專(zhuān)利名稱(chēng)：亨廷頓舞蹈癥的靶位蛋白質(zhì)及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種亨廷頓舞蹈癥(HuntingdonDisease, HD)的靶位蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
亨廷頓舞蹈癥(Huntingdon Disease, HD)又稱(chēng)為慢性進(jìn)行性舞蹈病，是目前影響人類(lèi)健康的主要神經(jīng)退行性疾病之一。這是是一種遲發(fā)性神經(jīng)退行性遺傳病，多發(fā)于中老年人，偶見(jiàn)于兒童和青少年，男女均可發(fā)病，發(fā)病隱匿，呈緩慢進(jìn)行性加重，臨床變現(xiàn)為“三聯(lián)征”，包括舞蹈樣不自主動(dòng)作、精神障礙和進(jìn)行性癡呆，平均生存期為10-20年。由于這一疾病多在中年后發(fā)病，而沒(méi)有有效的治療方法，只能任由疾病進(jìn)展，最終致死。因此，它被稱(chēng)為“寂靜的殺手”，給患者本人和家族中·其他成員帶來(lái)極大的痛苦。目前，人類(lèi)還沒(méi)有治療該病的有效措施。該病早已被發(fā)現(xiàn)，但直到1872年才由George Huntington首次對(duì)其進(jìn)行了全面系統(tǒng)的描述。Huntington指出其具有遺傳特性，該病遂以他的名字命名。1993年，HD協(xié)作研究組用外顯子擴(kuò)增和cDNA克隆技術(shù)，將HD基因豇一 J5定位于染色體4pl6.3，同時(shí)確認(rèn)在患者如一 J5基因外顯子I上CAG三核苷酸重復(fù)突變，現(xiàn)已確認(rèn)CAG重復(fù)突變可導(dǎo)致HD發(fā)生。HD基因上的CAG重復(fù)序列編碼一段多聚谷氨酰胺序列(Polyglutamine，PolyQ)，正常人的PolyQ長(zhǎng)度少于35個(gè),而患者的PolyQ長(zhǎng)度則超過(guò)36個(gè)。BrinkImn等對(duì)不同大小CAG重復(fù)序列的個(gè)體外顯情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，HD的外顯率依賴(lài)于CAG的重復(fù)個(gè)數(shù)。Grah等發(fā)現(xiàn)純合子HD病人發(fā)病較早且癥狀更嚴(yán)重，并且CAG的長(zhǎng)度與發(fā)病年齡呈負(fù)相關(guān)。含有延長(zhǎng)的polyQ的htt蛋白在腦內(nèi)的積累被認(rèn)為是誘發(fā)HD的主要原因。內(nèi)切酶切割產(chǎn)生N端截短的htt蛋白，并且在腦內(nèi)積聚成寡聚體和多聚體的形式，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。盡管對(duì)HD的研究已取得了令人矚目的進(jìn)展，但目前對(duì)于HD的致病機(jī)制并沒(méi)有統(tǒng)一結(jié)論，究竟是什么樣的原因?qū)е耯tt蛋白的積聚，目前仍不清楚。越來(lái)越多的證據(jù)表明，內(nèi)源性的金屬離子平衡紊亂尤其是鐵和銅的濃度異常與HD的病理過(guò)程有很強(qiáng)的聯(lián)系。有研究表明HD病人腦部鐵離子和銅離子濃度升高，有報(bào)道指出，在體外的情況下，銅離子可以導(dǎo)致htt exonl polyQ蛋白聚集,提取的小鼠htt蛋白與銅具有結(jié)合作用。因此，通過(guò)調(diào)控銅離子在大腦內(nèi)的累積，有可能預(yù)防或改善HD病癥的發(fā)展。盡管已經(jīng)鑒定了在人腦中參與銅離子運(yùn)輸?shù)牡鞍装蠧trl、Atoxl、CCS、ScoI/
I1、ATP7A、ATP7B，但是在人腦不同的細(xì)胞中銅離子的分布狀況以及銅離子平衡的調(diào)控狀況目前還不太清楚。雖然有些體外實(shí)驗(yàn)表征銅離子可能和HD的發(fā)病可能有一定的關(guān)系，但是一直沒(méi)有更為細(xì)致的、有說(shuō)服力的體內(nèi)證據(jù)來(lái)證明。因此，提供一種可以治療HD的蛋白質(zhì)及其基因序列十分的必要。

發(fā)明內(nèi)容
果蠅是一個(gè)研究人類(lèi)神經(jīng)退行性疾病非常好的模型，所以可以用果蠅為模式生物研究銅離子在HD發(fā)病過(guò)程中的作用，研究銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ctrl、ATP7A和ATP7B)治療亨廷頓舞蹈癥的應(yīng)用。在果蠅腦部表達(dá)htt exonl polyQ可以重現(xiàn)人類(lèi)HD的主要癥狀,包括成活率下降、運(yùn)動(dòng)障礙、htt蛋白聚集、神經(jīng)退化和壽命縮短等。通過(guò)RNAi基因沉默技術(shù)和過(guò)表達(dá)技術(shù)，本發(fā)明在HD果蠅大腦內(nèi)選擇性沉默CtrlB(人類(lèi)Ctrl的果蠅同源基因)基因或者選擇性過(guò)表達(dá)dmATP7 (人類(lèi)ATP7A和ATP7B的果蠅同源基因)基因顯著延緩了果蠅HD病癥的進(jìn)程，選擇性沉默ATP7基因加重了這一病癥的進(jìn)程。本發(fā)明為有效治療HD病癥提供了兩個(gè)關(guān)鍵的基因靶位，有望通過(guò)調(diào)控該基因靶位的表達(dá)防御和延緩人類(lèi)HD疾病。根據(jù)本發(fā)明的人類(lèi)的HD果蠅模型靶位蛋白CtrlB的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示
MDHGSDDSTSTAKSCPMIMVFHAGHCERILWRGWVASTVTEFVLSALAIFLVSFLYEALK 60FLRQQLARREARRASEQLAAEQRRKNEAPAAGGCCSEAPLAEPREQTYWQRLFASSHIVQ 120SLLNLLQIVISYLLMLIFMTFNYWLCL·AVILGLGLGYFFFGWNKKNPDESECCP 175人類(lèi)的HD果蠅模型靶位蛋白dmATP7的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示MPSDERVEATMSTVRLPIVGMTCQSCVRNITEHIGQKSGILGVRVILEENAGYFDYDPRQ 60TDPARIASDIDDMGFECSYPGDAADPPETPASAWTNIRVVGMTCQSCVRNIEGNIGTKPG 120IHSIEVQLAAKNARVQYDPAQYDPAQIAELIDDMGFEASVQEPRSPSQSPSPAPASSPKK 180RATPTPPPPSYAQNGSAVAIPVEQELLTKCFLHIRGMTCASCVAAIEKHCKKIYGLDSIL 240VALLAAKAEVKFNANVVTAENIAKSITELGFPTELIDEPDNGEAEVELEIMGMTCASCVN 300KIESHVLKIRGVTTASVTLLTKRGKFRYITEETGPRSICEAIEALGFEAKLMTGRDKMAH 360NYLEHKEEIRKWRNAFLVSLIFGGPCMVAMIYFMLEMSDKGHANMCCLVPGLSMENLVMF 420LLSTPVQFFGGFHFYVQSYRAIKHGTTNMDVLISMVTTISYVYSVAVVIAAVLLEQNSSP 480LTFFDTPPMLLIFISLGRWLEHIAKGKTSEALSKLLSLKAADALLVEISPDFDIISEKVI 540SVDYVQRGDILKVIPGAKVPVDGKVLYGHSSCDESLITGESMPVAKRKGSVVIGGSINQN 600GVLLVEATHTGENTTLAQIVRLVEEAQTSKAPIQQLADRIAGYFVPFVVVVSSITLIAWI 660IIGFSNPNLVPVAMEHKMHMDQNTIIVSYAFKCALSVLAIACPCALGLATPTAVMVATGT 720GAINGVLVKGATALENAHKVKTVVFDKTGTITHGTPMTSKVTLFVTAQVCSLARALTIVG 780AAEQNSEHPIASAIVHFAKDMLNVGATPQAGSFGKSSHFQAVPGCGIRVTVSNYEQTLRQ 840ACNADRIINYENLHRTHPQGSVPVDNGASIEHLLPQRSVRKSMELNNQQLLSDLVLEPEE 900ELLTDQKIIDSPEILVLIGNREWMERNAIEVPLEISDCMTHEERKGHTAVLCALNGQLVC 960MFAVSDMVKPEAHLAVYTLKRMGIDVVLLTCDNKNTAASIAREVGIRTVYAEVLPSHKVA 1020KIQRIQANGIRVAMV ⑶ GVNDSPALAQADVGITIAAGTDVAAEASDIVLMRNDLLDWAC 1080LDLSRCTVRRIRYNFFFASMYNLLGIPLASGLFAPYGFTLLPWMASVAMAASSVSVVCSS I140LLLKMYRKPTAKTLRTAEYEAQLAAERASGSEDELDKLSLHRGLDDLPEKGRMPFKRSST 1200SLISRIFMHDYGNITSPDAKYGEGLLDPEEQYDGRTKIVRSRFHANDSTELQKL 1254根據(jù)本發(fā)明的治療HD病癥的果蠅模型靶位基因Ctr 1B，其編碼上述CtrlB蛋白，例如，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。atggatcacggctcggatgacagcaccagcacggccaagtcctgccctatgatcatggtg 60ttccacgctggacactgcgagcgaattttgtggcgcggatgggtggcgtccactgtgacg 120gagttcgtgctctccgccctggccatcttcctggtgtccttcctgtatgaggcgctcaag 180ttcctgcgacagcaactggcgcgcagggaagcccgtcgagcaagcgagcagctggcggcg 240gagcagcgtaggaagaacgaggctccggcagccggaggatgetgetcggaagctcccctg 300gcggagccgagggagcagacctactggcagcgcttgttcgcctcgtcgcacatcgtccag 360tccctgctgaacctgctgcagatcgtcatctcgtacctgctgatgctgatcttcatgacc 420ttcaactactggctgtgcctggcagtgatcctgggactgggtctgggctacttcttcttc 480ggctggaacaagaagaatcccgacgagagcgagtgctgtccttag 525
根據(jù)本發(fā)明的治療HD病癥的果蠅模型靶位基因dmATP7，其編碼上述dmATP7蛋白，例如，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。 atgccaagtgacgagagagtagaagcgacgatgtccacggtgcgcctgcccattgtgggc 60atgacttgccagtcgtgtgtgcgcaatatcacagagcacattggccagaaatcgggaatc 120cttggcgtgcgcgtcattctcgaggagaatgcgggctatttcgactacgatccccgacag 180acggatcccgcccggatagccagcgatatcgacgacatgggcttcgagtgcagctatcca 240ggggatgcagcagatcctcccgaa·actcccgccagcgcatggaccaacatacgggtggtg 300ggcatgacctgccagtcgtgcgtgcgcaacatcgaaggcaatatcggcaccaagccgggc 360atccattccattgaggtgcaactggcggccaagaatgcccgcgttcagtacgatcccgcc 420cagtatgatcccgcccagatagccgagctcatcgatgacatgggttttgaggctagtgtg 480caggaacctcgatcgccatcccaatcgccgtcgcccgcccccgcctcatcacccaaaaag 540agggcaactcctactcctccacctccttcatatgctcaaaatggttcggcagtggccata 600cccgtcgaacaggagctactgaccaaatgctttctgcacatccgaggcatgacgtgcgcc 660agctgtgtggccgccatcgagaagcactgcaagaagatctacggcctggacagcatcctg 720gtagccctgctggccgccaaggcggaggtcaagttcaatgccaatgttgtgacggccgag 780aatatagcgaaatcaatcacggagctgggcttccccaccgaacteatcgatgagccggac 840aacggcgaggcggaggtggagttggagattatgggcatgacttgcgcctcctgcgtcaac 900aagatcgagagtcatgtgcttaaaataaggggcgtgaccaccgcctccgtcacactgcta 960acaaagaggggcaaattccggtacatcacggaggagacgggtccccggagcatctgcgag 1020gcgatcgaggcgctgggattcgaggccaaactgatgaccggccgagacaagatggcccac 1080aattatctggagcacaaggaggagatacggaagtggcgcaatgccttcctcgtctcgcta 1140attttcggtggaccctgcatggtggccatgatatacttcatgctggagatgagcgacaag 1200ggacatgccaacatgtgctgcctcgtgcccggcctgtcgatggagaatctggtgatgttc 1260ctgctatcgacaccagtgcagttcttcggtggctttcacttctatgtgcaatcctatcgt 1320gcgatcaaacacggcaccacgaacatggatgtactgatctcgatggtcacgaccatctcg 1380tatgtgtactcagtggccgtggtgatcgccgccgtgctgctagagcagaatagetcccca 1440ctgaccttcttcgatacgccgcccatgctgttgatcttcatatcgctgggtcgctggctg 1500gagcacatagccaagggaaagacctcggaggccttgtccaagctgctgtcgctcaaggcg 1560gccgatgccctgctggtcgagatatcaccggactttgatatcatcagcgagaaggtgata 1620tctgtggattatgtacagcgtggcgatatcctaaaggtgataccgggagccaaagttcca 1680gtggacggcaaagttctgtacggtcactccagttgcgatgaatcactaatcaccggggag 1740tctatgccggtggccaagcgaaagggatccgtcgtaatcggcggttccattaaccaaaac 1800ggtgtgctcctcgtagaggcaacgcacacgggtgagaatacgacgctcgcgcagattgtg 1860cgattagtggaggaggcccagacgagtaaggcgcccatccagcaactggccgatcggatt 1920gccggctactttgtgcccttcgttgttgtagtgtccagtataacgctgattgcttggatc 1980atcattggtttttccaatccaaacttggtgcccgtggccatggagcataagatgcacatg 2040gaccagaataccatcatcgttagttatgcatttaaatgtgccttgagcgtgctggccatt 2100gcgtgtccatgtgctttgggcttggccacgcccaccgctgtaatggtggccactggaacg 2160ggtgcgatcaatggcgtgctggtgaaaggagccactgccctagagaatgcccacaaggta 2220aagactgtggtcttcgacaagaccggcaccataacccatggcactccgatgaccagtaag 2280gttaccctcttcgtcacagcccaggtctgcagcctggcgcgtgctctgacgatcgtggga 2340gccgccgagcaaaacagcgagcatccgatcgcctccgccattgtgcacttcgccaaggat 2400atgctgaacgtgggcgccacacctcaggccggcagctttggcaagagcagtcacttccag 3360gccgtgcccggctgtggcatccgcgtcaccgtctccaattacgagcagactctgcgacag 2520gcgtgcaacgccgatcggatcattaactacgagaacctgcatcgcactcatccacagggt 2580tcggtgccggtggacaatggagccagtatcgaacacttgctgccgcagcgcagcgtacgc 2640aagtccatggagctgaacaatcagcagttgctatccgacttggtattggaaccggaggaa 2700gagctccttacggatcagaaaatcatcgattcacccgagattctggtgctgatcggcaat 2760cgcgaatggatggaac·gcaatgccatcgaagtgccgctggagattagcgattgtatgacg 2820catgaagaacgaaagggacacacagctgtgctatgcgccctcaacgggcagctggtgtgc 2880atgtttgcggtgtccgacatggtcaagccagaggcccatcttgccgtctatacactaaag 2940cgaatgggcatcgatgtggtgctgctcacgggggataacaagaacacggcagccagcatt 3000gcccgagaggttggcatccgaaccgtgtacgcggaggttttgccctcgcataaagtggcc 3060aaaatccagcggatacaggccaacggtatacgcgtggccatggtgggcgatggagtcaac 3120gacagtccggcgctagcgcaggcagatgtgggaattacgattgcagcgggcacggatgtt 3180gccgccgaggcatcggacattgtcctgatgcgcaacgatctgctggatgtggtggcttgc 3240ctggacttgtcccgctgcacggtgcgtcgcattcggtacaacttcttctttgccagcatg 3300tacaatctgctgggcataccgctggccagtggcttgttcgcaccgtacggcttcaccctg 3360ctgccatggatggcgtccgtggccatggccgccagctccgtgagcgtggtatgetcateg 4320ctgctgctcaagatgtatcgcaagcccacggcgaagacgttgcgcacggcagagtacgag 3480gcgcagctggcggcggaacgcgcaagtgggtccgaagacgagctggacaagctgtccctc 3540catcgtggccttgacgatttgcccgaaaagggtaggatgccattcaagcggtccagcaca 3600tcactgatttcgcgcattttcatgcacgactacgggaacatcacttcgccggatgccaaa 3660tacggggagggactgctggatcccgaggagcagtatgatggccgcaccaagatcgtgagg 3720agtcgcttccatgccaatgacagcaccgaactgcaaaagctgtga 3765
根據(jù)本發(fā)明的人的亨廷頓舞蹈癥的靶位蛋白質(zhì)包括如SEQ ID N0.5所示的氨基酸的序列(Ctrl)0 MDHSHHMGMSYMDSNSTMQPSHHHPTTSASHSHGGGDSSMMMMPMTFYFGFKNVELLFSG 60LVINTAGEMAGAFVAVFLLAMFYEGLKIARESLLRKSQVSIRYNSMPVPGPNGTILMETH 120KTVGQQMLSFPHLLQTVLHIIQVVISYFLMLIFMTYNGYLCIAVAAGAGTGYFLFSWKKA 180VVVDITEHCH 190
根據(jù)本發(fā)明的人的亨廷頓舞蹈癥的靶位蛋白質(zhì)包括如SEQ ID如.6所示的4了 7八氨基
酸的序列(Menkes),
MDPSMGVNSVTISVEGMTCNSCVWTIEQQIGKVNGVHHIKVSLEEKNATIIYDPKLQTPK 60TLQEAIDDMGFDAVIHNPDPLPVLTDTLFLTVTASLTLPWDHIQSTLLKTKGVTDIKIYP 120QKRTVAVTIIPSIVNANQIKELVPELSLDTGTLEKKSGACEDHSMAQAGEVVLKMKVEGM 180TCHSCTSTIEGKIGKLQGVQRIKVSLDNQEATIVYQPHLISVEEMKKQIEAMGFPAFVKK 240QPKYLKLGAIDVERLKNTPVKSSEGSQQRSPSYTNDSTATFIIDGMHCKSCVSNIESTLS 300ALQYVSSIVVSLENRSAIVKYNASSVTPESLRKAIEAVSPGLYRVSITSEVESTSNSPSS 360SSLQKIPLNVVSQPLTQETVINIDGMTCNSCVQSIEGVISKKPGVKSIRVSLANSNGTVE 420YDPLLTSPETLRGAIEDMGFDATLSDTNEPLVVIAQPSSEMPLLTSTNEFYTKGMTPVQD 480KEEGKNSSKCYIQVTGMTCASCVANIERNLRREEGIYSILVALMAGKAEVRYNPAVIQPP 540MIAEFIRELGFGATVIENADE⑶GVLELWRGMTCASCVHKIESSLTKHRGILYCSVALA 600TNKAHIKYDPEIIGPRDIIHTIESLGFEASLVKKDRSASHLDHKREIRQWRRSFLVSLFF 660CIPVMGLMIYMMVMDHHFATLHHNQNMSKEEMINLHSSMFLERQILPGLSVMNLLSFLLC 720VPVQFFGGWYFYIQAYKALKHKTANMDVLIVLATTIAFAYSLIILLVAMYERAKVNPITF 780FDTPPMLFVFIALGRWLEHIAKGKTSEALAKLISLQATEATIVTLDSDNILLSEEQVDVE 840LVQRGDIIKVVPGGKFPVDGRVIEGHSMVDESLITGEAMPVAKKPGSTVIAGSINQNGSL 900LICATHVGADTTLSQIVKLVEEAQTSKAPIQQFADKLSGYFVPFIVFVSIATLLVWIVIG 960FLNFEIVETYFPGYNRSISR·TETIIRFAFQASITVLCIACPCSLGLATPTAVMVGTGVGA 1020QNGILIKGGEPLEMAHKVKVVVFDKTGTITHGTPVVNQVKVLTESNRISHHKILAIVGTA 1080ESNSEHPLGTAITKYCKQELDTETLGTCIDFQVVPGCGISCKVTNIEGLLHKNNWNIEDN 1140NIKNASLVQIDASNEQSSTSSSMIIDAQISNALNAQQYKVLIGNREWMIRNGLVINNDVN 1200DFMTEHERKGRTAVLVAVDDELCGLIAIADTVKPEAELAIHILKSMGLEVVLMTCDNSKT 1260ARSIASQVGITKVFAEVLPSHKVAKVKQLQEEGKRVAMVGDGINDSPALAMANVGIAIGT 1320GTDVAIEAADVVLIRNDLLDVVASIDLSRETVKRIRINFVFALIYNLVGIPIAAGVFMPI 1380GLVLQPWMGSAAMAASSVSVVLSSLFLKLYRKPTYESYELPARSQIGQKSPSEISVHVGI 1440DDTSRNSPKLGLLDRIVNYSRASINSLLSDKRSLNSVVTSEPDKHSLLVGDFREDDDTAL 1500以及 SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9 所示的 ATP7B 氨基酸的序列(Wilson)。SEQ ID N0.7
MPEQERQITAREGASRKILSKLSLPTRAWEPAMKKSFAFDNVGYEGGLDGLGPSSQVATS 60TVRILGMTCQSCVKSIEDRISNLKGIISMKVSLEQGSATVKYVPSVVCLQQVCHQIGDMG 120FEASIAEGKAASWPSRSLPAQEAVVKLRVEGMTCQSCVSSIEGKVRKLQGVVRVKVSLSN 180QEAVITYQPYLIQPEDLRDHVNDMGFEAAIKSKVAPLSLGPIDIERLQSTNPKRPLSSAN 240QNFNNSETLGHQGSHVVTLQLRIDGMHCKSCVLNIEENIGQLLGVQSIQVSLENKTAQVK 300YDPSCTSPVALQRAIEALPPGNFKVSLPDGAEGSGTDHRSSSSHSPGSPPRNQVQGTCST 360TLIAIAGMTCASCVHSIEGMISQLEGVQQISVSLAEGTATVLYNPSVISPEELRAAIEDM 420GFEASVVSESCSTNPLGNHSAGNSMVQTTDGTPTSVQEVAPHTGRLPANHAPDILAKSPQ 480STRAVAPQKCFLQIKGMTCASCVSNIERNLQKEAGVLSVLVALMAGKAEIKYDPEVIQPL 540EIAQFIQDLGFEAAVMEDYAGSDGNIELTITGMTCASCVHNIESKLTRTNGITYASVALA 600TSKALVKFDPEIIGPRDIIKIIEEIGFHASLAQRNPNAHHLDHKMEIKQffKKSFLCSLVF 660GIPVMALMIYMLIPSNEPHQSMVLDHNIIPGLSILNLIFFILCTFVQLLGGWYFYVQAYK 720SLRHRSANMDVLIVLATSIAYVYSLVILVVAVAEKAERSPVTFFDTPPMLFVFIALGRWL 780EHLAKSKTSEALAKLMSLQATEATVVTLGEDNLIIREEQVPMELVQRGDIVKVVPGGKFP 840VDGKVLEGNTMADESLITGEAMPVTKKPGSTVIAGSINAHGSVLIKATHVGNDTTLAQIV 900KLVEEAQMSKAPIQQLADRFSGYFVPFIIIMSTLTLVVWIVIGFIDFGVVQRYFPNPNKH 960ISQTEVIIRFAFQTSITVLCIACPCSLGLATPTAVMVGTGVAAQNGILIKGGKPLEMAHK 1020IKTVMFDKTGTITHGVPRVMRVLLLGDVATLPLRKVLAVVGTAEASSEHPLGVAVTKYCK 1080EELGTETLGYCTDFQAVPGCGIGCKVSNVEGILAHSERPLSAPASHLNEAGSLPAEKDAV 1140PQTFSVLIGNREWLRRNGLTISSDVSDAMTDHEMKGQTAILVAIDGVLCGMIAIADAVKQ 1200EAALAVHTLQSMGVDVVLITCDNRKTARAIATQVGINKVFAEVLPSHKVAKVQELQNKGK 1260KVAMVGDGVNDSPALAQADMGVAIGTGTDVAIEAADVVLIRNDLLDVVASIHLSKRTVRR 1320IRINLVLALIYNLVGIPIAAGVFMPIGIVLQPWMGSAAMAASSVSVVLSSLQLKCYKKPD 1380LERYEAQAHGHMKPLTASQVSVHIGMDDRWRDSPRATPWDQVSYVSQVSLSSLTSDKPSR 1440HSAAADDD⑶KWSLLLNGRDEEQYI1465SEQ ID N0.8·
MPEQERQITAREGASRKILSKLSLPTRAWEPAMKKSFAFDNVGYEGGLDGLGPSSQVATS 60TVRILGMTCQSCVKSIEDRISNLKGIISMKVSLEQGSATVKYVPSVVCLQQVCHQIGDMG 120FEASIAEGKAASWPSRSLPAQEAVVKLRVEGMTCQSCVSSIEGKVRKLQGVVRVKVSLSN 180QEAVITYQPYLIQPEDLRDHVNDMGFEAAIKSKVAPLSLGPIDIERLQSTNPKRPLSSAN 240QNFNNSETLGHQGSHVVTLQLRIDGMHCKSCVLNIEENIGQLLGVQSIQVSLENKTAQVK 300YDPSCTSPVALQRAIEALPPGNFKVSLPDGAEGSGTDHRSSSSHSPGSPPRNQVQGTCST 360TLIAIAGMTCASCVHSIEGMISQLEGVQQISVSLAEGTATVLYNPSVISPEELRAAIEDM 420GFEASVVSESCSTNPLGNHSAGNSMVQTTDGTPTSVQEVAPHTGRLPANHAPDILAKSPQ 480STRAVAPQKCFLQIKGMTCASCVSNIERNLQKEAGVLSVLVALMAGKAEIKYDPEVIQPL 540EIAQFIQDLGFEAAVMEDYAGSDGNIELTITGMTCASCVHNIESKLTRTNGITYASVALA 600TSKALVKFDPEIIGPRDIIKIIESKTSEALAKLMSLQATEATVVTLGEDNLIIREEQVPM 660ELVQRGDIVKVVPGGKFPVDGKVLEGNTMADESLITGEAMPVTKKPGSTVIAGSINAHGS 720VLIKATHVGNDTTLAQIVKLVEEAQMSKNPNKHISQTEVIIRFAFQTSITVLCIACPCSL 780GLATPTAVMVGTGVAAQNGILIKGGKPLEMAHKIKTVMFDKTGTITHGVPRVMRVLLLGD 840VATLPLRKVLAVVGTAEASSEHPLGVAVTKYCKEELGTETLGYCTDFQAVPGCGIGCKVS 900NVEGILAHSERPLSAPASHLNEAGSLPAEKDAVPQTFSVLIGNREWLRRNGLTISSDVSD 960AMTDHEMKGQTAILVAIDGVLCGMIAIADAVKQEAALAVHTLQSMGVDVVLITCDNRKTA 1020RAIATQVGINKVFAEVLPSHKVAKVQELQNKGKKVAMVGDGVNDSPALAQADMGVAIGTG 1080TDVAIEAADVVLIRNDLLDVVASIHLSKRTVRRIRINLVLALIYNLVGIPIAAGVFMPIG 1140IVLQPWMGSAAMAASSVSVVLSSLQLKCYKKPDLERYEAQAHGHMKPLTASQVSVHIGMD 1200DRWRDSPRATPWDQVSYVSQVSLSSLTSDKPSRHSAAADDD⑶KWSLLLNGRDEEQYI 1258SEQ ID N0.9MPEQERQITAREGASRKILSKLSLPTRAWEPAMKKSFAFDNVGYEGGLDGLGPSSQVATS 60TVRILGMTCQSCVKSIEDRISNLKGIISMKVSLEQGSATVKYVPSVVCLQQVCHQIGDMG 120FEASIAEGKAASWPSRSLPAQEAVVKLRVEGMTCQSCVSSIEGKVRKLQGVVRVKVSLSN 180QEAVITYQPYLIQPEDLRDHVNDMGFEAAIKSKVAPLSLGPIDIERLQSTNPKRPLSSAN 240QNFNNSETLGHQGSHVVTLQLRIDGMHCMISQLEGVQQISVSLAEGTATVLYNPSVISPE 300ELRAAIEDMGFEASVVSESCSTNPLGNHSAGNSMVQTTDGTPTSVQEVAPHTGRLPANHA 360PDILAKSPQSTRAVAPQKCFLQIKGMTCASCVSNIERNLQKEAGVLSVLVALMAGKAEIK 420YDPEVIQPLEIAQFIQDLGFEAAVMEDYAGSDGNIELTITGMTCASCVHNIESKLTRTNG 480ITYASVALATSKALVKFDPEIIGPRDIIKIIEEIGFHASLAQRNPNAHHLDHKMEIKQffK 540KSFLCSLVFGIPVMALMIYMLIPSNEPHQSMVLDHNIIPGLSILNLIFFILCTFVQLLGG 600WYFYVQAYKSLRHRSANMDVLIVLATSIAYVYSLVILVVAVAEKAERSPVTFFDTPPMLF 660VFIALGRWLEHLAKSKTSEALAKLMSLQATEATVVTLGEDNLIIREEQVPMELVQRGDIV 720KVVPGGKFPVDGKVLEGNTMADESLITGEAMPVTKKPGSTVIAGSINAHGSVLIKATHVG 780NDTTLAQIVKLVEEAQMSKAPIQQLADRFSGYFVPFIIIMSTLTLVVWIVIGFIDFGVVQ 840RYFPNPNKHISQTEVIIRFAFQTSITVLCIACPCSLGLATPTAVMVGTGVAAQNGILIKG 900GKPLEMAHKIKTVMFDKTGTITHGVPRVMRVLLLGDVATLPLRKVLAVVGTAEASSEHPL 960GVAVTKYCKEELGTETLGYCTDFQAVPGCGIGCKVSNVEGILAHSERPLSAPASHLNEAG 1020SLPAEKDAVPQTFSVLIGNREWLRRNGLTISSDVSDAMTDHEMKGQTAILVAIDGVLCGM 1080IAIADAVKQEAALAVHTLQSMGVDVVLITCDNRKTARAIATQVGINKVFAEVLPSHKVAK 1140VQELQNKGKKVAMVGDGVNDSPALAQADMGVAIGTGTDVAIEAADVVLIRNDLLDVVASI 1200HLSKRTVRRIRINLVLALIYNLVGIPIAAGVFMPIGIVLQPWMGSAAMAASSVSVVLSSL 1260QLKCYKKPDLERYEAQAHGHMKPLTASQVSVHIGMDDRWRDSPRATPWDQVSYVSQVSLS 1320SLTSDKPSRHSAAADDD⑶KWSLLLNGRDEEQYI 1354
根據(jù)本發(fā)明的人亨廷頓舞蹈癥·的靶位基因編碼上述的Ctrl蛋白質(zhì)，所述基因包括如
SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列。atggatcattcccaccatatggggatgagctatatggactccaacagtaccatgcaacct 60tctcaccatcacccaaccacttcagcctcacactcccatggtggaggagacagcagcatg 120atgatgatgcctatgaccttctactttggctttaagaatgtggaactactgttttccggt 180ttggtgatcaatacagctggagaaatggctggagcttttgtggcagtgtttttactagca 240atgttctatgaaggactcaagatagcccgagagagcctgctgcgtaagtcacaagtcagc 300attcgctacaattccatgcctgtcccaggaccaaatggaaccatccttatggagacacac 360aaaactgttgggcaacagatgctgagctttcctcacctcctgcaaacagtgctgcacatc 420atccaggtggtcataagctacttcctcatgctcatcttcatgacctacaacgggtacctc 480tgcattgcagtagcagcaggggccggtacaggatacttcctcttcagctggaagaaggca 540gtggtagtggatatcacagagcattgccattga 573
根據(jù)本發(fā)明的人亨廷頓舞蹈癥的靶位基因編碼上述的Menkes蛋白質(zhì)，所述基因包括
如SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列。atggatccaagtatgggtgtgaattctgttaccatttctgttgagggtatgacttgcaat 60tcctgtgtttggaccattgagcagcagattggaaaagtgaatggtgtgcatcacattaag 120gtatcactggaagaaaaaaatgcaactattatttatgaccctaaactacagactccaaag 180accctacaggaagctattgatgacatgggctttgatgctgttatccataatcctgaccct 240ctccctgttttaactgacaccttgtttctgactgttacggcgtcactgactttgccatgg 300gaccatatccaaagcacattgctgaagaccaagggtgtgacagacattaaaatttaccct 360cagaaaagaactgtagcagtgacaataatcccttctatagtgaatgccaatcagataaaa 420gagetggttccagaactcagtttagatactgggacactggagaaaaagtcaggagcttgt 480gaagatcatagtatggctcaagctggtgaagtcgtgctgaagatgaaagtggaagggatg 540acctgccattcatgtactagcactattgaaggaaaaattgggaaactgcaaggtgttcag 600cgaattaaagtctccctggacaatcaagaagctactattgtttatcaacctcatcttatc 660tcagtagaggaaatgaaaaagcagattgaagctatgggctttccagcatttgtcaaaaag 720cagcccaagtacctcaaattgggagctattgatgtagaacgtctaaagaacacaccagtt 780aaatcctcagaagggtcacagcaaaggagtccatcatataccaatgattcaacagccact 840ttcatcattgatggcatgcattgtaaatcatgtgtgtcaaatattgaaagtactttatct 900gcactccaatatgtaagcagcatagtagtttctttagagaataggtctgccattgtgaag 960tataatgcaagctcagtcactccagaatccctgagaaaagcaatagaggctgtatcaccg 1020gggctatatagagttagtatcacaagtgaagttgagagtacctcaaactctccctccagc 1080tcatctcttcagaagattcctttgaatgtagttagccagcctctgacacaagaaactgtg 1140ataaacattgatggcatgacttgtaattcctgtgtgcagtctattgagggtgtcatatca 1200aaaaagccaggtgtaaaatc·catacgagtctcccttgcaaatagcaatgggactgttgag 1260tatgatcctctactaacctctccagaaacgttgagaggagcaatagaagacatgggattt 1320gatgctaccttgtcagacacgaatgagccgttggtagtaatagctcagcctteatcggaa 1380atgccgcttttgacttcaactaatgaattttatactaaagggatgacaccagttcaagac 1440aaggaggaaggaaagaattcatctaagtgttacatacaggtcactggcatgacttgcgct 1500tcctgtgtagcaaacattgaacggaatttaaggcgggaagaaggaatatattctatactt 1560gtggccctgatggctggcaaggcagaagtaaggtataatcctgctgttatacaaccccca 1620atgatagcagagttcatccgagaacttggatttggagccactgtgatagaaaatgctgat 1680gaaggagatggtgttttggaacttgttgtgaggggaatgacgtgtgcctcctgcgtacat 1740aaaatagagtctagtctcacaaaacacagagggatcctatactgctccgtggccctggca 1800accaacaaagcacatattaaatatgacccagaaattattggtcctagagatattatccat 1860acaattgaaagcttaggttttgaagcttctttggtcaagaaggatcggtcagcaagtcac 1920ttagatcataaacgagaaataagacaatggagacggtcttttcttgtgagtctgtttttc 1980tgtattcctgtaatggggctgatgatatatatgatggttatggaccaccactttgcaact 2040cttcaccataatcaaaacatgagtaaagaagaaatgatcaaccttcattcttctatgttc 2100ctggagcgccagattcttccaggattgtctgttatgaatttgctgtcctttttattgtgt 2160gtacctgtacagtttttcggaggctggtacttctacattcaggcttataaagcactgaag 2220cataagacagcaaatatggacgtactgattgtgctggcaaccaccattgcatttgcctac 2280tctttgattattcttctagttgcaatgtatgagagagccaaagtgaaccctattactttc 2340tttgacacaccccctatgctgtttgtgtttattgcactaggccgatggctggaacatata 2400gcaaagggcaaaacatcagaggctcttgcaaagttaatttcactacaagctacagaagca 2460actattgtaactcttgattctgataatatcctcctcagtgaagaacaagtggatgtggaa 2520cttgtacaacgtggagatatcattaaagtagttccaggaggcaaatttccagtggatggt 2580cgtgttattgaaggacattctatggtagatgagtccctcatcacaggggaggcaatgcct 2640gtggctaagaaacctggcagcacagtgattgctggttccattaaccagaacgggtcactg 2700cttatctgcgcaacacatgttggagcagacacaaccctttctcaaattgtcaaacttgtg 2760gaagaggcacaaacatcaaaggctcctatccagcagtttgcagacaaactcagtggctat 2820tttgttccttttattgtttttgtttccattgccaccctcttggtatggattgtaattgga 2880tttctgaattttgaaattgtggaaacctactttcctggctacaatagaagtatctcccga 2940acagaaacgataatacgatttgctttccaagcctctatcacagttctgtgtattgcatgt 3000ccctgttcactgggactggccactccaactgctgtgatggtgggtacaggagtaggtgct 3060caaaatggcatactaataaaaggtggagagccattggagatggctcataaggtaaaggta 3120gtggtatttgataagactggaaccattactcacggaaccccagtggtgaatcaagtaaag 3180gttctaactgaaagtaacagaatatcacaccataaaatcttggccattgtgggaactgct 3240gaaagtaacagtgaacaccctctaggaacagccataaccaaatattgcaaacaggagctg 3300gacactgaaaccttgggtacctgcatagatttccaggttgtgccaggctgtggtattagc 3360tgtaaagtcaccaatattgaaggcttgctacataagaataactggaatatagaggacaat 3420aatattaaaaatgcatccctggttcaaattgatgccagtaatgaacagtcatcaacttcg 3480tcttccatgattattgatgcccagatctcaaatgctcttaatgctcagcagtataaagtc 3540ctcattggtaaccgggagtggatgattagaaatggtcttgtcattaataacgatgtaaat 3600gatttcatgactgaacatgagagaaaaggtcggactgctgtattagtagcagttgatgat 3660gagctgtgtggcttgatagc·cattgcagacacagtgaagcctgaagcagaactggctatc 3720catattctgaaatctatgggcttagaagtagttctgatgactggagacaacagtaaaaca 3780gctagatctattgcttctcaggttggcattactaaggtgtttgctgaagttctaccttct 3840cacaaggttgctaaagtgaagcaacttcaagaggaggggaaacgggtagcaatggtggga 3900gatggaatcaatgactccccagctctggcaatggctaatgtgggaattgctattggcaca 3960ggcacagatgtagccattgaagcagctgatgtggttttgataaggaatgatcttctggat 4020gtagtggcaagtattgacttatcaagagagacagtcaagaggattcggataaattttgtc 4080tttgctctaatttataatctggttggaattcccatagctgctggagtttttatgcccatt 4140ggtttggttttgcagccctggatgggatctgcagcaatggctgcttcatctgtttctgta 4200gtactttcttctctcttccttaaactttacaggaaaccaacttacgagagttatgaactg 4260cctgcccggagccagataggacagaagagtccttcagaaatcagcgttcatgttggaata 4320gatgatacctcaaggaattctcctaaactgggtttgctggaccggattgttaattatagc 4380agagcctctataaactcactactgtctgataaacgctccctaaacagtgttgttaccagt 4440gaacctgacaagcactcactcctggtgggagacttcagggaagatgatgacactgcatta 4500taa 4503
根據(jù)本發(fā)明的人亨廷頓舞蹈癥的靶位基因編碼上述的Wilson蛋白質(zhì)，所述基因包括
如 SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.14 所示的核苷酸序列。SEQ ID N0.12
atgcctgagcaggagagacagatcacagccagagaaggggccagtcggaaaatcttatct 60aagctttctttgcctacccgtgcctgggaaccagcaatgaagaagagttttgcttttgac 120aatgttggctatgaaggtggtctggatggcctgggcccttcttctcaggtggccaccagc 180acagtcaggatcttgggcatgacttgccagtcatgtgtgaagtccattgaggacaggatt 240tccaatttgaaaggcatcatcagcatgaaggtttccctggaacaaggcagtgccactgtg 300aaatatgtgccatcggttgtgtgcctgcaacaggtttgccatcaaattggggacatgggc 360ttcgaggccagcattgcagaaggaaaggcagcctcctggccctcaaggtccttgcctgcc 420caggaggctgtggtcaagctccgggtggagggcatgacctgccagtcctgtgtcagctcc 480attgaaggcaaggtccggaaactgcaaggagtagtgagagtcaaagtctcactcagcaac 540caagaggccgtcatcacttatcagccttatctcattcagcccgaagacctcagggaccat 600gtaaatgacatgggatttgaagctgccatcaagagcaaagtggctcccttaagcctggga 660ccaattgatattgagcggttacaaagcactaacccaaagagacctttatcttctgctaac 720cagaattttaataattctgagaccttggggcaccaaggaagccatgtggtcaccctccaa 780ctgagaatagatggaatgcattgtaagtcttgcgtcttgaatattgaagaaaatattggc 840cagctcctaggggttcaaagtattcaagtgtccttggagaacaaaactgcccaagtaaag 900tatgacccttcttgtaccagcccagtggctctgcagagggctatcgaggcacttccacct 960gggaattttaaagtttctcttcctgatggagccgaagggagtgggacagatcacaggtct 1020tccagttctcattcccctggctccccaccgagaaaccaggtccagggcacatgcagtacc 1080actctgattgccattgccggcatgacctgtgcatcctgtgtccattccattgaaggcatg 1140atctcccaactggaaggggtgcagcaaatatcggtgtctttggccgaagggactgcaaca 1200gttctttataatccctctgtaattagcccagaagaactcagagctgctatagaagacatg 1260ggatttgaggcttcagtcgtttctgaaagctgttctactaaccctcttggaaaccacagt 1320gctgggaattccatggtgcaa·actacagatggtacacctacatctgtgcaggaagtggct 1380ccccacactgggaggctccctgcaaaccatgccccggacatcttggcaaagtccccacaa 1440tcaaccagagcagtggcaccgcagaagtgcttcttacagatcaaaggcatgacctgtgca 1500tcctgtgtgtctaacatagaaaggaatctgcagaaagaagctggtgttctctccgtgttg 1560gttgccttgatggcaggaaaggcagagatcaagtatgacccagaggtcatccagcccctc 1620gagatagctcagttcatccaggacctgggttttgaggcagcagtcatggaggactacgca 1680ggctccgatggcaacattgagetgacaatcacagggatgacctgcgcgtcctgtgtccac 1740aacatagagtccaaactcacgaggacaaatggcatcacttatgcctccgttgcccttgcc 1800accagcaaagcccttgttaagtttgacccggaaattatcggtccacgggatattatcaaa 1860attattgaggaaattggctttcatgcttccctggcccagagaaaccccaacgctcatcac 1920ttggaccacaagatggaaataaagcagtggaagaagtctttcctgtgcagcctggtgttt 1980ggcatccctgtcatggccttaatgatctatatgctgatacccagcaacgagccccaccag 2040tccatggtcctggaccacaacatcattccaggactgtccattctaaatctcatcttcttt 2100atcttgtgtacctttgtccagctcctcggtgggtggtacttctacgttcaggcctacaaa 2160tctctgagacacaggtcagccaacatggacgtgctcatcgtcctggccacaagcattgct 2220tatgtttattctctggtcatcctggtggttgctgtggctgagaaggcggagaggagccct 2280gtgacattcttcgacacgccccccatgctctttgtgttcattgccctgggccggtggctg 2340gaacacttggcaaagagcaaaacctcagaagccctggctaaactcatgtctctccaagcc 2400acagaagccaccgttgtgacccttggtgaggacaatttaatcatcagggaggagcaagtc 2460cccatggagctggtgcagcggggcgatatcgtcaaggtggtccctgggggaaagtttcca 2520gtggatgggaaagtcctggaaggcaataccatggctgatgagtccctcatcacaggagaa 2580gccatgccagtcactaagaaacccggaagcactgtaattgcggggtctataaatgcacat 2640ggctctgtgctcattaaagctacccacgtgggcaatgacaccactttggctcagattgtg 2700aaactggtggaagaggctcagatgtcaaaggcacccattcagcagctggctgaccggttt 2760agtggatattttgtcccatttatcatcatcatgtcaactttgacgttggtggtatggatt 2820gtaatcggttttatcgattttggtgttgttcagagatactttcctaaccccaacaagcac 2880atctcccagacagaggtgatcatccggtttgctttccagacgtccatcacggtgctgtgc 2940attgcctgcccctgctccctggggctggccacgcccacggctgtcatggtgggcaccggg 3000gtggccgcgcagaacggcatcctcatcaagggaggcaagcccctggagatggcgcacaag 3060ataaagactgtgatgtttgacaagactggcaccattacccatggcgtccccagggtcatg 3120cgggtgctcctgctgggggatgtggccacactgcccctcaggaaggttctggctgtggtg 3180gggactgcggaggcc·agcagtgaacaccccttgggcgtggcagtcaccaaatactgtaaa 3240gaggaacttggaacagagaccttgggatactgcacggacttccaggcagtgccaggctgt 3300ggaattgggtgcaaagtcagcaacgtggaaggcatcctggcccacagtgagcgccctttg 3360agtgcaccggccagtcacctgaatgaggctggcagccttcccgcagaaaaagatgcagtc 3420ccccagaccttctctgtgctgattggaaaccgtgagtggctgaggcgcaacggtttaacc 3480atttctagcgatgtcagtgacgctatgacagaccacgagatgaaaggacagacagccatc 3540ctggtggctattgacggtgtgctctgtgggatgatcgcaatcgcagacgctgtcaagcag 3600gaggctgccctggctgtgcacacgctgcagagcatgggtgtggacgtggttctgatcacg 3660ggggacaaccggaagacagccagagctattgccacccaggttggcatcaacaaagtcttt 3720gcagaggtgctgccttcgcacaaggtggccaaggtccaggagctccagaataaagggaag 3780aaagtcgccatggtgggggatggggtcaatgactccccggccttggcccaggcagacatg 3840ggtgtggccattggcaccggcacggatgtggccatcgaggcagccgacgtcgtccttatc 3900agaaatgatttgctggatgtggtggctagcattcacctttccaagaggactgtccgaagg 3960atacgcatcaacctggtcctggcactgatttataacctggttgggatacccattgcagca 4020ggtgtcttcatgcccatcggcattgtgctgcagccctggatgggctcagcggccatggca 4080gcctcctctgtgtctgtggtgctctcatccctgcagctcaagtgctataagaagcctgac 4140ctggagaggtatgaggcacaggcgcatggccacatgaagcccctgacggcatcccaggtc 4200agtgtgcacataggcatggatgacaggtggcgggactcccccagggccacaccatgggac 4260caggtcagctatgtcagccaggtgtcgctgtcctccctgacgtccgacaagccatctcgg 4320cacagcgctgcagcagacgatgatggggacaagtggtctctgctcctgaatggcagggat 4380gaggagcagtacatctga 4398SEQ ID N0.13
atgcctgagcaggagagacagatcacagccagagaaggggccagtcggaaaatcttatct 60aagctttctttgcctacccgtgcctgggaaccagcaatgaagaagagttttgcttttgac 120aatgttggctatgaaggtggtctggatggcctgggcccttcttctcaggtggccaccagc 180acagtcaggatcttgggcatgacttgccagtcatgtgtgaagtccattgaggacaggatt 240tccaatttgaaaggcatcatcagcatgaaggtttccctggaacaaggcagtgccactgtg 300aaatatgtgccatcggttgtgtgcctgcaacaggtttgccatcaaattggggacatgggc 360ttcgaggccagcattgcagaaggaaaggcagcctcctggccctcaaggtccttgcctgcc 420caggaggctgtggtcaagctccgggtggagggcatgacctgccagtcctgtgtcagctcc 480attgaaggcaaggtccggaaactgcaaggagtagtgagagtcaaagtctcactcagcaac 540caagaggccgtcatcacttatcagccttatctcattcagcccgaagacctcagggaccat 600gtaaatgacatgggatttgaagctgccatcaagagcaaagtggctcccttaagcctggga 660ccaattgatattgagcggttacaaagcactaacccaaagagacctttatcttctgctaac 720cagaattttaataattctgagaccttggggcaccaaggaagccatgtggtcaccctccaa 780ctgagaatagatggaatgcattgtaagtcttgcgtcttgaatattgaagaaaatattggc 840cagctcctaggggttcaaagtattcaagtgtccttggagaacaaaactgcccaagtaaag 900tatgacccttcttgtaccagcccagtggctctgcagagggctatcgaggcacttccacct 960gggaattttaaagtttctcttcctgatggagccgaagggagtgggacagatcacaggtct 1020tccagttctcattcccctggctccccaccgagaaaccaggtccagggcacatgcagtacc 1080actctgattgccattgccggcatgacctgtgcatcctgtgtccattccattgaaggcatg 1140atctcccaactggaaggggt·gcagcaaatatcggtgtctttggccgaagggactgcaaca 1200gttctttataatccctctgtaattagcccagaagaactcagagctgctatagaagacatg 1260ggatttgaggcttcagtcgtttctgaaagctgttctactaaccctcttggaaaccacagt 1320gctgggaattccatggtgcaaactacagatggtacacctacatctgtgcaggaagtggct 1380ccccacactgggaggctccctgcaaaccatgccccggacatcttggcaaagtccccacaa 1440tcaaccagagcagtggcaccgcagaagtgcttcttacagatcaaaggcatgacctgtgca 1500tcctgtgtgtctaacatagaaaggaatctgcagaaagaagctggtgttctctccgtgttg 1560gttgccttgatggcaggaaaggcagagatcaagtatgacccagaggtcatccagcccctc 1620gagatagctcagttcatccaggacctgggttttgaggcagcagtcatggaggactacgca 1680ggctccgatggcaacattgagetgacaatcacagggatgacctgcgcgtcctgtgtccac 1740aacatagagtccaaactcacgaggacaaatggcatcacttatgcctccgttgcccttgcc 1800accagcaaagcccttgttaagtttgacccggaaattatcggtccacgggatattatcaaa 1860attattgagagcaaaacctcagaagccctggctaaactcatgtctctccaagccacagaa 1920gccaccgttgtgacccttggtgaggacaatttaatcatcagggaggagcaagtccccatg 1980gagetggtgcagcggggcgatatcgtcaaggtggtccctgggggaaagtttccagtggat 2040gggaaagtcctggaaggcaataccatggctgatgagtccctcatcacaggagaagccatg 2100ccagtcactaagaaacccggaagcactgtaattgcggggtctataaatgcacatggctct 2160gtgctcattaaagctacccacgtgggcaatgacaccactttggctcagattgtgaaactg 2220gtggaagaggctcagatgtcaaagaaccccaacaagcacatctcccagacagaggtgatc 2280atccggtttgctttccagacgtccatcacggtgctgtgcattgcctgcccctgctccctg 2340gggctggccacgcccacggctgtcatggtgggcaccggggtggccgcgcagaacggcatc 2400ctcatcaagggaggcaagcccctggagatggcgcacaagataaagactgtgatgtttgac 2460aagactggcaccattacccatggcgtccccagggtcatgcgggtgctcctgctgggggat 2520gtggccacactgcccctcaggaaggttctggctgtggtggggactgcggaggccagcagt 2580gaacaccccttgggcgtggcagtcaccaaatactgtaaagaggaacttggaacagagacc 2640ttgggatactgcacggacttccaggcagtgccaggctgtggaattgggtgcaaagtcagc 2700aacgtggaaggcatcctggcccacagtgagcgccctttgagtgcaccggccagtcacctg 2760aatgaggctggcagccttcccgcagaaaaagatgcagtcccccagaccttctctgtgctg 2820attggaaaccgtgagtggctgaggcgcaacggtttaaccatttctagcgatgtcagtgac 2880gctatgacagaccacgagatgaaaggacagacagccatcctggtggctattgacggtgtg 2940ctctgtgggatgatcgcaatcgcagacgctgtcaagcaggaggctgccctggctgtgcac 3000acgctgcagagcatgggtgtggacgtggttctgatcacgggggacaaccggaagacagcc 3060agagctattgccacccaggttggcatcaacaaagtctttgcagaggtgctgccttcgcac 3120aaggtggccaaggtccaggagctccagaataaagggaagaaagtcgccatggtgggggat 3180ggggtcaatgactccccggccttggcccaggcagacatgggtgtggccattggcaccggc 3240acggatgtggccatcgaggcagccgacgtcgtccttatcagaaatgatttgctggatgtg 3300gtggctagcattcacctttccaagaggactgtccgaaggatacgcatcaacctggtcctg 3360gcactgatttataacctggttgggatacccattgcagcaggtgtcttcatgcccatcggc 3420attgtgctgcagccctggatgggctcagcggccatggcagcctcctctgtgtctgtggtg 3480ctctcatccctgcagctcaagtgctataagaagcctgacctggagaggtatgaggcacag 3540gcgcatggccacatgaagcccc·tgacggcatcccaggtcagtgtgcacataggcatggat 3600gacaggtggcgggactcccccagggccacaccatgggaccaggtcagctatgtcagccag 3660gtgtcgctgtcctccctgacgtccgacaagccatctcggcacagcgctgcagcagacgat 3720gatggggacaagtggtctctgctcctgaatggcagggatgaggagcagtacatctga 3777SEQ ID N0.14
atgcctgagcaggagagacagatcacagccagagaaggggccagtcggaaaatcttatct 60aagctttctttgcctacccgtgcctgggaaccagcaatgaagaagagttttgcttttgac 120aatgttggctatgaaggtggtctggatggcctgggcccttcttctcaggtggccaccagc 180acagtcaggatcttgggcatgacttgccagtcatgtgtgaagtccattgaggacaggatt 240tccaatttgaaaggcatcatcagcatgaaggtttccctggaacaaggcagtgccactgtg 300aaatatgtgccatcggttgtgtgcctgcaacaggtttgccatcaaattggggacatgggc 360ttcgaggccagcattgcagaaggaaaggcagcctcctggccctcaaggtccttgcctgcc 420caggaggctgtggtcaagctccgggtggagggcatgacctgccagtcctgtgtcagctcc 480attgaaggcaaggtccggaaactgcaaggagtagtgagagtcaaagtctcactcagcaac 540caagaggccgtcatcacttatcagccttatctcattcagcccgaagacctcagggaccat 600gtaaatgacatgggatttgaagctgccatcaagagcaaagtggctcccttaagcctggga 660ccaattgatattgagcggttacaaagcactaacccaaagagacctttatcttctgctaac 720cagaattttaataattctgagaccttggggcaccaaggaagccatgtggtcaccctccaa 780ctgagaatagatggaatgcattgcatgatctcccaactggaaggggtgcagcaaatatcg 840gtgtctttggccgaagggactgcaacagttctttataatccctctgtaattagcccagaa 900gaactcagagctgctatagaagacatgggatttgaggcttcagtcgtttctgaaagctgt 960tctactaaccctcttggaaaccacagtgctgggaattccatggtgcaaactacagatggt 1020acacctacatctgtgcaggaagtggctccccacactgggaggctccctgcaaaccatgcc 1080ccggacatcttggcaaagtccccacaatcaaccagagcagtggcaccgcagaagtgcttc 1140ttacagatcaaaggcatgacctgtgcatcctgtgtgtctaacatagaaaggaatctgcag 1200aaagaagctggtgttctctccgtgttggttgccttgatggcaggaaaggcagagatcaag 1260tatgacccagaggtcatccagcccctcgagatagctcagttcatccaggacctgggtttt 1320gaggcagcagtcatggaggactacgcaggctccgatggcaacattgagetgacaatcaca 1380gggatgacctgcgcgtcctgtgtccacaacatagagtccaaactcacgaggacaaatggc 1440atcacttatgcctccgttgcccttgccaccagcaaagcccttgttaagtttgacccggaa 1500attatcggtccacgggatattatcaaaattattgaggaaattggctttcatgcttccctg 1560gcccagagaaaccccaacgctcatcacttggaccacaagatggaaataaagcagtggaag 1620aagtctttcctgtgcagcctggtgtttggcatccctgtcatggccttaatgatctatatg 1680ctgatacccagcaacgagccccaccagtccatggtcctggaccacaacatcattccagga 1740ctgtccattctaaatctcatcttctttatcttgtgtacctttgtccagctcctcggtggg 1800tggtacttctacgttcaggcctacaaatctctgagacacaggtcagccaacatggacgtg 1860ctcatcgtcctggccacaagcattgcttatgtttattctctggtcatcctggtggttgct 1920gtggctgagaaggcggagaggagccctgtgacattcttcgacacgccccccatgctcttt 1980gtgttcattgccctgggccggtggctggaacacttggcaaagagcaaaacctcagaagcc 2040ctggctaaactcatgtctctccaagccacagaagccaccgttgtgacccttggtgaggac 2100aatttaatcatcagggaggagcaagtc·cccatggagctggtgcagcggggcgatatcgtc 2160aaggtggtccctgggggaaagtttccagtggatgggaaagtcctggaaggcaataccatg 2220gctgatgagtccctcatcacaggagaagccatgccagtcactaagaaacccggaagcact 2280gtaattgcggggtctataaatgcacatggctctgtgctcattaaagctacccacgtgggc 2340aatgacaccactttggctcagattgtgaaactggtggaagaggctcagatgtcaaaggca 2400cccattcagcagctggctgaccggtttagtggatattttgtcccatttatcatcatcatg 2460tcaactttgacgttggtggtatggattgtaatcggttttatcgattttggtgttgttcag 2520agatactttcctaaccccaacaagcacatctcccagacagaggtgatcatccggtttgct 2580ttccagacgtccatcacggtgctgtgcattgcctgcccctgctccctggggctggccacg 2640cccacggctgtcatggtgggcaccggggtggccgcgcagaacggcatcctcatcaaggga 2700ggcaagcccctggagatggcgcacaagataaagactgtgatgtttgacaagactggcacc 2760attacccatggcgtccccagggtcatgcgggtgctcctgctgggggatgtggccacactg 2820cccctcaggaaggttctggctgtggtggggactgcggaggccagcagtgaacaccccttg 2880ggcgtggcagtcaccaaatactgtaaagaggaacttggaacagagaccttgggatactgc 2940acggacttccaggcagtgccaggctgtggaattgggtgcaaagtcagcaacgtggaaggc 3000atcctggcccacagtgagcgccctttgagtgcaccggccagtcacctgaatgaggctggc 3060agccttcccgcagaaaaagatgcagtcccccagaccttctctgtgctgattggaaaccgt 3120gagtggctgaggcgcaacggtttaaccatttctagcgatgtcagtgacgctatgacagac 3180cacgagatgaaaggacagacagccatcctggtggctattgacggtgtgctctgtgggatg 3240atcgcaatcgcagacgctgtcaagcaggaggctgccctggctgtgcacacgctgcagagc 3300atgggtgtggacgtggttctgatcacgggggacaaccggaagacagccagagctattgcc 3360acccaggttggcatcaacaaagtctttgcagaggtgctgccttcgcacaaggtggccaag 3420gtccaggagctccagaataaagggaagaaagtcgccatggtgggggatggggtcaatgac 3480tccccggccttggcccaggcagacatgggtgtggccattggcaccggcacggatgtggcc 3540atcgaggcagccgacgtcgtccttatcagaaatgatttgctggatgtggtggctagcatt 3600cacctttccaagaggactgtccgaaggatacgcatcaacctggtcctggcactgatttat 3660aacctggttgggatacccattgcagcaggtgtcttcatgcccatcggcattgtgctgcag 3720ccctggatgggctcagcggccatggcagcctcctctgtgtctgtggtgctctcatccctg 3780cagctcaagtgctataagaagcctgacctggagaggtatgaggcacaggcgcatggccac 3840atgaagcccctgacggcatcccaggtcagtgtgcacataggcatggatgacaggtggcgg 3900gactcccccagggccacaccatgggaccaggtcagctatgtcagccaggtgtcgctgtcc 3960tccctgacgtccgacaagccatctcggcacagcgctgcagcagacgatgatggggacaag 4020tggtctctgctcctgaatggcagggatgaggagcagtacatctga 4065
根據(jù)本發(fā)明的包括上述靶位基因Ctrl、ATP7A和ATPB的載體可以為Ctrl、ATP7A和ATPB的正義載體或RNAi干擾載體。根據(jù)本發(fā)明的上·述載體可以為所有利用Ctrl核苷酸序列構(gòu)建的干擾或抑制表達(dá)的載體；所有利用ATP7A和ATPB核苷酸序列構(gòu)建的過(guò)表達(dá)的載體。根據(jù)本發(fā)明的亨廷頓舞蹈癥的靶位蛋白質(zhì)用于治療亨廷頓舞蹈癥的藥物中。根據(jù)本發(fā)明的亨廷頓舞蹈癥的靶位基因Ctrl、ATP7A和ATPB用于制備治療亨廷頓舞蹈癥的藥物中。根據(jù)本發(fā)明的上述載體可以用于制備治療亨廷頓舞蹈癥的藥物中的應(yīng)用。 根據(jù)本發(fā)明的靶位基因，通過(guò)RNAi干擾用于提高HD病人的運(yùn)動(dòng)能力，減緩或抑制截短的htt蛋白在腦部的沉積以及引起的神經(jīng)退變，延長(zhǎng)壽命。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:
I) CtrlB和dmATP7是作用于腦部銅離子代謝的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。利用RT-PCR半定量的方法，證明在腦內(nèi)特異的RNAi CtrlB或者ATP7能夠引起CtrlB或者ATP7在腦內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平的降低；過(guò)表達(dá)ATP7能夠引起ATP7轉(zhuǎn)錄水平的升高。RT-PCR顯示Cu含量指示蛋白MtnA的含量隨著CtrlB RNAi或者dmATP7 OE減低，dmATP7 RNAi升高。利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)，本發(fā)明直接測(cè)定了果蠅腦部的鋅含量，表明在果蠅腦部沉默CtrlB RNAi或者過(guò)表達(dá)dmATP7 OE會(huì)降低銅離子的積聚(t-test，p〈0.05)。因此，特異性的操控CtrlB或者ATP7在果蠅腦部的表達(dá)水平可改變其腦部銅離子積累的狀態(tài)。2)通過(guò)調(diào)控CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平可改變致病因子htt exonl polyQpolyQ在腦部的沉積。應(yīng)用EGFP融合蛋白示綜的方法顯示出htt exonl polyQ在腦部的沉積情況。結(jié)果表明，沉默掉Ctrl或者過(guò)表達(dá)dmATP7會(huì)降低甚至消除htt exonl polyQpolyQ的沉積,相反的抑制dmATP7的表達(dá)會(huì)增加htt exonl polyQ polyQ的積累。3)調(diào)控CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平可以改善由htt exonl polyQ引起的神經(jīng)退變。Leslie M.Thompson等人指出HD果蠅眼睛內(nèi)的感桿(指構(gòu)成復(fù)眼中感桿束的視覺(jué)神經(jīng)纖維)會(huì)有退變的現(xiàn)象。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)RNAi降低CtrlB的表達(dá)的HD果蠅和通過(guò)過(guò)表達(dá)增加dmATP7的表達(dá)的HD果蠅眼睛中的感桿退變的表型得到大大改善，而通過(guò)RNAi降低dmATP7的表達(dá)的HD果蠅眼睛中的感桿退變的表型更加嚴(yán)重。4)調(diào)控CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平可以改善由htt exonl polyQ引起的存活率下降。Leslie M.Thompson等人指出在腦部特異的表達(dá)htt exonl polyQ的果蠅,存活率會(huì)大大降低，只有野生型的30-40%。試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn),在腦部特異的表達(dá)htt exonl polyQ的果蠅，存活率只有34.46%，沉默CtrlB或者過(guò)表達(dá)dmATP7的HD果蠅，存活率會(huì)大大增加，至78.13%和72.75% ;而抑制dmATP7的極影表達(dá)，則會(huì)降低HD果蠅的存活率到22.99%。5)調(diào)控CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平可以改善由htt exonl polyQ引起的運(yùn)動(dòng)失調(diào)。試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)htt exonl polyQ果蜆隨著年齡的增長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙。而通過(guò)RNAi降低CtrlB的表達(dá)的HD果蠅運(yùn)動(dòng)障礙得到提高，而通過(guò)RNAi降低dmATP7的表達(dá)的HD果蠅運(yùn)動(dòng)障礙大大下降。6)調(diào)控CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平可以延長(zhǎng)由htt exonl polyQ引起的壽命縮短。野生型果蠅在25°C生長(zhǎng),壽命60天,試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)htt exonl polyQ果蠅壽命只能活16天。而通過(guò)RNAi降低CtrlB的表達(dá)的HD果蜆的中間壽命(the medium lifespan)和最終壽命(the maximum lifespan)能夠得到133.3%和75%的提高；通過(guò)過(guò)表達(dá)提高dmATP7表達(dá)的HD果蠅的中間壽命和最終壽命壽命能延長(zhǎng)42.2%和25% ;而通過(guò)RNAi降低dmATP7的表達(dá)的HD果蠅中間壽命和最終壽命壽命卻降低了 42.2%和25%。綜上所述，在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)中特異的RNAi干擾掉CtrlB和過(guò)表達(dá)dmATP7降低了果蠅腦部的銅的積累，特異的·RNAi干擾掉dmATP7提高了果蠅腦部的銅的積累。更為重要的是，特異抑制人的HD的果蠅模型神經(jīng)系統(tǒng)的CtrlB的表達(dá)或者提高dmATP7的表達(dá)會(huì)顯著減少HD果蠅腦內(nèi)的致病性htt蛋白的積累、減緩神經(jīng)病變，顯著提高HD果蠅的成活率、運(yùn)動(dòng)能力以及壽命。這些發(fā)現(xiàn)表明CtrlB蛋白是調(diào)節(jié)鋅代謝的關(guān)鍵靶位，根據(jù)本發(fā)明的靶位基因，通過(guò)Ctrl RNAi干擾或者ATP7過(guò)表達(dá)可以用于緩解HD病人的一些病癥，比如減緩或阻止截短的htt蛋白在腦部的沉積及其引起的神經(jīng)退變，改善HD病人的運(yùn)動(dòng)障礙以及延長(zhǎng)壽命。該發(fā)明有望為治療亨廷頓舞蹈癥提供新的治療策略和關(guān)鍵靶位。


圖1:半定量RT-PCR方法檢測(cè)CtrlB和dmATP7在野生型(泳道I)、Elav>CtrlBRNAi (泳道 2)、Elav>dmATP7 OE (泳道 3)和 Elav>dmATP7 RNAi (泳道 4)果蠅腦中豐度；以及MtnA和MtnB的豐度。與對(duì)照(泳道I)相比，Elav >CtrlB RNAi (泳道2)果蠅腦中CtrlBmRNA含量明顯降低，Elav >dmATP7 OE (泳道3)果蠅腦中dmATP7 mRNA含量明顯升高，Elav>dmATP7 RNAi (泳道4)果蠅腦中dmATP7 mRNA含量明顯下降。圖2:圖1中的MtnA (圖2A)與MtnB (圖2B)豐度變化統(tǒng)計(jì)。與對(duì)照(泳道I)相比，Elav >CtrlB RNAi (泳道 2)以及 Elav >dmATP7 OE (泳道 3)果蠅腦中 MtnA mRNA 含量明顯降低，Elav >dmATP7 RNAi (泳道4)果蠅腦中MtnA mRNA含量明顯下降。圖3:利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測(cè)定果蠅腦部的銅含量。與對(duì)照(泳道I)相比，Elav >CtrlB RNAi (泳道2)以及Elav >dmATP7 OE(泳道3)果蠅腦中銅含量明顯降低，Elav >dmATP7 RNAi (泳道4)果蠅腦中銅含量明顯下降。數(shù)據(jù)顯示三次重復(fù)的平均值+SEM, t test, *Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01。圖4:CtrlB和dmATP7表達(dá)水平影響htt exonl polyQ在腦內(nèi)的纖維沉積。利用htt-exonl-EGFP融合蛋白示綜顯示，在果蜆14天的時(shí)候，Elav>htt-exonlQ103_EGFP中出現(xiàn)大量的蛋白聚集體。抑制CtrlB的表達(dá)或者加強(qiáng)dmATP7的表達(dá)會(huì)降低htt蛋白的沉積，而抑制dmATP7的表達(dá)則會(huì)加強(qiáng)htt蛋白的沉積。圖5抑制CtrlB的表達(dá)或者加強(qiáng)dmATP7的表達(dá)抑制了 htt_exonl-Q93引起的眼睛內(nèi)視神經(jīng)感桿的退變，而制dmATP7的表達(dá)則會(huì)加重神經(jīng)退變。圖 6 與對(duì)照(Elav >P463)相比 CtrlB RNAi (Elav >P463/CtrlB RNAi)和 dmATP7OE (Elav >P463/dmATP7 0E)顯著提高了 HD 果蠅的存活率，而 dmATP7 RNAi (Elav >P463/dmATP7 RNAi )卻降低了 HD 的存活率。T test, *ρ〈0.05，**ρ〈0.01，_ρ〈0.001，η>5
圖 7 與對(duì)照(Elav>P463)相比，CtrlB RNAi Elav>P463/CtrlB RNAi)顯著改善了 HD 果蠅的運(yùn)動(dòng)障礙，而dmATP7 RNAi(Elav>P463/dmATP7 RNAi )卻加重了 HD的運(yùn)動(dòng)障礙。dmATP7OE沒(méi)有像預(yù)期的那樣改善HD的運(yùn)動(dòng)障礙時(shí)因?yàn)閐mATP7 OE本身運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)異常。T test，*ρ〈0.05, **ρ〈0.01, ***ρ〈0.001, η>5
圖 8 與對(duì)照(Elav>P463)·相比，CtrlB RNAi (Elav>P463/CtrlB RNAi)和 dmATP7 OE(Elav>P463/dmATP7 0E)顯著延長(zhǎng)了 HD 果蠅的壽命，而 dmATP7 RNAi (Elav>P463/dmATP7RNAi)卻縮短了 HD 的壽命。T test, *ρ〈0.05，**ρ〈0.01，_ρ〈0.001，η>10
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1:果蠅CtrlB和dmATP7基因在腦內(nèi)影響銅的平衡
一、CtrlB RNA1、dmATP7 OE以及dmATP7 RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅獲得及轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中用到的ttrlB RNAi轉(zhuǎn)基因果妮購(gòu)自fly stocks of National Institute ofGenetics (NIG), dmATP7 OE 轉(zhuǎn)基因果妮購(gòu)自 Bloomington Drosophila Stock Center,dmATP7 RNAi 轉(zhuǎn)基因果妮來(lái)自 Vienna Drosophila RNAi Center。為檢測(cè)不同基因型果蠅在腦部的靶基因轉(zhuǎn)服豐度，轉(zhuǎn)基因果蠅品系分別與Elav-Gal4轉(zhuǎn)基因果蠅品系雜交，選擇羽化后十天的后代Elav>CtrlB RNAi, Elav>dmATP70E,，Elav>dmATP7 RNAi和Elav〉+/+轉(zhuǎn)基因果蠅，每一基因型解剖20個(gè)果蠅腦，3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行總 RNA 提取和半定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR (Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction, RT-PCR)檢測(cè)，rp49作為內(nèi)參控制基因，保證PCR模板量一致。結(jié)果顯示(圖1):在神經(jīng)系統(tǒng)特異 CtrlB RNAi(Elav)CtrlB RNAi)和 dmATP7 RNAi (Elav>dmATP7 RNAi)降低了 CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平，特異性表達(dá)dmATP7 (Elav>dmATP7 0E)顯著提高了 dmATP7表達(dá)水平。二、在腦中 CtrlB RNA1、dmATP7 OE 以及 dmATP7 RNAi 對(duì)腦部 MtnA 和 MtnB 水平的影響
分別收集羽化后十天的CtrlB RNAi (Elav)CtrlB RNAi)、特異性表達(dá)dmATP7 (Elav>dmATP7 0E)和 dmATP7 RNAi (Elav>dmATP7 RNAi)及對(duì)照組果蠅(Elav〉+/+)。切取果蠅頭部，每一基因型解剖20個(gè)果蠅腦，3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行總RNA提取和半定量RT-PCR檢測(cè)，rp49作為內(nèi)參控制基因，保證PCR模板量一致。結(jié)果顯示(圖2):在神經(jīng)系統(tǒng)特異CtrlB RNAiCElav >CtrlB RNAi)和特異性表達(dá)dmATP7 (Elav>dmATP7 0E)顯著降低了 MtnA和MtnB的轉(zhuǎn)錄水平；dmATP7 RNAi (Elav>dmATP7 RNAi)顯著提高了 MtnA和MtnB的轉(zhuǎn)錄水平。三、在腦中CtrlB RNA1、dmATP7 OE以及dmATP7 RNAi對(duì)腦部銅水平的影響分別收集羽化后十天的CtrlB RNAi (Elav)CtrlB RNAi)、特異性表達(dá)dmATP7 (Elav>dmATP7 OE)和 dmATP7 RNAi (Elav>dmATP7 RNAi)及對(duì)照組果蠅(Elav〉+/+)。切取果蠅頭部，用濃硝酸進(jìn)行消解處理后，用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測(cè)定果蠅腦部銅含量，實(shí)驗(yàn)社三次重復(fù)。結(jié)果顯示(圖3)，在腦部特異CtrlB RNAiCElav >CtrlB RNAi)(nosignifacant)和特異性表達(dá)dmATP7 (Elav>dmATP7 0E) (t-test, ρ〈0.01)顯著降低了腦部銅積累。實(shí)施例2:在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)特異調(diào)節(jié)CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平可顯著影響腦部htt蛋白沉積
本實(shí)驗(yàn)借助于一個(gè)表達(dá)了 htt exonl polyQQ103_EGFP的HD果蠅模型，利用綠色熒光蛋白來(lái)標(biāo)記htt exonl polyQ的積聚情況。具體操作如下:解剖果蠅大腦,在4%多聚甲醒中固定20min，然后用·PBS洗三次，在甘油中透明30min，在甘油中封片。片子用Zeiss SM510共聚焦激光顯微鏡觀察，用LSM510分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示(圖4)，沉默掉Ctrl或者過(guò)表達(dá)dmATP7會(huì)降低甚至消除htt exonl polyQ的沉積,相反的抑制dmATP7的表達(dá)會(huì)增加htt exonl polyQ的積累。實(shí)施例3在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)特異調(diào)節(jié)CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平可顯著影響HD果蠅眼睛色素丟失和眼睛內(nèi)視神經(jīng)感桿的退變
通過(guò)對(duì)不同基因型果蠅眼睛進(jìn)行樹(shù)脂半薄切片和染色，研究了 CtrlB RNA1、特異性表達(dá)dmATP7和dmATP7 RNAi對(duì)HD果蠅果蠅眼睛色素丟失和眼睛內(nèi)視神經(jīng)感桿的退變的影響。HD果蠅果蠅眼睛色素丟失和眼睛內(nèi)視神經(jīng)感桿的退變是由于眼睛內(nèi)部神經(jīng)死亡造成的，因?yàn)楣壯劬ι貋G失和眼睛內(nèi)視神經(jīng)感桿的退變可以作為果蠅神經(jīng)退變嚴(yán)重程度的標(biāo)志。具體操作如下:
一、體式鏡下觀察果蠅眼睛色素丟失狀況
收集一天內(nèi)羽化的各種基因型果蠅，GMR>P463, GMR>P463/CtrlB RNAi, GMR>P463/dmATP7 0E, GMR>P463/dmATP7 RNAi, 25°C飼養(yǎng)I周；收集起來(lái)各種基因型果蠅，_80°C過(guò)夜，凍死果蠅；顯微鏡下觀察照相，采集圖片。二、果蠅眼睛樹(shù)脂切片
1.戊二醛固定:加入2.5%，pH=7.2戊二醛進(jìn)行前固定，室溫:2-3h。或者置于4 °〇冰箱中保存。2.PBS IOmin/次，3 次。3.鋨酸后固定:1%鋨酸，室溫避光固定2h。4.PBS 15min/次，3 次。5.水:用濃度為50%、70%、80%、90%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次15 min( 100%三次)，其它濃度各I次。注:更換溶液時(shí)，要保證果蠅眼睛不干燥。6.丙酮:100% 乙醇:丙酮=1: 1，15min/次；丙酮，15min/次。7.透:丙酮:樹(shù)脂=1:1，室溫lh。(注:避免環(huán)氧丙烷揮發(fā)，蓋好EP管的蓋子，密封條封住。)
丙酮:樹(shù)脂=1:2，室溫浸透8h。丙酮:樹(shù)脂=1:3，室溫浸透8h。純樹(shù)脂，室溫浸透8h。
8.樹(shù)脂放入模具，室溫聚合2_4h后，待樹(shù)脂變得濃稠后，將果蠅眼睛放入，定位。定位時(shí)將眼睛放在最下面。9.60度過(guò)夜聚合。10.500nm 半薄切片
11.甲苯胺藍(lán)染色，
12.觀察,照相,采集圖片
實(shí)施例4在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)特異調(diào)節(jié)CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平對(duì)HD果蠅存活率的影
響
對(duì)于羽化率、·運(yùn)動(dòng)和壽命測(cè)定，提前把Elav-Gal4和銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)基因果蠅組合在一起，做成了 Elav_Gal4 ;+/+，Elav_Gal4 ;CtrlB /CtrlB, Elav-Gal4; dmATP7 OE/ dmATP70E, Elav-Gal4;dmATP7 RNAi/ dmATP7 RNAi果蠅，挑HD處女蠅，與上述轉(zhuǎn)基因果蠅在25°C正常食物中雜交，三天后轉(zhuǎn)走親本。后代羽化后，統(tǒng)計(jì)雌蠅和雄蠅的的數(shù)目，作為相對(duì)羽化率，即存活率。實(shí)施例5果蠅神經(jīng)系統(tǒng)特異調(diào)節(jié)CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平可顯著影響HD果蠅運(yùn)動(dòng)能力
挑 HD 處女蠅，與 Elav-Gal4 ；+/+, Elav_Gal4 ；CtrlB /CtrlB, Elav_Gal4; dmATP7 OE/dmATP7 0E, Elav-Gal4; dmATP7 RNAi/ dmATP7 RNAi 轉(zhuǎn)基因果蠅在 25°C 正常食物中雜交，三天后轉(zhuǎn)走親本。后代羽化后，收集三天內(nèi)羽化的雌蠅，置于25°C正常食物中培養(yǎng)。每2-3天換一次食物，防止果蠅粘死。第九天的時(shí)候?qū)Υ婊畹墓夁M(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試。用二氧化碳麻醉果蠅后，每管分20只，蘇醒半個(gè)小時(shí)以上。檢測(cè)參照Iijima et al (2004)的方法，每基因型20只果蠅置于五十五的透明玻璃培養(yǎng)管中，輕拍管是果蠅至管底，計(jì)數(shù)6S內(nèi)爬到7cm的果蠅數(shù)目。每次有五組重復(fù)，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。結(jié)果顯示(圖6)，與正常果蠅Elav相t:匕，HD果蜆出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)障礙,CtrlB RNAi能明顯的改善這種運(yùn)動(dòng)障礙,而dmATP7 RNAi卻加重了這種運(yùn)動(dòng)障礙。然而意外的是dmATP7 OE并沒(méi)有像預(yù)期的那樣蓋上HD運(yùn)動(dòng)障礙，反而使其更嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)探究表明，Elav>dmATP7 OE本身就有很強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)障礙表型，所以，不能改善HD的運(yùn)動(dòng)障礙就不足為奇了。實(shí)施例6蠅神經(jīng)系統(tǒng)特異調(diào)節(jié)CtrlB和dmATP7的表達(dá)水平可顯著影響HD果蠅壽命
挑 HD 處女蠅，與 Elav-Gal4 ；+/+, Elav_Gal4 ；CtrlB /CtrlB, Elav_Gal4; dmATP7 OE/dmATP7 0E, Elav-Gal4; dmATP7 RNAi/ dmATP7 RNAi 轉(zhuǎn)基因果蠅在 25°C 正常食物中雜交，三天后轉(zhuǎn)走親本。后代羽化后，收集三天內(nèi)羽化的雌蠅，置于25°C正常食物中培養(yǎng)。每管20只，每2天換一次食物，統(tǒng)計(jì)死亡果蠅數(shù)目。每次有五組重復(fù)，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果顯示(圖7)，與正常果蠅Elav相比，HD果蠅出現(xiàn)明顯的壽命縮短，野生型果蠅在25°C生長(zhǎng)，壽命60天,試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)htt exonl polyQ果蜆壽命只能活16天。而通過(guò)RNAi降低CtrlB的表達(dá)的HD果蠅的中間壽命和最終壽命壽命能夠得到133.3%和75%的提高；通過(guò)過(guò)表達(dá)提高dmATP7表達(dá)的HD果蠅的中間壽命和最終壽命壽命能延長(zhǎng)42.2%和25% ;而通過(guò)RNAi降低dmATP7的表達(dá)的HD果蠅中間壽命和最終壽命壽命卻降低了 42.2%和25%。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可在本發(fā)明精神內(nèi)做其它變化，當(dāng)然，這些依據(jù)本發(fā)明精神所做的變化，都應(yīng)包含在本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種亨廷頓舞蹈癥的靶位蛋白質(zhì)，其特征在于，該亨廷頓舞蹈癥的靶位蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID N0.5所示，或者為SEQ ID N0.6所示，或者為SEQ ID N0.7、SEQ IDN0.8、SEQ ID No9 所示。
2.—種權(quán)利要求1所述亨廷頓舞蹈癥的靶位蛋白質(zhì)在制備用于治療亨廷頓舞蹈癥的藥物中的應(yīng)用。
3.一種亨廷頓舞蹈癥的靶位基因，該亨廷頓舞蹈癥的靶位基因?yàn)镃trl、ATP7A或ATP7B，其特征在于，所述基因Ctrl包括如SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列，所述基因ATP7A包括如SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列，所述基因ATP7B包括如SEQ ID N0.12,SEQID N0.13、SEQ ID N0.14所示的核苷酸序列。
4.一種權(quán)利要求3所述亨廷頓舞蹈癥的靶位基因在制備用于治療亨廷頓舞蹈癥的藥物中的應(yīng)用。
5.一種亨廷頓舞蹈癥的靶位基因的載體，其特征在于，所述載體為包含所述靶位基因Ctrl和ATP7A，ATP7B的正義載體或RNAi干擾載體。
6.一種權(quán)利要求6所述的載體在制備用于治療亨廷頓舞蹈癥的藥物中的應(yīng)用。
7.一種治療亨廷頓舞蹈癥的方法，其特征在于，調(diào)控腦內(nèi)銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平以降低腦內(nèi)銅含量。
8.如權(quán)利要求7所述的治療亨廷頓舞蹈癥的方法，其特征在于，所述銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0.5所示，或者為SEQ ID N0.6所示，或者為SEQ ID N0.7、SEQ IDN0.8、SEQ ID No9 所示。
9.如權(quán)利要求8所述的治療亨廷頓舞蹈癥的方法，其特征在于，編碼所述銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因?yàn)镃trl、ATP7A或ATP7B，其特征在于，所述基因Ctrl包括如SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列，所述基因ATP7A包括如SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列，所述基因ATP7B包括如SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.14所示的核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求9所述的治療亨 廷頓舞蹈癥的方法，其特征在于，通過(guò)基因過(guò)表達(dá)Ctrl、或者基因沉默ATP7A或ATP7B，來(lái)降低腦內(nèi)銅含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種亨廷頓舞蹈癥(HuntingdonDisease，HD)的靶位蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)提供亨廷頓舞蹈癥的靶位基因Ctr1、ATP7A及ATP7B，并通過(guò)基因沉默干擾Ctr1或者過(guò)表達(dá)ATP7A及ATP7B顯著緩解或者延緩HD病人的發(fā)病狀況。根據(jù)本發(fā)明，人的HD的靶蛋白包括如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示的氨基酸序列，所述基因包括如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的靶位基因，通過(guò)基因沉默或基因過(guò)表達(dá)可用于改善HD病人的運(yùn)動(dòng)能力和延長(zhǎng)壽命，減緩或阻止截?cái)嗟暮嗤㈩D蛋白(huntingtin，htt)在腦內(nèi)的沉積及其引起的神經(jīng)退變。該發(fā)明有望為治療HD提供新的治療策略和關(guān)鍵靶位。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103224556SQ20131003721
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月31日
發(fā)明者周兵, 肖桂然, 范強(qiáng)旺 申請(qǐng)人:清華大學(xué)