一種抑制粘附斑激酶多肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及具有抑制粘附斑激酶活性，治療急性淋巴細胞性白血病的多肽。其序列為ADLIDGYRLVNGTSQRALERLV是全新的序列，它們可以體外抑制粘附斑激酶活性，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【專利說明】一種抑制粘附斑激酶多肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及抑制粘附斑激酶多肽及其應用，具體涉及具有抑制粘附斑激酶活性、治療急性淋巴細胞性白血病的多肽。
【背景技術】
[0002]急性淋巴細胞性白血病(ALL)是一種進行性惡性疾病，其特征為大量的類似于淋巴母細胞的未成熟白細胞。這些細胞可在血液、骨髓、淋巴結、脾臟和其它器官中發(fā)現(xiàn)。急性淋巴細胞性白血病占兒童急性白血病的80%，發(fā)病率高峰在3歲至7歲之間。ALL也可發(fā)生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年來隨著醫(yī)學研究的深入，對急性淋巴細胞性白血病的認識和治療取得了很大進展。其中，粘附斑激酶在急性淋巴細胞性白血病中扮演著重要角色。
[0003]粘附斑激酶(focal adhesion kinase, FAK )是一種胞質非受體蛋白酪氨酸激酶，是粘附斑復合物家族(focal adhesion complex family)的一員。具有酪氨酸激酶活性，在受到原癌基因產物和胞外基質-整合素的刺激后發(fā)生磷酸化。此外，小神經肽、內皮素和血管升壓素等都能使其磷酸化FAK參與了多條細胞信號通路，它是胞內外信號轉導的中樞。它可以整合來自胞外的營養(yǎng)、壓力、細胞粘著等方面的信號，調節(jié)下游分子的活性，控制細胞的代謝、增殖，甚至是細胞的命運。近年的研究表明FAK可以調控細胞的生長、錨定、遷移、惡變和凋亡等過程，與腫瘤的發(fā)生密切相關。
[0004]目前發(fā)現(xiàn)有FAK表達或者活性增強的腫瘤有結腸癌、乳腺癌、胸腺癌、胃癌以及膠質母細胞瘤和黑色素瘤等。用FAK特異性抑制劑處理體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，可以抑制細胞的增殖、生長、擴散和遷移。磷酸化的FAK與Src形成復合體，可以激活或抑制多條下游通路，包括PI3K /Akt.RIP.p53和RAS-Erk等，起始腫瘤發(fā)生或誘導細胞凋亡。Wu等用shRNA技術處理神經母細胞瘤細胞發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK可以抑制整合素A5B1誘導的細胞遷移，并且FAK還可以通過其激酶結構域活化Src。當小鼠乳腺缺失了 FAK后，不影響乳腺上皮細胞的正常發(fā)育，但卻能抑制由PyMT激發(fā)的乳腺癌的發(fā)生；敲出體外培養(yǎng)的人乳腺癌細胞的FAK，可以阻止癌細胞的生長、誘導細胞衰老(cell senescent)。用ATP競爭性FAK和PYK2抑制劑，如PF-562，271、PF-573，228等，處理體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，可以抑制細胞遷移。一期臨床試驗結果表明，F(xiàn)AK抑制劑對多種腫瘤有明顯的治療作用。FAK是腫瘤發(fā)生、增殖、遷移等過程的關鍵蛋白，研究新的特異性FAK抑制劑將是癌癥研究和治療的途徑之一。但目前未見有FAK抑制劑治療急性淋巴細胞性白血病。
[0005]因此，需要設計特異性強的粘附斑激酶抑制劑用于治療急性淋巴細胞白血病。粘附斑激酶抑制劑包括大分子和小分子。大分子抑制劑的制備和使用限制了它們的發(fā)展，例如重組人粘附斑激酶抑制因子的體內半衰期短。很多成功的小分子抑制劑，可以在納摩爾水平上抑制粘附斑激酶的活力，但小分子抑制劑缺乏特異性，如果在慢性疾病中長期使用缺乏特異性的粘附斑激酶抑制劑可產生較大副作用。因而，從粘附斑激酶抑制劑的應用角度來看，以急性淋巴細胞白血病作為研究對象是正確的選擇。在急性反應期，機體能夠耐受短期的、粘附斑激酶廣譜抑制劑對正常生理功能的抑制，同時使關鍵組織器官的生理結構免受破壞，增加了生存幾率。
[0006]本專利中的抑制粘附斑激酶多肽已證明在急性淋巴細胞白血病中有效，具有在其他腫瘤模型中開發(fā)的前景。

【發(fā)明內容】

[0007]發(fā)明目的
本發(fā)明提供全新的序列，該序列粘附斑激酶抑制劑，對急性淋巴細胞白血病具有很好的療效。
[0008]技術方案 抑制粘附斑激酶多肽，其特征在于其序列為ADLIDGYRLVNGTSQRALERLV。
[0009]抑制粘附斑激酶多肽在治療急性淋巴細胞白血病藥物中的應用。
[0010]有益效果
利用固相合成法化學合成抑制粘附斑激酶多肽，該多肽具有全新的序列，該多肽可體外抑制粘附斑激酶，治療急性淋巴細胞白血病。在內毒素休克模型實驗中成功的增加了小鼠的生存率。我們發(fā)現(xiàn)的多肽抑制劑可以同時抑制粘附斑激酶活力，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【具體實施方式】
[0011]本發(fā)明涉及多肽由吉爾生化(上海)有限公司合成。
[0012]實施例1
抑制粘附斑激酶多肽對體外粘附斑激酶活性的作用。
[0013]取新鮮牛腦組織，剝去腦膜和大的血管，剪碎，用冷MES緩沖液洗滌1-2次，以每克腦組織0.5-lml的比例加入MES緩沖液，在4°C下，用電動勻漿器勻漿；4°C，105000g離心lh，取上清，加入等體積的微管聚合緩沖液，37°C水浴保溫30min。26°C，105000g離心lh，取沉淀，加入約1/10勻漿體積的冷MES緩沖液，輕輕攪拌或用勻漿器將沉淀碾碎；將懸液放冰浴30min，使沉淀完全溶解。用Lowry’s法測定蛋白含量(SDS聚酰胺凝膠電泳法)。粘附斑激酶用MES緩沖液稀釋至4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷凍的粘附斑激酶溶液，快速用常溫水沖其壁，使之融化，放入冰浴，用MES緩沖液稀釋至所需濃度(2-3mg/ml)，加入ATP至lmmol/1。以從冰浴中馬上取出的粘附斑激酶溶液在分光光度計350nm處調定為“0”點。然后將比色杯在37°C溫度下測定粘附斑激酶溶液的OD值，連續(xù)20-30min，記錄溫度-吸光值曲線(T-0D曲線)，重復三次。
[0014]抑制率計算:抑制率(％)=(對照管“0D”值一加藥管“0D”值)/對照管“0D” 實驗組設五個劑量:0.75iiM、l.5iiM、3iiM、12iiM、24iiM，陽性對照組長春新堿劑量
3 u M，空白組加入等體積的溶劑DMSO ;按上述操作測定吸光值。結果，隨抑制粘附斑激酶多肽濃度增加，抑制率逐漸升高，說明有抑制粘附斑激酶活性隨藥物濃度的增加而不斷增加。
[0015]實施例2
抑制粘附斑激酶多肽對體外培養(yǎng)腫瘤細胞的生長和存活IC50。
[0016]采用MTT比色法。將對數生長的U937細胞，以1.0X 105加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物抑制粘附斑激酶多肽和陽性對照藥物長春新堿；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設五個復孔，培養(yǎng)48h，分別在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式腫瘤細胞生長抑制率=(1-實驗組吸光值/對照組吸光值)X100%。計算出實驗藥物的IC50為33.43ii M。
[0017]實施例3 用腫瘤模型檢測抑制粘附斑激酶多肽的體內活力。
[0018]建立U937腫瘤模型，陽性對照藥物長春新堿；空白組加入相同體積的溶劑，實驗組設3個劑量:0.75、1.5iiM、3iiM mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數量，計算存活率。結果顯示，抑制粘附斑激酶多肽可有效地保護小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率達到83.31%。
【權利要求】
1.抑制粘附斑激酶多肽，其特征在于其序列為ADLIDGYRLVNGTSQRALERLV。
2.抑制粘附斑激酶多肽在治療急性淋巴細胞性白血病藥物中的應用。
【文檔編號】A61K38/16GK103739680SQ201310748503
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權日:2013年12月31日
【發(fā)明者】羅瑞雪 申請人:羅瑞雪