一種聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及具有抑制白介素-6，能預防和治療類風濕性關節(jié)炎的多肽。其序列為mPEG-SC20k-VFLCGLLVMAC是全新的序列，本發(fā)明的有益效益是可用于治療類風濕性關節(jié)炎，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【專利說明】一種聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽及其應用
[0001]【技術(shù)領域】:
本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及用于預防和治療或預防類風濕性關節(jié)炎的白介素-6多肽抑制劑。
[0002]【背景技術(shù)】:
類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是臨床最常見的炎性關節(jié)病和主要致殘因素之一。在全世界約為0.5%-1.0%，RA的發(fā)病在我國約為0.4%。RA可發(fā)生于任何年齡，隨著年齡的增長，發(fā)病率也隨之增高。女性高發(fā)年齡為45-55歲，性別與RA發(fā)病關系密切，男女之比約1:3。RA是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，以慢性、對稱性、多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，屬于自身免疫炎性疾病?；颊叱Ｒ允植炕蛲蟛刻弁醇澳[脹(特別是腕背部的腫脹)為首發(fā)癥狀，癥狀持續(xù)不緩解，普通的對癥治療雖可以緩解癥狀，但常常由于用藥不規(guī)則或不足量而導致癥狀反復。病情進展時可以出現(xiàn)明顯的晨僵，通?？蛇_I小時以上，并不斷加重；同時出現(xiàn)一定的關節(jié)功能障礙。
[0003]類風濕關節(jié)炎的病因和發(fā)病機制尚未完全明了，其基本病理特點是血管炎和滑膜炎。關節(jié)內(nèi)滑膜血管增生，形成血管翳，導致滑膜增厚，滲出增多，分泌多種細胞因子，侵犯軟骨并引起骨質(zhì)損害。對其周圍的肌腔、韌帶、腱鞘以及肌肉等組織也均可侵蝕，從而影響關節(jié)的穩(wěn)定，容易發(fā)生關節(jié)畸形而出現(xiàn)功能障礙。血管炎亦可侵犯周身各臟器組織，形成系統(tǒng)性疾病。
[0004]目前治療RA的藥物分 為兩大類:控制癥狀藥和控制疾病藥。由于RA病因不明，故當今并無堪稱控制疾病的藥。控制癥狀的抗風濕藥分為四類:一、非留體類抗炎藥，通常稱為一線藥，這類藥物種類繁多，國內(nèi)市場已多達數(shù)十種。二、類固醇激素，激素是一個非常好的止痛抗炎藥，但長期單獨使用不能改善病情，反而帶來許多副作用，激素作為二線慢作用藥起效前的過渡性用是可以的，但用量要小，時間不宜過長。在病情較重，伴有關節(jié)外表現(xiàn)的患者，短期治療沖擊，并聯(lián)合二線藥治療時必須的。三、慢作用抗風濕藥，通常稱為二線藥，所謂慢作用藥包括抗瘧藥、金鹽、青霉胺和柳氮碘胺吡啶，它們治療RA起效慢，長期作用對RA病情有一定緩解作用，故也稱病情改善藥。四、免疫抑制劑:常用有甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、雷公藤、青風藤等。
[0005]在治療RA的生物制劑中，臨床上研究較多的就是白介素-6(11-6)的拮抗劑。11_6是活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子。能使B細胞前體成為產(chǎn)生抗體的細胞；和集落刺激因子協(xié)同，能促進原始骨髓源細胞的生長和分化，增強自然殺傷細胞的裂解功能，在RA發(fā)病過程中起著重要作用。11-6拮抗劑的作用是特異性地拮抗11-6，抑制RA的病情進展。
[0006]VFLCGLLVMAC是一個全新的序列，前期的研究表明，該多肽經(jīng)反復體內(nèi)外活性評價證實具有較好的抗類風濕關節(jié)炎效果，能夠顯著抑制IL-6活性。然而上述多肽的半衰期短，擬用臨床人的給藥是每天靜脈滴注，這給患者帶來了一定的痛苦。
[0007]文獻報道中，對分子結(jié)構(gòu)進行修飾或改造是解決半衰期較短、需連續(xù)給藥問題的常用方法，其中以化學修飾應用最為廣泛，常用的化學修飾劑有聚乙二醇(polye thyleneglycol, PEG)、葡聚糖、聚氨基酸、聚酸酐等。PEG具有無毒、無免疫原性、水溶性好的特點，被美國食品與藥物管理局(FDA)認可作為藥品的輔助原料和修飾劑。蛋白質(zhì)類藥物經(jīng)PEG修飾后，分子量增加，腎小球的濾過率減少，PEG的屏障作用保護了蛋白質(zhì)不易被蛋白水解酶水解，同時減少了中和抗體的產(chǎn)生，這些均有助于蛋白質(zhì)類藥物生物半衰期的延長。目前已有多種PEG修飾的蛋白質(zhì)類藥物上市銷售。但PEG修飾同時也可能影響蛋白質(zhì)的生物學活性，其影響大小與修飾劑、修飾條件及蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關。對于具體的蛋白質(zhì)，其最佳修飾需通過制備PEG修飾的蛋白質(zhì)及生物活性研究來決定。合成小分子多肽的PEG修飾研究起步較晚，但已引起不少研究者的關注。
[0008]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有11-6拮抗劑的特點，設計全新序列的11-6多肽拮抗劑，更加適用于臨床的應用。
[0009]本發(fā)明技術(shù)方案是提供一種聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽，其序列為mPEG-SC20K-VFLCGLLVMAC,及在治療或預防類風濕性關節(jié)炎藥物中的應用。
[0010]有益結(jié)果: 本發(fā)明中的聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽序列mPEG-SC2(IK-VFLCGLLVMAC，可以靶向抑制白介素_6，抑制腫瘤壞死因子受體產(chǎn)生的生理或病理的效應，達到預防或治療類風濕性關節(jié)炎的效果。
[0011]發(fā)明人經(jīng)過大量實驗獲知聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽能夠抑制佐劑型大鼠類風濕關節(jié)炎和DBA/1小鼠膠原型類風濕性關節(jié)炎的發(fā)展，體內(nèi)實驗證明具有顯著的治療類風濕型關節(jié)炎的效果，并且副作用少，用量少成本降低。說明本發(fā)明設計的聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽科學、合理、可行有效，能作為治療或預防類風濕性關節(jié)炎藥物。
【具體實施方式】
[0012]本發(fā)明涉及多肽由吉爾生化(上海)有限公司合成。
[0013]實施例1
聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽在膠原誘導小鼠關節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用構(gòu)建膠原型小鼠關節(jié)炎動物模型，研究聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對小鼠膠原誘導性關節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)的治療作用。采用小鼠作為受試動物，SPF級DBA/1小鼠90只(由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司(Sino-British SIPPRLab.Animal Ltd)提供，動物生產(chǎn)許可證號碼:SCXK (滬)2008-0016)，雄性，7-8周齡，體重為18-22 g，隨機分成6組，分別是正常對照組，模型對照組，多肽抑制劑I低中高3個劑量組(5，10，20 mg/kg)和陽性藥對照組(甲氨蝶呤2 mg/kg)。除正常組外，第O天各實驗組建立小鼠CIA模型，方法是雞軟骨II型膠原(c II )用0.1 mol/Ι醋酸溶解成4 mg/ml的溶液，于4°C冰箱過夜。實驗當天用II型膠原與含4 mg/ml Myeobaeterium tuberculosisstrain H37Rv的完全弗氏佐劑(CFA)等體積充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮內(nèi)每只注射乳化劑50 μ?進行致敏，21 d后用4 mg/ml的II型膠原(c II )與不完全弗氏佐劑(IFA)等體積充分乳化后以相同劑量的乳化劑于尾部進行再次免疫。造模第30 d起皮下注射給藥:多肽的3個劑量組(5，10，20 mg/kg ):每日兩次，連續(xù)10天；陽性藥對照組(甲氨蝶呤2 mg/kg ):每五天一次，連續(xù)3次；正常對照組和模型對照組(生理鹽水):連續(xù)10天。分別于造模后第21天至第70天每3天稱量體重、關節(jié)評分、分別檢測左右后足足踝直徑來觀察藥物對小鼠膠原型關節(jié)炎的影響。
[0014]結(jié)果:造模后小鼠與正常小鼠相比較，免疫后第27天，CIA小鼠足爪紅腫，關節(jié)炎指數(shù)評分增高，模型組第45-60天為腫脹高峰，模型組自第35天開始體重幾乎不增加，后期還略微有下降。聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽在膠原誘導小鼠關節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用具體結(jié)果如下:
聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對小鼠膠原型關節(jié)炎左足足爪腫脹度的影響，陽性對照組、聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽高、中、低劑量組左后足踝直徑與模型組比較，均有極顯著性差異(P〈0.01)實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對小鼠膠原型關節(jié)炎右足足爪腫脹度的影響，陽性對照組、聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽高、中、低劑量組右后足踝直徑與模型組比較，均有極顯著性差異(P〈0.01)，實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對膠原型關節(jié)炎小鼠臨床評分的影響，多肽低、中、高劑量組四肢評分顯著低于模型對照組(P < 0.01)，與模型對照組比較極顯著性差異，實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對膠原型關節(jié)炎小鼠體重影響，多肽高、中、低劑量組體重顯著高于模型對照組(P < 0.01)，與模型對照組比較極顯著性差異，實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。
[0015]結(jié)論:聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對小鼠膠原型關節(jié)炎具有治療作用。
[0016]實施例2 聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對佐劑型大鼠關節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用構(gòu)建佐劑型大鼠關節(jié)炎動物模型，研究聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對佐劑性關節(jié)炎(Adjuvant arthritis, AA)大鼠的治療作用。采用大鼠作為受試動物,SPF級SD大鼠90只(由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司(Sino-British SIPPR Lab.Animal Ltd)提供，動物生產(chǎn)許可證號碼:SCXK (滬)2008-0016),雄性，體重為140 g-160 g，隨機分成6組，分別是正常對照組，模型對照組，聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽低中高3個劑量組(5,10,20 mg/kg)和陽性藥對照組(甲氨蝶呤I mg/kg)。除正常組外，第O天各實驗組建立大鼠AA模型，方法是在大鼠的左側(cè)后足足跎注射含滅活的結(jié)核分枝桿菌(H37RA，10 mg/ml)完全弗氏佐劑0.08 ml造成大鼠佐劑性關節(jié)炎模型。造模第10天起皮下注射給藥:多肽的3個劑量組(5，10，20 mg/kg ):每日兩次，連續(xù)10天；陽性藥對照組(甲氨蝶呤I mg/kg ):每五天一次，連續(xù)3次；正常對照組和模型對照組(生理鹽水):連續(xù)10天。分別于造模后第8，11，14，17，20, 23和26天，稱量體重、關節(jié)評分、分別檢測左右后足足踝直徑來觀察藥物對大鼠佐劑型關節(jié)炎的影響。
[0017]結(jié)果:造模后大鼠與正常大鼠相比較，AA大鼠左后足會迅速產(chǎn)生原發(fā)性關節(jié)炎，出現(xiàn)明顯的腫脹，并伴有潰爛；右后足大約10 d后開始出現(xiàn)繼發(fā)性關節(jié)炎，評分的分值逐漸增大；同時耳部血管增生明顯，紅腫明顯；尾部關節(jié)出現(xiàn)腫脹。聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽在佐劑性大鼠關節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用，具體結(jié)果如下:
聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對大鼠原發(fā)性關節(jié)炎足爪腫脹度的影響，大鼠陽性對照組、聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽的低、中、高劑量組左后足踝直徑與模型組比較，有極顯著性差異(P〈0.01);聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽低、中、高劑量組左后足踝直徑與模型組比較，均有顯著性差異(P〈0.05)，實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對大鼠繼發(fā)性關節(jié)炎足爪腫脹度的影響，大鼠陽性對照組、聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽低、中、高劑量組右后足踝直徑與模型組比較，有顯著性差異(P〈0.05)。聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對佐劑型關節(jié)炎大鼠臨床評分的影響，多肽低、中、高劑量 組四肢評分顯著低于模型對照組(P < 0.05)，與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義。聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對佐劑型關節(jié)炎大鼠體重影響，多肽高、中、低劑量組體重顯著高于模型對照組(P < 0.05)，與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義。
[0018]結(jié)論:聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽對AA大鼠關節(jié)炎具有治療作用。
【權(quán)利要求】
1.聚乙二醇修飾的抑制白介素-6多肽，其特征在于其序列為mPEG-SC-VFLCGLLVMAC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乙二醇修飾的白介素-6抑制劑多肽，其特征在于所述的mPEG-SC的分子量為20000。
3.聚乙二醇修飾的抑制白介素`-6多肽在治療或預防類風濕性關節(jié)炎藥物中的應用。
【文檔編號】A61P19/02GK103739673SQ201310748725
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】羅瑞雪 申請人:羅瑞雪