逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，該遞藥載體系統(tǒng)包含：半胱胺修飾的納米金核心，其表面帶有氨基正電荷；帶負(fù)電性的模型藥物，其通過吸附包覆于半胱胺修飾的納米金核心表面，形成模型藥物層；含有二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)的聚合物多肽，其通過吸附包覆于模型藥物層表面，形成還原響應(yīng)釋放層，該還原響應(yīng)釋放層表面還修飾有透明質(zhì)酸。本發(fā)明還公開了該遞藥載體系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，具有谷胱甘肽觸發(fā)智能釋放、高效低毒的功效，且該納米金復(fù)合物載體還呈現(xiàn)CD44介導(dǎo)的特異性內(nèi)吞，具有體內(nèi)肝靶向遞送效果，對今后基因治療中的非病毒給藥載體研究以及肝臟疾病方面的治療具有重要意義，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種新型的響應(yīng)釋放型逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用，該遞藥載體系統(tǒng)可獲得理想的肝靶向遞送效果。
【背景技術(shù)】
[0002]肝癌、肝炎等肝臟疾病均為當(dāng)前需要重點(diǎn)研究的重大防治疾病。這個頑固堡壘目前沒有被有效攻克的主要原因，除了治療藥物本身的藥理作用尚不夠理想外，就是沒有將藥物有效遞送至肝臟或肝臟的病變部位，即藥物的肝靶向性差。此外，藥物不能高效智能釋放，也是一個主要原因。
[0003]金是化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定的元素之一，但納米級別的金粒子卻具有特殊的物理化學(xué)性能，由于其良好的穩(wěn)定性、尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、光學(xué)效應(yīng)以及其獨(dú)特的生物親和性,使其在生物傳感器、光化學(xué)與電化學(xué)催化、生物醫(yī)藥(藥物、基因、蛋白)、生物分析化學(xué)、食品安全快速檢測、光電子器件、生物體著色等領(lǐng)域有著極其廣闊的應(yīng)用。
[0004]金納米粒子(Gold nanoparticles,AuNPs)作為一種無毒性的載體,可以運(yùn)用于藥物以及基因遞送。目前基因治療傳遞載體包括病毒載體和非病毒載體。病毒載體通常都能展現(xiàn)出較理想的轉(zhuǎn)染效果，其針對許多細(xì)胞類型具有天然的感染趨向性，天然的作用效果使其可有效從內(nèi)涵體逃逸，進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行表達(dá)。但是，在基因遞送中病毒載體卻會引起一系列問題，包括不可預(yù)知的免疫反應(yīng)及毒副作用。例如，染色體插入后激活原癌基因而具有強(qiáng)的致癌性，較強(qiáng)的免疫反應(yīng)致使多次注射給藥受到限制。在另一方面，其具有尺寸限制，因而只能攜載一定尺寸的核酸物質(zhì)。如此種種，限制了其在實(shí)際的科學(xué)研究以及臨床中的使用。由此，非病毒給藥載體受到了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。與病毒載體相比，非病毒給藥載體其免疫反應(yīng)相對較低，染色體插入無風(fēng)險，易于合成及質(zhì)量控制。載體基本可包載任意尺寸的核酸物質(zhì)。但是它也面臨著許多的挑戰(zhàn)和困難，其中，最主要的就是負(fù)載的藥物不能高效智能釋放、轉(zhuǎn)染效果不理想及靶向性差。
[0005]目前國內(nèi)納米金體系的研究主要局限于普通金納米粒的制備、處方優(yōu)化及表征等，但對納米金粒子的表面進(jìn)行不同官能團(tuán)的功能化以及基于該功能化納米金的逐層自組裝響應(yīng)釋放型肝靶向遞藥系統(tǒng)的研究在國內(nèi)均未見報道。
[0006]雖然國外近年已出現(xiàn)采用逐層組裝的功能化納米金作為非病毒給藥載體系統(tǒng)的研究報道，但是以功能化納米金為核心采用逐層組裝技術(shù)構(gòu)建的含有豐富二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)的聚合物多肽，可利用細(xì)胞內(nèi)部天然的谷胱甘肽作為藥物觸發(fā)釋放基質(zhì)并獲得理想的肝靶向遞送效果的研究未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，該遞藥載體系統(tǒng)能由體內(nèi)天然谷胱甘肽(GSH)觸發(fā)智能釋放，高效低毒，且該載體系統(tǒng)具有很好的祀向給藥效果。[0008]此外，還需要提供一種上述逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)的制備方法及應(yīng)用。
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]在本發(fā)明的一個方面，提供了一種逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，該遞藥載體系統(tǒng)包含:
[0011]半胱胺修飾的納米金核心，其表面帶有氨基正電荷；
[0012]帶負(fù)電性的模型藥物，其通過吸附包覆于半胱胺修飾的納米金核心表面，形成模型藥物層；
[0013]含有二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)的聚合物多肽，其通過吸附包覆于模型藥物層表面，形成還原響應(yīng)釋放層。 [0014]本發(fā)明的載體系統(tǒng)采用金納米粒為核心，是因?yàn)榧{米粒(NPs)是一種毒性小且穩(wěn)定性較好的制劑類型，經(jīng)靜脈注射入血后能夠?qū)乃幬餄饧诟?、脾等部位，可降低藥物在其他組織中的分布，達(dá)到被動祀向效果。納米(nanometer, nm)是計量單位，Inm是Im的千分之一，是一個氫原子直徑的10倍。當(dāng)物質(zhì)的特征尺寸進(jìn)入到納米尺度時，原有的很多物理和化學(xué)性質(zhì)會發(fā)生巨大的改變,表現(xiàn)出特有的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和量子效應(yīng)。以納米顆粒作為載體，可以將藥物、DNA或RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，通過納米粒表面修飾的靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性藥物治療和基因治療。其優(yōu)點(diǎn)是在體內(nèi)具有長循環(huán)、隱形和主體穩(wěn)定等特點(diǎn)，能克服藥物在體內(nèi)輸送過程中所遇到的各種生理屏障，將藥物送到一定的靶位，并可以控制藥物在靶向部位的釋放，不良反應(yīng)較小。而將NPs的表面進(jìn)行修飾后，可在一定程度上避免被單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞識別，并可通過與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)其主動靶向效果。
[0015]優(yōu)選的，本發(fā)明載體系統(tǒng)的還原響應(yīng)釋放層表面修飾有透明質(zhì)酸(HA)，HA作為載體系統(tǒng)的靶頭，可以將藥物特異性靶向肝臟細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明載體系統(tǒng)中的納米金，作為一種傳遞系統(tǒng)載體，其易于合成及功能化，并具有良好的生物相容性?？梢岳霉δ芑鶊F(tuán)修飾的納米金所帶電荷以及疏水等表面性能作為載體系統(tǒng)穩(wěn)定的核心。金納米粒子具有其獨(dú)特的屬性，首先，可以在其表面構(gòu)建復(fù)合單層膜，能被腫瘤細(xì)胞特異的識別，具有高的細(xì)胞穿透能力；第二，表面的單層膜能夠在大多數(shù)的生理學(xué)環(huán)境下穩(wěn)定存在；三，具有低的細(xì)胞毒性；四，為納米級載體，粒徑可控，構(gòu)造出單層膜表面具有好的生物相容性，具有高的有效負(fù)載量。納米金對蛋白質(zhì)、DNA等具有很強(qiáng)的吸附能力。伯胺和季胺表面修飾的納米金粒子可通過離子相互作用結(jié)合PDNA，與其它傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染介質(zhì)相比展現(xiàn)出了更有效的胞內(nèi)傳遞效果。本發(fā)明的納米金核心，進(jìn)行半胱胺修飾后，被修飾的納米金粒子表面帶氨基正電荷，可以與帶相反電荷的pDNA(模型藥物)形成穩(wěn)定的復(fù)合物。該半胱胺修飾的納米金是由氯金酸、鹽酸半胱胺氫氯化物和硼氫化鈉經(jīng)反應(yīng)制備而成。
[0017]優(yōu)選的，本發(fā)明載體系統(tǒng)中還原響應(yīng)釋放層的聚合物多肽，是由SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽單體經(jīng)氧化聚合反應(yīng)，在多肽單體兩端形成Cys-Cys連接而制成的含多個二硫鍵的聚TAT多肽。由聚合物多肽中的二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)，可利用細(xì)胞內(nèi)部天然的谷胱甘肽作為藥物觸發(fā)釋放基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)藥物的高效智能釋放，毒副作用減小。[0018]本發(fā)明還原響應(yīng)型逐層組裝納米金復(fù)合物肝靶向遞藥載體系統(tǒng)的粒徑為100~300nmo
[0019]在本發(fā)明的另一方面，提供了一種逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟:
[0020]將氯金酸溶液和鹽酸半胱胺氫氯化物溶液混合后，加入硼氫化鈉水溶液反應(yīng)，得半胱胺修飾的納米金；
[0021]合成陽離子穿膜多肽，將該多肽溶于磷酸鹽緩沖溶液，再加入二甲基亞砜反應(yīng)，制得含有二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)的聚合物多肽；
[0022]將半胱胺修飾的納米金原液，滴加入帶負(fù)電性的模型藥物溶液中，混合，得半胱胺修飾的納米金核心包覆負(fù)電性模型藥物層的納米金復(fù)合物，再加入含有二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)的聚合物多肽，混合，離心洗滌，得表面包覆有聚合物多肽的納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)。
[0023]優(yōu)選的，還包括步驟:在表面包覆有聚合物多肽的納米金復(fù)合物中，加入透明質(zhì)酸溶液，共孵育，離心洗滌，得表面修飾有透明質(zhì)酸的逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)。
[0024]優(yōu)選的，所述陽離子穿膜多肽的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0025]在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)在制備肝靶向藥物中的應(yīng)用。
[0026]在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)在制備基因治療藥物中的應(yīng) 用。
[0027]本發(fā)明的納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，是以逐層組裝為主要技術(shù)手段，以功能化的納米級金粒子為核心，構(gòu)建出的多層自組裝納米級復(fù)合物載體，其具有谷胱甘肽(GSH)觸發(fā)智能釋放、高效低毒、易于穿透細(xì)胞膜、有效逃逸內(nèi)涵體并定位細(xì)胞核周圍的功效。并且，后期在納米復(fù)合物粒子表面修飾的靶向分子透明質(zhì)酸(HA)，能使該納米金復(fù)合物載體呈現(xiàn)CD44介導(dǎo)的特異性內(nèi)吞，具有體內(nèi)肝靶向遞送效果，對今后基因治療中的非病毒給藥載體研究以及肝臟疾病方面的治療具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0029]圖1是本發(fā)明的還原響應(yīng)型逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)在包覆不同層時其水化粒徑變化圖；
[0030]圖2是本發(fā)明的還原響應(yīng)型逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)構(gòu)建時包覆不同層其電位反轉(zhuǎn)圖；
[0031]圖3是本發(fā)明的核心材料半胱胺修飾納米金的(A)溶液顏色、(B)紫外掃描光譜、(C)透射電鏡觀察粒子形貌、(D)納米粒水化粒徑分布、(E)納米粒粒子表面電位分布圖；
[0032]圖4是本發(fā)明的核心材料半胱胺修飾納米金的原子力顯微鏡圖；
[0033]圖5是本發(fā)明的半胱胺修飾納米金核心與pDNA的最優(yōu)結(jié)合比例的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0034]圖6是本發(fā)明的半胱胺修飾納米金與pDNA結(jié)合后溶液顏色變化(A)及質(zhì)粒載體尺寸改變⑶示意圖；
[0035]圖7是本發(fā)明的含有二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)PTAT多肽與pDNA的結(jié)合以及釋放瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0036]圖8是本發(fā)明的半胱胺修飾納米金與pDNA結(jié)合后透射電鏡圖；
[0037]圖9是本發(fā)明的還原響應(yīng)型逐層組裝金納米復(fù)合物AuCMs/pDNA/pTAT/HA的透射電子顯微鏡圖；
[0038]圖10是本發(fā)明的還原響應(yīng)型逐層組裝金納米復(fù)合物AuCMs/pDNA/pTAT/HA制備過程中包覆不同層后的原子力顯微鏡圖；
[0039]圖11是本發(fā)明的還原響應(yīng)型逐層組裝金納米復(fù)合物AuCMs/pDNA/pTAT及AuCMs/pDNA/pTAT/HA對三種不同細(xì)胞的細(xì)胞毒性柱狀圖；
[0040]圖12是本發(fā)明的還原響應(yīng)型納米金復(fù)合物載體在體外細(xì)胞攝取及細(xì)胞內(nèi)追蹤定位激光共聚焦顯微鏡圖；
[0041]圖13是本發(fā)明的基于半胱胺修飾納米金包覆不同層材料后其細(xì)胞攝取內(nèi)部透射電鏡圖；
[0042]圖14是本發(fā)明的還原響應(yīng)型逐層組裝納米金復(fù)合物載體HA競爭性抑制內(nèi)吞柱形圖；
[0043]圖15是本發(fā) 明的還原響應(yīng)型逐層組裝納米金復(fù)合物載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染激光共聚焦顯微鏡圖；
[0044]圖16是本發(fā)明的還原響應(yīng)型逐層組裝納米金復(fù)合物載體定量細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果柱形圖；
[0045]圖17是本發(fā)明的還原響應(yīng)型逐層組裝納米金復(fù)合物載體體內(nèi)分布柱形圖。【具體實(shí)施方式】
[0046]為了克服目前遞藥載體系統(tǒng)靶向性差、不能高效智能釋放藥物的技術(shù)問題，本發(fā)明研制出了一種還原響應(yīng)型逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)包括:
[0047](I)金納米粒核心，可對納米金表面進(jìn)行各種功能化的修飾，作為載體系統(tǒng)核心部件，進(jìn)行半胱胺修飾后，被修飾的粒子表面帶氨基正電荷可以與帶相反電荷的pDNA (模型藥物)形成穩(wěn)定的復(fù)合物；
[0048](2)帶負(fù)電性的模型藥物層，為下一還原響應(yīng)觸發(fā)釋放層的吸附提供負(fù)電性表面條件；
[0049](3)響應(yīng)釋放層聚TAT多肽，TAT肽(序列為RKKRRQRRR(SEQ ID N0.2))是一種細(xì)胞穿透肽，陽離子穿膜肽的共同特點(diǎn)是含較多荷正電的精氨酸和/或賴氨酸，由于生理環(huán)境下細(xì)胞膜帶負(fù)電，靜電作用介導(dǎo)穿膜是其重要的透膜機(jī)制。用固相法制備CTATC后，采用氧化聚合反應(yīng)氧化，使CTATC單體兩端的半胱氨酸形成Cys-Cys連接,形成富含多個二硫鍵的聚合物多肽PTAT。當(dāng)載體系統(tǒng)經(jīng)由血液循環(huán)后定位肝臟組織，進(jìn)入細(xì)胞后，高濃度的谷胱甘肽可還原富含二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)的多肽成小單體，從而獲得相應(yīng)釋放效果；
[0050](4)載體系統(tǒng)外修飾透明質(zhì)酸(HA)，實(shí)驗(yàn)的后期為了使整個載體系統(tǒng)具有特異性，在治療過程中，提高藥效和減輕不良反應(yīng)，獲得藥物定向輸送和細(xì)胞特異性的治療效果，引入了肝臟細(xì)胞特異性的HA，作為系統(tǒng)的靶頭，其可以與肝細(xì)胞表面豐富的CD44 (cluster determinant44) > HARE(hyaluronan receptor for endocytosis)、LYVE-1、RHAMM、IVd4等受體特異性的結(jié)合，使藥物的定點(diǎn)定向轉(zhuǎn)運(yùn)系成為了可能。[0051]本發(fā)明逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟:
[0052]1.表面修飾半胱胺金納米粒的合成
[0053]用移液槍吸取一定體積的I %的氯金酸溶液，加入40mL去離子水稀釋后，再精密稱取一定量鹽酸半胱胺氫氯化物溶解于400 μ L去離子水中，加入至上述氯金酸溶液中。攪拌20min后，再將ImL新鮮配制的ImM硼氫化鈉水溶液逐滴加入至上述混合液中，劇烈攪拌10-15min后，繼續(xù)溫和攪拌12h，反應(yīng)全程注意避光操作，再于去離子水中透析純化24h，即得表面修飾半胱胺的金納米粒。
[0054]反應(yīng)各項(xiàng)參數(shù)為:
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，其特征在于，該遞藥載體系統(tǒng)包含: 半胱胺修飾的納米金核心，其表面帶有氨基正電荷； 帶負(fù)電性的模型藥物，其通過吸附包覆于半胱胺修飾的納米金核心表面，形成模型藥物層； 含有二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)的聚合物多肽，其通過吸附包覆于模型藥物層表面，形成還原響應(yīng)釋放層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，其特征在于，所述還原響應(yīng)釋放層表面還修飾有透明質(zhì)酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，其特征在于，所述半胱胺修飾的納米金是由氯金酸、鹽酸半胱胺氫氯化物和硼氫化鈉經(jīng)反應(yīng)制備而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，其特征在于，所述還原響應(yīng)釋放層的聚合物多肽，是由SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽單體經(jīng)氧化聚合反應(yīng)，在多肽單體兩端形成Cys-Cys連接而制成的含多個二硫鍵的聚TAT多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)，其特征在于，所述遞藥載體系統(tǒng)的粒徑為100~300nm。
6.一種逐 層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 將氯金酸溶液和鹽酸半胱胺氫氯化物溶液混合后，加入硼氫化鈉水溶液反應(yīng)，得半胱胺修飾的納米金； 合成陽離子穿膜多肽，將該多肽溶于磷酸鹽緩沖溶液，再加入二甲基亞砜反應(yīng)，制得含有二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)的聚合物多肽； 將半胱胺修飾的納米金原液，滴加入帶負(fù)電性的模型藥物溶液中，混合，得半胱胺修飾的納米金核心包覆負(fù)電性模型藥物層的納米金復(fù)合物，再加入含有二硫鍵骨架結(jié)構(gòu)的聚合物多肽，混合，離心洗滌，得表面包覆有聚合物多肽的納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，還包括步驟:在表面包覆有聚合物多肽的納米金復(fù)合物中，加入透明質(zhì)酸溶液，共孵育，離心洗滌，得表面修飾有透明質(zhì)酸的逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述陽離子穿膜多肽的序列如SEQ ID N0.1 所示。
9.權(quán)利要求1或2所述的逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)在制備肝靶向藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2所述逐層組裝納米金復(fù)合物遞藥載體系統(tǒng)在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K47/42GK103990138SQ201310190824
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月21日
【發(fā)明者】鐘延強(qiáng), 于菲菲, 鄒豪, 張翮, 黃景彬, 魯瑩, 俞媛, 劉俊杰, 孫治國, 張國慶, 陳琰 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)