加帽生物假體組織以減少鈣化的制作方法
【專利摘要】對植入物中使用的生物假體組織進行處理或對裝配的生物假體心瓣膜進行處理，以減少體內鈣化。該方法包括應用鈣化緩和劑例如加帽劑或抗氧化劑到組織，以特定地抑制組織中的氧化。同時，該方法可以用于抑制脫水組織中的氧化。加帽劑抑制組織中結合位點的形成，結合位點由于氧化而被暴露或生成并且另外在植入后將吸引鈣、磷酸酯、免疫原性因子、或其它鈣化前體。在一種方法中，在裝配生物假體心瓣膜中的組織小葉用醛加帽劑預處理，然后脫水和滅菌。
【專利說明】加帽生物假體組織以減少鈣化
[0001]本申請是分案申請，原國際申請的申請日為2008年12月19日、申請?zhí)枮?00880126930.4(PCT/US2008/013879)、發(fā)明名稱為“加帽生物假體組織以減少鈣化”。
[0002]相關申請
[0003]本專利申請要求在2007年12月21日提交的、美國臨時申請?zhí)?1/016，263的優(yōu)先權，其整個公開通過引用以此并入。
發(fā)明領域
[0004]本申請總體涉及用于處理生物假體組織的方法、材料和減少植入后鈣化的設備，以及減少植入后鈣化的方法，特別是用于心瓣膜中使用的生物假體組織。
[0005]發(fā)明背景
[0006]當出現(xiàn)天然的心瓣膜變窄時一通常被稱為狹窄，或當天然的瓣膜滲漏或回流時一例如當小葉鈣化時，表明可以進行心瓣膜置換。在一種治療方案中，天然的瓣膜可以被切除并用生物或機械瓣膜替換。某些醫(yī)學狀況可能要求移植或縫合組織小片(tissuepatch)以修補生理畸形。這些包括但不限于疝修補、血管創(chuàng)傷、先天性心臟缺陷修補和重建以及膀胱壁修補。
[0007]組織型或“生物假體”瓣膜具有由基底結構支持的柔韌組織小葉，小葉通過彼此對著合緊以確保單向的血流，伸出進入流動流中并起到很像天然的人心瓣膜的那些小葉的作用。在組織型瓣膜中，整個的異種移植瓣膜(例如，豬)或多個異種移植小葉(例如，牛或馬心包)典型地提供流體閉合表面(fluid occluding surfaces)。也提出合成的組織小葉。一個或多個柔韌小葉安裝在外周支持結構里面，例如，如在可從加利福尼亞州Irvine的 Edwards Lifesciences 獲得的 CARPENTIER-EDWARDS 豬心瓣膜和 PERM0UNT 心包心瓣膜中所看見的。
[0008]可植入的生物組織可以由人體組織形成，所述人體組織通過冷凍(即，低溫保存)同種移植組織進行保存；或者由動物組織形成，所述動物組織通過化學固定(即，鞣制)異種移植組織進行保存。用作生物假體的生物組織類型包括心臟瓣膜、血管、皮膚、硬腦膜、心包、小腸粘膜下層(“SIS組織”)、韌帶和腱。這些生物組織典型地包含充當所述組織的支持構架的結締組織蛋白(即，膠原和彈性蛋白)。每種生物組織的柔韌性或剛性很大程度上由該組織中存在的膠原和彈性蛋白的相對量和/或其結締組織構架的物理結構和構造來決定。膠原是大多數(shù)組織中存在的最豐富的結締組織蛋白。每個膠原分子由以卷曲螺旋構造纏繞在一起的三(3)個多肽鏈形成。
[0009]用于化學固定生物組織的技術典型地包括將該生物組織暴露于一種或多種化學固定劑(即，鞣劑)，所述化學固定劑在給定的膠原分子內的多肽鏈之間形成交聯(lián)(即，分子內交聯(lián))，或者在相鄰膠原分子之間形成交聯(lián)(即，分子間交聯(lián))。已經用于交聯(lián)白纖維組織的化學固定劑的例子包括:甲醛、戊二醛、二醛淀粉、1，6-己二異氰酸酯和某些聚環(huán)氧化合物。
[0010]與許多生物假體材料植入相關的一個問題是這些材料中的結締組織蛋白(即，膠原和彈性蛋白)在植入到體內后可以變成鈣化的。這種鈣化可導致該生物假體發(fā)生不期望的硬化或降解。對白纖維組織的這種損傷導致瓣膜故障。
[0011]在可用的各種化學固定劑中，戊二醛(也簡單地稱為“戊二醛(glut)”)自從在1968年由Dr.Alain Carpentier發(fā)現(xiàn)它具有抗免疫和抗降解效果以來已經得到了最廣泛的應用。參見 Carpentier, A., J.Thorac.Cardiovascular Surgery, 58:467-69 (1969)。另外，戊二醛是最常見的滅菌劑之一。戊二醛因此被用作許多商業(yè)可得的生物假體產品的優(yōu)選的固定劑和滅菌劑，例如在可從加利福尼亞州Irvine的Edwards Lifesciences獲得的生物假體心瓣膜中。戊二醛在組織內產生可以導致體內鈣化的潛在的鈣結合位點，如殘留的醛、酸、希夫堿等等。這些基團可以有助于鈣化，除非經過加帽減輕。減輕這種鈣化在貯藏期間是特別重要的，特別當組織沒有被貯藏在水溶液中時。
[0012]已經提出減輕戊二醛固定的生物假體的體內鈣化或用其它方法改進戊二醛固定方法的各種技術。包括其中的是在美國專利4，729，139 (Nashef)；美國專利 4，885，005 (Nashef 等)；美國專利 4，648，881 (Carpentier 等)；美國專利
5,002, 566 (Carpentier) ;EP103947 (Pollock 等);美國專利 5，476，516 (Seufter 等);和美國專利5，215，541 (Nashef等)中所描述的方法。美國專利5，862，806 (Cheung)中的技術包括在應用有機溶劑中的化學還原劑例如氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉之前，使用有機溶液(即，乙醇，但沒有甘油)對戊二醛處理的組織進行脫水。這種方法僅包括加入還原劑而沒有任何加帽劑如蛋白質、胺或者氨基酸。在美國專利6，471，723和美國專利4，786，287中公開的鈣化減輕技術包括加入各種胺以使戊二醛固定組織中的醛基團解毒。這些化學品不是永久地連接到組織(例如，通過添加還原劑)，并且因此隨著時間將擴散出組織，其顯著地降低這些處理的鈣減輕效果。在美國專利5，476，516中的技術包括加入多羥基化合物(如，甘油)和醇到生物 假體組織中單獨地作為鈣化減輕處理，但是沒有提出任何氧化減輕(即，加帽)策略。美國專利6，509，145和美國專利7，078，163提出用于鈣化減輕目的的生物假體組織的氧化。美國專利6，630，001和美國專利6，277，555討論使用甘油保存和凍干組織，但是沒有討論防止氧化的化學方法。美國專利6，352，708包括新鮮的、“非固定的”組織的甘油保存以及用甘油和肝素的處理，但是沒有包括防止氧化或用甘油干燥步驟減少鈣化的化學處理的組合。
[0013]最近，通過在戊二醛中高溫固定組織的鈣減輕的新技術在美國專利
6,561, 970 (Carpentier 等)中描述，其與在美國專利 5，931，969 (Carpentier 等)中的相對組織/流體運動結合。包括調整戊二醛固定溶液的PH的另一種技術在美國專利 6,878，168 (Carpentier 等)中公開。Edwards Lifesciences XenoLogiX? 組織處理消除多至98%的磷脂，力圖減少鈣結合位點。在也來自于Edwards Lifesciences的Carpentier-Edwards ThermaFix?高級心瓣膜組織方法中，同時使用熱和化學處理以除去不穩(wěn)定戊二醛分子，因此減少了鈣結合位點，相對于只有戊二醛的對照，其導致鈣攝入顯著減少。
[0014]生物假體瓣膜一般貯存在戊二醛或甲醛溶液中，在植入之前，必須漂洗。戊二醛由于其滅菌劑的性而被廣泛地用作為貯存溶液，但是已知其有助于鈣化。最小化最終產品中的戊二醛含量的策略已經表明減輕體內鈣化。研究顯示沒有戊二醛的貯存溶液與具有戍二醒的忙存溶液相比，減少了體內鈣化(Mirzaie等，Ann Thorac CardiovascSurg200713:102)。
[0015]避免戊二醛作為貯存溶液的一種這樣的策略是在甘油/乙醇混合物中使生物假體組織脫水、用環(huán)氧丙烷消毒、和包裝最終產品為“干的”。這種方法避免了戊二醛作為滅菌劑和貯存溶液的潛在的毒性和鈣化作用。已經有多種方法提議使用甘油、醇類和它們的組合物作為戊二醛后處理的方法，使得生成的組織處于干燥”狀態(tài)，而不是帶有過量戊二醛的濕狀態(tài)。這些方法避免使用含水的液體醛、或液體滅菌劑作為組織和設備的貯存溶液。基于甘油的方法可以用于如下實例中描述的這種貯存。心瓣膜組織在甘油中的貯存由Parker等(Thoraxl97833:638)描述，但是沒有包括任何鈣化減輕技術和沒有描述任何益處。同樣，美國專利6，534，004(Chen等)描述在多元醇如甘油中貯存生物假體組織。然而，這些中沒有一個提出減輕組織的潛在氧化。[0016]在其中使組織在乙醇/甘油溶液中脫水的方法中，組織可以通過環(huán)氧乙烷、Y照射、或電子束輻射滅菌。環(huán)氧乙烷滅菌需要使組織暴露于將在組織中產生氧化損傷的高溫和水蒸氣(Olde Damink, LH.等.J Biomed Mater Resl99529:149)。已知 Y 照射在膠原底物中生成顯著數(shù)量的活性氧化種類，其使得膠原纖絲的骨架裂開和破壞(Ohan，MP等.JBiomed Mater Res A200367:1188)。這種損傷將導致組織中的機械和生物化學功能性減少。電子束輻射也將斷開膠原骨架和導致組織結構和反應性退化(Grant，RA等.J CellScil9707:387)。在滅菌和/或貯存期間來自氧化的損傷將促進瓣膜退化和結構故障。美國專利6，605，667討論加入各種抗氧化穩(wěn)定劑到可聚合的粘合劑中，但是沒有涉及在貯存期間通過離子輻射或氧化而減輕對生物假體組織的損傷。
[0017]雖然這些基于甘油的方法作為在含水的、液體型溶液中貯存的替代方案是有用的，但是它們沒有解決這樣的事實:處理后官能團(即，醛)可隨著時間氧化，并且因此增加鈣化的可能性。本發(fā)明描述加帽方法，使得氧化和其它變化隨貯存時間被顯著地減少?，F(xiàn)有技術沒有解決在貯藏期間脫水的生物假體組織內的變化，所述變化作為體外空氣氧化或體內氧化的結果出現(xiàn)。在戊二醛固定的組織中的高醛含量非常易于氧化，其導致鈣化和組織故障。因此，本發(fā)明教導改進的可植入組織設備的組織處理方法。
[0018]本發(fā)明解決脫水組織內的某些有害的變化，所述有害的變化可作為來自貯存和處理期間的滅菌、空氣暴露的氧化、或來自體內氧化的氧化的結果出現(xiàn)。戊二醛中的生物假體組織的貯存提供一些抗氧化作用并幫助阻止組織中醛官能的氧化，其可能促進增加的鈣化。在組織被脫水和在空氣中貯存的方法中，組織沒有被保護免受氧化，并且將導致來自活性氧化種類的生物化學損傷。生成的氧化生物標志如羧酸可能促進鈣結合并且由于鈣化而發(fā)生生物假體的失敗。組織中醛基團的永久加帽(還原胺化)將防止組織的顯著氧化并導致該材料的使用壽命更長。本發(fā)明包括醛(和其它種類)的化學加帽或組織的其它方式地抑制，以防止脫水組織中的氧化。
[0019]本發(fā)明也描述加入化學品(例如，抗氧化劑)到脫水溶液(乙醇/甘油)中，以阻止在滅菌(環(huán)氧乙烷、Y照射、電子束輻射等)和貯存期間的組織氧化。脫水的生物假體組織在滅菌和貯存期間特別易于氧化?，F(xiàn)有技術沒有討論化學阻止這種類型的生物假體材料的這種損傷。
[0020]發(fā)明概述
[0021]本發(fā)明的一個目的是提供減輕生物假體植入組織中鈣化的方法，包括:a)用加帽劑處理生物假體植入組織，所述加帽劑與所述組織上的官能團反應，和b)用非水溶液使所述加帽的組織脫水。[0022]另一個目的是提供抗鈣化組織，包括:a)已經用加帽劑處理的生物假體植入組織，所述加帽劑與所述組織上的官能團反應，和b)用非水溶液脫水。
[0023]本發(fā)明的性質和益處的進一步理解在以下描述和所附權利要求中說明，特別是當與附圖結合考慮時，在所述附圖中，相同的部分具有相同的指代數(shù)字。
[0024]附圖簡述
[0025]圖1為顯示在數(shù)種不同的化學處理后，牛心包組織中的醛和酸含量的圖；
[0026]圖2為將體內組織鈣含量與三種不同方式處理的組織的相應酸和醛含量關聯(lián)起來的圖；
[0027]圖3為圖解各種組織處理的酸和醛含量的圖；
[0028]圖4是顯示通過加帽、還原和干燥(GLX方法)的鈣化減少的圖；
[0029]圖5是顯示通過加帽、還原和干燥(GLX方法)的鈣化變異性降低的圖；
[0030]圖6是顯示在80天的實時貯存期后，通過加帽、還原和干燥(GLX方法)的鈣化減少的圖；
[0031]圖7是35天兔肌內研究的箱線圖；
[0032]圖8是35天兔肌內研究、短期貯存期和鈣化的箱線圖。
[0033]優(yōu)選的實施方式描述
[0034]本發(fā)明提供改進的生物假體組織處理方法，其通過在脫水步驟之前封閉游離醛基團和/或加入化學劑以防止滅菌期間的氧化損傷，大大降低植入后鈣化的可能性。“生物假體組織”包括但不限于在生物假體心瓣膜中通常使用的牛心包和豬組織，以及血管、皮膚、硬腦膜、心包、小腸粘膜下層(“SIS組織”)、組織心瓣膜、韌帶和腱。本申請中的“植入物”不僅指包括經導管心瓣膜在內的心瓣膜，而且指血管假體和移植物、組織移植物、骨移植物和眼眶植入物覆蓋物(orbital implant wraps)以及其它。
[0035]“生物假體心瓣膜”指至少部分地由生物假體組織制成的全裝配假體瓣膜。在所謂的“無支架(stentless)”生物假體瓣膜中使用一些完整豬瓣膜，在所謂的“無支架(stentless)”生物假體瓣膜中如果任何合成材料被加入用于支持或固定的目的，其存在是非常少的?！爸Ъ苁?stented) ”生物假體瓣膜典型地具有用于小葉的一些合成(例如，聚合物或金屬)支持，其可以是完整的豬異種移植小葉或分開的牛心包小葉。本文考慮的心瓣膜包括手術心瓣膜、切頂心瓣膜(transapical heart valves)、經骨動脈心瓣膜和其它類型的心瓣膜。
[0036]現(xiàn)有技術的組織處理方法針對交聯(lián)、微生物和在“靜態(tài)”裝置中的組織的其它方面，并且典型地包括使組織浸入在戊二醛、吐溫(聚氧乙烯20失水山梨糖醇單油酸酯)、乙醇、甲醛和其它物質中，以減輕植入后的鈣化。一些現(xiàn)有技術方法包括加入各種化學品，以便通過使用金屬離子(即，Al3+或Fe3+，參見美國專利5，746，775,Levy)或整體封閉劑(bulkblocking agents)(即，2-氨基油酸,參見美國專利4，976，733, Giradot)來降低交聯(lián)組織的毒性或減輕鈣化。但是這些方法中每一個僅應用于最初處理的組織，而不應用于脫水組織或者組織裝置以防止氧化損傷。現(xiàn)有技術方法局限于加入化學或生物制劑到臨時附著于組織的交聯(lián)組織，或者它們局限于在沒有加入任何“加帽劑”的情況下單獨地還原或氧化組織(參見美國專利5，862，806，Cheung)。
[0037]與各種現(xiàn)有技術組織處理不同一在現(xiàn)有技術中目標是固定(也就是交聯(lián)等)組織，本發(fā)明描述了另外的方法，藉此，由現(xiàn)有技術固定方法形成的酸和其它潛在結合位點被“加帽”。它也包括“加帽”由固定組織氧化生成的結合位點和潛在的結合位點。用戊二醛、吐溫(聚氧乙烯20失水山梨糖醇單油酸酯)、乙醇、甲醛和其它物質進行的組織處理可以提供有用的組織固定。然而，其也將產生能夠與鈣、磷酸酯、免疫原性因子或其它鈣化前體相互作用或吸引鈣、磷酸酯、免疫原性因子或其它鈣化前體的結合位點。例如，在戊二醛固定組織后，有許多帶負電荷的羧酸基團形成，并且這些基團能夠吸引鈣離子(由于它們的負電荷并且與帶正電荷離子的靜電相互作用)，導致組織鈣化或不利的細胞相互作用。已知羧酸基團像在谷氨酸或Y羧基谷氨酸中的那些基團結合鈣原子(Hauschka等PNAS1975，72:3925)。鈣結合蛋白例如骨涎蛋白含有富羧酸結構域，目的是吸引和結合鈣，導致羥基磷灰石形成(鈣化)。在這些蛋白質中的酸基團的總體水平和位置決定蛋白質有效結合鈣和形成羥基磷灰石的能力。術語組織的“酸化潛力(acid potential) ”是指在固定組織內通過氧化、脫水、水合、或類似的方法可以最終形成酸基團或“結合位點”的這些化學官能團的水平。
[0038]本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)這種結合導致生物假體材料中的顯著的植入后損傷，特別是用于心瓣膜小葉的組織。例如，在貯存和脫水或“干燥”組織處理期間出現(xiàn)的氧化損傷可產生將結合鈣和導致組織障礙的羧酸基團。這種漸進的小葉損傷過程可產生為鈣化前體和免疫原性相關通路的新結合位點或潛在結合位點。本發(fā)明描述在植入組織基生物假體的組織進入體內之前，加帽這些新形成的結合位點的方法。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)暴露于空氣氧化的生物假體組織當未浸入戊二醛溶液或在滅菌期間時可能包含更多個促進鈣化和炎癥的酸基團。在干燥貯存時，脫水組織被滅菌并在沒有戊二醛溶液的保護作用下被“干燥”貯存。這種新產品的處理和貯存的方便性由于沒有戊二醛貯存溶液而被大大地促進。這種技術可以通過用加帽劑處理此類生物假體組織和/或在脫水階段加入化學保護劑改進。
[0039]本發(fā)明內的一個化學目標是酸基團的永久“加帽”，這將顯著降低它們吸引鈣、磷酸酯、免疫原性因子或其它基團的能力。術語“加帽”指封閉、去除或改變將會對生物假體性能具有不良作用的官能團。例如，加入1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(硫代-NHS)和乙醇胺將有效地用非反應性醇基團給酸基團加帽。
[0040]除了酸結合位點，用戊二醛或其它含醛物質處理的組織也產生具有許多游離醛基團的組織，所述游離醛基團引起毒性增加、鈣化更高和參與免疫原性應答。這些醛基團通過空氣氧化、體內血液氧化、巨噬細胞氧化和其它類似氧化路徑可以容易地氧化成為羧酸基團。因此，本發(fā)明另外的目標包括使為潛在結合位點的醛基團永久加帽，其方式是阻止或減輕它們轉化為酸或其它基團的能力并且因此進一步減輕身體內(體內)的鈣化潛力。除了酸和醛，還有其它可能的結合位點例如免疫原性和抗原因子，使它們加帽被包括在本發(fā)明的范圍內。
[0041]本發(fā)明的加帽方法包括組織的化學還原，當在加帽劑存在時應用于組織時，組織的化學還原將永久地將加帽劑與目標基團連接。例如，加入乙醇胺到組織將加帽醛基團，同時還原劑(例如， 硼氫化鈉)還原由醛與乙醇胺的胺基團反應產生的任何希夫堿。因此，醛基團最終替換為可有利于組織水合、柔韌性和細胞相互作用的羥基。當然，可以使用其它加帽劑替換乙醇胺以及使用硼氫化鈉之外的其它還原劑，并且這些是本領域技術人員已知的，而且它們被包括在本專利的范圍內。另一優(yōu)選的策略是氧化組織醛為酸，然后給酸基團加帽。這可以包括加入1_乙基_3_ [3-二甲氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(硫代-NHS)和乙醇胺。這種新的“被加帽”基團將減少對鈣、磷酸酯、免疫原性因子或其它類似物質的吸引。
[0042]在一個【具體實施方式】中，本發(fā)明提供處理生物假體植入組織以減少體內鈣化的方法，包括至少部分地交聯(lián)生物假體植入組織，然后用醛(或酸)加帽溶液處理所交聯(lián)的組織以減輕鈣化，并且使組織在乙醇/甘油溶液中脫水。甘油溶液可以包括抗氧化劑處理和可以包含水溶性蠟。然后使組織干燥并且隨后進行最終滅菌(例如，環(huán)氧乙烷、Y照射或電子束輻射)。以下步驟描述在假體心瓣膜的制造中該方法的實施。
[0043]醛加帽。在瓣膜泄露和流量觀察后，瓣膜在20%乙烷中短暫漂洗以去除粘附到組織的任何過量的戊二醛。這被認為通過保證加帽溶液能夠粘結到組織上的醛、而不是溶液中的游離戊二醛而增強加帽工藝。瓣膜然后在室溫下?lián)u動下暴露于乙醇胺和硼氫化鈉的加帽溶液4小時。從加帽溶液中移走瓣膜，然后在室溫用在最終的生物負載(bioburden)還原工藝中使用的相同溶液漂洗幾分鐘，以去除過量的加帽溶液。
[0044]甘油處理。在瓣膜已經通過標準的最終生物負載還原步驟處理之后，它們在75wt%甘油和25被％乙醇的溶液中進行甘油處理。瓣膜在該溶液中室溫浸泡I小時。在該時間期間，在心包組織中存在的大部分水分子被甘油替代。瓣膜從溶液中移走并放置在清潔罩中，以使任何過量溶液從瓣膜中蒸發(fā)或滴完。
[0045]EO滅菌。脫水 瓣膜然后準備包裝。它們包裝在由硬盒(PETG)與Tyvek蓋組成的雙層無菌阻隔包裝中。包裝在潔凈室中密封并在100%環(huán)氧乙烷中滅菌。
[0046]鈣化緩和劑優(yōu)選地包含選自以下的加帽劑:
[0047]胺，
[0048]氨基酸，
[0049]氨基磺酸鹽，
[0050]親水性多官能聚合物，
[0051]疏水性多官能聚合物，
[0052]α - 二羰基，
[0053]酰肼類，
[0054]N, N- 二琥珀酰亞胺基碳酸酯，
[0055]碳二亞胺，
[0056]2-氯-1-甲基碘代吡啶(CMPI)，
[0057]抗生素，
[0058]細胞募集劑，
[0059]血液相容劑，
[0060]抗炎劑，
[0061]抗增殖劑，
[0062]免疫原性抑制劑，[0063]還原劑，和
[0064]單環(huán)氧烷烴、二環(huán)氧烷烴或聚環(huán)氧烷烴。
[0065]化學抗氧化劑期望選自:
[0066]水溶性抗氧化劑如抗壞血酸，
[0067]脂溶性抗氧化劑如生育酚，
[0068]糖類如果糖、蔗糖或甘露糖，
[0069]受阻酚如丁化羥基甲苯(BHT)，
[0070]受阻胺光穩(wěn)定劑(HALS)如對苯胺二胺(p-phenylamine diamine)、三甲基二氫喹啉或烷基化聯(lián)苯胺，
[0071]亞磷酸酯/亞膦酸酯如三苯膦，
[0072]和硫代酸酯如硫代肉桂酸酯。
[0073]期望以一種以下已選溶液或以下已選溶液的組合來遞送鈣化緩和劑(加帽劑)和/或化學氧化保護劑:
[0074]水溶液例如水緩沖溶液、水、短鏈醇、甘油或增塑劑，
[0075]有機溶劑，及
[0076]有機緩沖溶液。
[0077]組織在加帽過程之前優(yōu)選地被完全交聯(lián)。在一種實施方式中，組織包括在適當裝置中安裝和處理的預切割的心瓣膜小葉?？蛇x地，組織可以為在適當裝置中處理的組織大片(bulk sheets)。
[0078]以種類和亞類提供的加帽劑的實例是:
[0079]胺，
[0080]烷基胺、氨基醇、乙醇胺；
[0081]氨基酸，
[0082]賴氨酸、羥賴氨酸；
[0083]氨基磺酸鹽，
[0084]牛磺酸、氨基硫酸鹽、葡聚糖硫酸鹽、軟骨素硫酸鹽；
[0085]親水性多官能聚合物，
[0086]聚乙烯醇、聚乙烯亞胺；
[0087]疏水性多官能聚合物，
[0088]α-二羰基類，
[0089]甲基乙二醛、3-脫氧葡糖醛酮、乙二醛；
[0090]酰肼類，
[0091]己二酸酰肼，
[0092]N, N- 二琥珀酰亞胺基碳酸酯； [0093]碳二亞胺類，
[0094]1-乙基-3-[3_ 二甲氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、Ν_環(huán)己基-N' _(2_嗎啉乙基)碳二亞胺(CMC)、1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)；
[0095]2-氯-1-甲基碘代吡啶(CMPI)；
[0096]抗生素；[0097]細胞募集劑；
[0098]血液相容劑，
[0099]肝素；
[0100]抗炎劑；
[0101]抗增殖劑；
[0102]免疫抑制劑；
[0103]還原劑，
[0104]氰基硼氫化鈉、硼氫化鈉、亞硫酸氫鈉+乙酰丙酮、甲酸+甲醛；和
[0105]單環(huán)氧烷烴、二環(huán)氧烷烴或聚環(huán)氧烷烴。
[0106]優(yōu)選的加帽劑的 作用不僅封閉將吸引鈣、磷酸酯、免疫原性因子、或其它類似物質的官能團，而且用優(yōu)良的生物功能性(Biological functionality)代替那些基團。術語“生物功能性”定義為組織成分對植入材料的局部生物學的作用。改進的組織處理的生物功能性可以包括組織總電荷(overall charge)的減少、更好的血液相容性、增加的組織水合、更好的細胞相互作用、更好的柔韌性等。例如，用乙醇胺加帽于醛官能將阻止醛基團氧化成為酸并且將其替換為可有益于組織水合、柔韌性和細胞相互作用的羥基。被加帽的組織的期望生物功能性將決定使用的加帽化合物的類型。
[0107]加帽策略也旨在阻止可促進不良細胞反應的組織成分的生物功能性。這些目標中的一些包括但不限于a-gal、MHC-l相關蛋白質、HLA抗原等。因此，本發(fā)明也涉及加帽于或封閉蛋白質、糖類、脂類和可有助于細胞反應的其它組織成分。例如，a-gal糖可以通過用2-氯-1-甲基碘代吡啶(CMPI)和本領域技術人員所知的中和羥基的其它物質處理進行封閉。另外一個例子包括可以通過用1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和乙醇胺處理而被加帽或有效中和的MHC-1相關蛋白質。本發(fā)明加帽方法中也包括以與細胞和血管殘留物(remnants)相關的蛋白質、糖類或脂類作為目標。例如，纖連蛋白可以通過加入甲基乙二醛到組織而被加帽或封閉。已知這種二羰基結合蛋白質內關鍵的精氨酸官能并且損害這些蛋白質的生物功能性。
[0108]本發(fā)明的另一方面包括在滅菌后加帽技術的激活。例如，在Y照射滅菌之前，用特定的加帽劑(例如葡萄糖和乙醇胺或?；撬?處理組織，在照射后將產生加帽劑的活化。加入到組織的加帽劑將立刻有效地加帽于組織內的目標，但是滅菌(也就是，環(huán)氧乙烷、電子束輻射或Y照射)將產生新的結合位點，其隨后將被組織內殘留的加帽劑加帽。已知膠原的Y照射裂解骨架內的肽鍵并產生可能對組織有不良作用的新官能團。這些新官能團包括在本文所述的目標或結合位點，并可以通過本文列舉的加帽劑加帽或封閉。
[0109]免疫原性因子定義為引起或參與刺激免疫原性應答的任何物質。這包括能夠誘導免疫型應答的任何化學或生物制劑。例如，組織中留下的血管和細胞膜成分可以引起來自于體內的天然免疫系統(tǒng)的一些類型的免疫原性或抗原應答。本發(fā)明包括能夠靜態(tài)或動態(tài)地掩蔽、代替、或封閉組織中這些免疫原性元件的加帽劑。例如，完整的瓣膜被固定，隨后用非免疫原性或更加血相容的加帽劑例如肝素進行加帽，然后脫水和滅菌。這不同于將肝素添加到固定的組織而沒有任何的瓣膜脫水或沒有考慮處理后氧化條件的現(xiàn)有技術方法。本發(fā)明方法可以用去細胞化(decellularization)方法來補充，以減少免疫或抗原結合位點和潛在的結合位點，并且其也在本發(fā)明的范圍內。[0110]為了更好地理解為本發(fā)明處理技術基礎的原理，基于實際試驗，提供多個圖表(參見附圖)。如上提到的，本發(fā)明一般包括處理組織，使得鈣或磷酸酯結合位點、或可能引發(fā)鈣化的其它這類位點被封閉。酸結合位點和組織鈣化之間的相關性可以被看見(圖2，也參見Hauschka等PNAS197572:3925),并且顯示的是酸模板化(acid templating)指引多種種類的礦化。因此，在植入時組織中的游離酸和/或醛的量與這些結合位點的數(shù)目相關，并且因此增加了鈣化的可能性。組織中存在的游離酸和醛的量可以通過已知的方法測量，例如，標準的分光光度檢測。
[0111]圖1為顯示牛心包組織中的游離醛和游離酸含量——通過前述技術測量——的圖。應該理解的是，所有在本文提到的實驗包括戊二醛固定的牛心包組織。研究的組織都被化學處理，一種只用戍二醒，而其它兩種利用已經被Edwards Lifesciences用來制備商業(yè)植入用生物假體組織的組織處理。然而，其它交聯(lián)和組織處理方法可以被使用并且在本發(fā)明的范圍內。
[0112]化學處理后，測量組織的醛和酸含量，并且沒有給與組織任何損傷或應力。在圖1的圖右側，組織樣品只在戊二醛中處理，具體地在0.625%戊二醛溶液中處理14天的時間?？傆?0個樣品被處理并隨后被測試。測量顯示每毫克干重組織有大約40納摩爾醛和大約17納摩爾酸的平均水平。
[0113]圖1的圖中間顯示來自于經受處理A的總計10個組織樣品測試的結果，處理A商業(yè)上被稱為XenoLogiX?組織處理方法，來自于加利福尼亞州Irvine的EdwardsLifesciences0處理A包括首先用戊二醛固定，隨后用包括交聯(lián)劑例如甲醛、表面活性劑例如吐溫_80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)和變性劑例如乙醇在內的殺菌劑處理兩次。經受處理A的組織的醛和酸的含量都小于單獨用戊二醛處理的組織的醛和酸的含量，其中醛含量減少了大約25%而酸含量減少大約50%。這種減少歸因于酸結合位點的來源的磷脂的進一步還原以及來自醇和醛基團的半縮醛的形成。
[0114]圖1的左邊顯示來自于經受處理B的總計10個樣品測試的結果，處理B商業(yè)上被稱為 Carpentier-Edwards ThermaFix? 組織處理方法，來自于 Edwards Lifesciences0 處理B與處理A基本相同，外加在固定后和滅菌前的熱處理步驟。受到處理B的組織的醛和酸的含量都小于單獨用戊二醛處理的組織的醛和酸的含量，其中醛含量減少了大約33%而酸含量減少大于50%。另外，相對于處理A，處理B減少了 10-20%之間的醛和酸含量。
[0115]圖2為對圖1中顯示的三種組織處理重復醛/酸含量測量結果的圖，并且從單獨研究，也添加了來自于皮下植入兔中的相似組織樣品的鈣攝入的測量。在植入之前，測量組織中的這些酸水平，并且其在體內可能增加。圖2顯示在植入組織中發(fā)現(xiàn)的鈣量與來自于三種組織處理的醛/酸的水平相關。即，隨著在各種組織樣品中游離醛和游離酸的水平降低，植入后吸收的鈣量也減少。再次，應當理解的是許多因素有助于鈣攝入，但是某些鈣和磷酸酯結合位點的可用性以及其它因素是將來鈣化的主要指標。圖2的圖因此表明降低組織中醛/酸的水平將減少組織鈣化的傾向。
[0116]如以上提到的，現(xiàn)在應當理解的是，組織中醛基團氧化成羧酸基團產生鈣化的增加。這種現(xiàn)象的證據(jù)在圖3的圖中提供。具體地，如以上所解釋，組織中的酸水平與植入后的鈣化傾向直接相關。圖3表明在各種組織樣品中的酸水平。組織處理的類型是新鮮的未處理的組織、戊二醛-固定的組織、XenoLogiX(XLX)、ThermaFix(TFX)、只用甘油和乙醇處理的ThermaFix組織，以及GLX方法，其包括用戊二醛處理、用乙醇胺加帽同時用硼氫化鈉還原、和用甘油和乙醇脫水。
[0117]圖4和5是兔肌內植入研究的結果，顯示GLX方法(在本發(fā)明中描述)相對于現(xiàn)有技術(TFX)和相對于簡單的甘油處理(GLY-處理的)顯著地減少鈣化。這些數(shù)據(jù)也顯示GLX方法減少鈣化中的變異性。所有的鈣化測量通過原子吸收光譜測量并歸一化為凍干組
織的干重量。
[0118]圖6和7圖解在80天的實時貯存期后，GLX處理的組織相比TFX或單獨甘油處理的組織顯示顯著更少的鈣化。GLX方法也降低了 80天貯存期后的變異性。所有的鈣化測量通過原子吸收光譜測量并歸一化為凍干組織的干重量。
[0119]基于前述實驗結果，本發(fā)明人認為施加于生物假體組織的脫水組織的氧化損傷極大促進組織鈣化的傾向。具體地，不在戊二醛中貯存的心瓣膜小葉受到顯著的氧化損傷。這種有害的組織損傷過程可以產生先前沒有檢測或識別到的新的結合位點，作為鈣和磷離子的潛在附著位點，由此引起鈣化。
[0120]為了幫助預防這種植入后損傷-鈣化過程，本發(fā)明涉及通過加帽易于氧化的和增加鈣化引發(fā)的許多醛來減輕氧化。
[0121]優(yōu)選的實施方式包括但不限于:
[0122]1.在包含醛加帽劑的溶液中處理固定的組織瓣膜或組織片。
[0123]2.實施方式1，但是其中在加帽過程期間或之后，加入滅菌步驟。
[0124]3.實施方式I和2，但是其中處理被搖動。
[0125]4.實施方式1、2和3，但`是其中加帽劑用于其它結合位點如酸或生物免疫相關的位點。
[0126]5.醛加帽溶液可以包含在pH7.4的50mM磷酸鹽緩沖液中的胺(IOmM乙醇胺)和還原劑(132mM硼氫化鈉)。
[0127]6.組織或瓣膜然后在甘油溶液中脫水。
[0128]7.組織或瓣膜然后用環(huán)氧乙烷滅菌。
[0129]實施例1-使用乙醇胺和硼氫化鈉的戊二醛固定組織的醛加帽。剛好在熱處理步驟之后，生物假體組織從0.625%戊二醛中移走，然后在乙醇:鹽水(20%/80%)中漂洗2分鐘。制備I升包含在50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.3-7.8)中的IOmM乙醇胺(0.06%)和IlOmM硼氫化鈉(0.42%)的加帽溶液。
[0130]加帽溶液放置在定軌搖床上，然后組織(小葉或瓣膜)放置在該溶液中，使得它們被完全浸沒。組織與溶液的比例是每100ml中3個小葉或每100ml中一個瓣膜。容器被部分地覆蓋，但是不完全密封，因為與水化學反應釋放的氫氣可能使容器爆炸。定軌搖床以SO-1OOrpm在室溫運行4小時。然后取出組織并在FET溶液(甲醛、乙醇、吐溫-80)中漂洗3分鐘。
[0131]實施例2-心包瓣膜生物假體組織的甘油脫水過程。心包瓣膜通過用鑷子將每個瓣膜保持在瓣膜的縫合環(huán)上并將瓣膜放置在甘油/乙醇(75%/25%)混合物中來脫水。含瓣膜的燒杯放置在50-60RPM之間運轉的定軌搖床上至少一(I)小時，但是不超過四(4)小時，然后立即處理以去除過量甘油。這通過用鑷子將它們保持在瓣膜的縫合環(huán)上、從甘油/乙醇混合物中取出瓣膜并且隨后將其放置在廣口瓶中的吸收毛巾(absorbent towel)上進行。在使其室溫干燥至少5分鐘后，將廣口瓶連接到凍干機和干燥2個小時。瓣膜然后轉移至環(huán)氧乙烷氣體能滲透的包裝中并用環(huán)氧乙烷滅菌。
[0132]實施例3-鈣化減輕-小動物模型。為了評估GLX處理和EO滅菌的心包組織的鈣化減輕性能，進行兩種小動物可行性研究。這些研究表明，I)在減輕組織中鈣化發(fā)生方面，GLX優(yōu)于TFX，和2)在減輕鈣化方面，實時老化的GLX也優(yōu)于TFX。在兩個研究中，當與TFX瓣膜比較時，GLX瓣膜表明鈣化數(shù)據(jù)中減小的變異性。試驗方法和每個結果在下面總結。
[0133]實施例3A-兔研究#1。在35天大鼠肌內研究中環(huán)氧乙烷滅菌對GLX處理的心包組織的鈣化潛力。進行使用六十(60)只兔的研究，以觀察對使用100%環(huán)氧乙烷滅菌的GLX處理的心包?丐化的影響。對照組是ThermaFix (TFX)處理的牛心包,而試驗組是GLX處理的心包。使用符號軼和檢驗(sign-rank test),發(fā)現(xiàn)GLX組織當與TFX比較時,有顯著差別(p=0.0004)，并且表明相對于TFX有93%的鈣化減少。GLX數(shù)據(jù)也顯示減少的異常值和降低的變異性。對于GLX過程，箱線圖顯示可觀的變異性減小。圖7提供數(shù)據(jù)，其中y-軸測量微克鈣/毫克干重量組織。
[0134]實施例3B-兔研究#2。在35天大鼠肌內研究中短期貯存期對GLX處理的心包組織的鈣化的影響。進行使用另外六十(60)只兔的第二項研究，以觀察短期貯存期對GLX處理的心包的?丐化的影響。對照組是ThermaFix (TFX)處理的牛心包,而試驗組是GLX處理的心包。GLX組織樣品被包裝在Tyvek袋中，并經100%環(huán)氧乙烷滅菌。在25°C和60%濕度下，GLX樣品被貯存在受控穩(wěn)態(tài)室中83天的期間。TFX樣品沒有被老化。在該研究中，GLX處理的組織表現(xiàn)顯著降低的鈣化水平，與TFX相比73%(p=0.009)，以及減小的異常值和減少的數(shù)據(jù)變異性。在圖8中提供數(shù)據(jù)，其中1-軸測量微克鈣/毫克干重量組織。
[0135]雖然發(fā)明已經以其優(yōu)選方式描述，但是應該理解的是已經使用的語言是描述性的言語而不是限制性的。因 此，在所附權利要求內可以進行改變，而不偏離本發(fā)明的真正范圍。
【權利要求】
1.在生物假體組織中減輕鈣化的方法，所述方法包括: 至少部分交聯(lián)所述生物假體組織； 用加帽劑處理所述生物假體組織，其中所述加帽劑同與所述生物假體組織相關的官能團反應；并且 用還原劑處理所述生物假體組織，其中所述還原劑還原所述加帽劑同與所述生物假體組織相關的官能團的反應產生的任何希夫堿。
2.權利要求1所述的方法，其中所述生物假體組織選自牛心包、豬組織、血管、皮膚、硬腦膜、心包、小腸粘膜下層、組織心瓣膜、韌帶和腱。
3.權利要求1所述的方法，其中所述至少部分交聯(lián)所述生物假體組織用戊二醛或其他含醛試劑進行。
4.權利要求1所述的方法，其中所述處理步驟在所述至少部分交聯(lián)步驟之后進行，并且其中所述官能團與所述至少部分交聯(lián)生物假體組織相關。
5.權利要求1所述的方法，其中所述官能團與所述生物假體組織的體內毒性、鈣化和免疫原性相關。
6.權利要求5所述的方法，其中所述官能團為醛基團和羧酸基團的一個或者二者。
7.權利要求1所述的方法，其中所述加帽劑是選自以下的一個或者多個:胺、烷基胺、氨基醇、乙醇胺、氨基酸、賴氨酸、羥賴氨酸、氨基磺酸鹽、?；撬?、氨基硫酸鹽、葡聚糖硫酸鹽、軟骨素硫酸鹽、親水性多官能聚合物、聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、疏水性多官能聚合物、α - 二羰基類、甲基乙二醛·、3-脫氧葡糖醛酮、乙二醛、酰肼類、己二酸酰肼、肝素、單環(huán)氧烷烴、二環(huán)氧烷烴和聚環(huán)氧烷烴。
8.權利要求1所述的方法，其中所述還原劑選自硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、乙酰丙酮中的亞硫酸氫鈉和甲醛中的甲酸。
9.權利要求1所述的方法，進一步包括使所述至少部分交聯(lián)的組織脫水或者用甘油溶液處理所述至少部分交聯(lián)的生物假體組織中的一種。
10.權利要求9所述的方法，進一步包括在脫水或者用甘油溶液處理之后包裝所述至少部分交聯(lián)的生物假體組織。
11.權利要求10所述的方法，進一步包括對所包裝的、至少部分交聯(lián)的生物假體組織進行滅菌。
12.權利要求11所述的方法，其中所述滅菌通過環(huán)氧乙烷、Y照射或電子束輻射進行。
13.生物假體心瓣膜，其包括權利要求1-12中的任一項所述的方法處理的生物假體植入組織。
14.在生物組織中減輕鈣化的方法，所述方法包括: 用戊二醛或其他含醛試劑至少部分交聯(lián)所述生物假體組織；和 將所述交聯(lián)的生物假體組織暴露于加帽劑，所述加帽劑為選自以下的一種或其組合:乙醇胺、羥賴氨酸、?；撬?、葡聚糖硫酸鹽、軟骨素硫酸鹽、親水性多官能聚合物、聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、疏水性多官能聚合物、α - 二羰基類、甲基乙二醛、3-脫氧葡糖醛酮、乙二醛、酰肼類、己二酸酰肼、肝素、單環(huán)氧烷烴、二環(huán)氧烷烴和聚環(huán)氧烷烴。
15.權利要求14所述的方法，其中所述生物假體組織選自牛心包、豬組織、血管、皮膚、硬腦膜、心包、小腸粘膜下層、組織心瓣膜、韌帶和腱。
16.權利要求14所述的方法，其中所述暴露步驟在所述至少部分交聯(lián)步驟之后進行，并且其中所述官能團與所述至少部分交聯(lián)的生物假體組織相關。
17.權利要求14所述的方法，其中所述加帽劑是乙醇胺。
18.權利要求14所述的方法，其中所述加帽劑是?；撬?。
19.權利要求14所述的方法，其中所述加帽劑以水溶液、有機溶劑和有機緩沖溶液中的一種或其組合提供。
20.權利要求19所述的方法，其中所述水溶液選自:緩沖溶液、水、短鏈醇、甘油和增塑劑。
21.權利要求14所述的方法，進一步包括與將所述生物假體組織暴露于所述加帽劑的步驟同時或者在該步驟之后將所述生物假體組織暴露于還原劑。
22.權利要求21所述的方法，其中所述還原劑選自硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、乙酰丙酮中的亞硫酸氫鈉和甲醛中的甲酸。
23.權利要求14所述的方法，進一步包括使所述至少部分交聯(lián)的生物假體組織脫水或者用甘油溶液處理所述至少部分交聯(lián)的生物假體組織中的一種。
24.權利要求23所述的方法，進一步包括在脫水或者用甘油溶液處理之后包裝所述至少部分交聯(lián)的生物假體組織。
25.權利要求24所述的方法，進一步包括對所包裝的、至少部分交聯(lián)的生物假體組織進行滅菌。
26.權利要求25所述的方法，其中所述滅菌通過環(huán)氧乙烷、Y照射或電子束輻射進行。
27.生物假體心瓣膜，其包括權利要求14-26中的任一項所述的方法處理的所述生物假體植入組織。
28.在生物假體組織中減輕鈣化的方法，所述方法包括: 至少部分交聯(lián)所述生物假體組織；和 用加帽劑溶液處理所述生物假體組織以便同與所述生物假體組織相關的羧酸官能團反應，所述加帽劑溶液包括胺連同N，N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯、碳二亞胺、1-乙基_3_[3_ 二甲氛基丙基]碳二亞胺、N-環(huán)己基-N' -(2_嗎琳乙基)碳二亞胺、1，3_ 二環(huán)己基碳二亞胺、2-氯-1-甲基碘代吡啶和N-羥基硫代琥珀酰亞胺中的一個或者多個。
29.權利要求28所述的方法，其中所述加帽劑溶液包括乙醇胺、1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺。
30.生物假體心瓣膜，其包括根據(jù)權利要求28或者29所述的方法處理的所述生物假體植入組織。
【文檔編號】A61L27/36GK103705980SQ201410014350
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2008年12月19日 優(yōu)先權日:2007年12月21日
【發(fā)明者】J·S·德芙, D·多布拉, J·A·戴維森, G·A·懷特 申請人:愛德華茲生命科學公司