細(xì)胞及組織的冷凍保存用組合物的制作方法
【專利摘要】提供可不使用二甲基亞砜等的有害的冷凍保存劑地安全地冷凍保存包括人的動物或植物的細(xì)胞或組織的冷凍保存用組合物。另外，提供向食品或藥品的冷凍保存或冷凍干燥制品的應(yīng)用。使ε-聚-L-賴氨酸與無水琥珀酸反應(yīng)使而阻斷ε-聚-L-賴氨酸的氨基的60%以上。將如此得到的高分子化合物以7.5w/w%溶解于市售的培養(yǎng)液之一的Dulbecco-改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中而作為冷凍保存液。另外，向食品或藥品添加0.5～10%ε-聚-L-賴氨酸琥珀酸衍生物而防止冷凍濃縮。
【專利說明】細(xì)胞及組織的冷凍保存用組合物
[0001]本申請是分案申請，母案的申請?zhí)枮?00980130709.0 (國際申請?zhí)朠CT/JP2009/002941),申請日為2009年6月26日，發(fā)明名稱為“細(xì)胞及組織的冷凍保存用組合物”。
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0002]本發(fā)明涉及人及動物細(xì)胞及組織的冷凍保存用試劑，其能減輕在冷凍及解凍細(xì)胞及組織時對細(xì)胞及組織的損傷或傷害。此冷凍保存技術(shù)預(yù)期在需要冷凍保存活的組織(例如皮膚，角膜，胰島及心臟瓣膜)的移植醫(yī)學(xué)中，及在需要冷凍保存細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞，間葉干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，iPS細(xì)胞(誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)等)的再生醫(yī)學(xué)中高度需求。
【【背景技術(shù)】】
[0003]在0°C或以下溫度的冷凍保存技術(shù)常規(guī)用于長-時間保存帶水的或含水物質(zhì)(例如植物及動物的細(xì)胞及組織以及食品)。已知冷凍這些物質(zhì)時，冰晶形成，得到不均勻濃度的被水分子排除的溶質(zhì)及混入物，稱為‘冷凍濃縮’。
[0004]為阻止冷凍濃縮，可將各低分子量化合物加入冷凍保存介質(zhì)。例如，加入二甲基亞砜(DMS0)，甘油等作為冷凍-保護(hù)劑，以最小化由冷凍保存過程中細(xì)胞中的結(jié)晶化的水導(dǎo)致的對細(xì)胞及組織的損傷。
[0005]因此，細(xì)胞通常懸浮于冷凍管中的含5~20%冷凍保存劑(例如DMS0，甘油，乙二醇及丙二醇)的生理溶液，培養(yǎng)基中，及于低溫，_80°C或_196°C保存。
[0006]這些試劑中，DMSO是最有效的及常采用的，但其在生理學(xué)上有毒，及已知當(dāng)將細(xì)胞輸注到受者時導(dǎo)致高血壓，惡心及嘔吐。而且，DMSO毒性傾向于衰減解凍的細(xì)胞培養(yǎng)或輸注到受者身體后細(xì)胞的存活率和/或功能。
[0007]這些試劑中，甘油具有更低冷凍保存效果，及要求僅于室溫或非冷凍低溫保持細(xì)胞懸浮液后冷凍，或通過使用程序冷凍器等精確控制降低的溫度。而且，因為它們對細(xì)胞生存及功能的低保護(hù)效果，所述冷凍保存劑對解凍的細(xì)胞有害。
[0008]冷凍保存干細(xì)胞(例如胚胎干細(xì)胞或iPS細(xì)胞)或生殖細(xì)胞(例如精子，未受精的或受精卵)中，用高濃度的冷凍保護(hù)劑(例如DMS0，乙酰胺，丙二醇及聚乙二醇)進(jìn)行快速冷凍或玻璃化。玻璃化快速致使細(xì)胞內(nèi)水成為玻璃化狀態(tài)，以避免冰晶形成所致的對細(xì)胞的傷害或損傷。還是，細(xì)胞或組織被濃的冷凍保存劑的高毒性損傷非常可能；因此，此技術(shù)僅在一些有限情況中采用。
[0009]制備藥學(xué)產(chǎn)品，食品及用于展示目的的冰雕中，使用例如氯化鈉或糖，葡萄糖及海藻糖的添加劑。也使用其他由生 物(例如植物，魚及昆蟲)制得的例如抗冷凍蛋白或抗冷凍糖蛋白的添加劑(特開2005-126533及特開2003-250506)。
[0010]燃料電池中，水通過電化學(xué)反應(yīng)在任何一個電極產(chǎn)生。例如，在質(zhì)子-交換膜燃料電池中，水在陰極電極產(chǎn)生；及產(chǎn)生的一部分水通過電解質(zhì)膜向陽極側(cè)移動。水也將從進(jìn)入電池的氣體中的蒸汽冷凝產(chǎn)生。這些水潛在地阻礙氣流，耗竭氣體本身的供給及最終降低電池表現(xiàn)。這些錯雜可通過用親水包被材料(例如蛋白)處理氣體分隔物表面，由此限制水冷凝來防止，但液體水甚至在所述條件下于低溫偶爾冷凍導(dǎo)致其他錯雜。為防止此問題，將有抗冷凍蛋白的聚合物電解質(zhì)加入樹脂層，其然后包被聚合物電解質(zhì)膜表面(下列Adler等人)，但此方法具有高成本的問題。
[0011]【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】
[0012]【專利文獻(xiàn)】
[0013]【專利文獻(xiàn)I】特表平10-511402
[0014]【專利文獻(xiàn)2】專利第3694730號
[0015]【專利文獻(xiàn)3】特開2005-126533
[0016]【專利文獻(xiàn)4】特開2003-250506
[0017]【專利文獻(xiàn)5】特開2008-041596
[0018]【非專利文獻(xiàn)】
[0019]【非專利文獻(xiàn)I】 Lovelock JE and Bishop MWH, Nature 183:1394-1395,1959
[0020]【非專利文獻(xiàn)2】Polge C，Smith AU, Parkes AS, Nature 164:666-666,1949
[0021]【非專利文獻(xiàn)3】Miszta_Lane H,Gill P,Mirbolooki M,Lakey JRT.Cell PreservTechnol5, 16-24，2007
[0022]【非專利文獻(xiàn)4】H·a SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY.HumanReproduction20, 1779-1786,2005
[0023]【非專利文獻(xiàn)5】Yu HN, Lee YR, Noh EM, et al.1NT JHEMAT0L = 87: 189-194; 2008
[0024]【非專利文獻(xiàn)6】Adler S, Pellozzer C, Paparella M, Hartung T, Bremer
S.Toxicol in Vitro20:265-271 ；2006
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0025]【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】
[0026]常規(guī)冷凍保存方法(包括快速冷凍技術(shù))在冷凍及解凍后不可保存細(xì)胞或組織的完全結(jié)構(gòu)完整性；因此，非常需要有低毒性的新冷凍保存物質(zhì)。而且，已知DMSO誘導(dǎo)細(xì)胞(例如HL-60細(xì)胞)分化；因此，其不適于某些類型的細(xì)胞。抗冷凍蛋白及糖蛋白具有優(yōu)良的保存能力，但用于食物成本太高(JPYl，300，000YEN/g),更別提用于細(xì)胞及組織。
[0027]本發(fā)明旨在提供具有優(yōu)良的保護(hù)效果及對于細(xì)胞或組織的低毒性的冷凍保存劑，從而取代DMSO。本發(fā)明也旨在提供廉價的及安全的具有類似于抗冷凍蛋白及糖蛋白的阻止冷凝的性質(zhì)的冷凍保存劑，從而以使冷凍保存及冷凍干燥物質(zhì)(例如食品及藥學(xué)產(chǎn)品)。
[0028]【解決課題的技術(shù)方案】
[0029]本發(fā)明的冷凍保存液包括:基本上I~50%的具有側(cè)鏈氨基的聚胺；及生理溶液(例如鹽水或培養(yǎng)基)。
[0030]【發(fā)明效果】
[0031]通過將各動物細(xì)胞(包括人細(xì)胞)及植物細(xì)胞浸入冷凍保存液然后于_80°C冷凍保存或用液體或蒸汽氮冷卻下，而能不使用高度毒性DMSO或其他常規(guī)冷凍保存劑而保持它們的存活率及生物活性地保存。因為未使用常規(guī)冷凍保存劑(例如DMS0，甘油，乙二醇)等，對細(xì)胞的毒性保持低，及能不降低細(xì)胞的生物活性地長時間冷凍保存細(xì)胞。而且，冷凍保存液無蛋白成分(例如胎牛血清及白蛋白)，因此，無感染疾病的擔(dān)憂，及不受偶爾見于由生物材料制成的藥學(xué)產(chǎn)品的巨大變化的影響。
[0032]具有側(cè)鏈氨基的聚胺(例如ε -聚-L-賴氨酸及聚烯丙胺)由于側(cè)鏈氨基而具有與細(xì)胞膜的親和力，因此，認(rèn)為具有細(xì)胞保護(hù)效果。具有豐富的羧基的聚合物化合物也具有與水的高親和性，因此，將在冷凍過程中，將細(xì)胞內(nèi)水輔助移出到周圍的培養(yǎng)基，由此預(yù)期具有冷凍保存效果。以足夠的比例兼有氨基及羧基的聚合物化合物預(yù)期在冷凍時具有對細(xì)胞的進(jìn)一步改善的冷凍保存效果。因此，本發(fā)明以提供具有高有效性及高安全性的冷凍保存液為目標(biāo)，銳意研究了具有陽離子基團(tuán)(例如側(cè)鏈氨基)的聚合物化合物(例如聚氨基酸)，或具有陰離子基團(tuán)(例如羧酸基)的聚合物化合物、以及兼有陽離子及陰離子基團(tuán)的聚合物化合物的條件或要求。
[0033]本發(fā)明的冷凍保存劑相比DMSO毒性小，及不要求細(xì)胞或組織解凍后洗滌。然后可將解凍的細(xì)胞或組織直接懸浮于培養(yǎng)基中，以立即開始培養(yǎng)處理。
[0034]可根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定地進(jìn)行實驗用培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存；及而且期望能通過保持功能細(xì)胞(例如胰島及干細(xì)胞(例如ES細(xì)胞，間葉干細(xì)胞及iPS細(xì)胞))的細(xì)胞功能來保存。因此，預(yù)期改善這些細(xì)胞的移植效率。
[0035]通過使用本發(fā)明的非冷凍聚-氨基酸，能阻止具有生理物質(zhì)的帶水物質(zhì)的冷凍過程中的生理物質(zhì)的鈍化。而且，通過使用非冷凍聚-氨基酸，可在通過帶水或含水物質(zhì)的冷凍或冷凍干燥來獲得冷凍的產(chǎn)品或冷凍干燥的產(chǎn)品的過程中達(dá)到不同于水分子的成分的均勻擴(kuò)散。冷凍的產(chǎn)物可為冰淇淋，果汁牛奶凍，其他冷凍甜食，展覽用冰，速凍湯等；及冷凍干燥產(chǎn)品可為冷凍干燥的粉末形式的食品或藥學(xué)產(chǎn)品。
[0036]本發(fā)明的非冷凍試劑也可應(yīng)用于工業(yè)用燃料電池，以阻止它們的由于液體冷凍的起始表現(xiàn)的劣化。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
`[0037]圖1是顯示ε -聚-L-賴氨酸中阻斷的氨基的百分率與通過使用氨基通過琥珀酸酐部分阻斷的ε -聚-L-賴氨酸冷凍保存的有活力的L929細(xì)胞的百分率之間的關(guān)系的坐標(biāo)圖；
[0038]圖2是顯示部分阻斷的聚-L-賴氨酸的濃度與通過使用已以相當(dāng)于ε -聚-L-賴氨酸的氨基的63%的摩爾量加入琥珀酸酐的ε -聚-L-賴氨酸(PLL琥珀酸酐63%)冷凍保存的有活力的L929細(xì)胞的百分率之間的關(guān)系的坐標(biāo)圖；
[0039]圖3-1是顯示已在10%DMS0/胎牛血清中冷凍，然后解凍及不洗滌或稀釋地立即培養(yǎng)于平板24小時的L929細(xì)胞的培養(yǎng)物的顯微鏡圖像；
[0040]圖3-2是顯示已在含63%琥珀酸酐的7.5%PLL溶液中冷凍，然后解凍及不洗滌或稀釋地立即轉(zhuǎn)移到平板24小時的L929細(xì)胞的培養(yǎng)物的顯微鏡圖像；
[0041]圖4是顯示在含63%琥珀酸酐和10%DMS0/胎牛血清的7.5%PLL溶液中冷凍的大鼠間葉干細(xì)胞(RMSC)，及就它們的分化為骨，脂肪體，及軟骨的多能性進(jìn)行評估的一組坐標(biāo)圖。包括未冷凍的及未分化的細(xì)胞用于比較。
[0042]圖5是顯示通過在30%蔗糖水溶液中加入0.1~15%PLL( ε -聚-L-賴氨酸)(PLL琥珀酸酐63%)防止冰重結(jié)晶的一系列顯微鏡圖像。[0043]圖6是顯示冷凍的不含琥珀酸酐的5%PLL溶液(ε -聚-L-賴氨酸)及含63%琥珀酸酐的5%PLL溶液(PLL琥珀酸酐63%)中的晶體結(jié)構(gòu)的顯微鏡圖像。
[0044]圖7是冷凍干燥的瓊脂凝膠的照片(I )。左邊的凝膠是無添加劑，及右邊的具有含63%琥珀酸酐的5%PLL。
[0045]圖8是冷凍的-解凍的瓊脂凝膠的照片(2)。含63%琥珀酸酐的PLL濃度是0%(左)，1% (中)及3% (右)。
[0046]【實施方式】
[0047]通過在生理溶液中溶解I~50w/w% ;優(yōu)選2~20w/w%,特別優(yōu)選3~15w/w%,及更優(yōu)選5~10w/w%的聚合物(例如聚-賴氨酸)來得到本發(fā)明的冷凍保存液。待使用的生理溶液是生理鹽水以及用于培養(yǎng)各細(xì)胞及組織的培養(yǎng)基。例如，Dulbecco-改良的eagleMEM培養(yǎng)基(DMEM)可為優(yōu)選的培養(yǎng)基之一。代之以，或除了聚-賴氨酸之外，可使用聚烯丙胺。代替這些，或除了這些之至少一種之外，待使用的化合物選自:其他聚胺(例如導(dǎo)入氨基的多糖類)及聚-氨基酸(例如聚-精氨酸，聚-谷氨酸及聚-天冬氨酸)；也選自葡聚糖，糊精，支鏈淀粉及脫乙酰殼多糖的多糖化合物，以及聚羧酸(例如聚丙烯酸)。這些聚合物中，優(yōu)選的是具有可通過在相同單體分子中兼有陽離子及陰離子取代基的單體化合物的聚合獲得的結(jié)構(gòu)的聚合物；及尤其優(yōu)選的是聚-氨基酸。更特別是，尤其優(yōu)選的是具有兼有氨基及羧基的重復(fù)單元的聚合物。
[0048]待使用的聚-賴氨酸可為ε -聚-L-賴氨酸或ε -聚-D-賴氨酸或α -聚-L-賴氨酸。冷凍保護(hù)劑聚合物具有100與100，000之間的分子量。最優(yōu)選的聚合物落入常規(guī)用作食品添加劑的一組ε-聚-L-賴氨酸。這些或者是通過酶合成的或通過鏈霉菌屬真菌產(chǎn)生的，及具有1000~20，0 00的平均分子量，及特別具有1000~10，000的平均分子量(http://www.chiss0.c0.jp/fine/jp/polylisin/index, html)，嘗試產(chǎn)生有變動于 15 ~35之間的聚合度，及有20或更低聚合度(例如，特開2003-171463及特開2005-318815)。平均分子量或平均聚合度可容易通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過例如使用由Atto有限公司提供的電泳設(shè)備及密度計(AE-6920V型)測量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記物用于測量?？蔁崽幚砭?賴氨酸，以增加其分子量大于30，000及用作聚合物化合物。但是，以上提及的分子量范圍由于隨著分子量的增加的粘度而優(yōu)選。因為具有游離末端羧基的聚-賴氨酸具有側(cè)鏈伯氨基，它們的如下文所述的通過二羧酸酐的部分酰胺化大大給出優(yōu)良的混合性及增溶表現(xiàn)。也可根據(jù)本發(fā)明采用的其他特別有利的聚合物化合物是平均分子量1000~1，000, 000，優(yōu)選1000~20，000的聚烯丙胺。例如，所述可采用的聚合物是:向烯丙胺聚合物(日東紡織有限公司的PAA-03)的水溶液加入乙酸酐或乙酸；及部分-甲氧基-羰基化的烯丙胺聚合物(日東紡織有限公司的PAA-U5000)。烯丙胺聚合物，如同聚-賴氨酸，僅具有側(cè)鏈基團(tuán)伯氨基，但每單位分子量的伯氨基密度相比在聚-賴氨酸中，在烯丙胺聚合物中更大。而且，當(dāng)烯丙胺部分羧化時，得到的聚合物化合物認(rèn)為如同后述部分-羧化的聚-賴氨酸發(fā)揮作用。
[0049]優(yōu)選地，聚胺的氨基通過用羧酸酐羧基化或乙?；瘉聿糠肿钄唷４俗钄嗤ㄟ^氨基的羧化或乙?；羶?yōu)選50-99mol%，特別50~93mol%，更優(yōu)選50~90mol%，再更優(yōu)選為55~80mol%,及最優(yōu)選58~76mol%的程度來進(jìn)行。約50%的氨基將通過與52~53mol%的無水羧酸(相對于聚胺中氨基的摩爾量)反應(yīng)來阻斷。正常反應(yīng)條件下，當(dāng)與100mol%無水羧酸反應(yīng)時，將阻斷90~95%的氨基。以上提及的范圍以上或以下的阻斷率將降低冷凍保存效果。本文中可采用的羧酸酐包括:乙酸酐，檸檬酸酐，琥珀酸酐，戊二酸酐，蘋果酸酐，富馬酸酐及蘋果酸酐。這些中，特別優(yōu)選琥珀酸酐及乙酸酐。
[0050]但是，也可使用氨基未阻斷而處于游離狀態(tài)的聚胺；因此可采用的羧化及乙酰化程度跨O~100mOl/mOl%的范圍。本發(fā)明中，可使用部分羧基胺化的聚羧酸。更特別是，聚羧酸可通過使其羧基與化合物(例如二胺，三胺及聚胺)反應(yīng)來部分胺化?？刹捎玫亩肥且叶芳磅ｋ拢缂憾岫ｋ?。這些氨基化合物與羧酸的反應(yīng)以與碳二亞胺的加成反應(yīng)方式進(jìn)行。這種情況下，可采用在O~100mOl/mOl%范圍內(nèi)的胺化作用程度。如同氨基阻斷，殘留羧基的百分率優(yōu)選在50~99mol%范圍內(nèi)，更優(yōu)選在60~97mol%范圍內(nèi)，其中，殘留百分率是胺化的羧酸基的殘留百分比。例如，使用具有平均分子量1000~3，000，000,或尤其是1000~10，000的聚丙烯酸；及I~50mol%的，優(yōu)選3~40mol%的聚丙烯酸的羧基用胺類及碳二亞胺(例如乙二胺二酰肼等)阻斷。本發(fā)明的冷凍保存液也可含0.3~15w/w%,或尤其是0.1~50w/w%的常規(guī)冷凍保存物質(zhì)，例如DMS0，甘油，乙二醇，海藻糖或蔗糖。因為細(xì)胞在冷凍及解凍期間經(jīng)受氧化應(yīng)激所致的損傷，將抗氧化劑添加到冷凍保護(hù)劑預(yù)期提高其保存效果。例如，可使用抗氧化劑，例如過氧化氫酶，過氧化物酶，超氧化物歧化酶，維生素E，維生素C，多酚(例如表沒食子兒茶酚沒食子酸酯)或谷胱甘肽。
[0051 ] 本發(fā)明的冷凍保存劑的滲透壓是200~1000m0sm/kg，更優(yōu)選為300~700m0sm/kg,及還優(yōu)選400~600m0sm/kg。本發(fā)明的冷凍保存劑可應(yīng)用于保存不僅細(xì)胞，而且組織。所述待用冷凍保存劑冷凍保存的細(xì)胞及組織之例是培養(yǎng)的細(xì)胞系，動物及人來源的受精卵。進(jìn)一步例為:精子細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，iPS細(xì)胞，間葉干細(xì)胞，造血干細(xì)胞，神經(jīng)元干細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞及血細(xì)胞。不僅可包括動物或人細(xì)胞，而且包括植物細(xì)胞。能通過根據(jù)本發(fā)明的冷凍保存劑保存的組織及器官是皮膚，神經(jīng)，血管，軟骨，角膜，肝，腎，心臟及胰島。
[0052]而且，以上提及的聚合物化合物也可應(yīng)用于通過將聚合物化合物加入食品或藥物用含水或帶水物質(zhì)，以避免冷凍濃縮及由此獲得成分均勻擴(kuò)散的冷凍的或冷凍干燥的產(chǎn)品來產(chǎn)生冷凍的或冷凍干燥的`食品或藥物。特別可采用通過與琥珀酸酐，乙酸酐或其他羧酸酐反應(yīng)來用羧化或乙?；钄喟被倪x自下列的化合物:ε -聚-L-賴氨酸，α -聚-L-賴氨酸，聚精氨酸，其他聚氨基酸，胺化的多糖類及聚烯丙胺。沒必要使用生理溶液溶解聚合物化合物。例如，將具有部分阻斷的氨基的聚-賴氨酸，其他聚-氨基酸或胺化的聚-糖加入前述用于冰淇淋或冷凍干燥的食品的帶水的或含水物質(zhì)，從而聚合物化合物的濃度成I~15%。用此方式，冷凍濃縮被阻止。如果將琥珀酸酐用于阻斷聚合物基團(tuán)，則當(dāng)相當(dāng)于氨基的50~85mol%的摩爾量的琥珀酸酐與聚合物反應(yīng)時(其中實際氨基-阻斷率在約48~80mol%的范圍內(nèi))，得到阻止冷凍濃縮的優(yōu)良效果。
[0053]上述聚合物化合物可在工業(yè)用燃料電池中應(yīng)用，從而將聚合物化合物加入燃料電池，以阻止它們的起始表現(xiàn)的劣化(可在起始時以別的方式液體冷凍所致)。更特別是，可采用具有氨基的單元形成的聚合物化合物，其選自:ε-聚-L-賴氨酸，α-聚-L-賴氨酸，聚精氨酸，其他聚氨基酸，胺化的多糖類及聚烯丙胺；其中聚合物化合物的氨基通過羧化或乙酰化，通過與琥珀酸酐，乙酸酐或其他羧酸酐反應(yīng)來阻斷；及聚合物化合物可加入暴露于燃料電池內(nèi)側(cè)的表面層材料。例如，聚合物化合物可以I~15w/w%摻入形成分隔物或固體電解質(zhì)膜表面的涂層材料，或尤其是UV固化性樹脂液體。
[0054]【實施例】
[0055]以下示本發(fā)明的實施例以及比較例，但本發(fā)明不限于以下實施例。
[0056]【實施例1:冷凍保存溶液的制備】
[0057]使用ε-聚-L-賴氨酸(由Chisso公司制造；分子量:4000)的25%水溶液；及使用聚烯丙胺(Nittobo，分子量 5000 [PAA-05L]，15000 [PAA-L], 60000 [PAA-H])的 20% 水溶液。相對于聚胺聚合物的氨基，向各溶液均加入O~100mol%琥珀酸酐(和光純藥工業(yè)制)，以獲得有具有不同氨基-阻斷率的阻斷的氨基的聚-胺類。將各聚-胺溶液加入Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma Aldrich)至O~10w/w%。此時，將培養(yǎng)基pH用IN鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)至7.0~8.0。而且，用蒸汽壓滲透壓計(5型520，Wescor)測量培養(yǎng)基滲透壓及用10%氯化鈉水溶液調(diào)節(jié)。
[0058]【實施例2:培養(yǎng)的細(xì)胞的冷凍保存】
[0059]在冷凍瓶(SimportPlastics)中，將 IX IO6 細(xì)胞的 L929, MG63, Caco-2 (大日本住友制藥)，Colon26，HT1080, B16F1及KB細(xì)胞(ATCC)的各細(xì)胞種均懸浮于Iml的各冷凍液；然后在_80°C冷凍器中冷凍。一周后，將細(xì)胞在37°C水浴中快速解凍，在DMEM中洗滌及用錐蟲藍(lán)染料進(jìn)行細(xì)胞死亡率測試。然后將解凍的細(xì)胞以I X IO5細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，及在培養(yǎng)6及24小時后用錐蟲藍(lán)染料評價細(xì)胞存活率。將作為通常使用的冷凍保存劑的胎牛血清(FBS)中的10%DMS0用作比較例的冷凍保存液。
[0060]如圖1中所示，當(dāng)在冷凍保存L929細(xì)胞中用作冷凍保存液的是已通過相對于氨基加入50%或更多摩爾量的琥珀酸酐來修飾的聚-賴氨酸(PLL)的各7.5%溶液時，則達(dá)到幾乎相同或高于使用DMSO溶 液的比較例的細(xì)胞活力。作為通過茚三酮及TNBS方法定量測量殘留氨基的結(jié)果，已通過加入100%摩爾量的琥珀酸酐修飾的羧化的聚-賴氨酸(PLL)顯示具有93%氨基-阻斷百分率。已通過相對于聚-賴氨酸的氨基加入10mol%，27mol%, 45mol%,52mol%,63mol%及79mol%摩爾量的琥珀酸酐修飾的聚-賴氨酸(PLL)分別顯示具有10%，25%，43%，50%, 60%及76%的氨基-阻斷百分率。如圖1中所示，具有在50~93%范圍內(nèi)的氨基-阻斷百分率的聚-賴氨酸溶液顯示具有冷凍保存效果；及通過具有60%的阻斷百分率(已加入63mol%的琥珀酸酐)及76%阻斷百分率(已加入79mol%的琥珀酸酐)的聚-賴氨酸溶液達(dá)到特別高冷凍保存效果。當(dāng)使用具有部分阻斷的氨基的聚烯丙胺(其為分子量5000的烯丙胺聚合物，已與相當(dāng)于烯丙胺聚合物中的氨基摩爾量的45~90mol%的琥珀酸酐反應(yīng))水溶液時也如同上述顯示，隨著氨基-阻斷百分率增加的細(xì)胞存活率改善。
[0061]圖2顯示冷凍保存過程中，L929細(xì)胞的細(xì)胞存活率與通過相對于氨基加入63%摩爾量的琥珀酸酐來修飾的部分阻斷的ε -聚-L-賴氨酸(其在圖中被表示為"PLL (0.63)"及在下文說明書通篇稱為"PLL琥珀酸酐63%")的濃度之間的關(guān)系。如圖2中所示，當(dāng)部分阻斷的聚-L-賴氨酸或PLL琥珀酸酐63%濃度是7.0%或更高時，則細(xì)胞存活率幾乎相同于或高于使用DMSO溶液得到的細(xì)胞存活率。當(dāng)使用具有部分阻斷的氨基的聚烯丙胺(其為分子量5000的烯丙胺聚合物，已與相當(dāng)于氨基的摩爾量的63~85mol%的琥珀酸酐反應(yīng))水溶液時也顯示如同上述的趨勢。
[0062]在圖1~2中，呈現(xiàn)最佳結(jié)果的范圍如在得到保存液的滲透壓時顯示，對應(yīng)于在400~600m0sm/kg范圍內(nèi)的滲透壓。更特別地，當(dāng)滲透壓在400~600m0sm/kg范圍內(nèi)時得到最佳保存效果。
[0063]表1顯示當(dāng)將細(xì)胞冷凍保存于PLL琥珀酸酐63%的7.5%溶液時的其他細(xì)胞種的冷凍保存效果。如表1所示，全部細(xì)胞種達(dá)到幾乎相同于或高于由DMSO溶液(10%DMS0/胎牛血清)得到的細(xì)胞存活率。盡管未顯示數(shù)據(jù)，有部分阻斷的氨基的聚烯丙胺產(chǎn)生類似結(jié)果。
[0064]【表1】7.5%PLL (0.63)對各細(xì)胞的冷凍保存效果
[0065]
【權(quán)利要求】
1.細(xì)胞及組織的冷凍保存用組合物， 其包括: ?聚合物化合物， 其包括具有氨基的單元的聚合物，及 其選自:ε -聚-L-賴氨酸，α -聚-L-賴氨酸，聚-精氨酸，其他聚-氨基酸，導(dǎo)入氨基的多糖類及聚烯丙胺；及?生理溶液；及 將所述聚合物化合物溶于所述生理溶液至I~50w/w%。
2.權(quán)利要求1的組合物,其中所述聚合物化合物的50~99mol%的氨基通過與羧酸酐反應(yīng)而具有羧酸基或乙?；鶃碜钄唷?br> 3.細(xì)胞及組織的冷凍保存用組合物， 其包括: ?聚合物化合物， 其包括具有羧基的單元的聚合物，及 其選自:聚丙烯酸，CL-聚-谷氨酸，Y-聚-谷氨酸，聚-谷氨酸，聚-天冬氨酸，其他聚-氨基酸及羧化的多糖類；及?生理溶液；及 將所述聚合物化合物溶于所述生理溶液至I~50w/w%。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述聚合物化合物的I~50mol%的羧基通過與具有多個氨基的化合物反應(yīng)來阻斷，所述具有多個氨基的化合物例如二胺，三胺及聚胺。
5.權(quán)利要求1~4中任一項的組合物，其中所述生理溶液是鹽水，Dulbecco-改良的eagle MEM培養(yǎng)基(DMEM)，或者細(xì)胞或組織用培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求1~5中任一項的組合物，其中所述聚合物化合物是具有在1000~20，000范圍內(nèi)的數(shù)平均分子量的ε -聚-L-賴氨酸。
7.權(quán)利要求1~5中任一項的組合物，其中所述聚合物化合物是具有在1000~3，000, 000范圍內(nèi)的數(shù)平均分子量的聚丙烯酸。
8.食品或藥物的冷凍保存或冷凍干燥用添加劑組合物， 其包括聚合物化合物， ?其包括具有氨基的單元的聚合物，及 ?其選自:ε -聚-L-賴氨酸，α -聚-L-賴氨酸，聚-精氨酸，其他聚-氨基酸，導(dǎo)入氨基的多糖類及聚烯丙胺；且 其中所述聚合物化合物的氨基通過與羧酸酐反應(yīng)而具有羧酸基或乙?；鶃碜钄?。
9.制備食品，藥物或燃料電池的方法，包括:將權(quán)利要求1中所述的添加劑加入: ?用于產(chǎn)生食品或藥物的帶水物質(zhì)、或 ?工業(yè)產(chǎn)品元件，例如燃料電池的內(nèi)部結(jié)構(gòu)元件， 至所述添加劑的濃度成為在I~15?/?%范圍內(nèi)。
【文檔編號】A61K47/36GK103858859SQ201410040415
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2008年6月27日
【發(fā)明者】松村和明, 須賀井一, 玄丞烋 申請人:博傲沃德株式會社