抑制晚期內皮祖細胞功能的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制晚期內皮祖細胞功能的方法，該方法采用聚乳酸防粘連膜。與現(xiàn)有的相比，本發(fā)明保護的方法可以抑制晚期內皮祖細胞的增殖、粘附、遷移或成血管功能，減少新生血管的形成，從而預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生。
【專利說明】抑制晚期內皮祖細胞功能的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抑制晚期內皮祖細胞功能的方法、一種減少新生血管的形成的方法以及一種模擬預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的方法。
【背景技術】
[0002]感染或手術易引起粘連，粘連的過程相對較為復雜，除受到纖維蛋白溶解機制失調的影響外，各種細胞因素和生長因子等也對粘連的形成產生一定的影響。研究表明，術后粘連如持續(xù)3天未能溶解，則有成纖維細胞增生，伴隨新生毛細血管長入其中，在相互接觸的組織間形成永久性纖維性粘連。
[0003]現(xiàn)有的關于粘連的研究基本上集中在成纖維細胞，但新生血管的生成是永久性粘連形成的一個重要過程。現(xiàn)有的研究顯示，內皮祖細胞(endothelial progenitorcells, EPCs)，特別是晚期EPCs，具有和成熟血管內皮細胞相似的特性，在一定條件下，能在組織損傷部位、機體缺血區(qū)及肉芽形成過程中形成新生血管。
[0004]術后粘連是外科手術中亟待解決的難題，由于組織的創(chuàng)傷，結締組織纖維與相鄰的器官或組織結合在一起，從而形成異常結構，造成關節(jié)活動受限或畸形、粘連性腸梗阻、不孕癥及盆腔炎癥等嚴重的術后并發(fā)癥。受損組織和與其相接觸的臟器間形成的暫時性纖維蛋白性粘連，正常情況下可被間皮及間皮下毛細血管內存在的纖維蛋白裂解酶所溶解，但這些粘連如持續(xù)3天未能溶解，則有成纖維細胞增生，伴隨新生毛細血管長入其中，在相互接觸的組織間形成永久性纖維性粘連。
[0005]目前臨床上使用的防粘連膜殼聚糖，其缺點在于殼聚糖防粘連膜材料活性保持時間較短。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明中，聚乳酸防粘連膜購自廣州市弘健生物醫(yī)用制品科技有限公司；SD大鼠(體重100-150g，雌雄不限)購自中國人民解放軍第八十九醫(yī)院實驗動物中心)；EGM-2培養(yǎng)基購自美國(Invitrogen,);胎牛血清(0.25%胰蛋白酶)購自美國(HyClone);纖維粘連蛋白(Fibronectin, FN)購自德國(Roche);CCK_8 購自日本(Dojindo) ；Matrigel 膠，AnnexinV/PI凋亡試劑購自美國(BD) ;β-半乳糖苷酶試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；Boyden小室購自江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠；酶標儀(Bio-Rad Laboratories)購自美國；C02培養(yǎng)箱購自美國(Thermo);熒光顯微鏡購自德國(Leica);流式細胞儀購自美國(BD FACSCaliburX
[0007]本發(fā)明的目的之一就在于提供一種抑制晚期內皮祖細胞功能的方法。
[0008]技術方案是:一種抑制晚期內皮祖細胞功能的方法，該方法采用聚乳酸防粘連膜。
[0009]作為優(yōu)選，所述晚期內皮祖細胞功能為增殖、粘附、遷移或/和成血管功能。
[0010]本發(fā)明的目的之二在于提 供一種減少新生血管的形成的方法。
[0011]技術方案是:一種減少新生血管的形成的方法，該方法采用上述方法減少新生血管的形成。
[0012]本發(fā)明的目的之三在于提供一種預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的模擬方法。
[0013]技術方案是:一種預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，該方法包括:
[0014]大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定；
[0015]用胰蛋白酶消化、完全EGM-2培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液，接種于六孔板中，六孔板孔中預先放入聚乳酸防粘連膜膜片，置于培養(yǎng)箱中，每隔3天換一次液。
[0016]作為優(yōu)選，所述大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定為采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單核細胞，以完全EGM-2培養(yǎng)液重懸細胞，將其接種于預先經FN打底的培養(yǎng)瓶中，置37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中；4天后更換培養(yǎng)液，以后每隔3天換一次液；待細胞生長到80%左右時，用0.25%胰蛋白酶按1:1比例傳代；以傳至第三代的EPCs，即晚期EPCs為靶細胞，細胞行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1染色，雙染陽性，流式細胞術檢測VEGFR2、vWF、CD31及VE-Cadherin等內皮細胞標記的表達。
[0017]作為優(yōu)選，所述聚乳酸防粘連膜膜片為無菌的聚乳酸防粘連膜膜片。
[0018]作為優(yōu)選，所述聚乳酸防粘連膜膜片規(guī)格為1.5cmX 1.5cm。
[0019]作為優(yōu)選，所述細胞懸液密度為5X104/ml的或所述胰蛋白酶為0.25%胰蛋白酶。
[0020]作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)箱為溫度為37°C、含5%C02的培養(yǎng)箱。
[0021]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0022]EPCs又稱為血管內皮干細胞，作為一種原始細胞，EPCs具有較強的分化增殖能力和生物活性。研究發(fā)現(xiàn)EPCs至少分為早期EPCs和晚期EPCs兩種類型[19]。早期EPCs出現(xiàn)于單個核細胞貼壁培養(yǎng)的早期，表達⑶14、⑶45及⑶133等干細胞標記，不具有體外成血管能力，晚期EPCs多出現(xiàn)于培養(yǎng)2~4周，表達VEGFR2，vWF,⑶31及VE-鈣黏素等成熟內皮細胞標記，因其典型的內皮細胞形態(tài)和高增殖潛力被認為是真正的EPCs，能在組織損傷部位、機體缺血區(qū)及肉芽形成過程中形成新生血管。因此抑制晚期EPCs的功能有利于抑制永久性纖維性粘連的產生。
[0023]相對于殼聚糖防粘連膜材料活性保持時間較短的缺點，聚乳酸防粘連膜植入人體后，在手術創(chuàng)面愈合時間內始終保持活性，將會在預先設計的時間內逐漸降解、吸收，最終形成二氧化碳和水，以呼吸和體液的形式排出體外，無任何殘留和蓄積。
[0024]本發(fā)明將晚期EPCs種植于聚乳酸防粘連膜上培養(yǎng)一定時間后，細胞的增殖、粘附、遷移、成血管功能均降低，衰老比率增高。該研究結果提示聚乳酸防粘連膜除在手術創(chuàng)面和周圍組織之間形成自然屏障，抑制成纖維細胞對手術創(chuàng)面的入侵外，尚可通過抑制晚期EPCs的功能來減少新生血管的形成。
[0025]本發(fā)明中，由于聚乳酸及其共聚物的物理和化學性能俱佳，具有可降解性和生物相容性，它能夠在體內完全代謝無蓄積，最終的降解產物是CO2和H2O,對人體無毒、無刺激，因此本發(fā)明方法對增殖、粘附、遷移、體外成血管、細胞衰老等指標測定結果均表明聚乳酸防粘連膜對晚期EPCs的功能有抑制作用，提示聚乳酸防粘連膜亦可通過抑制EPCs的功能，減少新生血管的形成，預防手術后永久性粘連的發(fā)生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1聚乳酸防 粘連膜對晚期EPCs細胞形態(tài)的影響示意圖；[0027]圖2聚乳酸防粘連膜對晚期EPCs增殖的影響示意圖；
[0028]圖3聚乳酸防粘連膜對晚期EPCs粘附的影響示意圖；
[0029]圖4聚乳酸防粘連膜對晚期EPCs遷移的影響示意圖；
[0030]圖5聚乳酸防粘連膜對晚期EPCs體外成血管能力的影響示意圖；
[0031]圖6聚乳酸防粘連膜對晚期EPCs凋亡的影響示意圖；
[0032]圖7聚乳酸防粘連膜對晚期EPCs衰老的影響示意圖；
[0033]圖1-7中，Control是對照組，PLLA是實驗組；圖3中，A為熒光顯微鏡下遷移細胞圖像(X 100)，B為統(tǒng)計學分析結果；圖4中，A為熒光顯微鏡下遷移細胞圖像(X100)，B為統(tǒng)計學分析結果；圖5中，A為光鏡下晚期EPCs體外成血管圖像(X 100)，B為統(tǒng)計學分析結果；圖6中，A為EPCs凋亡的流式散點圖，B為統(tǒng)計學分析結果；圖7中，A為光鏡下晚期EPCs β -gal細胞衰老染色圖像(X 100)，B為統(tǒng)計學分析結果。
【具體實施方式】
[0034]下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步說明。
[0035]實施例1
[0036]①大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定
[0037]采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單核細胞，以完全EGM-2培養(yǎng)液重懸細胞，將其接種于預先經FN打底的培養(yǎng)瓶中，置37°C含5%C02 (體積百分比)的培養(yǎng)箱中。4天后更換培養(yǎng)液，以后每隔3天換一次液。待細胞生長到80%左右時，用0.25% (重量百分比)胰蛋白酶按1:1比例傳代。以傳至第三代的EPCs，即晚期EPCs為靶細胞，細胞行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1染色，雙染陽性，流式細胞術檢測VEGFR2、vWF、CD31及VE-Cadherin等內皮細胞標記的表達。
[0038]②取上面①制取的晚期EPCs，用0.25%胰蛋白酶消化、完全EGM-2培養(yǎng)基重懸制成密度為5X104/ml的細胞懸液，接種于六孔板中，本發(fā)明組六孔板孔中預先放入無菌的聚乳酸防粘連膜膜片(1.5cmXl.5cm)，對照組孔中不放置，置于37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中，每隔3天換一次液，6天后進行形態(tài)觀察及下面的功能檢測。
[0039]形態(tài)觀察1-晚期EPCs細胞形態(tài)觀察(本發(fā)明組與對照組)
[0040]觀察結果見圖1和圖2。
[0041]由圖1-圖2可見，種植于聚乳酸防粘連膜上晚期EPCs胞體略大于對照組，有偽足形成，總體細胞數量明顯少于對照組。
[0042]功能檢測1-增殖功能檢測
[0043]采用CCK-8法檢測細胞的增殖能力。向96孔板中均勻加入細胞(4000個細胞/100 μ I/孔)，置37°C 5%C02培養(yǎng)箱48h后取出，棄去各孔培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑和培養(yǎng)基的混合液(按1:10比例)，在培養(yǎng)箱內孵育60min，酶標儀測定各孔在450nm波長的吸光度。
[0044]將晚期EPCs分別種植于聚乳酸防粘連膜上或普通培養(yǎng)板。6天后以CCK-8法檢測EPCs的增殖能力。檢測結果見圖2。
[0045]如圖2所示，聚乳酸防粘連膜抑制晚期EPCs的增殖能力(Ρ〈0.01)。
[0046]功能檢測2-粘附能力檢測
[0047]用10mg/L的FN預包被12孔板2h，PBS洗3遍。將I X 104晚期EPCs種植于預先包被的培養(yǎng)板中，置37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中30min后取出，IXPBS洗掉未貼壁的細胞，每孔隨機取6個視野(XlOO)計數貼壁細胞。
[0048]將晚期EPCs分別種植于聚乳酸防粘連膜上或普通培養(yǎng)板。6天后，細胞再次接種于經FN預處理的培養(yǎng)板中，30min后觀測粘附細胞數，結果見圖3。
[0049]由圖3可知，聚乳酸防粘連膜抑制晚期EPCs的粘附能力(Ρ〈0.01)。
[0050]功能檢測3-遷移功能檢測
[0051]采用改良的Boyden小室法觀察細胞遷移情況，用ΕΒΜ-2培養(yǎng)基制成懸液計數，50 μ I細胞(2X 104)懸浮液注入上室，用培養(yǎng)基加滿下室。置于37°C、5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內。8h后，刮去濾膜上面的未移動細胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，顯微鏡下隨機選取5個視野(X 100)，計數遷移細胞，取其平均數。
[0052]以改良Boyden小室法檢測聚乳酸防粘連膜對晚期EPCs遷移能力的影響。結果見圖4。
[0053]由圖4可知，本發(fā)明組遷移的細胞數明顯少于對照組(P〈0.01)，提示聚乳酸防粘連膜抑制晚期EPCs的遷移能力。
[0054]功能檢測4-衰老功能檢測
[0055]采用β_半乳糖苷酶法檢測細胞衰老。按說明書進行洗滌、固定、染色，置37°C無CO2恒溫箱中20h后取出，光學顯微鏡下拍照計數。表達β-gal活性的地方呈藍色，計算視野中的染成藍色的細胞陽性率。
[0056]體外成血管實驗結果見圖5。
[0057]由圖5可知，聚乳酸防粘連膜可抑制晚期EPCs在Matrigel上形成管腔樣結構，與對照組比較，其形成的血管腔數量較少，細胞連接比較松散。圖像及統(tǒng)計學分析結果提示，實驗組晚期EPCs形成的血管樣結構管腔數明顯低于對照組(P〈0.01)。
[0058]功能檢測5-凋亡功能檢測
[0059]采用Annexin V-FITC和PI雙染細胞，流式細胞儀檢測凋亡細胞數。
[0060]收集對照組及實驗組晚期EPCs行AnnexinV/PI染色，F(xiàn)ASC檢測細胞凋亡，設定AnnexinV (+)PI(_)細胞為凋亡細胞。結果見圖6。
[0061]由圖6可知，聚乳酸防粘連膜對晚期EPCs凋亡無明顯影響。
[0062]功能檢測6-體外成血管功能檢測
[0063]吸取100 μ I/孔基質膠加入96孔板，37 V，5%C0 2孵育Ih后，將晚期EPCs以2X 104/ml密度接種于基質膠，8h后，倒置顯微鏡下拍照觀察。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus (Media Cybernetics, USA)分析形成管腔數。
[0064]結果見圖7。
[0065]由圖7可知，β -gal細胞衰老染色顯示:與對照組相比，聚乳酸防粘連膜實驗組晚期EPCs藍染細胞數較多，其染色陽性細胞百分比率為(22.19±2.37)%，顯著高于對照組細胞(15.03 ±2.30)%(Ρ〈0.01)。
[0066]本發(fā)明中，統(tǒng)計學分析的所有數據以x±χ表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件處理，數據間比較采用t檢驗，P 〈0.05時認為有統(tǒng)計學差異。
【權利要求】
1.一種抑制晚期內皮祖細胞功能的方法，其特征在于:該方法采用聚乳酸防粘連膜。
2.根據權利要求1所述的抑制晚期內皮祖細胞功能的方法，其特征在于:所述晚期內皮祖細胞功能為增殖、粘附、遷移或/和成血管功能。
3.一種減少新生血管的形成的方法，其特征在于:該方法通過權利要求1或2所述的方法減少新生血管的形成。
4.一種預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的方法，其特征在于:該方法采用聚乳酸防粘連膜。
5.一種預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，該方法包括: 大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定； 用胰蛋白酶消化、完全EGM-2培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液，接種于六孔板中，六孔板孔中預先放入聚乳酸防粘連膜膜片，置于培養(yǎng)箱中，每隔3天換一次液。
6.根據權利要求5所述的預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述大鼠骨髓EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定為采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓單核細胞，以完全EGM-2培養(yǎng)液重懸細胞，將其接種于預先經FN打底的培養(yǎng)瓶中，置37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中；4天后更換培養(yǎng)液，以后每隔3天換一次液；待細胞生長到80%左右時，用0.25%胰蛋白酶按1:1比例傳代；以傳至第三代的EPCs，即晚期EPCs為靶細胞，細胞行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1染色，雙染陽性，流式細胞術檢測VEGFR2、vWF、CD31及VE-Cadherin等內皮細胞標記的表達。
7.根據權利要求5所述的預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述聚乳酸防粘連膜膜片為無菌的聚乳酸防粘連膜膜片。
8.根據權利要求5所述的預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述聚乳酸防粘連膜膜片規(guī)格為1.5cmX 1.5cm。
9.根據權利要求5所述的預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述細胞懸液密度為5 X 104/ml的或所述胰蛋白酶為0.25%胰蛋白酶。
10.根據權利要求5所述的預防感染或手術后永久性粘連發(fā)生的模擬方法，其特征在于:所述培養(yǎng)箱為溫度為37°C、含5%C02的培養(yǎng)箱。
【文檔編號】A61K31/765GK103784469SQ201410027874
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權日:2014年1月21日
【發(fā)明者】成敏, 官秀梅, 李鑫 申請人:濰坊醫(yī)學院