
[0039] 在某些實(shí)施方案中，所述一氧化氮前體包括瓜氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生瓜氨酸的前體、其 藥學(xué)可接受的鹽及其組合的至少一種。參見圖1。在某些實(shí)施方案中，所述一氧化氮前體選 自包括但不限于瓜氨酸、精氨酸或其組合的組。在某些實(shí)施方案中，將諸如瓜氨酸的一氧化 氮前體口服給藥。在某些實(shí)施方案中，將諸如瓜氨酸的一氧化氮前體靜脈內(nèi)給藥。
[0040] 在某些實(shí)施方案中，所述個體患有低瓜氨酸血癥。在某些實(shí)施方案中，所述低瓜氨 酸血癥的特征在于血漿瓜氨酸水平為< 37 μ mol/升，在某些實(shí)施方案中為< 25 μ mol/升， 在某些實(shí)施方案中為< 20 μ mol/升，在某些實(shí)施方案中為< 10 μ mol/升，在某些實(shí)施方案 中為< 5 μ mol/升。
[0041] 在某些實(shí)施方案中，患有本文公開的病癥的個體還患有相對低瓜氨酸血癥 (relative hypocitrullinemia)。術(shù)語"相對低瓜氨酸血癥"指這樣的狀態(tài)，其中與未患有 病癥的個體相比，患有病癥的個體具有降低的血漿瓜氨酸。
[0042] 本文所用的短語"治療"是指為改善個體的病癥（例如，疾病過程開始后或者在損 傷后）、為改善個體的與病癥有關(guān)的并發(fā)癥而設(shè)計的干預(yù)措施，以及為預(yù)防個體的病癥發(fā)生 而設(shè)計的干預(yù)措施。換言之，術(shù)語"治療"及其語法變體旨在被廣義地解釋為涵蓋意指減少 病癥的嚴(yán)重性和/或治愈病癥的含義，以及意指預(yù)防的含義。在后一方面，"治療"可以指在 例如但不限于面臨罹患病癥的風(fēng)險的個體中"預(yù)防"至任何程度；或者以其它方式增強(qiáng)個體 抵抗病癥過程的能力。
[0043] 在本發(fā)明的許多實(shí)施方案中治療的個體期望地為人類個體，但是應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明 的原理表明本發(fā)明對于包括諸如哺乳動物和鳥類的溫血脊椎動物在內(nèi)所有脊椎動物物種 是有效的，其意圖被包括在術(shù)語"個體"中。在本文的語境中，哺乳動物被理解為包括期望 治療的任何哺乳動物物種，例如但不限于農(nóng)業(yè)哺乳動物物種和飼養(yǎng)哺乳動物物種。
[0044] 因此，本發(fā)明提供了對諸如人的哺乳動物的治療，以及對以下哺乳動物的治療，其 由于瀕臨絕種而對人類具有重要性（例如西伯利亞虎）、對人類具有經(jīng)濟(jì)重要性（為人類食 用而在農(nóng)場飼養(yǎng)的動物）和/或?qū)θ祟惥哂猩鐣匾裕ㄗ鳛閷櫸锘蛟趧游飯@中飼養(yǎng)），例 如除人以外的食肉動物（如貓和狗）、豬（swine)(小豬（pig)、肉豬（hog)和野豬）、反芻動 物（例如牛（cattle)、閹牛（oxen)、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝）和馬。本發(fā)明還 提供了對鳥類的治療，包括對瀕臨滅絕的鳥、飼養(yǎng)在動物園中的鳥，以及家禽（fowl)，更特 別的是馴養(yǎng)家禽，即諸如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞等家禽（poultry)的治療，因?yàn)樗鼈円矊?人類具有經(jīng)濟(jì)重要性。因此，本發(fā)明提供了對家畜的治療，所述家畜包括但不限于家豬（小 豬和肉豬）、反芻動物、馬、家禽等。II.藥物組合物
[0045] 將有效劑量的本發(fā)明的組合物向有此需要的個體給藥。"有效量"是足以產(chǎn)生可測 量的反應(yīng)（例如正在接受治療的個體中的生物或臨床相關(guān)的反應(yīng)）的組合物的量?？梢愿?變本發(fā)明的組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平，從而以有效實(shí)現(xiàn)特定個體的期望治療反 應(yīng)的量將活性化合物給藥。所選的劑量水平取決于治療組合物的活性、給藥途徑、與其它藥 物或療法的組合、被治療的病癥的嚴(yán)重性以及被治療的個體的病癥和既往醫(yī)療史。以示例 而非限制的方式，組合物的劑量可以以低于實(shí)現(xiàn)期望療效所需的水平開始，并且逐漸地增 加劑量直至實(shí)現(xiàn)期望的效果。組合物的效力可以變化，因此"有效量"可以變化。
[0046] 閱讀了本文所提供的本發(fā)明的公開內(nèi)容之后，考慮到具體制劑、用所述組合物實(shí) 施的給藥方法以及治療的具體疾病，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以為單獨(dú)的個體制定劑量。劑量的 進(jìn)一步計算可以考慮個體的身高和體重、性別、癥狀的嚴(yán)重性和階段，以及其它有害身體病 癥的存在。
[0047] 以其它實(shí)例的方式，可以與載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量取決于 待治療個體和具體給藥方式而變化。例如，意圖向人類給藥的制劑可以含有與合適且方便 的量的載體材料混合的〇. 5mg至5g的活性劑，所述載體材料可以為全部組合物的約5% 至約95%不等。例如，在成人中，每人每次給藥的劑量通常為lmg至500mg，并且每天多達(dá) 數(shù)次。因此，單位劑型通常含有約lmg至約500mg的活性成分，通常為25mg、50mg、100mg、 200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg 或 lOOOrng 的活性成分。
[0048] 在某些實(shí)施方案中，以約0· Olmg至約1，OOOrng的劑量將一氧化氮前體給藥，在某 些實(shí)施方案中，劑量為約0. 5mg至約500mg，并且在某些實(shí)施方案中，劑量為約l.Omg至約 250mg。在某些實(shí)施方案中，還可以以約lOOmg至約30,000mg的劑量將一氧化氮前體給藥， 并且在某些實(shí)施方案中，劑量為約250mg至約1，OOOmg。代表性劑量為3. 8g/m2/天的精氨 酸或瓜氨酸（摩爾當(dāng)量，麗L-瓜氨酸175. 2,麗L-精氨酸174. 2)。
[0049] 代表性的靜脈內(nèi)瓜氨酸溶液可以包括100mg/ml (10% )的溶液。代表性的靜脈內(nèi) 瓜氨酸劑量可以包括200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg和800mg/kg。在某些實(shí)施方案中，所述 劑量例如但不限于600mg/kg或800mg/kg，可以將所述劑量減少50mg/kg至100mg/kg的量 以緩和所觀察到的對全身血壓的不期望作用。在某些實(shí)施方案中，在諸如1天的給定時間 內(nèi)，可以給藥一次或多次的劑量。
[0050] 在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含有效地升高血漿瓜氨酸水平以治療個體的本 文公開的病癥的量的瓜氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述水平是通過將待治療個體的血漿瓜 氨酸水平與在未患有所述病癥的個體中所觀察到的血漿瓜氨酸水平進(jìn)行比較而測定的。在 某些實(shí)施方案中，瓜氨酸的量將個體的血漿瓜氨酸水平有效升高到至少5 μ mol/升，任選 至少10 μ mol/升，任選至少20 μ mol/升，任選至少25 μ mol/升，以及任選約37 μ mol/升。
[0051] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含一氧化氮前體和藥學(xué)可接 受的載體，如在人類中藥學(xué)可接受的載體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物， 其包含上述劑量的瓜氨酸或精氨酸。
[0052] 通常以單位劑量制劑（dosage unit formulation)將本發(fā)明的組合物口服或胃腸 外給藥，所述制劑視需要含有標(biāo)準(zhǔn)無毒的藥學(xué)可接受的載體、佐劑和媒介物（vehicle)。本 文所用的術(shù)語"胃腸外"包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
[0053] 根據(jù)已知技術(shù)，利用合適的分散劑或潤濕劑及助懸劑配制諸如無菌注射水性或油 性懸浮液的注射制劑。所述無菌注射制劑還可以為在無毒可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌 注射溶液或懸浮液，例如，1，3- 丁二醇中的溶液。
[0054] 可用的可接受的媒介物和溶劑中包括水、林格溶液（Ringer' s solution)和等滲 氯化鈉溶液。另外，通常將無菌非揮發(fā)油用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了該目的，可以使用包括 合成甘油單酯或甘油二酯在內(nèi)的任何溫和的非揮發(fā)油。此外，諸如油酸的脂肪酸可用于注 射劑的制備。示例性載體包括用磷酸鹽、乳酸鹽、Tris等緩沖的中性鹽溶液。
[0055] 在代表性實(shí)施方案中，可以在相關(guān)治療期間向個體給藥若干次的劑量，其包括但 不限于1、2、3、4、5、6或更多次的劑量。
[0056] 然而，應(yīng)當(dāng)理解，對于任何特定個體的具體劑量水平取決于多種因素，其包括年 齡、體重、一般健康、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速率、藥物組合以及在治療的特 定疾病的嚴(yán)重性。 實(shí)施例
[0057] 本發(fā)明包括以下實(shí)施例以示例本發(fā)明的代表性方式。根據(jù)本公開內(nèi)容和本領(lǐng)域的 一般技術(shù)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況 下采用多種變化、修改和改變，以下實(shí)施例僅僅旨在示例。
[0058] 實(shí)施例1-4
[0059] 下列實(shí)施例評價在將新生小豬暴露于10天的慢性缺氧期間，口服補(bǔ)充L-瓜氨酸 是否會預(yù)防肺動脈高壓的產(chǎn)生和NO產(chǎn)生的隨之減少。
[0060] 實(shí)施例1-4所用的方法
[0061] 動物護(hù)理
[0062] 將總共17只缺氧小豬和17只對照小豬進(jìn)行研究。參見圖2。在從農(nóng)場抵達(dá)的當(dāng) 天研究12天大的對照動物。將缺氧的豬（2天大）置于常壓的缺氧室中達(dá)10天至11天。 利用壓縮空氣和氮?dú)馓峁┏喝毖跻援a(chǎn)生8-11 %的吸入氧氣（P0260-72T〇rr)，并且通過用 堿石灰的吸收來將C0 2保持在3-6T〇rr。監(jiān)測動物的每日體重并且每日體檢兩次。用籠中 飼喂裝置的豬乳替代物隨意地飼養(yǎng)它們。
[0063] L-瓜氨酸補(bǔ)充
[0064] 將17只缺氧小豬中的6只在缺氧暴露的第一天開始口服補(bǔ)充L-瓜氨酸。參見圖 2。以0.13-gm/千克體重的劑量，利用注射器每日口服遞送兩次來提供L-瓜氨酸補(bǔ)充。如 果研究人員覺得小豬沒有攝入大部分的劑量，則重復(fù)該步驟。利用〇. 13克每升蒸餾水的濃 度的制劑（Sigma Pharmaceuticals, St. Louis, Missouri, United States of America,純 度98% )來混合L-瓜氨酸，并且當(dāng)完全溶解時，將該溶液通過0. 20微米過濾器。
[0065] 體內(nèi)血流動力學(xué)
[0066] 在對照小豬中的6只和全部缺氧小豬中測量體內(nèi)血流動力學(xué)。參見圖2。對于這 些測量，將這些動物稱重，然后用氯胺酮（15mg/kg)和乙酰丙嗪（2mg/kg)進(jìn)行肌肉內(nèi)預(yù)麻 醉。然后利用用于鎮(zhèn)靜的靜脈內(nèi)戊巴比妥，如以前所描述進(jìn)行氣管造口術(shù)，置入靜脈和動脈 導(dǎo)管以及熱敏電阻。Fike，C.D.等人，J Appl Physiol (2000)88:1797-1803。測量肺動脈 壓、左心室舒張末期壓以及心輸出量。通過熱稀釋技術(shù)（9520型熱稀釋法心輸出量計算機(jī)， Edwards Laboratory, Irvine, California, United States of America),利用主動脈弓中 的熱敏電阻以及作為注入孔的左心室導(dǎo)管來測量心輸出量。在呼氣末將心輸出量測量為 3ml普通鹽水（0°C)的3次注射的平均值。如下所述測量呼出的N0。在體內(nèi)測量期間，利 用活塞型通氣機(jī)以15-20cc/kg的潮氣量、2mmHg的終末呼氣壓以及每分鐘15-20次呼吸的 呼吸速率，用室內(nèi)空氣將動物通氣。
[0067] 呼出的一氧化氮測量
[0068] 對于被麻醉的動物中的呼出N0測量，如前所述，每3分鐘時間段將呼出氣體取 樣 2 至 3 次，并通過化學(xué)發(fā)光分析儀（270B 型 Ν0Α ;Sievers, Boulder, Colorado, United States of America)來測量 NO 濃度。Fike,C.D.等人，American Journal of Physiology(Lung，Cellular and Molecular Physiologyl8)(1998)274:L517_L526。利用 每分鐘通氣量和所測量的呼出的NO濃度來計算呼出的NO產(chǎn)量（nmol/min)。
[0069] 分離的肺灌注物
[0070] 在37 °C下，將肺分離，并用含有mol. wt.為70, 000的5 %葡聚糖的克雷 布-林格碳酸氫鹽（Krebs Ringer bicarbonate, KRB)溶液進(jìn)行原位灌注，并且如前 所述地用常氧氣體混合物（21 % 02和5 % C02)進(jìn)行通氣。Fike，C.D.等人，J Appl Physiol (2000)88:1797-1803。將肺灌注30-60min直至達(dá)到穩(wěn)定的肺動脈壓。然后在60 分鐘的時間段內(nèi)，每l〇min從左心房插管中除去灌注液樣品（lml)。將灌注液樣品離心，并 且將上清液貯存在_80°C下以用于下述以后的亞硝酸鹽/硝酸鹽（NOf)濃度分析。在灌 注末尾，測量保留在回路和儲氣泡中的灌注液體積。在某些情況下，在灌注后立即收集肺組 織，將其用液氮冷凍，然后貯存于-80度下以用于下述以后的eNOS含量測量。NCV測量
[0071] 在每次收集時間，使用前述化學(xué)發(fā)光分析來測定灌注液NOx^濃度〇1111〇1/1111)。 Fike，C.D.等人，J Appl Physiol (2000) 88:1797-1803 ;Turley，J.E.等人，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2003)284:L489-L500。將灌注液（20μ1)注入化學(xué)發(fā)光 NO 分析 儀（170B型N0A，Sievers)的反應(yīng)室中。該反應(yīng)室含有在1M HC1中的氯化釩（III)，其被 加熱到90°C以將亞硝酸鹽和硝酸鹽還原為N0氣體。利用恒定的N2氣流，通過含有用于除 去HC1蒸汽的1M NaOH的除泡器（gas bubble trap)將N0氣體帶入分析儀中。通過向蒸 餾水中添加已知量的NaN03，并且如所述地測定灌注樣品來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0072] 通過以下方法計算每次收集時間的灌注液N0x^濃度〇1111〇1/1111):將樣品收集時間 時的灌注液N0x ^濃度乘以樣品收集時間時的體系體積（灌注回路+儲藏），加上所有以前 樣品除去的N0f的量。從與灌注液中N0f的量比收集時間段的最初60分鐘的時間擬合 的線性回歸線的斜率來測定Ν0χ_的產(chǎn)生速率。
[0073] 血漿氨基酸測量
[0074] 在血流動力學(xué)測量和/或肺灌注研究的當(dāng)天，對于對照動物與用L-瓜氨酸治療和 未治療的慢性缺氧動物，在開始研究之前抽取血液，并將血漿在-80度下冷凍以用于以后 的氨基酸水平測定。對于用L-瓜氨酸治療的缺氧動物，獲得血液樣品的時間為L-瓜氨酸 的最后給藥后約12小時，因此其為低谷水平。在某些用L-瓜氨酸治療的動物（η = 3)中， 對低谷水平血液取樣后，通過經(jīng)鼻胃管給予一次劑量的L-瓜氨酸。在該次給藥之后，在90 分鐘（體內(nèi)研究的時間長度）的每30分鐘抽取血液樣品。將全部樣品離心，收集血漿并 在-80度下冷凍以用于氨基酸分析。
[0075] 通過無蛋白提取物的氨基酸分析來測定血漿瓜氨酸和精氨酸的濃度。利用 Hitachi L8800 氨基酸分析儀（Hitachi USA, San Jose, California, United States of America)，通過陽離子交換色譜來分離氨基酸。在測試小豬樣品前進(jìn)行分析儀的校準(zhǔn)。
[0076] 肺組織中EN0S的蛋白質(zhì)印跡
[0077] 利用前述標(biāo)準(zhǔn)免疫印跡技術(shù)，我們分析了來自對照動物（η = 3)、未治療的缺氧 動物（η = 3)以及用L-瓜氨酸治療的缺氧動物（η = 3)的全肺勻漿樣品的eNOS。我 們使用了 10微克總蛋白、1:500的第一 eNOS抗體稀釋液（BD轉(zhuǎn)導(dǎo)）和1:5000的與辣 根過氧化物酶結(jié)合的第二抗小鼠抗體稀釋液。Fike，C.D.等人，American Journal of Physiology (Lung, Cellular and Molecular Physiologyl8) (1998)274:L517-L526〇
[0078] 計算和統(tǒng)計學(xué)
[0079] 從體內(nèi)血流動力學(xué)測量計算肺血管阻力：（肺動脈壓-左心室舒張末期 壓）+ (心輸出量/體重）。
[0080] 將數(shù)據(jù)表示為平均值+SE。使用具有Fisher保護(hù)的最小顯著差異（Fisher' s protected least significant difference) (PLSD)的單向AN0VA事后比較測試來比較對照 動物、未治療的缺氧動物和用L-瓜氨酸治療的缺氧動物之間的數(shù)據(jù)。將小于0. 05的p值 視為顯著。Meier, U.，Pharm Stat (2006) 5:253-263。
[0081] 實(shí)施例1
[0082] 體內(nèi)血流動力學(xué)測量
[0083] 在12-13天大的動物的研究當(dāng)天，與年齡相當(dāng)?shù)膶φ招∝i相比，用L-瓜氨酸治療 的缺氧動物和未治療的缺氧動物均具有較低的心輸出量和重量以及較高的LVEDP測量值 (表1)。組群中的主動脈壓和血?dú)庵笖?shù)的測量值類似（對照小豬中的pa02S74+5T〇rr，未 治療的缺氧小豬中的pa0 2為74+8T〇rr，用L-瓜氨酸治療的缺氧小豬中的pa02為78+7T 〇rr ; 對照小豬中的paC02為39+2,未治療的缺氧小豬中的paC02為41+4,用L-瓜氨酸治療的缺 氧小豬中的paC02為30+1. 0)。明顯地，如圖3所示，與未治療的缺氧動物相比，用L-瓜氨 酸治療的缺氧動物具有明顯較低的肺動脈壓（P值為0.01)。在常氧對照動物和用L-瓜氨 酸治療的缺氧動物之間的肺動脈壓并無不同（P = 〇. 08)。
[0084] 另外，如圖4所示，在用L-瓜氨酸治療的這些缺氧動物中計算的肺血管阻力 (0. 071 ±0.003)明顯低于未治療的缺氧動物的肺血管阻力（p值為0.001)。而且，用L-瓜 氨酸治療的缺氧動物與常氧對照動物的肺血管阻力類似（P值為〇. 07)。
[0085] 實(shí)施例2
[0086] 呼出的N0輸出量和灌注液N0X_
[0087] 如圖5所示，對照動物與用L-瓜氨酸治療的缺氧動物中的呼出的NO輸出量高于 未治療的缺氧動物中的呼出的N0輸出量（p值分別為0. 001和0. 032)。然而，對照動物與 用L-瓜氨酸治療的缺氧動物之間呼出的N0輸出量并無差別（p = 0. 124)。
[0088] 如圖6所示，與未治療的缺氧動物的肺相比，對照動物（p = 0. 02)和用L-瓜氨酸 治療的缺氧動物（P = 0.04)的肺具有明顯更高的NOf積累速率。而且，用L-瓜氨酸治療 的缺氧動物的肺與常氧對照動物的肺的Ν0χ_積累速率并無差別。
[0089] 實(shí)施例3
[0090] 血漿氨基酸
[0091] 如表2所示，盡管沒有達(dá)到統(tǒng)計顯著性（p = 0.05)，但是未治療的缺氧小豬中的 血漿L-瓜氨酸水平低于治療過的缺氧小豬中的低谷L-瓜氨酸水平。而且，當(dāng)在給藥后 90分鐘抽取時，治療過的缺氧動物的L-瓜氨酸水平幾乎是未治療的缺氧動物的2倍（p = 〇. 001)。然而，不管抽取樣品的時間如何，當(dāng)與未治療的缺氧動物相比，用L-瓜氨酸治療的 慢性缺氧動物中的血漿精氨酸水平不會更高。
[0092] 實(shí)施例4
[0093] 肺EN0S蛋白的蛋白質(zhì)印跡
[0094] 如圖7A和7B所示，存在于對照動物的肺組織中的eNOS蛋白的量明顯高于存在于 未治療的缺氧動物的肺中的eNOS蛋白的量。而且，存在于用L-瓜氨酸治療的缺氧小豬的肺 組織中的eNOS蛋白的量與未治療的缺氧動物的肺組織中的eNOS蛋白的量沒有明顯差異， 并且明顯低于對照動物中的eNOS蛋白水平。
[0095] 表1對照小豬、慢性缺氧小豬和用L-瓜氨酸治療的慢性缺氧小豬的數(shù)據(jù)
[0096] N =動物數(shù)目，值為平均值土SEM，*p〈0. 05比對照，事后比較檢驗(yàn)的AN0VA
[0097]

【權(quán)利要求】
1. 治療支氣管肺發(fā)育不良的方法，所述方法包括向有此需要的個體給藥有效量的一氧 化氮前體。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一氧化氮前體選自瓜氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生瓜氨酸 的前體、精氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生精氨酸的前體及其組合。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述給藥包括口服給藥、靜脈內(nèi)給藥及其組合。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個體為嬰兒。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述嬰兒為早產(chǎn)兒。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述一氧化氮前體以約lOOmg至約30, OOOmg的劑 量給藥。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中將所述一氧化氮前體以約250mg至約1，OOOmg的劑 量給藥。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個體患有低瓜氨酸血癥，其特征在于血漿瓜氨 酸水平為彡37 μ mol/升。
9. 治療慢性缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓的方法，所述方法包括向有此需要的個體給藥有效 量的一氧化氮前體。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一氧化氮前體選自瓜氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生瓜氨酸 的前體、精氨酸、在體內(nèi)產(chǎn)生精氨酸的前體及其組合。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述給藥包括口服給藥、靜脈內(nèi)給藥及其組合。
12. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述個體為嬰兒。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述嬰兒為早產(chǎn)兒。
14. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中將所述一氧化氮前體以約lOOmg至約30, OOOmg的 劑量給藥。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中將所述一氧化氮前體以約250mg至約1，OOOmg的 劑量給藥。
16. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述個體患有低瓜氨酸血癥，其特征在于血漿瓜氨 酸水平為彡37 μ mol/升。
17. 藥物組合物，其包含藥學(xué)可接受的載體以及有效升高血漿瓜氨酸水平以治療個體 的支氣管肺發(fā)育不良或缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓的量的瓜氨酸，其中所述水平是通過將待治 療個體的血漿瓜氨酸水平與在未患有支氣管肺發(fā)育不良或缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓的個體 中所觀察到的血漿瓜氨酸水平進(jìn)行比較而測定的。
18. 如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中瓜氨酸的量將個體的血漿瓜氨酸水平有效 升高到至少5 μ mol/升，任選至少10 μ mol/升，任選至少20 μ mol/升，任選至少25 μ mol/ 升，以及任選約37 μ mol/升。
19. 如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物適合于靜脈內(nèi)或口服給 藥。
【文檔編號】A61K31/198GK104083352SQ201410300705
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2009年2月2日 優(yōu)先權(quán)日:2008年1月31日
【發(fā)明者】馬歇爾·L.·薩默, 弗雷德里克·E.·巴爾, C·D·菲克, J·L·阿施納 申請人:范德比爾特大學(xué)