用于因子xa抑制劑的解毒劑和其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及靶向因子Xa的抗凝血?jiǎng)┑慕舛緞?。所述解毒劑是因子Xa蛋白質(zhì)衍生物，所述因子Xa蛋白質(zhì)衍生物結(jié)合至因子Xa抑制劑，由此實(shí)質(zhì)上中和所述因子Xa抑制劑而不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。本文所述衍生物缺少固有凝血活性或具有降低的固有凝血活性。本文揭示了停止或阻止目前正利用因子Xa抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的患者出血的方法。
【專利說明】用于因子XA抑制劑的解毒劑和其使用方法
[0001] 本申請(qǐng)為2010年3月19日進(jìn)入中國國家階段、申請(qǐng)?zhí)枮?00880107973.8、申請(qǐng)日為2008年9月26日、發(fā)明名稱為“用于因子XA抑制劑的解毒劑和其使用方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
_2] 相關(guān)_請(qǐng)案交叉參考
[0003]本申請(qǐng)案根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)主張2007年9月28日提出申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第60/976，343號(hào)和2008年8月20日提出申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/090，574號(hào)的權(quán)利，這兩個(gè)臨時(shí)申請(qǐng)案均以整體引用的方式并入本文中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及因子Xa(fXa)衍生物的用途，所述因子Xa (fXa)衍生物具有降低的固有促凝血活性或沒有固有促凝血活性，但能夠結(jié)合和/或中和fXa抑制劑，由此作為靶向fXa的抗凝血?jiǎng)┑慕舛緞垺?br> 【背景技術(shù)】
[0005]市場(chǎng)上在治療或預(yù)防在不活動(dòng)時(shí)或正接受醫(yī)療手術(shù)時(shí)易于形成血凝塊的患者(例如，那些患有凝血病癥的患者)的不期望血栓形成時(shí)需要抗凝血?jiǎng)?。然而，抗凝血療法的一個(gè)重要限制是與治療有關(guān)的出血風(fēng)險(xiǎn)，且在服用過量或如果需要緊急手術(shù)的情況下限制了迅速逆轉(zhuǎn)抗凝血活性的能力。因此，業(yè)內(nèi)極為期望針對(duì)所有形式的抗凝血療法的特定且有效解毒剤。出于安全考慮，同樣有利的是在研發(fā)新的抗凝血?jiǎng)┧幬镏蝎@得抗凝血?jiǎng)?解毒劑對(duì)。
[0006]目前對(duì)于過度抗凝血可用的抗凝血?jiǎng)?解毒劑對(duì)是肝素-魚精蛋白和華法林(warfarin)-維生素K。新鮮的冷凍血衆(zhòng)和重組因子Vila(rfVIIa)也已用作在低分子量肝素治療中正經(jīng)受嚴(yán)重創(chuàng)傷或嚴(yán)重失血的患者的非特異性解毒剤。(勞里岑(Lauritzen’B.)等人，血液(Blood) ,2005，607A-608A。)還報(bào)導(dǎo)了魚精蛋白片段(美國專利第6，624，141號(hào))和小的合成肽(美國專利第6，200，955號(hào))作為肝素或低分子量肝素解毒劑；和凝血酶突變蛋白質(zhì)(美國專利第6，060, 300號(hào))作為凝血酶抑制劑的解毒剤。已報(bào)導(dǎo)將凝血酶原中間產(chǎn)物和衍生物作為水蛭素和合成凝血酶抑制劑的解毒劑(美國專利第5，817，309號(hào)和第6，086，871 號(hào))。
[0007]抗凝血療法的一種有希望的形式靶向因子Xa(fXa)，且實(shí)際上，目前在臨床研發(fā)的不同階段中有多種直接fXa抑制劑用于抗凝血療法中。這些中的大多數(shù)是小分子。盡管這些新的fXa抑制劑展示有希望用于治療，但仍需要特定且有效的解毒剤。在過度抗凝血或利用這些fXa抑制劑治療的患者需要手術(shù)的情況下，可能需要一種試劑來實(shí)質(zhì)上中和所投與的ー種或多種fXa抑制劑并恢復(fù)正常止血。
[0008]目前可用試劑(例如重組因子`Vlla(rfVIIa))是以機(jī)械方式進(jìn)行限制且并非特定用于fXa抑制劑的逆轉(zhuǎn)且因此臨床醫(yī)生極為期望經(jīng)改良的方案。在人類研究中，已經(jīng)使用rfVIIa來逆轉(zhuǎn)間接抗凝血酶III依賴性fXa抑制劑(例如磺達(dá)肝素(fondaparinux)和伊達(dá)肝素(idraparinux))的作用(比斯特沃特(Bi jsterveld, NR)等人,循環(huán)(Circulation)
,2002, 106:2550-2554 ;比斯特沃特(Bi jsterveld, NR)等人，英國血液病學(xué)雜志(BritishJ.0f Haematology), 2004(124):653-658 )。因子 Vlla(fVIIa)的作用機(jī)制是與組織因子一起作用將血液循環(huán)中存在的因子X(fX)轉(zhuǎn)化成fXa來恢復(fù)患者的正常止血。必須說明的是，這種作用模式可能達(dá)到以中和活性位點(diǎn)定向fXa抑制劑的fXa的最高可能濃度受fX的循環(huán)血漿濃度限制。因此，使用rfVIIa來逆轉(zhuǎn)直接fXa抑制劑的作用的潛力機(jī)械上受限。由于fX的循環(huán)血漿濃度為150毫微摩爾(“nM”)，所以通過這種模式所產(chǎn)生的fXa的最大量將為150nM。因此，使用rfVIIa來逆轉(zhuǎn)直接fXa抑制劑的作用的潛力機(jī)械上受限。小分子fXa抑制劑(例如利伐沙班(rivaroxaban))的報(bào)告治療濃度(大約600nM,庫比察(KubitzaD)等人，歐洲臨床藥理學(xué)雜志(Eur.J.Clin.Pharmacol), 2005, 61:873-880)高于由 rfVIIa所生成的fXa的可能量。因此，使用rfVIIa來逆轉(zhuǎn)由fXa抑制劑所產(chǎn)生的治療或超治療水平的抗凝作用將提供不充分的效能水平。如圖4中所示，在中和因子Xa抑制劑貝特沙班(betrixaban)的抗凝血活性中使用rfVIIa具有有限的作用(如下文所闡述)。重組fVIIa展示50nM至100nM的劑量反應(yīng)解毒活性，但所述作用在100nM至200nM之間趨于穩(wěn)定，此表明其解毒作用受除其濃度以外的因素的限制。在所有所測(cè)試的rfVIIa濃度中，貝特沙班在250nM的濃度下仍展示fXa的劑量反應(yīng)抑制(高達(dá)約75%抑制)。此觀察結(jié)果與fVIIa的建議作用機(jī)制一致。此結(jié)果還被展示rfVIIa不能完全逆轉(zhuǎn)磺達(dá)肝素對(duì)凝血酶生成和凝血酶原活化的參數(shù)的抑制作用的研究所支持。(吉偌提法斯(Geix)tiafaS，GT)等人，血栓形成和止血(Thrombosis&Haemostasis) 2204 (91): 531-537)。
[0009]外源活性fXa不能以類似于rfVIIa的方式直接投與個(gè)體。不像rfVIIa在缺少其輔因子組織因子的情況下具有極低促凝血活性那樣，天然fXa是強(qiáng)效酶且具有造成血栓形成的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，使用rfVIIa或活性fXa作為fXa抗凝血療法的解毒劑具有許多缺點(diǎn)。
[0010]因此，需要經(jīng)改良的解毒剤，其不會(huì)造成不期望的血栓形成且在fXa抑制劑服用過量的情況下或在需要恢復(fù)正常止血以阻止或停止出血的情況下有效地實(shí)質(zhì)上中和fXa抑制劑的抗凝血活性。
[0011]本文所提及的任何及所有出版物、專利和專利申請(qǐng)案均以整體引用的方式并入本文中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，投與fXa蛋白質(zhì)的經(jīng)修飾衍生物可用作靶向fXa的抗凝血?jiǎng)┑慕舛緞?。所述fXa蛋白質(zhì)的經(jīng)修飾衍生物并不與fXa競爭組裝成凝血酶原酶復(fù)合物，而是結(jié)合和/或?qū)嵸|(zhì)上中和抗凝血?jiǎng)?例如fXa抑制剤)。可用作解毒劑的衍生物經(jīng)修飾以降低或去除固有的促凝血和抗凝血活性，同時(shí)保留結(jié)合至抑制劑的能力。預(yù)計(jì)本發(fā)明的衍生物可包括修飾活性位點(diǎn)、或改變Gla結(jié)構(gòu)域或自fXa去除整個(gè)Gla結(jié)構(gòu)域、或其各種組合。由于已知活性位點(diǎn)經(jīng)修飾的全長fXa是抗凝血?jiǎng)?，因此進(jìn)ー步預(yù)計(jì)修飾Gla結(jié)構(gòu)域?qū)⒔档突蛳齠Xa衍生物對(duì)正常止血的抗凝血作用。
[0013]進(jìn)一步預(yù)計(jì)，修飾fXa的EGF結(jié)構(gòu)域(通過EGF1、EGF2、或EGF1和EGF2兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的缺失或取代)提供用于本發(fā)明方法的衍生物。EGF結(jié)構(gòu)域修飾可單獨(dú)實(shí)施或連同Gla結(jié)構(gòu)域修飾一起實(shí)施。[0014]在一個(gè)實(shí)施例中，衍生物保留結(jié)合靶向fXa的抗凝血?jiǎng)?或fXa抑制劑)所需的結(jié)構(gòu)特性。通過衍生物直接或間接結(jié)合抑制劑，抑制劑實(shí)質(zhì)上被中和。
[0015]在ー個(gè)方面中，本發(fā)明提供阻止或降低正利用因子Xa抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的因子Xa蛋白質(zhì)衍生物，所述衍生物結(jié)合至因子Xa抑制劑但不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施例中，衍生物具有一個(gè)或ー個(gè)以上的以下性質(zhì):降低的促凝血活性或沒有促凝血活性；經(jīng)修飾或去除的Gla結(jié)構(gòu)域；和經(jīng)修飾的活性位點(diǎn)。本發(fā)明的衍生物選擇性地結(jié)合并抑制以外源方式投與的因子Xa抑制劑，由此實(shí)質(zhì)上中和fXa抑制劑的抗凝血活性。此方法涵蓋活體外和活體內(nèi)方法二者。本發(fā)明所涵蓋的對(duì)因子Xa蛋白質(zhì)的各種修飾可在整個(gè)【具體實(shí)施方式】中找到。
[0016]應(yīng)了解，本發(fā)明所涵蓋的衍生物不是血漿源性因子Vila、重組因子Vila、新鮮冷凍血漿、凝血酶原復(fù)合物濃縮物、或全血。
[0017]本發(fā)明的ー個(gè)方面是使用因子Xa衍生物和含有其的組合物來治療已接受或正利用因子Xa抑制劑接受過度抗凝血療法的患者或之前已投與因子Xa抑制劑且然后需要止血的患者(例如非急需或急診手術(shù)可能需要)。在ー個(gè)方面中，經(jīng)修飾fXa蛋白質(zhì)不同于天然存在的fXa，這是因?yàn)槠渚哂薪档偷墓逃写倌钚曰蛳逃写倌钚郧覍⒉粫?huì)妨礙在止血方面的生理fXa功能，同時(shí)仍能夠結(jié)合并實(shí)質(zhì)上中和fXa抑制劑。
[0018]在另一方面中，經(jīng)修飾的因子Xa蛋白質(zhì)是與能夠延長所述因子Xa衍生物的血漿半壽期(或循環(huán)半壽期)的試劑共同投與。在又一方面中，解毒劑與ー個(gè)部分偶聯(lián)以延長其血漿半壽期。
[0019]還提供含有因子Xa衍生物的醫(yī)藥組合物，所述因子Xa衍生物結(jié)合(和/或?qū)嵸|(zhì)上中和)因子Xa抑制劑，但不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。所述醫(yī)藥組合物任選地包含醫(yī)藥上可接受的載劑。
[0020]在另一方面中，本發(fā)明提供試劑盒，其包含用于抗凝血用途的fXa抑制劑和當(dāng)需要實(shí)質(zhì)上中和fXa抑制劑的抗凝血活性時(shí)使用的fXa抑制劑解毒劑(或因子Xa衍生物)。
[0021]本發(fā)明的ー個(gè)實(shí)施例涉及分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID N0.12或與SEQID N0.12具有至少80%同源性的多肽。另ー實(shí)施例涉及分離的雙鏈多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID N0.13或與SEQ ID N0.13具有至少80%同源性的多肽。再ー實(shí)施例涉及分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID N0.15或與SEQ ID N0.15具有至少80%同源性的多肽。
[0022]還提供包含載劑和剛剛所闡述多肽的醫(yī)藥組合物。
[0023]還提供編碼剛剛所闡述多肽的多核苷酸。
[0024]本發(fā)明進(jìn)一歩提供肽偶聯(lián)物，其包含以共價(jià)或非共價(jià)方式連接至剛剛所闡述多肽的載劑。載劑可為脂質(zhì)體、膠束、醫(yī)藥上可接受的聚合物、或醫(yī)藥上可接受的載劑。
[0025]本發(fā)明還涉及結(jié)合剛剛所闡述多肽的抗體。所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。還提供抗體的生物活性片段。所述抗體可以可檢測(cè)方式標(biāo)記。所述抗體(或抗體片段)還作為組合物的一部分提供，所述組合物進(jìn)ー步包含載劑。
[0026]在一個(gè)實(shí)施例中提供抗體-肽復(fù)合物，其包含本發(fā)明的抗體和特異性結(jié)合至所述抗體的多肽。所述多肽是受到對(duì)抗可產(chǎn)生所述抗體的多肽。所述抗體可為多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0027]在另ー實(shí)施例中提供制備本發(fā)明多肽的方法，其包含在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述多肽的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞且尤其是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell)。在一個(gè)實(shí)施例中，重鏈(SEQ ID N0.15)表達(dá)于原核細(xì)胞(例如大腸桿菌(E.coli))中。在另ー實(shí)施例中，多肽經(jīng)分離。
[0028]在再一實(shí)施例中提供分離的原核或真核宿主細(xì)胞，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述宿主細(xì)胞在組合物中，所述組合物進(jìn)ー步包含載劑。
[0029]在又一實(shí)施例中提供阻止或降低正利用因子Xa抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的組合物，所述組合物包含本發(fā)明的多肽和載劑。進(jìn)ー步提供選擇性結(jié)合并抑制正進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體中以外源方式投與的因子Xa抑制劑，其包含向所述個(gè)體投與有效量的剛剛所闡述的組合物。
[0030]在ー種阻止或減少正利用因子Xa抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的方法中，其中所述衍生物包括催化結(jié)構(gòu)域，所述催化結(jié)構(gòu)域任選地以化學(xué)方式或重組方式經(jīng)修飾以失去蛋白水解活性但保持結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)特性，所述結(jié)構(gòu)域源自以下中的任一者:a.哺乳動(dòng)物蛋白酶，其選自由血漿激肽釋放酶、凝血酶和胰蛋白酶組成的群組；或b.細(xì)菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶。
[0031]在ー種阻止或減少正利用因子Xa抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的方法中，其中所述衍生物包含具有經(jīng)修飾輕鏈的氨基酸序列SEQ ID N0.7或其等效物，其中所述衍生物包含經(jīng)修飾輕鏈以降低磷脂膜結(jié)合，其中與野生型人類因子Xa蛋白質(zhì)的Gla-結(jié)構(gòu)域相比，所述經(jīng)修飾輕鏈在所述Gl a-結(jié)構(gòu)域中包含至少ー個(gè)氨基酸取代、添加或缺失，其中所述衍生物選自由未羧化的因子Xa蛋白質(zhì)、羧化不全的因子Xa蛋白質(zhì)和脫羧的因子Xa蛋白質(zhì)組成的群組，其中所述衍生物包含SEQ ID N0.7的經(jīng)修飾重鏈或其等效物，其中所述衍生物是通過至少ー個(gè)選自由Glu216、Glu218、Arg332、Arg347、Lys351和Ser379組成的群組的氨基酸的氨基酸取代來修飾，其中Ser379經(jīng)修飾成為脫氫丙氨酸或丙氨酸，其中所述衍生物是具有氨基酸序列SEQ ID N0.10或其等效物的去Gla酐-fXa，其中所述衍生物是具有氨基酸序列SEQ ID N0.11或其等效物的去Gla fXa_S379A，其中所述衍生物與ATII1、輔因子fV/fVa和/或fVIII/fVIIIa的相互作用降低且包含氨基酸序列SEQ ID N0.7或其等效物，其中所述衍生物包含氨基酸序列SEQ ID N0.12或13或15或與SEQ ID N0.12或13或15具有至少80%同源性的多肽，其中所述衍生物在氨基酸位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、Lys414、或Arg424處具有至少ー個(gè)氨基酸取代，其中所述衍生物在EGF結(jié)構(gòu)域中具有修飾，所述修飾選自由EGF1結(jié)構(gòu)域缺失、EGF2結(jié)構(gòu)域缺失和EGF1和EGF2兩個(gè)結(jié)構(gòu)域缺失組成的群組，其中所述衍生物偶聯(lián)至能夠延長所述衍生物的循環(huán)半壽期的部分，其中所述部分選自由以下組成的群組:聚こニ醇、酰基、脂質(zhì)體、囊封劑、載劑蛋白、人工磷脂膜、納米粒子、Fc肽片段、包含F(xiàn)c載劑結(jié)構(gòu)域和fXa衍生物的嵌合蛋白質(zhì)和其組合，其中所述方法進(jìn)ー步包含投與有效量的延長所述衍生物的循環(huán)半壽期的試劑，其中所述試劑是特異性識(shí)別并結(jié)合fXa的外部位點(diǎn)的抗fXa抗體或結(jié)合fXa衍生物的α _2_巨球蛋白，其中所述因子Xa抑制劑選自由以下組成的群組:磺達(dá)肝素(fondaparinux)、伊達(dá)肝素(idraparinux)、生物素化的伊達(dá)肝素、依諾肝素(enoxaparin)、法安明(fragmin)、NAP-5、rNAPc2、組織因子途徑抑制劑、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班(apixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)、PD-348292、奧米沙班(otamixaban)、DU_176b、LY517717、GSK913893、雷扎沙班(razaxaban)、低分子量肝素、貝特沙班(betrixaban)或其醫(yī)藥上可接受的鹽、和其組合，其中所述因子Xa抑制劑選自貝特沙班、利伐沙班、阿哌沙班、低分子量肝素、和其組合，其中所述個(gè)體正經(jīng)歷選自由以下組成的群組的臨床重大出血事件:失血、重要器官出血、需要再次手術(shù)或新的治療程序的出血、和出血指數(shù)等于或大于2.0并伴有明顯出血，其中所述個(gè)體正經(jīng)歷選自由以下組成的群組的出血事件:持續(xù)性或復(fù)發(fā)性鼻出血、不需要治療程序的直腸或泌尿道出血、顯著的注射位點(diǎn)血腫、非注射位點(diǎn)的自發(fā)性血腫、伴隨輕微創(chuàng)傷出現(xiàn)的血腫、大量血液流失、和需要非計(jì)劃性輸血的出血，其中所述衍生物是在手術(shù)之前投與。
[0032]ー種醫(yī)藥組合物，其包含結(jié)合至因子Xa抑制劑且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物的因子Xa衍生物蛋白質(zhì)和醫(yī)藥上可接受的載劑。
[0033]一種分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID N0.12或與SEQ ID N0.12具有至少80%同源性的多肽。
[0034]一種分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID N0.12。
[0035]一種分離的雙鏈多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID N0.13或與SEQ ID N0.13具有至少80%同源性的多肽。
[0036]一種分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID N0.15或與SEQ ID N0.15具有至少80%同源性的多肽。
[0037]ー種肽偶聯(lián)物，其包含以共價(jià)方式或非共價(jià)方式連接至根據(jù)權(quán)利要求35至38中任ー權(quán)利要求所述的多肽的載劑，其中所述載劑是脂質(zhì)體、膠束、醫(yī)藥上可接受的聚合物或醫(yī)藥上可接受的載劑。
[0038]ー種醫(yī)藥組合物，其包含`載劑和上述任一多肽。
[0039]—種多核苷酸，其編碼上述任ー多肽多肽。
[0040]ー種抗體，其結(jié)合上述任ー多肽，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0041]ー種上述抗體的生物活性片段，其中所述抗體以可檢測(cè)方式經(jīng)標(biāo)記。
[0042]一種組合物，其包含上述抗體和載劑。
[0043]一種組合物，其包含上述抗體片段。
[0044]—種抗體-肽復(fù)合物，其包含上述抗體和特異性結(jié)合至所述抗體的多肽，其中所述多肽是受到對(duì)抗可產(chǎn)生所述抗體的多肽，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0045]—種制備上述任一多肽的方法,其包含在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼上述任ー多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID N0.12且所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID N0.16，其中所述宿主細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinesehamster ovary cell),該方法還包含分離所述多肽。
[0046]—種分離的原核或真核宿主細(xì)胞，其包含編碼上述任一多肽的多核苷酸。
[0047]一種組合物，其包含載劑和上述原核或真核宿主細(xì)胞。
[0048]ー種阻止或降低正利用因子Xa抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物。
[0049]一種選擇性結(jié)合并抑制正利用因子Xa抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體中以外源方式投與的因子Xa抑制劑的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的上述組合物，其中所述因子Xa抑制劑選自由以下組成的群組:磺達(dá)肝素、伊達(dá)肝素、生物素化的伊達(dá)肝素、依諾肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、組織因子途徑抑制劑、DX_9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、PD-348292、奧米沙班、DU-176b、LY517717、GSK913893、雷扎沙班、低分子量肝素、貝特沙班或其醫(yī)藥上可接受的鹽、和其組合，其中所述因子Xa抑制劑選自貝特沙班、利伐沙班、阿哌沙班、低分子量肝素、和其組合，其中所述衍生物是在手術(shù)之前投與。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1示意性地展示表1中所示的人類因子X(SEQ ID N0.1)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，如在李塔斯(Leytus)等人，生物化學(xué)(Biochem.)，1986，25，5098-5102 中所報(bào)告。SEQ ID N0.1是由表2中所示的人類fX的核苷酸序列(SEQ ID N0.2)編碼的人類fX的氨基酸序列，如此項(xiàng)技術(shù)中所習(xí)知。例如，經(jīng)翻譯的氨基酸序列報(bào)告于李塔斯等人(Leytus)，生物化學(xué)(Biochem.), 1986, 25, 5098-5102 中且可在〈http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731> 的基因庫(GenBank)，“NM_000504” 中找到。此序列中的氨基酸編號(hào)是基于fX序列。人類fX前體(SEQ ID N0.1)含有前導(dǎo)序列(SEQ IDN0.1的氨基酸1至40)，隨后是對(duì)應(yīng)于fX輕鏈(LC)的序列(SEQ ID N0.1的氨基酸41至179)、在fX分泌期間去除的RKR三聯(lián)體的序列(SEQ ID N0.1的氨基酸180至182)、和fX重鏈的序列(SEQ ID N0.1的氨基酸183至488)，所述重鏈含有激活肽(AP) (SEQ ID N0.1的氨基酸183至234)和催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0.1的氨基酸235至488)。
[0051]圖2(SEQ ID N0.3)展示成熟人類因子X的氨基酸序列。此圖中氨基酸編號(hào)是基于成熟fX序列自fX輕鏈的N-末端開始。因子X在血漿中作為通過二硫鍵連接的雙鏈分子循環(huán)。輕鏈(LC)具有139個(gè)氨基酸(SEQ ID N0.1的氨基酸41至179)殘基且含有富gamma-羧基谷氨酸(Gla)的結(jié)構(gòu)域(SEQ ID Ν0.3的1_45)(包括短芳香族堆棧(AS) (SEQ ID N0.3的氨基酸40-45))，之后是兩個(gè)表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域(EGF1:SEQ ID N0.3的氨基酸46-84，EGF2:SEQ ID N0.3氨基酸85-128)。重鏈(HC)具有306個(gè)氨基酸且含有52個(gè)氨基酸激活肽(AP:SEQ ID N0.3的氨基酸143-194)，然后是催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0.3的氨基酸195-448)。糜蛋白酶編號(hào)中的H57-D102-S195的催化三元體等效物位于fX序列中的 His236、Asp282、和 Ser379 處并加下劃線(SEQ ID N0.3 的氨基酸 236,282 和 379)。
[0052]圖3示意性地展示圖2中所示的成熟人類因子X的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。此圖中的氨基酸編號(hào)是基于成熟fX序列。突出顯示用于糜蛋白酶消化以去除含Gla-結(jié)構(gòu)域的片段(SEQID N0.3的氨基酸1-44)和用于fX激活以去除激活肽的切割位點(diǎn)。糜蛋白酶消化fXa產(chǎn)生缺少1-44氨基酸殘基的無Gla結(jié)構(gòu)域fXa(SEQ ID N0.4)。
[0053]圖4展示在凝血酶生成(表示為相對(duì)熒光單位(RFU))分析中在組織因子的存在下各種濃度的rfVIIa對(duì)fXa抑制劑貝特沙班(如下文所述)的抗凝血活性的影響(如實(shí)例2中所述))。數(shù)據(jù)顯示，rfVIIa和組織因子的組合在高達(dá)200nM的濃度下不能完全中和fXa抑制劑貝特沙班的抗凝血活性。
[0054]圖5展示在含活性fXa和貝特沙班(空心圓)的純化系統(tǒng)中Gla-結(jié)構(gòu)域完整的酐_fXa逆轉(zhuǎn)貝特沙班的fXa抑制作用，而與活性fXa相比，僅酐-fXa的促凝血活性(空心三角)可忽略。將fXa發(fā)色活性標(biāo)準(zhǔn)化成在無任何抑制劑的情況下的活性fXa(空心正方形)。此更充分地闡述于實(shí)例2中。數(shù)據(jù)表明，酐-fXa對(duì)于fXa底物無活性，但仍保留fXa抑制劑結(jié)合能力。
[0055]圖6展示在血楽;凝血酶生成(表示為相對(duì)突光單位(RFU))分析(如實(shí)例2中所述)中，圖5中具有完整Gla結(jié)構(gòu)域的酐-fXa是有效抑制劑。其在115nM約時(shí)幾乎完全抑制凝血酶生成。數(shù)據(jù)表明，Gla-結(jié)構(gòu)域未修飾的酐-fXa并不適于用作fXa抑制劑解毒剤。
[0056]圖7展示在96孔板格式中活性fXa的凝血活性在糜蛋白酶消化之前和在糜蛋白酶消化15分鐘和30分鐘之后的比較。如此圖中所示，凝血時(shí)間(0D405的變化)在fXa被糜蛋白酶消化15分鐘之后明顯延遲，且當(dāng)fXa被消化30分鐘時(shí)有長達(dá)20分鐘的時(shí)間未觀察到凝血。此結(jié)果還用于建立糜蛋白酶消化酐_fXa的條件，這是因?yàn)樵谙陂g可監(jiān)測(cè)到酐_fXa沒有活性。此更充分地闡述于實(shí)例3中。
[0057]圖8展示去Gla的酐-fXa對(duì)因子Xa抑制劑貝特沙班的結(jié)合親和力，如實(shí)例4中所闡述。數(shù)據(jù)表明，通過糜蛋白酶消化酐_fXa所制備以去除含Gla-結(jié)構(gòu)域的片段(殘基1-44)的去Gla的酐-fXa能夠以與天然fXa類似的親和カ結(jié)合貝特沙班(fXa:Ki=0.12nM，去 Gla 的酐-fXa:Kd=0.32nM)。
[0058]圖9展示，在實(shí)例2的凝血酶生成分析中，通過添加濃度為680nM的解毒劑(去Gla的酐-fXa)逆轉(zhuǎn)不同濃度 貝特沙班的抗凝血活性。在濃度為680nM吋，去Gla的酐-fXa能夠產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上完全的fXa活性恢復(fù)。
[0059]圖10展示，在凝血延長分析中使用aPTT試劑在96孔板格式(如實(shí)例3中所述)，通過不同濃度的解毒劑(去Gla的酐-fXa)逆轉(zhuǎn)250nM貝特沙班的抗凝血活性。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)使用約608nM的解毒劑來中和250nM的fXa抑制劑貝特沙班時(shí)，凝血時(shí)間與對(duì)照貧血小板血漿的凝血時(shí)間相當(dāng)。
[0060]圖11展示，在凝血延長分析中使用aPTT試劑在96孔板格式中，563nM的解毒劑(去Gla的酐-fXa)對(duì)依諾肝素(enoxaparin) (0.3125-1.25U/mL)的抗凝血活性的影響，其表示為標(biāo)準(zhǔn)化之后的倍數(shù)變化。分析方案闡述于實(shí)例3中。數(shù)據(jù)表明，添加563nM的解毒劑明顯中和低分子量肝素依諾肝素的活性。
[0061]圖12展示在發(fā)色分析中解毒劑(去Gla的酐-fXa)對(duì)凝血酶(5nM)活性的作用和50nM阿加曲班(argatroban)(—種特異性凝血酶抑制劑)對(duì)其的抑制作用。正如所預(yù)期，fXa抑制劑的解毒劑在高達(dá)538nM濃度下不會(huì)以可檢測(cè)方式影響凝血酶活性或所述特異性抑制劑阿加曲班對(duì)其的抑制作用。此更充分地闡述于實(shí)例14中。
[0062]圖13展示，在aPTT分析中使用標(biāo)準(zhǔn)凝血計(jì)時(shí)器通過改變解毒劑去Gla的酐-fXa的濃度對(duì)400nM貝特沙班抗凝血活性的影響。分析方案闡述于實(shí)例3中。數(shù)據(jù)展示，fXa抑制劑的解毒劑實(shí)質(zhì)上400nM貝特沙班對(duì)fXa的抑制作用。據(jù)估計(jì)，在400nM貝特沙班的情況下，解毒劑的EC5(i為約656nM。
[0063]圖14展示CH0細(xì)胞中用于表達(dá)fXa三重突變體(SEQ ID N0.12)的DNA構(gòu)建體的圖。將質(zhì)粒DNA線性化并轉(zhuǎn)染至CHO dhfr(-)細(xì)胞中。使用四氫葉酸酯(HT)缺乏的培養(yǎng)基加甲氨蝶呤(MTX)來選擇細(xì)胞。通過ELISA來針對(duì)高蛋白質(zhì)表達(dá)篩選穩(wěn)定克隆。在無血清培養(yǎng)基中產(chǎn)生fXa三重突變體并通過離子交換與親和柱的組合來純化。圖中的編號(hào)是基于編碼人類fX SEQ ID N0.1的多核苷酸序列進(jìn)行。例如，活性位點(diǎn)S419(SEQ ID N0.1)處的丙氨酸突變等效于成熟人類fX的S379(SEQ ID N0.3)處的突變，如整個(gè)申請(qǐng)案且更具體地實(shí)例7所討論。[0064]圖15展示分別使用識(shí)別fX重鏈和輕鏈的單克隆抗體純化的r-解毒劑的西方印跡(Western blot)。當(dāng)將連接輕鏈和重鏈的ニ硫鍵還原后，r_解毒劑重鏈以類似于血漿源性fXa的預(yù)計(jì)分子量遷移。與正常FXa相比，fXa突變體的Gla-結(jié)構(gòu)域中缺失6_39aa使得r-解毒劑輕鏈的分子量帶較低。
[0065]圖16展示經(jīng)ロ單獨(dú)投與貝特沙班(15mg/kg)、或經(jīng)ロ投與貝特沙班(15mg/kg)然后靜脈注射(300 μ g，IV)根據(jù)實(shí)例1制得的血漿源性解毒劑(pd-解毒劑)之后小鼠(n=7-10/組)中的貝特沙班血漿水平。pd-解毒劑是在1.5小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)之前5分鐘時(shí)投與，并在經(jīng)ロ投與貝特沙班之后1.5,2.0和4.0小時(shí)時(shí)取小鼠血液樣品(0.5mL)。分析全血INR、貝特沙班和解毒劑血漿水平。將小鼠血漿中的貝特沙班水平(平均值土SEM)繪示為小鼠投與15mg/kg(空心正方形)和15mg/kg然后解毒劑注射(空心圓)之后隨時(shí)間變化的曲線。在1.5小時(shí)時(shí)間點(diǎn)(解毒劑注射后5分鐘)解毒劑治療組的PK-PD相關(guān)性匯總于表13中。根據(jù)INR測(cè)量值，單次注射解毒劑使功能性貝特沙班減少>50%。此更充分地闡述于實(shí)例8中。
[0066]圖17展示利用經(jīng)純化r-解毒劑進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)(n=4_10/組)的結(jié)果。比較經(jīng)ロ單獨(dú)投與貝特沙班(15mg/kg)或經(jīng)ロ投與貝特沙班(15mg/kg)然后靜脈注射(300yg)r_解毒劑之后小鼠血漿中的貝特沙班水平(圖17A)和全血INR(圖17B)。標(biāo)明各治療組的平均值。如表14中所匯總，單次靜脈注射r-解毒劑使得離體全血INR有>50%校正，此證明經(jīng)由多次注射或其它方案解毒劑有效中和fXa抑制劑。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的fXa變體具有用作普遍解毒劑來逆轉(zhuǎn)在出血或其它醫(yī)療急診的患者中fXa抑制劑的抗凝血作用的潛力。此更充分地闡述于實(shí)例8中。
[0067]圖18展示在96孔濁度變化凝血分析中r-解毒劑逆轉(zhuǎn)依諾肝素的抑制作用。這些結(jié)果基本上類似于pd-解毒劑(圖11)，此表明兩種fXa衍生物具有相當(dāng)?shù)墓δ苄越舛緞┗钚浴?0nM r-解毒劑實(shí)質(zhì)上校正(>75% ) 1.25U/mL依諾肝素的抑制作用。分析方案呈現(xiàn)于實(shí)例11中。
`[0068]圖19展示r-解毒劑逆轉(zhuǎn)低分子量肝素(LMWH)的抑制作用，如在人類血漿凝血分析中所測(cè)試。圖18和19 二者均于實(shí)例11中討論。
[0069]圖20展示r-解毒劑逆轉(zhuǎn)利伐沙班的抗凝血作用。此更充分地討論于實(shí)例12中。
[0070]圖21展示r-解毒劑的多核苷酸序列和經(jīng)翻譯多肽序列的排列。
[0071]圖22展示在單次靜脈注射(1次注射)或兩次注射(2次注射)r-解毒劑的情況下小鼠實(shí)驗(yàn)(n=5/組，312ug/200ul r_解毒剤)的結(jié)果。對(duì)經(jīng)ロ投與貝特沙班(15mg/kg)之后靜脈注射媒劑或r-解毒劑之后的血漿中的貝特沙班水平進(jìn)行比較(圖22A)(參見實(shí)例8的詳細(xì)闡述)。如圖22A中所示，與媒劑對(duì)照(對(duì)照1)相比，單次靜脈注射r-解毒劑使血漿中的貝特沙班水平増加8倍以上，此表明解毒劑在活體內(nèi)有效捕獲貝特沙班的能力。與單次注射相比，第二次注射解毒劑又使貝特沙班水平增加不到2倍，此表明在小鼠血漿中貝特沙班的數(shù)量有限且其抗凝血作用可能被解毒劑逆轉(zhuǎn)。圖22B表明，單次和雙次注射解毒劑之后，所測(cè)量的INR隨小鼠血漿中解毒劑/貝特沙班的比例的增加而降低。
【具體實(shí)施方式】
[0072]1.定義[0073]除非另有說明，否則本發(fā)明的實(shí)踐將使用組織培養(yǎng)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技木，此在所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的范圍內(nèi)。參見例如薩姆布魯克(Sambrook)和羅塞爾(Russell)編輯(2001)分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning:A Laboratory Manual),第 3版；奧蘇貝爾(Ausubel)等人編輯(2007)最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編(Current Protocols in Molecular Biology)系列；酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)系列(學(xué)術(shù)出版社公司(Academic Press, Inc.)，紐約(Ν.Υ.));麥克弗森(MacPherson)等人(1991)PCR1:實(shí)用方法(PCR1:A Practical Approach)(牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press)的 IRL Press);麥克弗森(MacPherson)等人(1995)PCR2:實(shí)用方法(PCR2:A Practical Approach);哈洛(Harlow)和萊恩(Lane)編輯(1999)抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies, A Laboratory Manual);富潤氏尼(Freshney)(2005)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng):基本技術(shù)手冊(cè)(Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique),第 5 版；蓋特(Gait)編輯(1984)寡核苷酸的合成(OligonucleotideSynthesis);美國專利第4，683，195號(hào)；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)編輯(1984)核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization);安德森(Anderson) (1999)核酸雜交(NucleicAcid Hybridization);黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)編輯(1984)轉(zhuǎn)錄和翻譯；固化細(xì)胞矛ロ酶(Transcription and Translation ；Immobilized Cells and Enzymes)(IRL Press (1986));佩巴爾(Perbal) (1984)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(A Practical Guide 至Molecular Cloning);米勒(Miller)和考斯(Calos)編輯(1987)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold SpringHarbor Laboratory));馬克瑞德斯(Makrides)編輯(2003)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)(Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells);邁耳(Mayer)和沃克(Walker)編輯(1987)細(xì)胞核分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法(Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology)(學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),倫敦(London))；赫岑貝格(Herzenberg)等人編輯(1996)串爾的實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Weir’s Handbook ofExperimental Immunology);小鼠胚胎探作實(shí)驗(yàn)J旨南(Manipulating the Mouse Embryo:ALaboratory Manual),第 3版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress) (2002))?
[0074]所有包括范圍在內(nèi)的數(shù)值指定(例如，pH、溫度、時(shí)間、濃度、和分子量)都是近似值，其以⑴或(-)0.1的增量變化。應(yīng)了解，但不一定明確陳述所有數(shù)值指定前面皆有術(shù)語“約”。還應(yīng)該了解，但未必明確陳述本文所述的試劑僅是例示性的且這些試劑的等效物已為此項(xiàng)技術(shù)習(xí)知。
[0075]除非上下文另有明確說明，否則說明書和權(quán)利要求書中使用的単數(shù)形式“一(a，an)”和“所述的(the)”包括復(fù)數(shù)意義。例如，術(shù)語“醫(yī)藥上可接受的載劑”包括多種醫(yī)藥上可接受的載劑(包括其混合物)。
[0076]本文所用術(shù)語“包含”意欲指組合物和方法包括所列舉要素，但并不排除其它要素。當(dāng)使用“基本上由…組成”定義組合物和方法時(shí)，將意味著出于所想要的用途不包括對(duì)所述組合有任何本質(zhì)意義的其它要素。因此，基本上由本文所定義的要素組成的組合物不會(huì)將來自分離和純化方法的痕量污染物和醫(yī)藥上可接受的載劑(例如磷酸鹽緩沖的鹽水、防腐劑、和諸如此類)排除在外。“由…組成”將意味著排除超過其它成分的痕量元素和用于投與本發(fā)明組合物的大量方法步驟。通過這些過渡術(shù)語中的每ー者定義的實(shí)施例均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0077]診斷或治療的“個(gè)體”是細(xì)胞或哺乳動(dòng)物(包括人類)。診斷或治療的非人類動(dòng)物個(gè)體包括(例如)鼠科動(dòng)物(例如大鼠、小鼠)、犬科動(dòng)物(例如狗)、兔科動(dòng)物(例如兔子)、家畜、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物。
[0078]術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互換使用且在其最廣泛意義上是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的亞單位氨基酸、氨基酸類似物或擬肽的化合物。所述亞單位可通過肽鍵連接。在另ー實(shí)施例中，所述亞單位可通過其它鍵(例如，酷、醚等)連接。蛋白質(zhì)或肽必須含有至少兩個(gè)氨基酸且對(duì)蛋白質(zhì)或肽序列中可包含的氨基酸的最大數(shù)量并無限制。本文所用術(shù)語“氨基酸”涉及天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，其包括甘氨酸和D與L光學(xué)異構(gòu)體二者、氨基酸類似物和擬肽物質(zhì)。天然存在的氨基酸的單個(gè)字母和三個(gè)字母縮寫列示于下文中。如果肽鏈短，通常將三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸的肽稱為寡肽。如果肽鏈較長，則通常將所述肽稱為多肽或蛋白質(zhì)。
[0079]
【權(quán)利要求】
1.ー種阻止或減少正利用因子Xa抑制劑進(jìn)行抗凝血療法的個(gè)體出血的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的因子Xa蛋白質(zhì)衍生物，所述因子Xa蛋白質(zhì)衍生物結(jié)合至所述因子Xa抑制劑且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
2.一種選擇性結(jié)合并抑制個(gè)體中以外源方式投與的因子Xa抑制劑的方法，其包含向所述個(gè)體投與有效量的Xa蛋白質(zhì)衍生物，所述Xa蛋白質(zhì)衍生物結(jié)合至所述因子Xa抑制劑且不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述因子Xa蛋白質(zhì)衍生物直接或間接地結(jié)合至所述因子Xa抑制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述衍生物具有降低的促凝血活性或沒有促凝血活性。
5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述衍生物是Gla缺乏的因子Xa蛋白質(zhì)衍生物或去Gla因子Xa蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述衍生物具有經(jīng)修飾的活性位點(diǎn)。
7.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述衍生物至少包含SEQID N0.3的氨基酸殘基46至448或其等效物。
8.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述衍生物至少包含SEQID N0.3的氨基酸殘基46至139和195至448或其等效物。
9.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述衍生物缺少fXa的輕鏈且含有在重鏈中存在的絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。
10.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述衍生物是包含氨基酸序列SEQIDN0.5的多肽。
【文檔編號(hào)】A61P7/04GK103446579SQ201310301566
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2007年9月28日
【發(fā)明者】盧根民, 戴維·R·菲利普斯, 帕特里克·安德烈, 烏馬·辛哈 申請(qǐng)人:普托拉制藥有限公司