人白細胞介素ii突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人白細胞介素II突變體、及其在制備藥物中的應(yīng)用，在人白細胞介素II原生體的氨基酸序列中，與α受體和/或β受體結(jié)合點發(fā)生突變；降低所述人白細胞介素II與α受體的親和力，從而降低了誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞的功能，減少能引起肺水腫的副作用，并且增強與β受體的親和力，保留人白介素II對自然殺傷細胞免疫活性的屬性。本發(fā)明是人白細胞介素II突變體可用于刺激免疫系統(tǒng)，增強抑制腫瘤生長功能，從而提高其臨床療效和應(yīng)用范圍。
【專利說明】人白細胞介素 I I突變體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人白介素 II突變體，尤其涉及一種低毒、高效、副作用小的人白 細胞介素 II突變體及其在制備生物醫(yī)藥中用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 白細胞介素 II (interleukin-2，IL_2,白介素 II)是T淋巴細胞分泌的一種淋巴 因子(人白介素 II由133個氨基酸組成的蛋白質(zhì)多肽鏈，分子量為15KD，其氨基酸序列如本 發(fā)明序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示)，是維持免疫系統(tǒng)中正常功能的最重要分子 之一。白介素 II能促進T細胞成熟、維持T細胞活性，還能促進細胞毒性T淋巴細胞的活 性，并使其轉(zhuǎn)化為腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL)，促進自然殺傷（NK)細胞的活性，并誘導(dǎo)殺傷腫 瘤的淋巴因子細胞和殺傷細胞（CTL)的增長。白介素 II具有增強人體免疫功能，激活自然 殺傷細胞，擴增T淋巴細胞的作用，能誘導(dǎo)和激活淋巴因子激活的殺細胞（LAK)及腫瘤浸潤 淋巴細胞，這些細胞都有殺傷外源微生物感染細胞以及癌變細胞的作用。W099/60128A1對 白介素 II的作用進行了詳細介紹。
[0003] 由于白介素 II具有顯著的增強免疫作用，故它有很好的抗病毒、抗癌作用和廣泛 的臨床應(yīng)用潛力。通過促進T細胞和NK細胞成熟和增殖，白介素 II具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫 的功效，研究發(fā)現(xiàn)白介素 II對腎細胞癌、黑素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌有較明顯 療效，對肝癌、軟巢癌、頭頸部鱗癌、膀胱癌、肺癌等有不同程度的療效，并早已被FDA批準 用于黑色素瘤和腎細胞癌的臨床治療。在我國白介素 Π 也已廣泛應(yīng)用于臨床癌癥治療和 病毒感染。
[0004] 目前已有大量關(guān)于IL-II藥物制劑的報道，如US5358708、US4604377、US5417970 等公開的水性制劑或凍干粉劑。
[0005] 但是，同時白介素 II在臨床上有許多毒副作用。在低劑量下，白細胞介素 II促進 淋巴細胞殺死腫瘤功能微小，但是它卻明顯地促進調(diào)節(jié)性T細胞功能，增加外周血調(diào)節(jié)性 T細胞（T抑制細胞）（⑶4+⑶25+細胞）的數(shù)量（JEM201:723-735)，進一步抑制浸潤淋巴細 胞的功能和增殖，并抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)（JI26:85-93);在高劑量下，白細胞介素 II能引 起病人疼痛、高燒、惡心、嘔吐、肺水腫、血管滲漏、甚至死亡（JC021:3127-3132)。由于具有 殺死腫瘤細胞和促進抑制細胞的雙重功能，目前，白介素 II的臨床應(yīng)用因其嚴重毒性而受 到很大限制，據(jù)估計，僅有20%左右的相關(guān)疾病患者能夠采用白介素 II進行治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決人白介素 II副作用明顯的缺陷，本發(fā)明提供了一種低毒高效副作用小 的人白介素 II突變體，同時保持了激活自然殺傷細胞及腫瘤浸潤淋巴細胞功能，從而擴大 其在臨床上的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明第一個方面是提供一種人白細胞介素 II突變體，包括一種序列，所述序列 為人白細胞介素 Π 氨基酸序列中，在與人白細胞介素 II的α和/或β受體結(jié)合點發(fā)生 突變的序列；其中，與α受體結(jié)合點的突變降低所述人白細胞介素 II與α受體的親和力； 與β受體結(jié)合點的突變增強與β受體的親和力。
[0008] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述結(jié)合點選自人白細胞介素 II氨基酸序列的 37、38、41-45、61、62、65、68、72、80、81、85、86、92位點中的任意一個或多個。
[0009] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述發(fā)生突變的結(jié)合點至少為3個，更優(yōu)選為至 少為5個，更優(yōu)選為至少為6個。
[0010] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述發(fā)生突變的結(jié)合點至少包括人白細胞介素 II 氨基酸序列的65、80、81、85、86、92位點。
[0011] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述突變包括氨基酸的缺失或者替代，并優(yōu)選為 人白細胞介素 II序列中的相應(yīng)的氨基酸被其它不同氨基酸替代。
[0012] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述突變至少包括：人白細胞介素 II氨基酸序列 的65位點的氨基酸Pro被氨基酸Arg替代。
[0013] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述突變至少包括：人白細胞介素 II氨基酸序列 的80位點的氨基酸Leu被氨基酸Phe替代。
[0014] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述突變至少包括：人白細胞介素 II氨基酸序 列的81位點的氨基酸Arg被氨基酸Asp替代。
[0015] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述突變至少包括：人白細胞介素 II氨基酸序列 的85位點的氨基酸Leu被氨基酸Val替代。
[0016] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述突變至少包括：人白細胞介素 II氨基酸序列 的86位點的氨基酸lie被氨基酸Val替代。
[0017] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述突變至少包括：人白細胞介素 II氨基酸序列 的92位點的氨基酸lie被氨基酸Phe替代。
[0018] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述人白細胞介素 II突變體包括序列表SEQ ID No. 3的氨基酸序列。
[0019] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述人白細胞介素 II突變體為序列表SEQ ID No. 3的氨基酸序列，或者包括SEQ ID No. 3氨基酸序列的融合蛋白。
[0020] 本發(fā)明第二個方面是提供一種合成所述人白細胞介素 II突變體的方法，包括：
[0021] 合成表達所述人白細胞介素 II突變體氨基酸序列的基因，并將所述基因重組至 表達載體；
[0022] 用表達載體轉(zhuǎn)染宿主，進行人白細胞介素 II突變體的生產(chǎn)。
[0023] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述宿主可以是任意能夠接納所述表達載體的真 核細胞。
[0024] 所述真核細胞可以是動物細胞、植物細胞、人類細胞中的任意一種或幾種，并優(yōu)選 為動物細胞和人類細胞中的任意一種或幾種，如肌細胞、肝細胞、紅細胞、卵巢細胞等。
[0025] 本發(fā)明第三個方面是提供一種藥物，所述藥物至少包括所述人白細胞介素 II突 變體。
[0026] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述藥物優(yōu)選為注射劑型，如溶液、乳液、懸液、粉 齊U (更優(yōu)選為凍干粉劑）等。
[0027] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述藥物中還可以包括載體蛋白。
[0028] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述藥物還可以包括輔料，如pH值調(diào)節(jié)劑、防凍 齊?、表面活性劑(如增溶劑、助懸劑等)、助溶劑、抗氧劑、抑菌劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑(如氯化鈉、 葡萄糖)、填充劑。
[0029] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述藥物還可以包括第二活性成分，所述第二活 性成分可以是治療活性成分、減少刺激的活性成分中的任意一種或幾種。
[0030] 所述減少刺激的活性成分優(yōu)選為止痛劑、去熱感劑等中的任意一種或幾種。
[0031] 本發(fā)明所述的藥物可以是用于治療病毒、桿菌和寄生菌感染的藥物，治療癌癥及 其并發(fā)癥的藥物，免疫調(diào)節(jié)劑，疫苗，治療自身免疫性疾病的藥物中的任意一種或幾種。
[0032] 其中，所述病毒、桿菌和寄生菌可以是乙肝病毒、流感病毒、結(jié)核病毒、甲肝病毒、 丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒、皰疹病毒、狂犬病毒、艾滋病毒、白色念珠菌等。
[0033] 其中，所述癌癥可以是腎癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、淋巴癌、直腸癌、肺 >rg· 寺。
[0034] 其中，所述自身免疫性疾病可以是甲亢、糖尿病、肌無力、肝硬化、類風濕性關(guān)節(jié) 炎、系統(tǒng)性脈管炎、天皰瘡、皮肌炎、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍等。
[0035] 應(yīng)當理解的是，本發(fā)明上述各個方面及其各種優(yōu)選實施例，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人 員不受限制的的進行任意組合，并且所述組合也包含在本
【發(fā)明內(nèi)容】
范圍內(nèi)。
[0036] 本發(fā)明人白細胞介素 II突變體，相比于原生體，在與α受體結(jié)合的位點上發(fā)生突 變，降低α受體（CD4CD25)和白介素 II的親和力，從而進一步影響促進調(diào)節(jié)性Τ細胞的能 力，所以減弱α受體結(jié)合的白介素 II基因突變將有減少促進抑制Τ細胞增殖活性的功能。 同時，本發(fā)明突變體減少了對肺上皮細胞α受體的結(jié)合，從而降低和消除高劑量引起肺水 腫的毒副作用。
[0037] β受體結(jié)合點突變主要表達在自然殺傷（ΝΚ)細胞，淋巴因子細胞和殺傷細胞的 表面。通過80,81，85,86和92氨基酸位點的突變，結(jié)構(gòu)變化的白介素 II增強與β受體結(jié) 合的結(jié)合，因此可提高和促進免疫細胞殺傷腫瘤細胞能力。
[0038] 實驗結(jié)果表明，本發(fā)明通過對人白細胞介素 II氨基酸序列進行定點突變，降低了 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性Τ細胞的功能，減少或消除其毒副作用，同時保留了白介素 II對自然殺傷細胞 免疫活性的屬性，因此白介素 II的突變體可刺激免疫系統(tǒng)，增強抑制腫瘤生長功能，增加 其抑制體內(nèi)固體腫瘤生長的效用，從而提高其臨床療效和應(yīng)用范圍。
[0039] 本發(fā)明可單獨作為藥物或疫苗進行疾病的治療和預(yù)防，或者與其它治療方法進 行組合，如在手術(shù)后作為免疫調(diào)節(jié)劑使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明人白介素 II突變體（mutat IL-2)與人白介素 II原生體（native IL-2)免疫反應(yīng)效果對比；其中，圖1A為NK細胞活性，圖1B為⑶8細胞活性，圖1C為⑶4 和⑶25細胞活性，圖1D為⑶25細胞數(shù)量對比；
[0041] 圖2為小白鼠注射本發(fā)明人白介素 II突變體（mutat IL-2)與人白介素 II原生 體（native IL-2)之后對肺水腫的影響對比；
[0042] 圖3為本發(fā)明人白介素 II突變體（mutat IL-2)與人白介素 II原生體（native IL-2)抗腫瘤效果對比。

【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明一種實施例中，對照本發(fā)明序列表SEQ ID No. 2 (人白介素 II原生體）和 SEQ ID No. 3 (本發(fā)明人白介素 II突變體)，所述突變體與原生體相比，突變位置和替代氨 基酸如下：
[0044] 表1，本發(fā)明本發(fā)明人白介素 II突變體的突變位點和替代氨基酸
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種人白細胞介素 II突變體，其特征在于，包括一種序列，所述序列為人白細胞介 素 II氨基酸序列中，在與人白細胞介素 II的α和/或β受體結(jié)合點發(fā)生突變的序列；其 中，與α受體結(jié)合點的突變降低所述人白細胞介素 II與α受體的親和力；與β受體結(jié)合 點的突變增強與β受體的親和力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人白細胞介素 II突變體，其特征在于，所述結(jié)合點選自人白 細胞介素 Π 氨基酸序列的37、38、41-45、61、62、65、68、72、80、81、85、86、92位點中的任意 一個或多個。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人白細胞介素 II突變體，其特征在于，所述發(fā)生突變的結(jié)合 點至少為3個。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的人白細胞介素 II突變體，其特征在于，所述發(fā)生突變的結(jié)合 點至少為6個。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的人白細胞介素 II突變體，其特征在于，所述發(fā) 生突變的結(jié)合點至少包括人白細胞介素 II氨基酸序列的65、80、81、85、86、92位點。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人白細胞介素 II突變體，其特征在于，所述突變至少包括下 述的一種或幾種： 人白細胞介素 II氨基酸序列的65位點的氨基酸Pro被氨基酸Arg替代； 人白細胞介素 II氨基酸序列的80位點的氨基酸Leu被氨基酸Phe替代； 人白細胞介素 II氨基酸序列的81位點的氨基酸Arg被氨基酸Asp替代； 人白細胞介素 II氨基酸序列的85位點的氨基酸Leu被氨基酸Val替代； 人白細胞介素 II氨基酸序列的86位點的氨基酸lie被氨基酸Val替代； 人白細胞介素 II氨基酸序列的92位點的氨基酸lie被氨基酸Phe替代。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1述的人白細胞介素 II突變體，其特征在于，所述人白細胞介素 II突 變體包括序列表SEQ ID No. 3的氨基酸序列。
8. -種合成權(quán)利要求1所述人白細胞介素 II突變體的方法，其特征在于，包括： 合成表達所述人白細胞介素 II突變體氨基酸序列的基因，并將所述基因重組至表達 載體； 用表達載體轉(zhuǎn)染宿主，進行人白細胞介素 II突變體的生產(chǎn)。
9. 一種藥物，其特征在于，所述藥物至少包括權(quán)利要求1所述人白細胞介素 II突變體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于，所述藥物還可以包括選自載體蛋白、輔 料、第二活性成分的組分。
【文檔編號】A61K39/39GK104231068SQ201410040477
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】劉根桃, 岳喜連 申請人:蘇州發(fā)士達生物科技有限公司