蜜桶花片在制備抑制橫紋癌細(xì)胞a673細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蜜桶花片在制備抑制橫紋癌細(xì)胞A673細(xì) 胞增殖藥物中的應(yīng)用及蜜桶花片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蜜桶花顆粒標(biāo)準(zhǔn)號WS-11440(ZD-1440)-2002,記載于國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科肝 膽分冊。由蜜桶花1700g作為原料藥制成，具有清熱解毒，除濕利膽，用于肝膽濕熱所致的急 慢性肝炎。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有蜜桶花片在在制備抑制人橫紋癌細(xì)胞A673細(xì)胞增殖藥物中的 應(yīng)用的報道，也未見有蜜桶花片提取制備方面采用超臨界萃取的報道，而傳統(tǒng)水煎煮的方 法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng) 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種蜜桶花片在制備抑制橫紋癌細(xì)胞A673細(xì)胞 增殖藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種蜜桶花片的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的： 蜜桶花片在制備抑制橫紋癌細(xì)胞A673細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述蜜桶花片由蜜桶花 1700g作為原料藥制成，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成:取蜜桶花，加入到0)2超 臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度3〇-50°C，C〇2流量l_3ml/g生藥· min，萃取時間800-900min，得超臨界萃取物， 將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.50g。
[0007] 優(yōu)選的，上述的蜜桶花片在制備抑制橫紋癌細(xì)胞A673細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所 述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成:取蜜桶花，加入到CO 2超臨界萃取器中，乙醇作為 夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO 2流量2ml/g 生藥· min，萃取時間850min，得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒， 干燥，壓片，制成400片，每片重0.50g。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)中，蜜桶花顆?？诜?，一次5g，一日3次。蜜桶花顆粒服藥量大。采用本發(fā) 明方法制備成的蜜桶花片每片重〇.50g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分 的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗證明。
[0009]試驗一、不同方法制備的蜜桶花片中麥角甾苷含量的比較 1、儀器及試藥本發(fā)明蜜桶花片：按實施例1方法制備，使用1700g原料藥，經(jīng)提取制成 400片，每片重0.50g。原蜜桶花片，按照WS-11440( ZD-1440 )-2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備。 AgiIent 1200高效液相色譜儀;METTLER AE240電子分析天平;麥角留苷對照品（中國藥品生 物制品檢定所）。
[0010] 2、方法 照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0011]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.5%醋 酸(42:58)為流動相;檢測波長為334nm。理論板數(shù)按麥角留苷峰計算應(yīng)不低于3000。
[0012]對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷真空干燥至恒重的麥角留苷對照品 4mg，置I OOml棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含40μ g的溶液，即得。
[0013]供試品溶液的制備取本發(fā)明蜜桶花片10片，精密稱定，研細(xì)，取〇 . 20g，精密稱 定，加水IOml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣 加甲醇使溶解，并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0014]對照產(chǎn)品供試品溶液的制備取對照的蜜桶花顆粒20g，研細(xì)，取I g，精密稱定，加 水IOml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次IOml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲 醇使溶解，并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0015] 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液、對照產(chǎn)品供試品溶液各5μ1，注 入液相色譜儀，測定，即得。
[0016] 3、結(jié)果 結(jié)果表明，本發(fā)明蜜桶花片中麥角留苷的含量為1.51-2.61mg/片;而原蜜桶花顆粒中 麥角留苷的含量為1.02mg/袋(每袋含顆粒劑5g)，每次服用量2片的麥角留苷含量為原顆粒 劑5g含量的3-5倍，在服用量減少的情況下，麥角留苷含量有很大提高。
[0017] 上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的蜜桶花片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-11440(ZD-1440)-2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的蜜桶花顆粒。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解 本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述 內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0019] 實施例1 取蜜桶花1700g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥· min，萃取時間850min，得 超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重 0·50g〇
[0020] 經(jīng)檢測，成品中麥角甾苷的含量為2.61mg /片。
[0021] 實施例2 取蜜桶花1700g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥· min，萃取時間900min，得 超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重 0·50g〇
[0022]經(jīng)檢測，成品中麥角甾苷的含量為1.58 mg/片。
[0023] 實施例3 取蜜桶花1700g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度60°C，C02流量3ml/g生藥· min，萃取時間800min，得 超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重 0·50g〇
[0024]經(jīng)檢測，成品中麥角留苷的含量為2.04mg /片。
[0025]實施例4:蜜桶花片抑制人橫紋癌細(xì)胞A673細(xì)胞增殖的實驗研究資料 1.實驗材料 1.1實驗用細(xì)胞株 人橫紋癌細(xì)胞A673細(xì)胞，山東大學(xué)實驗室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0026] 1.2實驗藥物 研究藥物:本發(fā)明蜜桶花片:按實施例1方法制備。
[0027] 藥液儲液:稱取IOOmg蜜桶花片，溶于5ml無水乙醇中，0.2μπι濾器過濾，500μ1(1 〇?Τ 管分裝，-20°C存儲，同時0.2μπι濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0028] 1.3實驗試劑 DMEM( GIBCO公司Cat · No · 12100-061 Lot · No · 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419); NaHCO3 (上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot.No. 1088387) ;Trypsin(AMRESC0公司）；EDTA(AMRESC0公司）！Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司I) ; Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限 公司）；MTT (Biosharp批號：0793) :PBS(實驗室自配）； 1.4實驗器材 萊卡倒置顯微鏡（德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型 號：SPECTRAMAX 190) ; CO2培養(yǎng)箱(FORMA型號：3111);超凈臺（蘇凈集團安泰公司制造型號： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國SprIng公司型號：S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型 號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋（日本SANYO公 司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實驗設(shè)備公司型號：DHG9123A);冰箱 (西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠 型號:KA-1000) ;0 · 2μπι濾器(MILLIP0RE型號：SLGP033RB) ; Icm培養(yǎng)皿(NEST公司）、96孔培養(yǎng) 板(NEST公司）;細(xì)胞計數(shù)板;離心管、移液管、Tips若干。
[0029] 2.實驗方法 1)A673細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培養(yǎng)皿），當(dāng)細(xì)胞生長至 對數(shù)期時，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37°C 消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000 rpm 離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3 X IO4個/ml。
[0030] 2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180μ1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中 (37°C，5%C0 2)常規(guī)培養(yǎng)。
[0031] 3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50%-70%，加入蜜桶花片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0032] 4)24h 后加入 20μ1 MTT 溶液（5mg/ml，即0·5%ΜΤΤ)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0033] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200μ1二甲基亞砜，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0034] 6)同時設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液），對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0035] 7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(％ )=(對照孔OD值-給藥孔OD 值）、對照孔OD值X 100%。實驗重復(fù)3次。
[0036] 3.統(tǒng)計處理 采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean土S.D. 表不。
[0037] 4.實驗結(jié)果 MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時，對A673細(xì)胞增殖抑 制有差異(P〈〇.〇5)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(？〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-2〇11^/1111 時有極顯著性差異(P〈〇. 001)。
[0038] 表1蜜桶花片對A673細(xì)胞增殖抑制影響研究（X±SD)
注：與對照組比較，*P〈〇. 01; #P〈〇. 001。
[0039] 5.實驗結(jié)論 本發(fā)明的蜜桶花片可以抑制A673細(xì)胞增殖，減少A673細(xì)胞的細(xì)胞生長數(shù)目，該作用呈 劑量依賴性。
【主權(quán)項】
1. 蜜桶花片在制備抑制橫紋癌細(xì)胞A673細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述蜜桶花片由蜜桶 花1700g作為原料藥制成，其特征在于，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成:取蜜桶 花，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力 15-30MPa，溫度30-50°C，C02流量l-3ml/g生藥·min，萃取時間800-900min，得 超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重 0·50g〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜜桶花片在制備抑制橫紋癌細(xì)胞A673細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng) 用，其特征在于，所述蜜桶花片的制備方法由下列步驟組成:取蜜桶花，加入到C02超臨界萃 取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40 °C，C02流量2ml/g生藥·min，萃取時間850min，得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀 粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.50g。
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蜜桶花片在制備抑制橫紋癌細(xì)胞A673細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及蜜桶花片的制備方法。所述蜜桶花片由蜜桶花1700g作為原料藥制成，采用超臨界萃取制備而成，使得麥角甾苷含量有很大提高。
【IPC分類】A61K36/80, A61P35/00, A61K9/20
【公開號】CN105434644
【申請?zhí)枴緾N201510986128
【發(fā)明人】陳志祥
【申請人】濟南新時代醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月25日