一種骨整合性改良的醫(yī)用復(fù)合材料的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種骨整合性改良的醫(yī)用復(fù)合材料，具體地，本發(fā)明的醫(yī)用復(fù)合材料具有基體以及涂覆于基體上的涂層，其中所述的涂層為T(mén)a涂層。本發(fā)明的醫(yī)用復(fù)合材料具有良好的機(jī)械性能和骨整合性，因而非常適合用于醫(yī)用移植物的制備，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種骨整合性改良的醫(yī)用復(fù)合材料

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及復(fù)合材料領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種骨整合性改良的醫(yī)用復(fù)合材料及其制法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002]金屬假體的作用已被越來(lái)越多的臨床研究及臨床前研究所檢驗(yàn)。理想的假體材料應(yīng)該具有恰當(dāng)?shù)膹椥阅Ａ?，?yōu)良的抗腐蝕性，良好的生物相容性及骨錨定性。但是絕大多數(shù)醫(yī)用假體材料并不能同時(shí)滿(mǎn)足上述特性。所以人們開(kāi)發(fā)了多種不同種類(lèi)的假體涂層來(lái)提高承重材料的骨相容性和骨誘導(dǎo)性。羥基磷灰石(HA)涂層就是這些涂層的優(yōu)秀代表之一。HA涂層的鈦(Ti)合金假體同時(shí)具有HA良好的生物活性及Ti合金的優(yōu)異機(jī)械性能，從而在骨外科手術(shù)中被廣泛的應(yīng)用為骨組織的替代材料。但是HA及其他種類(lèi)的陶瓷涂層脆性都相對(duì)較大，很容易從承重假體上脫落下來(lái)，這些缺點(diǎn)阻礙了 HA及其他陶瓷涂層的更廣泛應(yīng)用。所以醫(yī)用移植物仍然需要具有良好的生物相容性，骨誘導(dǎo)性，化學(xué)穩(wěn)定性，并能和基材牢固結(jié)合的新型涂層材料。
[0003]鉭(Ta)是一種非常具有前景的醫(yī)用假體涂層材料。Ta (原子序號(hào)73)是一種過(guò)渡稀有金屬，在體內(nèi)具有極高的抗腐蝕性和惰性。從上世紀(jì)中葉開(kāi)始，Ta開(kāi)始應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)踐并表現(xiàn)出良好的醫(yī)學(xué)生物相容性和安全性。由于其優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性，體液抗性，生物相容性及和骨組織的生物結(jié)合的固定性，Ta被認(rèn)為是一種非常有前景的生物材料。但是，Ta明顯的高彈性模量及和骨組織機(jī)械不相容性使其不適合作為整塊的醫(yī)用假體材料。通過(guò)在假體表面制造多孔Ta涂層可能會(huì)提高Ta的醫(yī)療應(yīng)用前景，這些多孔材料提供了較低的彈性模量，較高的表面阻力特性以及優(yōu)良的骨整合性(比如，生物活性，生物相容性及骨長(zhǎng)入性)。但是Ta相對(duì)較高生產(chǎn)成本和其復(fù)雜的生產(chǎn)工藝(需要在惰性環(huán)境進(jìn)行，不可焊接，磨削困難及較高的溶解溫度等)，限制了其在醫(yī)療實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。
[0004]綜上所述，本領(lǐng)域尚缺乏一種具有良好的機(jī)械性能和骨整合性的醫(yī)用復(fù)合材料。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種適用于制備骨組織移植物的醫(yī)用復(fù)合材料。
[0006]本發(fā)明的第一方面，提供了一種復(fù)合材料，所述復(fù)合材料包括:
[0007](a)基體，其中所述的基體為金屬基體；和
[0008](b)涂覆于基體上的涂層，所述的涂層為T(mén)a涂層。
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)合材料為醫(yī)用復(fù)合材料。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述基體表面全部或部分帶有涂層。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的涂層具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:
[0012]所述涂層為多孔結(jié)構(gòu)；和/或
[0013]所述的涂層厚度為30?500微米；和/或
[0014]所述涂層是通過(guò)真空等離子噴涂形成的。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的涂層厚度為40?300微米，較佳地為100?250微米。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的金屬基體選自下組:Ti金屬基體、Ti合金基體、不銹鋼基體、Co合金基體，或其組合。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的基體是鈦鋁合金基體。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的基體是T1-6A1_4V基體。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的基體是T1-6Al_7Nb基體。
[0020]本發(fā)明第二方面，提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的醫(yī)用復(fù)合材料的用途，用于制備醫(yī)用移植物。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)合材料用于制備選自下組的移植物:人工骨、人工關(guān)節(jié)、脊柱內(nèi)固定，牙齒種植體，下頜骨移植物，骨釘，骨板，外傷修復(fù)，髓內(nèi)釘，或其組合。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述人工關(guān)節(jié)包括:肩關(guān)節(jié)，髖關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)，肘關(guān)節(jié)。
[0023]本發(fā)明第三方面，提供了一種醫(yī)用移植物，所述移植物包括:
[0024](a)基體，其中所述的基體是金屬基體；和
[0025](b)涂覆于基體上的涂層，所述的涂層為T(mén)a涂層。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的金屬基體選自下組:Ti金屬基體、不銹鋼基體、Fe金屬基體、Co合金基體，或其組合；
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述基體表面全部或部分帶有涂層；和/或；
[0028]所述涂層位于所述移植物與骨接觸的部位。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的涂層具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:
[0030]所述的涂層為多孔結(jié)構(gòu)；和/或
[0031]所述的涂層厚度為30?500微米；和/或
[0032]所述涂層是通過(guò)真空等離子噴涂法制備。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的涂層厚度為40?300微米，較佳地為100?250微米。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的移植物用于與骨接觸部位的移植。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述的移植物用于骨質(zhì)部位的移植。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述的移植物用于選自下組的醫(yī)用移植:人工骨、人工關(guān)節(jié)、脊柱內(nèi)固定、牙齒種植體、下頜骨種植物、骨釘、骨板、外傷修復(fù)、骨髓內(nèi)釘，或其組合。
[0037]在另一優(yōu)選例中，所述人工關(guān)節(jié)包括:肩關(guān)節(jié)，髖關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)，肘關(guān)節(jié)。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合材料通過(guò)真空等離子噴涂法制備。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述的制備方法包括步驟:
[0040](i)提供一基材；
[0041](ii)通過(guò)真空等離子體噴涂技術(shù)，在所述基材上噴涂鉭涂層。
[0042]在另一優(yōu)選例中，所述基材為醫(yī)用金屬基材或醫(yī)用金屬合金基材。
[0043]在另一優(yōu)選例中，所述基材是用選自下組的材料制備的:T1、Co、Fe、Ti合金、不銹鋼、Co合金,或其組合。
[0044]在另一優(yōu)選例中，在所述步驟(ii)中，所述的等離子體氣體為Ar、H2和粉末載氣的混合氣體。
[0045]在另一優(yōu)選例中，所述等離子體氣體Ar的流量為35?50SLM (Standard LiterPer Minute);和 / 或
[0046]所述的等離子體氣體H2流量為8?18SLM ;和/或
[0047]粉末載氣流量為1.5?3.5SLM。
[0048]在另一優(yōu)選例中，所述等離子體氣體的噴涂距離為80?380mm。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述真空等離子體噴涂技術(shù)中噴涂電流為500?700A ;和/或
[0050]送粉速率為10?30g/min。
[0051]本發(fā)明的第四方面，提供了一種制品，所述的制品具有本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合材料或由本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合材料所制成。
[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的制品包括醫(yī)用制品。
[0053]在另一優(yōu)選例中，所述的醫(yī)用制品包括移植物。
[0054]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0055]圖1流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離得到的hBMSC的表面標(biāo)志分子，結(jié)果表明分離得到的hBMSC 為 CD29+，CD34' CD105+，CD44+，CD45' and CD90+ ；
[0056]圖2hBMSC譜系分化:成骨細(xì)胞(ALP染色)，和成脂(Oil Red O染色)；
[0057]圖3Ta涂層和Ti涂層的XRD圖譜；
[0058]圖4多孔Ta涂層表面和多孔Ti涂層表面的接觸角
[0059]圖5多孔Ta涂層表面和多孔Ti涂層表面的接觸角(t檢驗(yàn)，假設(shè)方差不等，誤差線(xiàn)代表土SD，n=3 ；Ti 涂層，131.917±5.10882 ;Ta 涂層，130.455±5.55294 ;概率 > 111，
0.7125，表示無(wú)顯著區(qū)別)；
[0060]圖6SEM觀(guān)測(cè)多孔Ta和Ti涂層的表面形態(tài)圖，放大倍率:300X，500X，1000X，和3000 X ；
[0061]圖7SEM觀(guān)測(cè)兩種涂層表面培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形貌圖像倍率500X和800 X ；
[0062]圖8hBMSC F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在兩種涂層表面形態(tài)培養(yǎng)3小時(shí)和24小時(shí)的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像(紅，F(xiàn)-actin，藍(lán)色，DAPI的細(xì)胞核)；
[0063]圖9DRAQ5染色在Ta和Ti涂層表面上培養(yǎng)48h的hBMSCs的細(xì)胞量檢測(cè)(t檢驗(yàn)，假設(shè)方差不等，誤差線(xiàn)代表土SD，n=3 ;Ti 涂層，65.377±18.2972 ;Ta涂層，164.80±46.1212 ；概率 >|t|，0.0498*)；
[0064]圖lOPrestoBlue法檢測(cè)各表面上hBMSCs的細(xì)胞存活率；(t檢驗(yàn)，假設(shè)方差不等，誤差條塊代表土SD，n=3 ;在普通表面上hBMSCs的細(xì)胞存活率作為對(duì)照組)；
[0065]圖1lhBMSCs在涂層表面培養(yǎng)48h的死活細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)；活細(xì)胞為綠色，死細(xì)胞為紅色，黑色為未有細(xì)胞生長(zhǎng)的涂層表面；
[0066]圖12DAPI染色的hBMSCs在涂層表面培養(yǎng)48h的anti_Ki67實(shí)驗(yàn)；
[0067]圖13hBMSCs在涂層表面培養(yǎng)7日的CFSE熒光情況直方圖；其中，各曲線(xiàn)的意義如下:
[0068]黃色表示第O天的未種植于涂層表面的CFSE標(biāo)記的hBMSC的熒光情況，hBMSC還沒(méi)有分裂，CFSE的量沒(méi)有因細(xì)胞分裂而減弱；
[0069]紅色表示種植于Ta涂層表面5天后的CFSE標(biāo)記的hBMSC的熒光情況，hBSMC內(nèi)的CFSE由于細(xì)胞分裂而逐次減半遞減，hBMSC的CFSE熒光信號(hào)都減弱，大部分hBMSC均發(fā)生了增殖，增殖活躍；
[0070]藍(lán)色表示種植于Ti涂層表面5天后的CFSE標(biāo)記的hBMSC的熒光情況，相對(duì)于種植于Ta涂層表面的hBMSC更多的hBMSC的CFSE熒光沒(méi)有減弱，說(shuō)明Ta涂層表面的hBMSC相對(duì)于Ti涂層表面的hBMSC增殖更加活躍；
[0071]綠色表示種植于表面涂有膠原蛋白的培養(yǎng)皿表面5天后的CFSE標(biāo)記的hBMSC的熒光情況，CFSE熒光減弱明顯；
[0072]圖14實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)涂層表面成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)21日的hBMSCs的RUNX2的mRNA表達(dá)。GAPDH作為參照(t檢驗(yàn)，假設(shè)方差不等，誤差條塊代表土SD，n=3 ;Ti涂層，1±0.1404 ; Ta 涂層，1.9678±0.2370 ;概率 >|t|，〈0.01*)；
[0073]圖15免疫熒光檢測(cè)涂層表面培養(yǎng)6日和12日的hBMSCs的ALP蛋白表達(dá)；
[0074]圖16ALP染色檢測(cè)涂層表面培養(yǎng)3，7，15，21日的hBMSCs ；
[0075]圖17新骨在體內(nèi)植入的Ta和Ti涂層表面形成圖，Van Gieson’ s Picric -Fuchsin對(duì)植入物周?chē)纬傻男鹿沁M(jìn)行染色；紅色表示3個(gè)月內(nèi)在植入物周?chē)L(zhǎng)的新骨，雙熒光標(biāo)記用于表示新骨形成的礦化沉積率；綠色與白色箭頭表示在3個(gè)月內(nèi)的鈣黃綠素的熒光標(biāo)記；
[0076]圖183個(gè)月內(nèi)，體內(nèi)涂層植入物周?chē)纬傻男鹿橇浚?t檢驗(yàn)，假設(shè)方差不等，誤差條塊代表土SD，n=3 ；Ti 涂層，14.0741 ±6.46293 ; Ta 涂層，32.6501 ±0.9072 ;概率 >|t|，
0.0358*)。

【具體實(shí)施方式】
[0077]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在Ti合金的醫(yī)用材料表面噴涂Ta涂層，能夠使材料保持優(yōu)良的機(jī)械屬性的通式，顯著改善其骨整合性?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0078]術(shù)語(yǔ)
[0079]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“醫(yī)用移植物”或“醫(yī)用種植物”(簡(jiǎn)稱(chēng)為“移植物”或“種植物”)指在臨床上用于植入生物體內(nèi)的醫(yī)用假體，如人造骨骼、人造器官等、骨釘?shù)取?br> [0080]術(shù)語(yǔ)“真空等離子噴涂法”、“真空等離子噴涂技術(shù)”、“真空等離子體噴涂技術(shù)”均可互換使用，均指在氣氛可控的負(fù)壓密閉容器內(nèi)進(jìn)行的等離子噴涂過(guò)程。
[0081]術(shù)語(yǔ)“金屬基體”指金屬或合金材質(zhì)制成的基體，如Ti金屬基體、Ti合金基體、鐵(Fe)金屬基體、不銹鋼基體、鈷(Co)合金基體等。特別地，在本發(fā)明中，所述的金屬基體不是Ta金屬基體。
[0082]醫(yī)用復(fù)合材料
[0083]本發(fā)明提供的醫(yī)用復(fù)合材料，包括:
[0084](a)基體，其中所述的基體為金屬基體，包括(但并不限于)選自下組的基體:Ti金屬基體、Ti合金基體、鐵(Fe)金屬基體、不銹鋼基體、鈷(Co)合金基體等。
[0085](b)涂覆于基體上的涂層，所述的涂層較佳地為T(mén)a涂層。
[0086]在另一優(yōu)選例中，所述的基體是鈦鋁合金基體，如T1-6A1_4V或T1-6Al_7Nb等，以提高復(fù)合材料的機(jī)械性能。
[0087]所述的涂層可以位于基體的全部或部分表面，較佳地，位于基體的部分表面，更佳地，位于與骨組織接觸的部位，如白杯、髕骨假體、脛骨假體、股骨柄假體、肩關(guān)節(jié)盂和肱骨假體等。
[0088]所述的涂層可以是多孔結(jié)構(gòu)，以改良涂層的表面阻力特性，彈性模量等機(jī)械性能。所述的涂層厚度沒(méi)有特別限制，在本發(fā)明的優(yōu)選例中，如本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合材料，其特征在于，所述的涂層厚度為30?500微米，較佳地為40?300微米，更佳地為100?250微米。
[0089]所述的涂層可以通過(guò)各種常規(guī)手段制備，如化學(xué)沉積法、氣相沉積法等。較佳地，所述的涂層可以通過(guò)真空等離子噴涂法制備。
[0090]在本發(fā)明的優(yōu)選例中，所述的醫(yī)用復(fù)合材料可以用于制備醫(yī)用移植物。
[0091]在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)合材料用于制備選自下組的移植物:人工骨、人工關(guān)節(jié)(如肩關(guān)節(jié)，髖關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)，肘關(guān)節(jié)等)、脊柱內(nèi)固定，牙齒種植體，下頜骨種植物，骨釘，骨板，外傷修復(fù)，骨髓內(nèi)釘。
[0092]醫(yī)用移植物
[0093]本發(fā)明還提供了一種醫(yī)用移植物，所述移植物包括:
[0094](a)基體，其中所述的基體包括(但并不限于)=Ti基體、Co基體、Fe基體、不銹鋼基體、Ti合金基體，或其組合；
[0095](b)涂覆于基體上的涂層，所述的涂層為T(mén)a涂層。
[0096]在另一優(yōu)選例中，所述的基體是鈦鋁合金基體，如醫(yī)用T1-6A1_4V等，以提高移植物的機(jī)械性能。
[0097]其中，所述涂層位于所述基體的全部或部分表面，較佳地，可以位于與骨組織接觸的部位，如白杯、髕骨假體、脛骨假體、股骨柄假體、肩關(guān)節(jié)盂和肱骨假體等。
[0098]所述的涂層可以是多孔結(jié)構(gòu)，以改良涂層的表面阻力特性，彈性模量等機(jī)械性能。所述的涂層厚度沒(méi)有特別限制，在本發(fā)明的優(yōu)選例中，所述的涂層厚度為30?500微米，較佳地為40?300微米，更佳地為100?250微米。
[0099]所述的涂層可以通過(guò)各種常規(guī)手段制備，如化學(xué)沉積法、氣相沉積法等。較佳地，所述的涂層可以通過(guò)真空等離子噴涂法制備。
[0100]所述的移植物用于與骨細(xì)胞接觸部位的移植，如骨釘、頜骨再造、腿骨移植等。
[0101]在另一優(yōu)選例中，所述的移植物用于骨質(zhì)部位的移植。
[0102]在另一優(yōu)選例中，所述的移植物用于選自下組的醫(yī)用移植:人工骨、人工關(guān)節(jié)(肩關(guān)節(jié)，髖關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)，肘關(guān)節(jié))、脊柱內(nèi)固定，牙齒種植體，下頜骨種植物，骨釘，骨板，外傷修復(fù)，骨髓內(nèi)釘。
[0103]醫(yī)用復(fù)合材料的制備
[0104]本發(fā)明還提供了一種醫(yī)用復(fù)合材料的制備方法，所述復(fù)合材料通過(guò)真空等離子噴涂法制備。
[0105]較佳地，所述的制備方法包括步驟:
[0106](i)提供一基材；
[0107](ii)通過(guò)真空等離子體噴涂技術(shù)，在所述基材上噴涂鉭涂層。
[0108]其中，基材可以是醫(yī)用金屬或醫(yī)用金屬合金，如T1、Co、Fe、Ti合金；或不銹鋼、Co
其A全坐
口巫寸ο
[0109]在本發(fā)明中，真空等離子體噴涂技術(shù)的各項(xiàng)工藝參數(shù)沒(méi)有特別限制。一種優(yōu)選的工藝包括以下的一個(gè)或多個(gè)特征:
[0110]所述的等離子體氣體為Ar、H2和粉末載氣的混合氣體；
[0111]其中，所述等離子體氣體Ar的流量為35?50SLM(Standard Liter Per Minute)；和/或
[0112]所述的等離子體氣體H2流量為8?18SLM ;和/或
[0113]粉末載氣流量為1.5?3.5SLM。
[0114]所述等離子體氣體的噴涂距離為80?380mm。
[0115]所述真空等離子體噴涂技術(shù)中噴涂電流為500?700A ;和/或
[0116]送粉速率為10?30g/min。
[0117]在另一優(yōu)選例中，所述制備工藝如下:
[0118]真空等離子體噴涂技術(shù)在基材上制備鉭涂層，等離子體氣體Ar流量35?50SLM(Standard Liter Per Minute),等離子體氣體H2流量為8?18,粉末載氣流量為1.5?
3.5SLM，噴涂距離為80?380_，噴涂電流為500?700A，送粉速率為10?30g/min。
[0119]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)
[0120](I)首次提供了一種具有良好的機(jī)械性能(彈性模量低、表面阻力特性高、抗腐蝕性能好)和骨整合性(生物相容性、生物活性、骨長(zhǎng)入性)的醫(yī)用復(fù)合材料；
[0121](2)首次提供了一種具有良好的機(jī)械性能和生物相容性的的醫(yī)用移植物；
[0122](3)提供了一種新的醫(yī)用復(fù)合材料制備方法。通過(guò)本發(fā)明方法制備的復(fù)合材料涂層結(jié)合牢固，脆性小，不易脫落；
[0123](4)本發(fā)明的制備方法成本低、生產(chǎn)工藝較現(xiàn)有工藝更為簡(jiǎn)單、因而非常適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0124](5)本發(fā)明的醫(yī)用復(fù)合材料具有良好的骨相容性，相較于現(xiàn)有技術(shù)的Ti合金材料，本發(fā)明提供的具有Ta涂層的Ti合金材料能夠使骨髓干細(xì)胞表現(xiàn)出更好的鋪展?fàn)顟B(tài)，并有利于成骨過(guò)程。細(xì)胞增殖速度快、凋亡少。在體內(nèi)骨整合實(shí)驗(yàn)中，也表現(xiàn)出了更好的新骨成型率，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。
[0125]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0126]倫理學(xué)聲明
[0127]本實(shí)驗(yàn)已被上海交通大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院第九人民醫(yī)院獨(dú)立倫理委員會(huì)及上海交通大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)(滬科動(dòng)倫
[2012]5)。實(shí)驗(yàn)所有兔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從上海交通大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院第九人民醫(yī)院動(dòng)物房獲取(SCXK2007-0007)。所有對(duì)動(dòng)物的處理均按造上海交通大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院第九人民醫(yī)院的規(guī)定進(jìn)行。
[0128]實(shí)施例1復(fù)合材料的制備
[0129]Ta 及 Ti 涂層通過(guò) VPS 系統(tǒng)(Sulzer, Winterthur, Switzerland)進(jìn)行制備。醫(yī)用T1-6A1-4V做為涂層的基材。檢測(cè)BMSC體外增殖和分化的樣本為1mmX 1mmX 2mm長(zhǎng)方體及.033畫(huà)乂201?11圓柱體。檢測(cè)體內(nèi)骨整合和新骨形成的樣本為02mm X I Omra的圓柱體。
[0130]實(shí)施例2材料表面形貌檢測(cè)
[0131]涂層表面形貌特性通過(guò)以下儀器進(jìn)行:檢測(cè)X光衍射儀(XRD，D/max2550v,Rigaku, Japan ；MDIJade6.5),接觸角分析儀(SL200, Kino, Shanghai, P.R.China),掃描電鏡(SEM，JSM6700F, JEOL, Akishima, Tokyo, Japan),電子探針(EPMA，JXA-8100，JEOL,Akishima, Tokyo, Japan)
[0132]實(shí)施例3BMSC的分離純化及成骨成脂誘導(dǎo)
[0133]本實(shí)驗(yàn)所需試劑配制及主要儀器設(shè)備
[0134](I)磷酸緩沖液(PBS):9gNaCl, 1.44gNa2HP04.7Η20，0.25gKH2P04.2H20，用 1000ml超純水配置，pH值調(diào)到7.2，高溫滅菌后備用；
[0135](2) a-MEM 培養(yǎng)基(Hy c I one, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)；
[0136](3)胎牛血清(FBS, Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)；
[0137](4) 0.25%Trypsin_EDTA 溶液(GibcoTM, Invitrogen)；
[0138](5)DMSO(Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA)；
[0139](6) a -MEM培養(yǎng)液:a -MEM培養(yǎng)基入10%的胎牛血清，再加入100U/ml青霉素和100mg/l 鏈霉素(Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA),放于 4°C備用；
[0140](7)細(xì)胞凍存液:90%FBS，10%DMS0,放于 4°C備用；
[0141](8) 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱:HerAcel1150 (Heraeus, Germany)；
[0142](9)超凈工作臺(tái)；
[0143](10)p!Uf(METTLERT0LED0320，Switzerland)；
[0144](11)電動(dòng)吸引器(YB.DX.23D，上海)；
[0145](12)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Invitrogen, Carlsbad, CA)；
[0146](13)臺(tái)式水平離心機(jī)(5810R, Eppendorf, Germany);
[0147](14)電子分析天平(METTLERT0LED0，AB204-ESwitzerland);
[0148](15)純水器(MilliporeUS);
[0149](16)液氮罐(BCBSCRY0 SYSTEMS,47/1IUS)；
[0150](17) CO2 培養(yǎng)箱(MCO-18AIC, SAVYO, Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan)；
[0151](18)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning, Corning, NY, USA)；
[0152](19)成骨誘導(dǎo)液:a -MEM培養(yǎng)基，10%FBS, 50 μΜ抗壞血酸/維生素C(L-ascorbicacid2-phosphate, Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA),1mM -甘油憐酸鈉能(β -glycerophosphate, Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA), 10nM 地塞米松(dexamethasone, Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA), lOOU/mL 青霉素，lOOmg/L 鏈霉素
[0153](20)成脂誘導(dǎo)液:a -MEM培養(yǎng)基，10%FBS, I μ M dexamethasonephosphate, 200 μ MIndomethin (Sigma - Aldrich, St.Louis, MO,USA),10 μ g/m Linsulin (Sigma - Aldrich,St.Louis, MO, USA),0.5mM3-1sobutyl-l-methylxanthine (IBMX, Sigma - Aldrich,St.Louis, MO, USA), lOOU/mL 青霉素，lOOmg/L 鏈霉素
[0154](21)成脂維持液:a -MEM 培養(yǎng)基，10%FBS, 10 μ g/mL insulin, lOOU/mL 青霉素，lOOmg/L鏈霉素
[0155](22) 4% 多聚甲醛；
[0156](23) 0.5%油紅O:0.5g油紅O粉劑加入10ml異丙醇，攪拌溶解，濾紙過(guò)濾后室溫備用，避光保存。
[0157]3.1BMSC的分離純化方法
[0158]將臨床上獲取的人骨髓抽吸物和a -MEM培養(yǎng)液(ImL抽吸物:20mL培養(yǎng)液)吹打混勻后接種0 [OOram培養(yǎng)皿；于5%C02培養(yǎng)箱中37° C孵育培養(yǎng)，48h全量換液除去未貼壁的雜細(xì)胞，以后每3天全部換液一次；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)85%匯合時(shí)，吸取原有培養(yǎng)液后用PBS清洗一次，再用0.25%Trypsin-EDTA消化2min左右，500g，5min室溫離心收取細(xì)胞，用適量37°C新鮮培養(yǎng)液重懸后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照2X105/cm2傳代，成為第一代細(xì)胞(Pl);再經(jīng)過(guò)兩次傳代(一般比例為1:3)后，大部分細(xì)胞于液氮罐中凍存，留少量細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
[0159]凍存的程序?yàn)?消化細(xì)胞 >> 使用凍存液重懸細(xì)胞 >> 調(diào)整細(xì)胞濃度 >> 程序凍存盒一 70° C過(guò)夜》移至液氮罐。
[0160]3.2成骨誘導(dǎo)
[0161]種植BMSCs到六孔板(5X 104cells/well)，a -MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，融合后加入成骨誘導(dǎo)液，每 3 天換液一次，7 天后通過(guò) BCIP/NBT ALP Color Development Kit (Beyotime,P.R.China)進(jìn)行染色。
[0162]3.3成脂誘導(dǎo)
[0163]種植BMSCs到六孔板(2X 105cells/well)，a -MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，融合后加入成脂誘導(dǎo)液2天，然后成脂維持液培養(yǎng)I天。反復(fù)上述過(guò)程到14天進(jìn)行油紅O染色。
[0164]3.4油紅O染色
[0165]吸棄培養(yǎng)基后以PBS清洗2次；
[0166]以4%的多聚甲醛固定細(xì)胞20min ；
[0167]雙蒸水漂洗3次后空氣晾干；
[0168]新過(guò)濾0.5%的油紅O室溫染色I(xiàn)小時(shí)；
[0169]70%乙醇漂洗3次后鏡下觀(guān)察油紅染色陽(yáng)性的細(xì)胞。
[0170]實(shí)施例4細(xì)胞活力及細(xì)胞骨架
[0171]本實(shí)驗(yàn)所需試劑配制及主要儀器設(shè)備
[0172](1)24 孔培養(yǎng)板(Corning, Corning, NY, USA)；
[0173](2)DRAQ5 (Danvers, MA, USA)；
[0174](3)Odyssey near-1nfrared scanner (L1-COR B1sciences, Millipore,Billerica, MA, USA)；
[0175](4)PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Life Technologies,Carlsbad, CA, USA)；
[0176](5)microplatereader (InfiniteM200pro, TECAN, Switzerland)；
[0177](6)LIVE/DEAD Cell Viability Assays (Invitrogen, Life Technologies,Carlsbad, CA, USA)；
[0178](7)Phalloidin-TRITC (Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA)；
[0179](8)Ant1-Ki67 抗體(Abeam, Cambridge, UK)；
[0180](9)DAPI (Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA)；
[0181](9) a-MEM 培養(yǎng)基(Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)；
[0182](10) a -MEM培養(yǎng)液:a -MEM培養(yǎng)基入10%的胎牛血清，再加入100U/ml青霉素和100mg/l 鏈霉素(Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA),放于 4°C備用；
[0183](Il)CO2 培養(yǎng)箱(MC0-18AIC (UV), SAVYO, Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan)；
[0184](12)共聚焦顯微鏡(LSM510, CarlZeissAG, Oberkochen, Germany)
[0185]4.1檢測(cè)細(xì)胞活力及細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)方法
[0186]1mmX 1mmX 2mm 樣本放入 24 孔培養(yǎng)板加入 BMSCs (2X 104cells/well), a -MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，將樣本放入新的24孔培養(yǎng)板。用DRAQ5進(jìn)行DNA的熒光染色。樣本通過(guò)Odyssey near-1nfrared scanner進(jìn)行掃描檢測(cè)涂層表面的增殖情況。Presto Blue CellViabilityReagent用于檢測(cè)細(xì)胞活力，并使用microplatereader檢測(cè)570and650nm的吸光度。死活細(xì)胞染色通過(guò)LIVE/DEAD Cell Viability Assays進(jìn)行。F-actin通過(guò)熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽進(jìn)行檢測(cè)。Ant1-Ki67抗體用來(lái)檢測(cè)BMSC的Ki67表達(dá)情況，DAPI用來(lái)標(biāo)記BMSC的細(xì)胞核。最后使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。CFSE標(biāo)記實(shí)驗(yàn)使用CFDA-SE (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)對(duì)hBMSC進(jìn)行標(biāo)記，CFDA-SE進(jìn)入細(xì)胞后被非特異性的脂酶切除乙酸基后形成CFSE，可與細(xì)胞內(nèi)多肽及蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性不可逆穩(wěn)定的共價(jià)鍵結(jié)合。經(jīng)標(biāo)記的hBMSC種植于放置于六孔板(Corning, NY, USA)中的0 33臟X 2 mm的樣本上，24小時(shí)后樣本轉(zhuǎn)入新的六孔板繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)5天后，使用流式細(xì)胞儀(FranklinLakes, NJ, USA)對(duì)標(biāo)記的hBMSC進(jìn)行檢測(cè)。
[0187]4.2涂層表面BMSC的ALP染色
[0188]033mmX 2.2mm的樣本放入六孔板(Corning，NY, USA)加入 BMSC (5X 14Cells/well), a -MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后轉(zhuǎn)入新的六孔板再培養(yǎng)24h，然后用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每 3 天換液一次。使用 BCIP/NBT ALP Color Development Kit (Beyotime, P.R.China)進(jìn)行染色，并用 Odyssey near-1nfrared scanner (L1-COR B1sciences, Millipore,Billerica, MA, USA)及普通掃描儀(Cannon, Tokyo, Japan)進(jìn)行掃描。
[0189]4.3In_Cell Western
[0190]4% 多聚甲醒用于固定，Odyssey Blocking Buffe (L1-COR B1sciences,Millipore, Billerica, MA, USA)用于封閉和抗體稀釋?zhuān)珹LP antibody (SantaCruzB1technology, SantaCruz, CA, USA)用于檢測(cè)涂層表面BMSC的ALP蛋白表達(dá)。孵育后Infra-Red Secondary Antibody IRDye (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville,PA, USA)做為二抗，最后通過(guò) Odyssey Infrared Imaging System (L1-COR B1sciences,Millipore, Billerica, MA, USA)進(jìn)行檢測(cè)。
[0191]實(shí)施例5多孔Ta涂層上BMSC成骨分化的基因表達(dá)
[0192]本實(shí)驗(yàn)所需試劑配制及主要儀器設(shè)備
[0193](I)DEPC水的配制:將Iml DEPC加入I升Mill1-Q超純水中，攪拌過(guò)夜；高溫滅菌15min并失活DEPC后，室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br> [0194](2)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)；
[0195](3)各 PCR 引物:Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA)合成，用 DEPC 水配成1mmoI/L 濃度，-20°C保存；
[0196]GAPDH:
[0197]正向引物(SEQID NO:1)GCACCACCAACTGCTTA
[0198]反向引物(SEQID NO:2)AGTAGAGGCAGGGATGAT
[0199]Runx2:
[0200]正向引物(SEQID NO:3)TGTTCTCTGATCGCCTCAGTG
[0201]反向引物(SEQID NO:4)CCTGGGATCTGTAATCTGACTCT
[0202](4)熒光定量 PCR 試劑盒(SYBRPremixExTaq, TaKaRa)；
[0203](5)TriPure Isolat1n Reagent (Roche, Basel, Switzerland),4°C保存；
[0204](6)氯仿(分析純)；
[0205](7)異丙醇(分析純)；
[0206](8) RealTime PCR 儀 Lightcycler480 (Roche, Basel, Switzerland)；
[0207](9)低溫臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf)。
[0208]實(shí)時(shí)定量PCR
[0209]通過(guò)TriPure Isolat1n Reagent 提取總 RNA ;等量 lug RNA 通過(guò) Revert AidFirstStrand cDNA Synthesis Kit (Fermentas,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；每20μ I反應(yīng)體系中加入I μ g的RNA，I μ I oligo(dT) 16和RNA-free的水至6.5 μ 1，混勻后在70°C孵育5min，迅速放在冰上；加入5X緩沖液4 μ 1，2.5mMdNTP8 μ I,混勻，加入 100 單位的 Revert Aid M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(0.5μ I) (Fermentas,Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA),混勻后 42°C 孵育 60min ；70°C 1min 后停止反應(yīng)，樣品放于_20°C保存；取反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為模板檢驗(yàn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，使用 SYBR Premix ExTaq? 系統(tǒng)(Takara, Otsu, Shiga, Japan) ;10μ I
[0210]反應(yīng)體系如下:5μ I SYBR Premix ExTaq supermix+2pmo 1/1 正反引物+0.5 μ IcDNA模板,其余用水補(bǔ)齊。每個(gè)樣品至少采用4個(gè)復(fù)孔；LightcycIer480 (Roche,Basel, Switzerland)進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)；
[0211]反應(yīng)條件:95°C，10s_(95°C，10s ;60°C，20s，40 個(gè)循環(huán))一溶解曲線(xiàn)一4°C ;采用Roche Lightcycler480software (Roche, Basel, Switzerland)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；
[0212]實(shí)施例6體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)研究
[0213]本實(shí)驗(yàn)所需試劑配制及主要儀器設(shè)備
[0214](I)在多孔Ta涂層假體材料直徑2mm，長(zhǎng)度10mm，由中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所提供；
[0215](2)Technovit7200VLC (Exakt, Norderstedt, Hamburg, Germany)；
[0216](3)EXAKT400CS MicroGrinding System with AffI1controlIer (Exakt,Norderstedt, Hamburg, Germany)
[0217](4)EXAKT510Dehydrat1nand Infiltrat1n System (Exakt, Norderstedt,Hamburg, Germany)
[0218](5)EXAKT520Light Polymerizat1n System (Exakt, Norderstedt, Hamburg,Germany)
[0219](6)品紅苦味酸染色液(VanGeison):1%酸性品紅溶液10ml、苦味酸飽和水溶液10ml ；
[0220](7) 2%戊巴比妥鈉溶液注射液；[0221 ] (8)直徑2mm的鉆頭及電轉(zhuǎn)；
[0222](9)全套的手術(shù)器械:主要包括，手術(shù)刀片，刀柄，剪刀，鑷子，止血鉗，持針器，縫針，縫線(xiàn)，拉鉤，注射器等；
[0223](10)手術(shù)鋪單與手術(shù)衣；
[0224](11)消毒液:碘伏，75%酒精；
[0225](12) I丐黃綠素(Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA)；
[0226](13)硬組織切片機(jī)(Leica, SP1600Germany)；
[0227](14)熒光倒置顯微鏡(LEICADM4000B，German)；
[0228](15)圖像分析軟件(B1QUANT)
[0229]6.1動(dòng)物模型構(gòu)建
[0230]動(dòng)物手術(shù)前一天準(zhǔn)備手術(shù)用具，假體經(jīng)高壓消毒后烘干；手術(shù)器械高壓消毒烘干；手術(shù)鋪單等消毒烘干；麻醉藥配置；手術(shù)室清潔紫外滅菌。
[0231]采用雄性新西蘭大白兔(3月，2.8 - 3.0kg)制作股骨缺損假體模型，肌肉注射2%戊巴比妥鈉溶液(20mg/Kg)麻醉；充分麻醉后固定，兔取仰位，下肢股骨髁術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒、鋪巾；沿股骨髁縱向切開(kāi)皮膚、皮下組織，應(yīng)盡量避開(kāi)肌肉群，肌間暴露股骨髁；推開(kāi)骨膜檢查股骨髁四周邊界，確定鉆洞位置；02mm鉆頭與骨面垂直鉆洞，深度應(yīng)以不鉆透對(duì)側(cè)皮質(zhì)骨為宜，固定位置防止滑動(dòng)；放入假體，保證材料表面不高于皮質(zhì)骨；從內(nèi)至外逐層縫皮；動(dòng)物復(fù)蘇恢復(fù)觀(guān)察后放回動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)。為避免傷口感染，術(shù)后3天每天青霉素注射一次。
[0232]6.2突光雙標(biāo)及標(biāo)本獲取
[0233]第一次標(biāo)記于動(dòng)物處死前10天注射，第二次標(biāo)記于動(dòng)物處死前3天注射。鈣黃綠素(8mg/kg)雙標(biāo)。過(guò)量麻醉處死，獲取其股骨髁與骨干部分。
[0234]6.3組織學(xué)觀(guān)察
[0235]6.3.1標(biāo)本包埋
[0236]標(biāo)本固定:10%甲醛溶液固定10d，自來(lái)水沖洗過(guò)夜；
[0237]梯度酒精脫水:75%, 85%，90%, 95%，100%, 5個(gè)梯度對(duì)標(biāo)本行脫水處理。
[0238]Technovit7200VLC (Exakt, Norderstedt, Hamburg, Germany)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行真空滲透2d。
[0239]通過(guò)EXAKT520Light Polymerizat1n System (Exakt, Norderstedt, Hamburg,Germany)使 Technovit7200VLC 光聚合 10h。
[0240]6.3.2硬組織切片
[0241]米用Saw Microtome LeicaSP1600(Leica,Wetzlar,Germany)硬組織切片機(jī)切片，切片厚度為 100 μ m, EXAKT400CS Micro Grinding System with AffI1controIIer(Exakt,Norderstedt, Hamburg, Germany)打磨至 50 μ m,拋光。
[0242]6.3.3苦味酸一品紅染色
[0243]超聲洗片2min ；0.1%甲酸3min ;流水沖洗2min ；20%甲醇2h ;流水沖洗2min,擦干；60°C Stevenol藍(lán)染色5_15min ;60°C蒸餾水洗；VG染液染色3_8min ；100%乙醇清洗；蒸餾水洗，晾干。
[0244]通用方法
[0245]組織形態(tài)計(jì)量
[0246]染色前后組織切片在顯微鏡(LEICA DM4000B，German)下拍攝，使用半自動(dòng)分析軟件(B10QUANT)進(jìn)行計(jì)量分析。
[0247]統(tǒng)計(jì)分析
[0248]統(tǒng)計(jì)分析采用SAS JMP (Cary，NC，USA)進(jìn)行。雙樣本均數(shù)比較才Aspin-Welch-Satterthwaite-Student’ s t-test,數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，Ρ〈0.05為顯著差異，以*標(biāo)記。
[0249]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0250]1.BMSC 鑒定
[0251]為了評(píng)估多孔鉭涂層的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，我們采用本研究材料和方法部分里所述方法提取純化BMSC。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分離得到的細(xì)胞表達(dá)MSC的表面標(biāo)志⑶29，⑶105，⑶44和⑶90，但不表達(dá)造血表明標(biāo)志⑶34及白細(xì)胞標(biāo)志⑶45 (圖1)，表明我們提取的BMSC的細(xì)胞特性和已知的BMSC細(xì)胞相類(lèi)似。另外我們也通過(guò)ALP和油紅O檢測(cè)了 BMSC向成骨和成脂方向的分化能力(圖2)。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明BMSC具有成骨和成脂分化的潛能，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
[0252]2.涂層表面形貌
[0253]圖3顯示了 XRD圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多孔Ti涂層表面主要成分為T(mén)i，多孔Ta涂層表面主要為T(mén)a及少量的Ta氧化物。多孔Ta涂層表面的氧化層(Ta2O5)在多種pH值下都很穩(wěn)定。
[0254]如圖4和圖5所示，多孔Ta涂層表面和多孔Ti涂層表面的接觸角檢測(cè)未見(jiàn)明顯區(qū)別(n=3 ；Ticoating, 131.917±5.10882 ；Tacoating, 130.455±5.55294 ；p=0.7125)。
[0255]如圖6所示，我們通過(guò)SEM來(lái)觀(guān)測(cè)多孔Ta和Ti涂層的表面形態(tài)(300 X，500 X，1000X，和3000X )，可見(jiàn)多孔Ta和Ti涂層的表面粗糙度相近。
[0256]3.多孔Ta涂層表面hBMSC細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架張力
[0257]BMSC在多孔Ta涂層表面表現(xiàn)出相對(duì)Ti涂層更好的鋪展?fàn)顟B(tài)(圖7，圖8)。SEM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在多孔Ta涂層表面的BMSC表現(xiàn)出扁平鋪展的狀態(tài)。F-actin細(xì)胞骨架染色(圖8)也表明在多孔Ta涂層表面的BMSC表現(xiàn)出和多孔Ti涂層表面BMSC不同細(xì)胞骨架張力和扁平鋪展的狀態(tài)。
[0258]4.多孔Ta涂層表面BMSC的粘附和增殖
[0259]我們應(yīng)用DRAQ5來(lái)檢測(cè)涂層表面的BMSC的生長(zhǎng)情況。圖9表明BMSC在多孔Ta涂層表面有比多孔Ti涂層表面更快的增殖速度(48h，n=3 ；Ti coating, 65.377±18.2972 ；Ta coating, 164.80±46.1212 ；P<0.0498*)。
[0260]如圖10所示，PrestoBlue的結(jié)果表明第4及6天后在多孔Ta涂層表面BMSC有比在多孔Ti涂層表面更快的增殖速度(n=3 ;第2天:Ti coating,0.45268±0.097954 ；Ta coating, 1.0767±0.495686，P=0.992 ；第 3 天:Ticoating，0.56950±0.089554，Tacoating, 1.26228±0.458399，Ρ=0.0620 ；第 4 天:Ti coating,0.90275±0.082739，Tacoating, 2.13239±0.699593，Ρ〈0.0390* ；第 6 天:Ti coating, 0.86752±0.089092，Tacoating, 1.68688±0.386935, P〈0.0233*)。
[0261]死活細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)(圖11)以及anti_Ki67實(shí)驗(yàn)(圖12)表明在多孔Ta涂層表面的BMSC不但增殖的更快，而且凋亡的更少。
[0262]CFSE實(shí)驗(yàn)(圖13)表明BMSC在多孔Ta涂層表面相對(duì)更快的增殖速度/細(xì)胞活力不只是由于BMSC可以更好的粘附在多孔Ta涂層表面，其在多孔Ta涂層表面的更快生長(zhǎng)速度也起到一定作用。
[0263]5.多孔Ta涂層表面的BMSC的ALP及RUNX2表達(dá)情況
[0264]對(duì)在多孔Ta涂層表面的BMSC通過(guò)成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，可以檢測(cè)到BMSC的RUNX2的mRNA表達(dá)在多孔Ta涂層表面的相對(duì)上調(diào)(n=3 ；Ti coating，I±0.1404 ;Tacoating, 1.9678±0.2370 ；P<0.01*)(圖 14)。
[0265]通過(guò)免疫熒光(圖15)和ALP染色(圖16)表明在多孔Ta涂層表面BMSC具有更高的ALP的表達(dá)水平。上述結(jié)果表面多孔Ta涂層相對(duì)于多孔Ti涂層更有利于hBMSC的成骨過(guò)程。
[0266]6.多孔Ta涂層假體的體內(nèi)骨整合
[0267]我們使用Van Gieson’ s Picric - Fuchsin染色的硬組織切片用來(lái)觀(guān)察多孔Ta,Ti涂層假體的骨整合情況。新骨形成率通過(guò)鈣黃綠素雙標(biāo)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。假體植入體內(nèi)3個(gè)月后，組織形態(tài)學(xué)計(jì)量提示多孔Ta涂層周?chē)男律敲黠@多于多孔Ti涂層假體(圖17，圖18，n=3;Ti coating，14.0741 ±6.46293 ;Ta coating，32.6501 ±0.90721 ;Ρ〈0.0358*)。鈣黃綠素雙標(biāo)圖17表明多孔Ta涂層假體周?chē)鄬?duì)多孔Ti涂層假體周?chē)懈叩男鹿切纬陕省?br> [0268]討論
[0269]過(guò)去的20年來(lái)，許多不同種類(lèi)的涂層及材料都被用來(lái)提高假體的生物牢固度。由于Ti合金具有優(yōu)良可靠的機(jī)械屬性，其是一種非常合適的承重的生物材料。但和其他大多數(shù)金屬一樣，Ti的成骨誘導(dǎo)性并不強(qiáng)。在生物金屬材料里，Ta是一種越來(lái)越被大家所注意的新型生物材料。在體內(nèi)，Ta表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗腐蝕及優(yōu)良生物活性，但相對(duì)高昂的制作費(fèi)用及其自身的較難的加工性阻礙了 Ta的廣泛應(yīng)用。為了能夠在承力假體發(fā)揮出Ta的優(yōu)良的生物相容性能，本研究通過(guò)真空等離子噴涂技術(shù)在Ti的基材上制備了多孔Ta涂層。而后我們?cè)u(píng)估了通過(guò)真空等離子噴涂制備的Ta涂層的生物相容性及骨誘導(dǎo)性。
[0270]正如在SEM細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)-actin細(xì)胞骨架染色實(shí)驗(yàn)以及PrestoBlue細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)中所見(jiàn)的，體外BMSC和材料相互作用結(jié)果明確提示多孔Ta涂層表面顯著提高了BMSC的黏附和細(xì)胞增殖。假體表面材料的特性和生物相容性非常依賴(lài)于材料和細(xì)胞的相互作用，生物材料可以通過(guò)這種細(xì)胞材料的相互作用影響細(xì)胞的反應(yīng)及行為。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BMSC在多孔Ta涂層表面相對(duì)多孔Ti涂層表面具有好得多的細(xì)胞粘附及細(xì)胞增殖。這些結(jié)果提示Ta表面是具有生物相容性的，并可以顯著影響B(tài)MSC的生物學(xué)行為。一般來(lái)講，初始的粘附影響了后續(xù)的干細(xì)胞分化，從粘附而來(lái)的不同細(xì)胞骨架信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，在那里它們可以改變基因信號(hào)的表達(dá)及更進(jìn)一步的改變細(xì)胞分化過(guò)程。McBeath等證明細(xì)胞形態(tài)會(huì)調(diào)節(jié)BMSC的成骨成脂分化命運(yùn)。比如，可以附著變平伸展的BMSC會(huì)進(jìn)入成骨進(jìn)程，而那些聚集渾圓的細(xì)胞會(huì)變?yōu)槌芍?xì)胞。在本研究中，F(xiàn)-actin細(xì)胞骨架蛋白染色揭示BMSC在多孔Ta涂層表面呈扁平伸展?fàn)?。所以在在多孔Ta，Ti涂層表面不同的BMSC F-actin細(xì)胞骨架可以部分解釋BMSC在多孔Ta涂層表面較高的成骨能力。進(jìn)一步的，多孔Ta涂層相對(duì)多孔Ti涂層不但增加了 BMSC的粘附及增殖，同時(shí)在體外也更有利于干細(xì)胞的成骨分化。這些結(jié)論被ALP及RUNX2在多孔Ta涂層表面的BMSC的高表達(dá)所證實(shí)。一種可能的解釋是彈性與骨近似的基底表面可能有利于骨的新生及BMSC的分化。這樣，由于和骨小梁具有相近的彈性，多孔Ta涂層可能因此更有利于成骨。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)兔的股骨缺損模型，由于Ta具有較好的生物相容性和生物活性，所以相對(duì)多孔Ti涂層假體，多孔Ta涂層假體具有更好的骨整合性。另外，多孔Ta涂層的關(guān)鍵屬性是其可以形成自鈍化的表面氧化層。在體內(nèi)這層表面氧化層發(fā)生水和作用生成Ta-OH，其和體內(nèi)的Ca2+離子形成某種鈣化鉭，而后和磷酸根離子及后續(xù)的大量Ca2+離子和磷酸根離子形成磷灰石層，而這層表面在體內(nèi)導(dǎo)致了骨樣磷灰石的形成，從而使骨和纖維結(jié)構(gòu)可以更容易的長(zhǎng)入，并為后續(xù)骨-軟組織快速大量附著提供調(diào)條件。我們體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)也表明在多孔Ta涂層相對(duì)于在多孔Ti涂層具有更高的新骨形成率。這和我們體外多孔Ta涂層上BMSC具有更高的細(xì)胞粘附增殖和成骨分化也是相符的。
[0271]這些結(jié)果表明多孔Ta涂層在體外具有支持干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的能力，在體內(nèi)具有支持成熟骨細(xì)胞的的能力。多孔Ta是一種在體內(nèi)具有優(yōu)異生物相容性和使用安全性的生物材料，是一種具有吸引力的臨床應(yīng)用選擇。雖然仍然需要長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)及臨床研究來(lái)證明其優(yōu)點(diǎn)和療效，應(yīng)用VPS的多孔Ta涂層作為骨科移植物涂層促進(jìn)骨再生的應(yīng)用前景已經(jīng)被打開(kāi)。
[0272]結(jié)論
[0273]我們通過(guò)VPS在Ti合金基材表面制備了多孔Ta涂層。多孔Ta涂層有效的減少了金屬移植物和骨組織的機(jī)械不相容性。我們通過(guò)檢測(cè)多孔Ta涂層假體的生物相容性骨誘導(dǎo)性及骨整合性，來(lái)確定多孔Ta涂層假體是否適合臨床應(yīng)用。在體外，結(jié)果表明在多孔Ta涂層表面BMSC的細(xì)胞粘附，增殖和成骨分化均較在多孔Ti涂層表面有所提高。更進(jìn)一步的，體內(nèi)兔股骨缺損假體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻鞫嗫譚a涂層假體具有優(yōu)良的骨整合和新骨形成率。我們的結(jié)果表明VPS制備的多孔Ta涂層是一種有希望的骨修復(fù)方式。
[0274]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)合材料，其特征在于，包括: (a)基體，其中所述的基體為金屬基體；和 (b)涂覆于基體上的涂層，所述的涂層為T(mén)a涂層。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料，其特征在于，所述基體表面全部或部分帶有涂層。
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料，其特征在于，所述的涂層具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征: 所述涂層為多孔結(jié)構(gòu)；和/或 所述的涂層厚度為30?500微米；和/或 所述涂層是通過(guò)真空等離子噴涂形成的。
4.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料，其特征在于，所述的金屬基體選自下組:Ti金屬基體、Ti合金基體、不銹鋼基體、Co合金基體，或其組合。
5.如權(quán)利要求1所述的醫(yī)用復(fù)合材料的用途，其特征在于，用于制備醫(yī)用移植物。
6.一種醫(yī)用移植物，其特征在于，所述移植物包括: (a)基體，其中所述的基體是金屬基體；和 (b)涂覆于基體上的涂層，所述的涂層為T(mén)a涂層。
7.如權(quán)利要求6所述的移植物，其特征在于，所述基體表面全部或部分帶有涂層；和/或.所述涂層位于所述移植物與骨接觸的部位。
8.如權(quán)利要求6所述的移植物，其特征在于，所述的涂層具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征: 所述的涂層為多孔結(jié)構(gòu)；和/或 所述的涂層厚度為30?500微米；和/或 所述涂層是通過(guò)真空等離子噴涂法制備。
9.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料的制法，其特征在于，所述復(fù)合材料通過(guò)真空等離子嗔涂法制備。
10.一種制品，其特征在于，所述的制品具有權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料或由權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料所制成。
【文檔編號(hào)】A61L27/04GK104127913SQ201310163527
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2013年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月3日
【發(fā)明者】張曉玲, 謝有桃, 湯賾, 戴尅戎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院