專利名稱：腸道病毒71型感染性克隆及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及腸道病毒71型感染性克隆及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道病毒71型(EV71)病毒和柯薩奇病毒A16 (Coxsckie A16, CA16)是手足口病的主要病原，已在世界范圍內(nèi)引起多次暴發(fā)與流行，主要發(fā)病者為嬰幼兒，嚴(yán)重危害兒童健康，CA16引起的癥狀輕微，而EV71的感染易引起無菌性腦膜炎、腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹性疾病等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，易發(fā)生死亡。腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)的成員，歸屬于人類腸道病毒A。根據(jù)我國衛(wèi)生部的最近數(shù)據(jù)，2010和2011兩個年度報道手足口病病例分別為1774669和1619706例，其中包括死亡病例905和509例。EV71抗體在成人血清中的陽性率達(dá)到65%以上，說明了這種病毒的廣泛傳播，每年春夏季溫度升高時都會進(jìn)入感染高峰期，流行趨勢從散發(fā)逐漸趨于有小型聚集性爆發(fā)。然而，手足口病的相關(guān)科研工作比較薄弱，發(fā)達(dá)國家擁有較好的科研平臺，亞太地區(qū)為主要流行區(qū)域，卻對EV71的關(guān)注很少，至今在臨床上還沒有有效的疫苗和藥物，對EV71進(jìn)行有效的預(yù)防和控制。利用反向遺傳學(xué)方法研究RNA病毒，在質(zhì)粒水平上來操作、研究RNA病毒，獲得的病毒型表型穩(wěn)定，操作方便，為EV71的深入研究提供了一個很好的基礎(chǔ)平臺。但由于EV71的全長基因組有約7.5 Kb的長度，因此，已報道的文章中多是通過分為多段PCR來測序或進(jìn)一步構(gòu)建感染性克隆，操作起來繁復(fù)較多，嚴(yán)重限制了對EV71的深入研究
發(fā)明內(nèi)容
基于此，本發(fā)明提供了一種腸道病毒71型感染性克隆及其簡化的構(gòu)建方法，以及構(gòu)建得到的腸道病毒71型感染性克隆的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:一種腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法，包括以下步驟:(I)、以從腸道病毒71型毒株SZ2010-EV71提取的RNA為模板，SEQ ID NO: 2為引物，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ;所述SZ2010-EV71的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示；(2)、以步驟(I)得到的cDNA為模板，SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為引物，PCR擴增得到腸道病毒71型的全基因組序列；(3)、將步驟(2)得到的腸道病毒71型的全基因組序列與載體連接，酶切，篩選得到陽性克隆，即為腸道病毒71型的感染性克隆。在其中一個實施例中，步驟(I)中所述反轉(zhuǎn)錄的程序為:42°C—個小時，70°C 15分鐘。在其中一個實施例中，步驟⑵中所述PCR的程序為:94°C 30秒，55°C 30秒，72 °C 8分鐘，30個循環(huán)。在其中一個實施例中，步驟(3)中所述載體為T0P0-XL-PCR載體。本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的腸道病毒71型感染性克隆。本發(fā)明還提供了腸道病毒71型毒株SZ2010-EV71，其具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了包含上述腸道病毒71型感染性克隆的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) T0P0-SZ2010-EV71/DH5 α。本發(fā)明還提供了上述腸道病毒71型感染性克隆在制備抗腸道病毒71型藥物或疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明從深圳市2010年手足口病的一例死亡病例的病毒分離株出發(fā)，僅用了一對引物，就擴增構(gòu)建成功了感染性克隆，大大簡化了 EV71的反向遺傳學(xué)操作步驟，為EV71重要毒株的序列獲得和分析、致病機理研究、藥物篩選提供方法提供了更簡便的平臺；在構(gòu)建成功感染性克隆后，設(shè)計了八條引物對一個毒株的多個克隆進(jìn)行了測序和序列比對，最終獲得該毒株的全基因組序列。從而從序列到方法上都填補了國內(nèi)手足口病研究的空白。為EV71的致病機理研究提供了一個有效的平臺，可進(jìn)行多個重要毒株或新毒株的全基因組序列獲得及病毒特性分析，同時為EV71的抗病毒藥物篩選平臺的建立及疫苗的評估提供了重要基礎(chǔ)。本發(fā)明的構(gòu)建腸道病毒71型感染性克隆的方法，利用一對通用引物可擴增目前臨床樣本的絕大多數(shù)EV71病毒。


圖1為來自genebank的現(xiàn)有EV71a、b、c三個亞型的代表毒株的基因組序列的比對圖；圖2為本發(fā)明實施例1中RT-PCR后，采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR結(jié)果進(jìn)行檢測的圖譜；圖3為將圖2中得到的PCR產(chǎn)物連接到T0P0-XL-PCR載體中得到的感染性克??；圖4為通過對20株代表毒株和本發(fā)明獲得的毒株分離株SZ2010-EV71VP1序列比對，繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖5為實施例1中構(gòu)建得到的感染性克隆經(jīng)恢復(fù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的病變圖；其中A為陰性對照，B為恢復(fù)出的病毒；圖6為采用EV71VP1的抗體對圖5中的病變細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，病變細(xì)胞中病毒VPl蛋白的分布圖；其中C為陰性對照，D為恢復(fù)出的病毒。
具體實施方案在以下實施例中，所用的EV71毒株分離株是分離自2010年深圳臨床檢測樣本中的一例死亡病例的糞便(深圳市兒童醫(yī)院防保科，樣本的采集方法、儲存、運送、處理均按照衛(wèi)生部《手足口病預(yù)防控制指南(2008年版)》(6)執(zhí)行)，經(jīng)分析檢測后得到的陽性標(biāo)本，命名為SZ2010-EV71，毒株保藏于深圳市疾病預(yù)防控制中心，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以購買得到。該毒株分離株在序列上有潛在的致病序列或致病突變，病毒致細(xì)胞病變效率強，存在進(jìn)一步的研究價值。以下實施例僅用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的包含范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1E71感染性克隆的構(gòu)建包括以下步驟:1、擴增引物的設(shè)計與合成從genebank中選取EV71a, b, c三個亞型的代表毒株的基因組序列進(jìn)行比對,如圖1所示，在病毒基因組3’和5’端都有30多個堿基的保守序列，因此，理論上來說，選取此段序列設(shè)計引物，可擴增EV71的絕大多數(shù)毒株的全基因組序列。本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計了一對可兼并大部分 EV71 的保守引物 EV71genomeS(SEQ ID NO:1)和 EV7IgenomeA(SEQ IDNO:2)，由Takara公司合成。其中:正向引物(上游引物)EV71genomeS5’端加入SnaBI酶切位點和T7啟動子序列，反向引物(下游引物)EV71gen0meA5’端加入30個T和MluI酶切位點，具體引物序列如下:EV71genomeS: 5，-GCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCC-3’ (SEQ ID NO:1)EV71 genomeA: 5，-ACGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTATTCTGGTTATAACAAATTTAC-3’ (SEQ ID NO:2)2、RT-PCR按照病毒RNA提取試劑盒(羅氏生物有限公司)提取死亡病例糞便樣本的RNA，反轉(zhuǎn)錄的引物為反向引物 EV 71genomeA(SEQ ID NO: 2)，按 Primescript RT-PCR Kit (TAKARA公司)說明書構(gòu)建20 μ L反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄程序為:42°C—個小時，70°C 15分鐘；PCR擴增的引物為正向引物EV71 genomeS (SEQ ID NO:1)和反向引物EV71 genomeA (SEQ ID N0:2)，按照 ex HS taq 酶(TAKARA 公司)說明書構(gòu)建 50 μ L 反應(yīng)體系，PCR程序為:94°C 30秒，550C 30秒，72°C 8分鐘，30個循環(huán)；擴增后，取5ulPCR擴增產(chǎn)物，用0.7%瓊脂糖膠電泳確定EV71基因組是否已經(jīng)獲得。瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示，從圖2可以看出:對病毒RNA進(jìn)行全長基因組RT-PCR擴增，獲得的基因組片段大小在7000-8000bp的位置(DNA marker為Takara公司的DL15000)，與EV71的基因組大小(7.5Kbp左右)基本一致，說明可以獲得很好的EV71的擴增產(chǎn)物。3、EV71感染性克隆的構(gòu)建回收步驟2的基因組片段。由于RT-PCR試劑盒Taq酶的特點，可以直接按照TOPO_ XL PCR Cloning Kit所述，通過T/A方法將步驟2獲得的基因組片段連接到T0P0-XL-PCR載體(invitrogen)中，通過PCR和酶切的方法確定陽性克隆，即為本發(fā)明所述的EV71感染性克隆。圖3為連接有EV71全基因組的T0P0-XL-PCR載體。上述感染性克隆的構(gòu)建方法沒有多個PCR過程，也沒有酶切連接，方法很簡化，適用用于多個EV71重要樣品的全基因組序列克隆和病毒特性分析。4、感染性克隆轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞用構(gòu)建好的含有腸道病毒71型全基因組克隆的T0P0-XL-PCR載體轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5a，得到T0P0-SZ2010-EV71/DH5 a，保藏于深圳市疾病預(yù)防控制中心。5、全基因組測序及比對構(gòu)建獲得陽性克隆后，選取三個陽性克隆測序，設(shè)計八條引物分別對三個陽性克隆同時測序，獲得三個陽性克隆的測序結(jié)果。通過三個克隆全序列的同源比對和拼接獲得感染性克隆的全基因組序列，共7405bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示，申請人將其命名為SZ2010-EV71，其蛋白全序列(核苷酸743-7324bp翻譯出的蛋白序列)如SEQ IDN0:10所示。其中八條引物分別為SEQ ID N0:1-SEQ ID NO:8:EV71 genomeS: 5，-GCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCC-3’ (SEQ ID NO:1)EV71 genomeA: 5，-ACGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTATTCTGGTTATAACAAATTTAC-3’ (SEQ ID NO:2)EV71-813S:5 ‘-CCATAAACTACACCACCATT-3’ (SEQ ID NO:3)EV71-6570A:5 ‘-CCAGAATGTGTCAGGGTTAC-3，(SEQ ID NO:4)EV71-1868S:5 ‘-CTGGAGGTTAACAATGTG-3，(SEQ ID NO:5)EV71-5540A:5 ‘-TGTGCTCAATCCAAATAG-3，(SEQ ID NO:6)`
EV71-2888S:5 ‘-CTCCAATATATGTTTGTG-3’ (SEQ ID NO:7)EV71-4540A:5 ‘-GGGTCTGGTGGGAGCGAG-3，(SEQ ID NO:8)6、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹利用EV71VP1的l_891bp序列比對進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4,發(fā)現(xiàn)此克隆(SZ2010-EV71,即該實施例所米用的毒株分尚株)為C4a亞型病毒,與近年中國主要流行株的趨勢一致。此克隆在基因組核酸序列上與其他地區(qū)中國流行C4a亞型的同源性達(dá)96.79%，與B亞型的同源性89.02%,與A亞型同源性80.21%，與CA16的同源性有74.99%，而在蛋白序列上與其他中國近年流行C4a亞型的同源性98.38%，與B亞型同源性97.08%,與A亞型同源性95.76%，與CA16的同源性有89.88%。從北京、安徽、廣東分離的幾個代表毒株，都屬于近年中國主要流行株C4a，從圖4也可以看出C4a在北京、安徽、廣東都同源性比較高。EV71亞型之間雖然核酸序列變化較大，多為同義突變，蛋白序列的同源性還是很高，而與不同種的病毒CA16的蛋白序列差距相對較大。實施例2實施例1構(gòu)建的感染性克隆的病毒的恢復(fù)采用SnaBI和MluI雙酶切2_3ug純化的質(zhì)粒DNA(即實施例1構(gòu)建的感染性克隆)，膠回收切出的EV71病毒的基因組片段,利用T7RiboMAX express large Scale Rnaproduction System (promega公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)RNeasy mini kit純化試劑盒(Qiagen公司)純化后，用lipofectamin2000 (Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染12孔板的RD細(xì)胞(由中國疾病預(yù)防控制中心病毒預(yù)防控制所提供)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，觀察病變，如圖5所示，EV71病毒傳至第二代可以看出明顯的病變(A為陰性對照)；將第二代可以看到明顯病變的樣品，凍融三次后取上清，取50ul感染24孔板的RD細(xì)胞，18小時后4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞，PBS清洗三次后，3%山羊血清+PBST透化并封閉細(xì)胞，EV71單抗(EV71VP1的抗體，Mab979，Chemicon)與細(xì)胞溫浴I小時，PBS清洗三次后，以德克薩斯紅標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗標(biāo)記細(xì)胞一小時，PBS清洗三次后，熒光顯微鏡觀察。從圖6可以看到病變細(xì)胞能夠被特異的抗體標(biāo)記為陽性(C為陰性對照)。實施例3實施例2恢復(fù)的病毒的組織半數(shù)感染量(TCID50)將傳代RD細(xì)胞按10000個細(xì)胞/孔的接種量接至96孔板中，將獲得的病毒(即實施例2恢復(fù)的病毒)按10_2到10_9八個稀釋倍數(shù)倍比稀釋，每個稀釋倍數(shù)接種10個孔，5天后觀察細(xì)胞死亡率,計算TCID50,詳細(xì)檢測方法見http://jpkc.ynau.edu.cn/course/zwbl/shuo/MolVirol/data/tcid/tcid.htm。將恢復(fù)的病毒與正常分離的病毒相比較，正常病毒可達(dá)到7.8X107TCID50/ml，恢復(fù)的病毒第三代也可以達(dá)到3.2X 107TCID50/ml，說明恢復(fù)出來的病毒的特性并沒有明顯改變。以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專 利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、以從腸道病毒71型毒株SZ2010-EV71提取的RNA為模板，SEQID N0:2為引物，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ;所述SZ2010-EV71的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示； (2)、以步驟(I)得到的cDNA為模板，SEQID N0:1和SEQ ID N0:2為引物，PCR擴增得到腸道病毒71型的全基因組序列； (3)、將步驟(2)得到的腸道病毒71型的全基因組序列與載體連接，酶切，篩選得到陽性克隆，即為腸道病毒71型的感染性克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中所述反轉(zhuǎn)錄的程序為:42°C—個小時，70°C15分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中所述PCR的程序為:94°C30秒，55 °C 30秒，72°C 8分鐘，30個循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的腸道病毒71型感染性克隆的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)中所述載體為TOPO-XL-PCR載體。
5.腸道病毒71型毒株SZ2010-EV71，其特征在于，其具有如SEQID NO:9所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1-4任一項所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的腸道病毒71型感染性克隆。
7.包含權(quán)利要求6所述的腸道病毒71型感染性克隆的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為 T0P0-SZ2010-EV71/DH5a。
8.權(quán)利要求6所 述的腸道病毒71型感染性克隆在制備抗腸道病毒71型藥物或疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腸道病毒71型感染性克隆及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。腸道病毒71型感染性克隆是以從腸道病毒71型毒株SZ2010-EV71提取的RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增得到全基因組序列，再與載體連接，酶切篩選陽性克隆而獲得的。本發(fā)明僅用了一對引物，就擴增構(gòu)建成功了感染性克隆，大大簡化了EV71的反向遺傳學(xué)操作步驟；獲得的感染性克隆及其序列信息，為EV71的致病機理研究提供了一個有效的平臺，可進(jìn)行多個重要毒株或新毒株的全基因組序列獲得及病毒特性分析，同時為EV71的抗病毒藥物篩選平臺的建立及疫苗的評估提供了重要基礎(chǔ)。
文檔編號A61K48/00GK103194475SQ20131013396
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者羅敏, 張仁利, 盧智剛, 冼慧霞 申請人:深圳市疾病預(yù)防控制中心