識別流行性感冒血凝素的受體-結(jié)合袋狀結(jié)構(gòu)的廣泛中和人類抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的特征為與流行性感冒凝血素特異性地結(jié)合，并且減少或抑制凝血素與唾液酸結(jié)合的新穎流行性感冒抗體。本發(fā)明亦提供特征為新穎抗體和其用于預(yù)防或治療流行性感冒感染的方法、組合物以及試劑盒。
【專利說明】識別流行性感冒血凝素的受體-結(jié)合袋狀結(jié)構(gòu)的廣泛中和 人類抗體
[0001] 相關(guān)申請案的對照參考
[0002] 本申請案主張于2011年8月3日提出申請的美國臨時專利申請案第61/514,662 號的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容以參考方式全部并入本文。
[0003] 美國聯(lián)邦贊助的研究下進行的發(fā)明的權(quán)利聲明
[0004] 此研究成果是由來自美國國家衛(wèi)生院的補助款第U19AI067854號和第 P01GM62580號支持。美國政府對于本發(fā)明有特定權(quán)利。

【背景技術(shù)】
[0005] 流行性感冒病毒抗原性的周知季節(jié)性漂移說明了在先前感染的個體中缺乏長期 免疫保護。血凝素（HA)是一種結(jié)合病毒受體、促進融合以及從低pH核內(nèi)體穿透的三聚體 表面碳水化合物蛋白，而且為流行性感冒病毒粒子的主表面抗原。HA呈現(xiàn)保守以及可變表 位,但針對后者的中和抗體主宰對免疫接種和感染的反應(yīng)。
[0006] 從而，對于發(fā)展可有效地治療或預(yù)防流行性感冒的漂移株的廣泛中和治療劑有需 求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 如下述，本發(fā)明是基于廣泛中和流行性感冒抗原變異體的新穎抗體的發(fā)現(xiàn)。本發(fā) 明的特征為含有新穎抗體的組合物和試劑盒、以及使用此等新穎治療分子治療或預(yù)防流行 性感冒病毒感染的方法。
[0008] 于方面中，本發(fā)明提供與流行性感冒血凝素（HA)的表位特異性地結(jié)合的單離的 抗流行性感冒抗體或抗體片段。抗體或抗體片段與流行性感冒HA表位的結(jié)合減少或抑制 流行性感冒HA與唾液酸的結(jié)合。
[0009] 于具體實施例中，流行性感冒HA的表位包括唾液酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。于具體實施例 中，HA為H1HA、H2HA、H3HA或H5HA (來自適應(yīng)人類的H5病毒株的HA)。
[0010] 于相關(guān)具體實施例中，流行性感冒HA表位包括對應(yīng)于來自A/Solomon Islands/3/2006 的 CDR HI 殘基 158 ;CDR H2 殘基 158 至 160 ;CDR H3 殘基 135 至 136、190 至195以及226 ;⑶R L1殘基222、225以及227 ;以及⑶R L3殘基187和189的氨基酸
[0011] 于相關(guān)具體實施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID N0 :17至44中任一者所表 示的氨基酸。
[0012] 于相關(guān)具體實施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID N0 :17至44中任一者中的 CH65至CH67結(jié)合殘基（例如，圖15中辨識的CH65至CH67結(jié)合殘基）。
[0013] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括可變重（VH)鏈，而且其中V H 鏈包括SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11或SEQIDN0 :12中所表示的氨基酸序 列。
[0014] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括一個或多個存在于SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12的可變重（VH)鏈氨基酸序列中的重 鏈⑶R區(qū)。于相關(guān)具體實施例中，一個或多個重鏈⑶R區(qū)包括存在于SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12的可變重（VH)鏈氨基酸序列中的CDR3區(qū)。
[0015] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括可變輕（')鏈，而且其中' 鏈包括 SEQ ID N0 :13、SEQ ID N0 :14、SEQ ID N0 :15 或 SEQ ID N0 :16 所表示的氨基酸序 列。
[0016] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括一個或多個存在于SEQID N0 :13、SEQ ID N0 :14、SEQ ID N0 :15 或 SEQ ID N0 :16 的可變輕（VJ 鏈氨基酸序列中的 輕鏈⑶R區(qū)。于相關(guān)具體實施例中，一個或多個輕鏈⑶R區(qū)包括存在于SEQ ID N0:13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15或SEQ ID NO :16的可變重（VJ鏈氨基酸序列中的CDR3區(qū)。
[0017] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括i)可變重（VH)鏈氨基，其包 括SEQ ID N0 :10所表示的氨基酸序列，以及ii)可變輕（VJ鏈，其包括SEQ IDN0 :14所表 示的氨基酸序列。
[0018] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括可變重（VH)鏈，其中V H鏈的 CDR3 區(qū)包括 Argl04、Serl05、Vall06、Aspl07、Tyrl09、Tyrll0、Tyrll2 或其組合。
[0019] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體為單克隆抗體或其抗體片段。
[0020] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體為人源化抗體。
[0021] 于具體實施例中，抗體片段為Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb 片段、F(ab'）2片段、單鏈片段、雙鏈抗體或線性抗體。
[0022] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段進一步包括與抗流行性感冒抗體 或其抗體片段偶聯(lián)的劑。于相關(guān)具體實施例中，與抗體或其抗體片段偶聯(lián)的劑是治療劑或 可檢測的標(biāo)記。
[0023] 治療劑可為任何適合與新穎抗體共享的治療劑。此劑為本領(lǐng)域中周知，而且包含 小分子、納米粒子、多肽、放射性同位素、抑制性核酸等。于具體實施例中，治療劑為抗病毒 劑或毒素。于具體實施例中，治療劑為減少流行性感冒病毒生產(chǎn)的siRNA、shRNA或反義核 酸分子。
[0024] 可檢測的標(biāo)記可為適合與新穎抗體共享的任何可檢測的標(biāo)記。此標(biāo)記為本領(lǐng)域中 周知，而且包含可由光譜、光化學(xué)、生化、免疫化學(xué)、物理或化學(xué)手段檢測的標(biāo)記。于具體實 施例中，可檢測的標(biāo)記為已制成可檢測的酶、熒光分子、顆粒標(biāo)記、電子致密試劑、放射性標(biāo) 記、微泡、生物素、地高辛或半抗原或蛋白質(zhì)。
[0025] 于方面中，本發(fā)明提供含有本文所述的至少一種抗流行性感冒抗體或抗體片段的 醫(yī)藥組合物。于具體實施例中，醫(yī)藥組合物含有醫(yī)藥可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0026] 于方面中，本發(fā)明提供編碼本文所述抗流行性感冒抗體或抗體片段的單離的多核 苷酸。于相關(guān)方面中，本發(fā)明提供包括此單離的多核苷酸的表達(dá)載體。于進一步相關(guān)方面 中，本發(fā)明提供包括此表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0027] 于方面中，本發(fā)明提供治療或預(yù)防有需要的受試者的流行性感冒病毒感染的方 法。所述方法涉及對受試者給藥有效量的本文所述抗流行性感冒抗體或抗體片段或含有所 述抗體或抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法治療或預(yù)防受試者的流行性感冒病毒感染，包 含減少或緩和與感染相關(guān)的癥狀。
[0028] 于方面中，本發(fā)明提供中和有需要的受試者中的流行性感冒病毒的方法。所述方 法涉及對受試者給藥有效量的本文所述抗流行性感冒抗體或抗體片段或含有所述抗體或 抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法中和受試者中的流行性感冒病毒，從而治療或預(yù)防受試 者的流行性感冒病毒感染，包含減少或緩和與感染相關(guān)的癥狀。
[0029] 于方面中，本發(fā)明提供在有需要的受試者中建立流行性感冒病毒感染的方法。所 述方法涉及對受試者給藥有效量的本文所述抗流行性感冒抗體或抗體片段或含有所述抗 體或抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法抑制在受試者中建立流行性感冒病毒感染，從而預(yù) 防與感染相關(guān)的癥狀。
[0030] 于方面中，本發(fā)明提供抑制有需要的受試者的流行性感冒病毒感染的散播的方 法。所述方法涉及對受試者給藥有效量的本文所述抗流行性感冒抗體或抗體片段或含有所 述抗體或抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法抑制受試者中的流行性感冒病毒感染的散播， 從而減少或緩和與感染相關(guān)的癥狀。
[0031] 于方面中，本發(fā)明提供抑制流行性感冒病毒進入受試者中的細(xì)胞的方法。所述方 法涉及對受試者給藥有效量的本文所述抗流行性感冒抗體或抗體片段或含有所述抗體或 抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法抑制流行性感冒病毒進入受試者中的細(xì)胞，從而預(yù)防與 感染相關(guān)的癥狀或減少或緩和與感染相關(guān)的癥狀。
[0032] 于方面中，本發(fā)明提供抑制流行性感冒病毒進入細(xì)胞的方法。所述方法涉及使具 有流行性感冒病毒感染或有發(fā)展流行性感冒病毒感染的風(fēng)險的細(xì)胞接觸抗本文所述流行 性感冒抗體或抗體片段或含有所述抗體或抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法抑制流行性感 冒病毒進入細(xì)胞。
[0033] 于以上任何方面中，受試者具有流行性感冒感染或有發(fā)展流行性感冒感染的風(fēng) 險。于相關(guān)具體實施例中，受試者為哺乳動物（例如，人類）。于相關(guān)具體實施例中，受試者 易受病毒感染（例如，懷孕女性、年輕受試者或嬰兒受試者、老年受試者）。
[0034] 于以上方面和具體實施例中任一者中，抗流行性感冒抗體或抗體片段或醫(yī)藥組合 物是通過肌內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射或吸入而給藥。
[0035] 于方面中，本發(fā)明提供治療或預(yù)防流行性感冒病毒感染的試劑盒；中和流行性感 冒病毒的試劑盒；抑制流行性感冒病毒感染的建立的試劑盒；抑制流行性感冒病毒感染的 散播的試劑盒；以及抑制流行性感冒病毒進入細(xì)胞的試劑盒。
[0036] 于具體實施例中，試劑盒含有本文所述抗流行性感冒抗體或抗體片段。
[0037] 于具體實施例中，試劑盒也含有治療劑。于相關(guān)具體實施例中，治療劑抑制流行性 感冒感染。
[0038] 于具體實施例中，試劑盒也含有在本文所述任何方法中使用試劑盒的指示。
[0039] 于以上任何具體實施例中，流行性感冒可為H1N1、H2N2、H3N2或人類適應(yīng)H5流 行性感冒病毒株（即，已獲得人類受體特異性的H5流行性感冒；參閱圖14D的例示性病毒 株）。
[0040] 本發(fā)明的另外目的和優(yōu)點將部分在以下描述中闡明，部分將自該描述顯而易見， 或可從本發(fā)明的實施得知。本發(fā)明的目的和優(yōu)點將通過本文揭露的組件和組合的方式實踐 和實現(xiàn)，包含在附加的權(quán)利要求中指出的。應(yīng)了解前述一般敘述和以下實施方式皆僅為例 示性和說明性，而且并非限制請求保護的發(fā)明。附圖是并入本文和構(gòu)成本說明書的一部分 且說明本發(fā)明的許多具體實施例，以及所述附圖與描述內(nèi)容共同解釋本發(fā)明的原則。
[0041] 定義
[0042] -些術(shù)語和短語定義如下，以促進本發(fā)明的了解。
[0043] 如本文所使用，單數(shù)〃一（a)〃、〃一（an) 〃以及〃所述（the)"包含復(fù)數(shù)形式，除非 語境清楚指出。因此，例如，關(guān)于"一種流行性感冒抗體"包含關(guān)于超過一種流行性感冒抗 體。
[0044] 如本文所使用，術(shù)語〃或〃應(yīng)了解為包含前后兩者，除非具體注明或從語境顯而易 見。
[0045] 如本文所使用，術(shù)語〃包括（comprises) 〃、〃包括（comprising) 〃、〃含有 (conaining)"、〃具有（having)"等可具有所述術(shù)語歸于美國專利法所規(guī)定的含義，而 且可表示〃包含（includes) 〃〃包含（including) 〃等；〃基本上由…組成（consisting essentially of) 〃或〃基本上由…組成（consists essentially) 〃同樣地具有歸于美國專 利法所規(guī)定的含義，而且所述術(shù)語是開放式的，允許存在超過所述者，只要敘述的基本或新 穎特征未因超過敘述者而改變，但排除先前技術(shù)的具體實施例。
[0046] 術(shù)語"抗體"表示通過所具可變區(qū)內(nèi)的至少一種抗原辨識位點辨識目標(biāo)且與其特 異性地結(jié)合的免疫球蛋白分子，所述目標(biāo)為蛋白質(zhì)、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì) 或前述者的組合。如本文所使用，術(shù)語"抗體"涵蓋完好的多克隆抗體、完好的單克隆抗體、 抗體片段（諸如，F(xiàn)ab、Fab'、F(ab'）2以及Fv片段）、單鏈Fv( SCFv)突變體、多特異性抗體 諸如從至少兩種完好抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、包括抗體的抗原決定部分的 融合蛋白質(zhì)、以及包括抗原辨識位點的任何其它改性的免疫球蛋白分子產(chǎn)生的雙特異性抗 體，只要抗體展現(xiàn)期望的生物活性?？贵w可為五種主要類別的免疫球蛋白分子：IgA、IgD、 IgE、IgG 以及 IgM，或其子類（同種型）（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 以及 IgA2)中 的任何一種，其是基于分別稱為α、Λ、ε、Y以及μ的免疫球蛋白分子的重鏈恒定結(jié)構(gòu) 域的識別性。不同類別的免疫球蛋白分子具有不同且周知的亞單元結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)形?？贵w 可為無改性或與其它分子諸如毒素、放射性同位素等偶聯(lián)。
[0047] 基本的四鏈抗體單元為由兩個相同輕（L)鏈和兩個相同重（Η)鏈所組成的異源四 聚體糖蛋白。IgM抗體是由5個基本的異源四聚體單元與稱為J鏈的另外多肽所組成，而 且因此含有抗原結(jié)合位點，同時分泌的IgA抗體可聚合以形成包括2至5個基本的4鏈單 元與J鏈的多價集合。IgG的情況下，4鏈單元通常約150, 000道爾頓。取決于Η鏈的同種 型，各L鏈以一個共價雙硫鍵鏈接Η鏈，同時兩個Η鏈一個或多個雙硫鍵彼此鏈接。各Η和 L鏈也具有規(guī)律分隔的鏈內(nèi)雙硫橋。各Η鏈在Ν端具有可變結(jié)構(gòu)域（VH)，接著各α和Υ 鏈具有三個恒定結(jié)構(gòu)域（CH)，以及μ和ε同種型具有四fCH結(jié)構(gòu)域。各L鏈在Ν端具有 可變結(jié)構(gòu)域（')，接著在其它端具有恒定結(jié)構(gòu)域（Q)。八與￥ 11對齊，而且Q與重鏈（CH1) 的第一個恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R。據(jù)信，特別氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成界面。 VH和' 的配對共同形成單一抗原結(jié)合位點。至于不同類別的抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參閱，例 如，Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P.Stites, Abba I.Terr and Tristram G. Parslow (eds.)，Appleton&Lange, Norwalk, Conn.，1994,第 71 頁和第 6 章。
[0048] 〃單離的抗體〃為已與其自然環(huán)境的組分分離者及/或已自其自然環(huán)境的組分回 收者。其自然環(huán)境的污染物組分為會干擾抗體的診斷或治療用途的物料，而且可包含酶、激 素以及其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。于具體實施例中，抗體是純化成：（1)以羅式法（Lowry method)所測定為80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、99重量％或更高重量％的抗體； (2)通過使用旋轉(zhuǎn)杯測序儀，而達(dá)成足以獲得N端或內(nèi)氨基酸序列的至少15個殘基的程度； 或（3)使用考馬斯亮藍(lán)、銀染等在還原或非還原的條件下用SDS-PAGE而得的均質(zhì)性。單離 的抗體包含重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因為抗體的自然環(huán)境的至少一種組分將不存在。于具 體實施例中，單離的抗體將以至少一個純化步驟制備。
[0049] 術(shù)語〃抗體片段〃指完好抗體的一部分，而且指完好抗體的抗原決定可變區(qū)?？?體片段的實例，包含，但非限于：Fab、Fab'、F(ab'）2以及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體以及 形成自抗體片段的多特異性抗體。
[0050] 抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩種相同抗原結(jié)合片段，稱為"Fab〃片段和殘留〃Fe〃 片段，其是反映容易結(jié)晶的能力的指稱。Fab片段是由整個L鏈與Η鏈（V H)的可變區(qū)結(jié)構(gòu) 域和一個重鏈（CH1)的第一個恒定結(jié)構(gòu)域所組成。各Fab片段的抗原結(jié)合方面是單價，即， Fab片段具有單抗原結(jié)合位點?？贵w的胃蛋白酶處理產(chǎn)生單一大F (ab'）2片段，其大致對應(yīng) 于具有二價抗原結(jié)合活性和仍能交聯(lián)抗原的兩種雙硫化物鏈接的Fab片段。Fab'片段不 同于Fab片段，因為在CJ結(jié)構(gòu)域的羧基端具有另外的幾個殘基，包含來自抗體鉸鏈區(qū)的一 個或多個半胱氨酸。本文的Fab' -SH為其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有游離硫醇基的 Fab'的指稱。？(&13'）2抗體片段原本產(chǎn)生為彼此之間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab'片段對。亦 已知其它化學(xué)耦合的抗體片段。
[0051] "Fc"片段包括雙硫化物維持的兩個Η鏈的羧基端部分。Fc區(qū)亦為某些類型的細(xì) 胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體（FcR)辨識的部分，而且抗體的效應(yīng)物功能是由所述Fc區(qū)中的序列測 定。
[0052] 〃Fv抗體〃是指含有完整抗原辨識和結(jié)合位點的最小抗體片段，其是其中一個重 鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域形成非共價二聚體的兩個鏈，或其中一個重鏈可變結(jié) 構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以柔性肽接頭序列共價鏈接以便使兩個鏈以相似的二聚體結(jié) 構(gòu)相關(guān)聯(lián)的單鏈（scFv或sFv)。于此構(gòu)形中，各可變結(jié)構(gòu)域的互補決定區(qū)（CDR)交互作用， 以定義Fv二聚體的抗原結(jié)合特異性?；蛘撸瑔我豢勺兘Y(jié)構(gòu)域（或一半的Fv)可用以辨識和 結(jié)合抗原，雖然通常以較低的親和力結(jié)合。
[0053] 術(shù)語〃雙鏈抗體〃是指由以下述方法制備而成的小抗體片段：以VH和 '結(jié)構(gòu)域之 間的短接頭序列（約5個殘基）構(gòu)筑sFy片段（參閱前段），以致達(dá)成V結(jié)構(gòu)域的鏈間（但 非鏈內(nèi)）配對，造成二價片段，即，具有兩種抗原結(jié)合位點的片段。雙特異性雙鏈抗體為兩 個"交疊"sFy片段的異質(zhì)二聚體，其中兩個抗體的V H和 '結(jié)構(gòu)域存在于不同多肽鏈上。雙 鏈抗體更詳述于，例如，￡卩404,097;冊93/11161;以及!1〇11;[1^616七31.，？1'0(3.似1:1.八0已(1· Sci. USA, 90 :6444-6448(1993)。
[0054] "單克隆抗體"指涉及高度特異性辨識和與單一抗原決定簇或表位的結(jié)合的同質(zhì) 抗體群體。此單克隆抗體不同于典型包含不同抗體以針對對抗不同抗原決定簇的多克隆抗 體。術(shù)語〃單克隆抗體〃涵蓋皆為完好和全長的單克隆抗體以及抗體片段（諸如Fab、Fab'、 F(ab'）2、Fv)、單鏈（scFv)突變體、包括抗體部分的融合蛋白質(zhì)，以及包括抗原辨識位點的 任何其它改性免疫球蛋白分子。此外，〃單克隆抗體〃是指此以任何數(shù)量的方式制造的抗 體，所述方式包含，但非限于，雜交瘤、噬菌體選殖、重組表達(dá)以及轉(zhuǎn)基因動物。
[0055] 術(shù)語"人源化抗體"是指含有最小非人類（例如，鼠類）序列的特異性免疫球 蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白分子或其片段的非人類（例如，鼠類）抗體的形式。典型地，人 源化抗體為人類免疫球蛋白分子，所述人類免疫球蛋白分子中來自互補決定區(qū)（CDR)的 殘基被來自非人類物種（例如，小鼠、大鼠、兔子、倉鼠等）的具有期望的特異性、親和力、 以及能力的 CDR 的殘基置換（Jones et al.，I986, Nature, 321 :522-525 ;Riechmann et al.，1988, Nature, 332 :323-327 ;Verhoeyen et al.，1988, Science, 239 :1534-1536)。于某 些情況下，人類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)（FR)殘基以來自非人類物種的抗體中的具有期望 的特異性、親和力以及能力的對應(yīng)的殘基置換。人源化抗體可進一步通過以下方式改性：取 代Fv骨架區(qū)中及/或被置換的非人類殘基內(nèi)的另外的殘基，以細(xì)化和最優(yōu)化抗體特異性、 親和力及/或能力。通常，人源化抗體將包括實質(zhì)上全部含有對應(yīng)于非人類免疫球蛋白的 所有或?qū)嵸|(zhì)上全部的CDR區(qū)的至少一種以及典型兩種或三種的可變結(jié)構(gòu)域，反觀所有或?qū)?質(zhì)上全部的FR區(qū)為那些人類免疫球蛋白共有序列所具者。人源化抗體亦可包括至少一部 分的免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域（Fc)，其典型為人類免疫球蛋白所具者。用以產(chǎn)生人源化 抗體的方法實例描述于US5, 225, 539。
[0056] 術(shù)語〃人類抗體〃表示由人類產(chǎn)生的抗體或使用本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)制造的 具有對應(yīng)于人類產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體。此人類抗體的定義包含完好或全長的抗 體、其片段、及/或包括至少一個人類重鏈及/或輕鏈多肽的抗體，諸如，例如，包括鼠類輕 鏈和人類重鏈多肽的抗體。
[0057]"雜交抗體"為其中來自具有不同抗原決定簇區(qū)的重鏈和輕鏈對共同組合以便使 兩種不同表位或兩種不同抗原可被辨識和與所產(chǎn)生的四聚體結(jié)合的免疫球蛋白分子。
[0058] 術(shù)語"嵌合抗體"是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自兩種或更多種物種 的抗體。典型地，輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)對應(yīng)于源自哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔子 等）中的一種物種的抗體的具有期望的特異性、親和力以及能力的可變區(qū)，同時恒定區(qū)與 源自另一種物種（通常為人類）的抗體的序列同源，以避免在所述物種中引發(fā)免疫反應(yīng)。
[0059] 抗體的"可變區(qū)"是指單獨的抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)，或其組合。 重鏈和輕鏈的可變區(qū)各由以三個互補決定區(qū)（CDR)(亦已知為高度可變區(qū)）連接的四個骨 架區(qū)（FR)所組成。各鏈中的CDR是由FR維持緊密靠近，而且與來自另一個鏈的CDR貢獻(xiàn) 于抗體的抗原結(jié)合位點的形成。有至少兩種測定CDR的技術(shù)：（1)基于跨物種序列變異性 的方法（參閱 Kabat et al. , Sequences of Poteins of Immunological Interest (5th ed.，1991，美國國家衛(wèi)生院，Bethesda Md.));以及（2)基于抗原抗體復(fù)合物的結(jié)晶研究的 方法（參閱 Al-lazikani et al.J.Molec. Biol. 273 :927-948 (1997))。此外，本領(lǐng)域中有 時使用此兩種方法的組合以測定CDR。
[0060] 本文定義"給藥"為以造成劑在受試者的身體內(nèi)，從而將所述劑或含有所述劑的 組合物提供給所述受試者的方式。此給藥可為任何路徑，包含，但無限制于，口服、經(jīng)皮（例 如，陰道、直腸、口腔粘膜），通過注射（例如，皮下、靜脈內(nèi)、腸道外、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)）、或通過 吸入（例如，經(jīng)口或鼻）。醫(yī)藥制劑當(dāng)然是由適合各給藥路徑的形式給定。
[0061] 所謂"劑"表示任何小分子化學(xué)化合物、抗體、核酸分子或多肽或其片段。
[0062] 所謂"類似物"表示非相同，但具有類似的功能或結(jié)構(gòu)特征的分子。例如，流行性 感冒抗體的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲或磷酸酯類似物是具有以下特性的分子：1) 不會破壞流行性感冒抗體的生物活性,而且賦予流行性感冒抗體有利的體內(nèi)性質(zhì)，諸如，吸 收、作用的持續(xù)時間或作用的開始；或2)本身為生物不起作用，但在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成生物活性 化合物。類似物包含前藥形式的流行性感冒抗體。此前藥為當(dāng)對生物系統(tǒng)給藥時因自發(fā)性 化學(xué)反應(yīng)、酶催化的化學(xué)反應(yīng)及/或代謝化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果而產(chǎn)生流行性感冒抗體的任何化 合物。
[0063] 所謂"對照組〃是表示標(biāo)準(zhǔn)品或參考條件。
[0064] 術(shù)語〃衍生物〃是表示與給定劑（例如，流行性感冒抗體）有相等或接近相等的 生理功能性的醫(yī)藥活性化合物。如本文使用，術(shù)語〃衍生物〃包含任何醫(yī)藥可接受的鹽、 醚、酯、前藥、溶劑合物、包含對映異構(gòu)物、非對映異構(gòu)物或立體異構(gòu)地富集或外消旋混合物 的立體異構(gòu)物以及給藥接受者時能（直接或間接）提供化合物或抗病毒活性代謝物或其殘 基的任何其它化合物。
[0065] 所謂"疾病〃是表示破壞或干擾細(xì)胞、組織或器官的正常功能的任何狀態(tài)或病癥。
[0066] 術(shù)語〃表位〃或〃抗原決定簇〃在本文中互相交替使用，而且意指能被特別抗體 辨識和特異性地結(jié)合的抗原的部分。當(dāng)抗原為多肽時，表位皆可形成自通過蛋白質(zhì)的三級 折疊而并排的鄰接的氨基酸和非鄰接的氨基酸。形成自鄰接的氨基酸的表位通常在蛋白質(zhì) 變性時保留，反觀以三級折疊形成的表位通常在蛋白質(zhì)變性時流失。表位典型包含至少3 個，更常為至少5或8個氨基酸形成獨特空間構(gòu)形。
[0067] 抗體之間的競爭是以其中測試的免疫球蛋白抑制參考抗體與一般抗原的特異性 結(jié)合的檢測法測定。已知有許多類型的競爭結(jié)合檢測法，例如：固相直接或間接放射性免疫 檢測法（RIA)、固相直接或間接酶免疫檢測法（EIA)、三明治競爭檢測法（參閱Stahli et al.，Methods in Enzymology9 :242-253(1983));固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA(參 閱 Kirkland et al.，J. Immunol. 137 :3614-3619(1986));固相直接標(biāo)不檢測法、固相直接 標(biāo)不的三明治檢測法（參閱 Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual, "Cold Spring Harbor Press (1988));使用 1-125 標(biāo)記的固相直接標(biāo)記 RIA(參閱 Morel et al.，Molec. Immunol. 25(1) :7-(1988));固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA(Cheung et al·，Virologyl76 :546-552 (1990));以及直接標(biāo)不的 RIA(Moldenhauer et al.，Scand. J. Immunol. 32 :77-82(1990))。典型地，此檢測法涉及使用與固體表面或具有未標(biāo)示的測 試免疫球蛋白或標(biāo)示的參考免疫球蛋白的細(xì)胞結(jié)合的純化抗原。競爭抑制是通過在測試的 免疫球蛋白的存在下，測定與固體表面或細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記量而測量。通常，測試的免疫球蛋 白存在過量。通過競爭檢測法（競爭抗體）辨識的抗體包含與參考抗體結(jié)合相同表位的抗 體和與足夠接近結(jié)合所述表位的所述參考抗體的相鄰的表位結(jié)合的抗體，進而造成位阻發(fā) 生。當(dāng)競爭抗體存在過量時，將抑制參考抗體與一般抗原的特異性地結(jié)合至少25%、50、75% 或更1?。
[0068] 所謂"加強〃或〃增加〃表示相對于參考物，至少約10%、25%、50%、75%或100%的 正向變化。
[0069] 所謂"片段"是表示多肽或核酸分子的一部分。此部分含有參考核酸分子或多肽 的整個長度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。丨個片段可含有10、20、 30、40、50、60、70、80、90 或 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 個核苷酸或氨 基酸。
[0070] 〃雜交〃表示氫鍵結(jié)，其可為互補核堿基之間的瓦生-克里克（Watson-Crick)、胡 思町（Hoogsteen)或反向胡思町氫鍵結(jié)。例如，腺嘌呤和胞腺嘧啶是通過氫鍵的形成而配 對的互補核堿基。
[0071] 所謂"單離的多核苷酸〃是表示不含基因的核酸（例如，DNA)，所述核酸在其中衍 生本發(fā)明的核酸分子的生物體的天然存在基因組中在所述基因的側(cè)翼。所述術(shù)語因此包 含，例如，并入載體的重組DNA ;并入自主地復(fù)制的質(zhì)體或病毒；或并入原核生物或真核生 物的基因組DNA ;或存在為與無關(guān)其它序列無關(guān)的個別分子（例如，由PCR或限制性內(nèi)切核 酸酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組或cDNA片段）。此外，所述術(shù)語包含自DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA 分子，以及為編碼另外的多肽序列的雜交基因的一部分的重組DNA。
[0072] 所謂〃單離的多肽〃是表示已從自然伴隨它的組分單離的本發(fā)明的多肽。典型地， 當(dāng)多肽為至少60重量％時是單離的，而且不含與其自然相關(guān)的蛋白質(zhì)和天然存在的有機分 子。于具體實施例中，制備至少75重量％，至少90重量％或至少99重量％的本發(fā)明的多 肽。本發(fā)明的單離的多肽可通過，例如，從天然來源萃取而獲得，通過表達(dá)編碼此多肽的重 組核酸；或通過化學(xué)地合成蛋白質(zhì)。純度可通過任何適當(dāng)方法，例如，柱色譜法、聚丙烯酰胺 凝膠電泳、HPLC分析等測量。
[0073] 于兩種或更多種核酸或多肽的語境中，術(shù)語〃同一性〃或〃同一性百分率〃是指 當(dāng)比較和比對（若需要，引入空位）最大對應(yīng)，但不考慮任何保守氨基酸取代為序列同一性 的一部分時，相同或具有特定百分率的相同核苷酸或氨基酸殘基的兩個或更多個的序列或 子序列。同一性百分率可使用序列比較軟件或算法測量或目測測量。本領(lǐng)域中已知有多種 算法和軟件，而且其可用以獲得氨基酸或核苷酸序列的比對。序列比對算法的一個非限制 性實例是描述于 Karlin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，87 :2264-2268 (1990)，由 Karlin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ,90 :5873-5877(1993)所修改的算法，以及并入 NBLAST 和 XBLAST 程序（Altschul et al·，Nucleic Acids Res. ,25 :3389-3402 (1991))。于某些具 體實施例中，有空位的 BLAST 可如 Altschul et al·，Nucleic Res. 25 :3389-3402(1997) 中所述使用。BLAST-2、WU-BLAST-2 (Altschul et al·，Methods in Enzymology, 266 : 460-480(1996))、ALIGN、ALIGN_2(Genentech，South San Francisco, California)或 Megalign(DNASTAR)為可用以比對序列的可公開取得的另外的軟件程序。于某些具體實施 例中，兩個核苷酸序列之間的同一性百分率是使用GCG軟件中的GAP程序測定（例如，使用 NWSgapdna. CMP matrix 和 40、50、60、70 或 90 的空位重量和 1、2、3、4、5 或 6 的長度重量）。 于某些具體實施例中，GCG套裝軟件中的GAP程序并入可用以測定兩個氨基酸序列之間的 同一性百分率（例如，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的空 位重量和 1、2、3、4、5 的長度重量）的 Needleman and Wunsch 的算法（J.Mol.Biol. (48): 444-453(1970))。于某些具體實施例中，核苷酸或氨基酸序列之間的同一'丨生百分率是使用 Myers and Miller(CABI0S，4 :11-17(1989))的算法測定。例如，同一性百分率可使用ALIGN 程序（2.0版）測定，并且使用具有殘基表的PAM1，空位長度罰分為12和空位罰分為4。特 別比對軟件的最大比對的適當(dāng)參數(shù)可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員測定。于某些具體實施例中，使 用比對軟件的預(yù)設(shè)參數(shù)。于某些具體實施例中，第一氨基酸序列與第二序列氨基酸的同一 性百分率"X"是計算為lOOx (Y/Z)，其Y為氨基酸殘基的數(shù)目（其計數(shù)為第一個和第二序列 的比對中的相同配對）（如通過目測或特別序列比對程序而比對），而且Z為第二序列中的 殘基總數(shù)。若第一序列的長度比第二序列更長，則第一個序列與第二序列的同一性百分率 將比第二序列與第一個序列的同一性百分率更長。
[0074] 作為非限制性實例，任何特別多核苷酸是否與參考序列具有特定序列同一性百分 率（例如，至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性，以及于一些具體實施例中， 至少95%、96%、97%、98%或99%同一性）可于某些具體實施例中使用最佳適配（Bestfit)程 序（Wisconsin 序列分析套組，Version8for Unix, Genetics Computer Group, University ResearchPark，575Science Drive，Madison，WI53711)測定。最佳適配使用 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics2 :482489(1981)的局部同源性算法，得到兩 種序列之間的同源性的最佳區(qū)段。當(dāng)使用最佳適配或任何其它序列比對程序測定特別序列 是否為，例如，與根據(jù)本發(fā)明的參考序列為95%同一性時，參數(shù)設(shè)定成計算參考核苷酸序列 全長的同一性百分率，而且允許同源性的空位為高達(dá)參考序列的核苷酸總數(shù)的5%。
[0075] 于一些具體實施例中，當(dāng)比較和比對最大對應(yīng)時，如使用序列比較算法或目測測 量時，本發(fā)明的兩個核酸或多肽為實質(zhì)上相同，表示它們具有至少70%、至少75%、至少80%、 至少85%、至少90%，以及于一些具體實施例中，至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基 酸殘基同一性。同一性可存在于長度或其間的任何積分值為至少約5、至少約10、約20、約 40至60個殘基的序列區(qū)，或超過60至80個殘基，至少約90至100的殘基的更長區(qū)，或與 比較的序列的全長相比實質(zhì)同一性的序列。
[0076] "保守氨基酸取代"為其中一個氨基酸殘基被具有相似的側(cè)鏈的另一個氨基酸殘 基置換者。具有相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已于本領(lǐng)域中定義，包含堿性側(cè)鏈（例如， 賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側(cè)鏈（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、無電荷極性側(cè)鏈（例如， 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非極性側(cè)鏈（例如，丙 氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β -支鏈側(cè)鏈 (例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）以及芳族側(cè)鏈（例如，酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、組 氨酸）。例如，以酪氨酸對苯基丙氨酸進行的取代為保守取代。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽和抗 體序列上的保守取代不會廢除含有氨基酸序列的多肽或抗體與抗原的結(jié)合。不會消除抗 原結(jié)合的辨識核苷酸和氨基酸保守取代的方法為本領(lǐng)域中周知者（參閱，例如，Brummell et al. , Biochem.32 ：1180-1187(1993) ；Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10)： 879-884(1999);以及 Burks et al.Proc. Natl. Acad. Sci.USA94 :.412-417 (1997))。
[0077] 〃醫(yī)藥可接受〃是指美國聯(lián)邦或州政府的監(jiān)管機關(guān)已核準(zhǔn)或可核準(zhǔn)者，或列于美 國藥典者，或以于動物（包含，人類）的其它通常認(rèn)可的藥典。
[0078] 〃醫(yī)藥可接受的賦形劑、載體或稀釋劑〃是指可與劑共同給藥受試者的賦形劑、載 體或稀釋劑，所述賦形劑、載體或稀釋劑不會破壞劑的藥理活性，而且當(dāng)以足以遞送治療量 的劑給予劑量時是無毒的。
[0079] 本文所述流行性感冒抗體的〃醫(yī)藥可接受的鹽〃為本領(lǐng)域中通常被認(rèn)為適合接 觸人類或動物的組織，但無過度毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥的酸或堿鹽。此 鹽包含堿性殘基的無機和有機酸鹽諸如胺類，以及酸性殘基的堿或有機鹽的諸如羧酸。具 體醫(yī)藥鹽包含，但非限于，下述酸的鹽類，諸如鹽酸、磷酸、氫溴酸、蘋果酸、乙醇酸、反丁烯 二酸、硫酸、氨基磺酸、對氨基苯磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙二磺酸、2_羥基 乙磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水楊酸、谷氨酸、 抗壞血酸、撲酸、琥珀酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、丙酸、羥基順丁烯二酸、氫碘酸、苯基乙 酸、烷酸諸如乙酸，HOOC-(CH2)n-COOH，其中η是0至4等。同樣地，醫(yī)藥可接受的陽離子包 含，但非限于，鈉、鉀、鈣、鋁、鋰以及銨。具有本領(lǐng)域一般知識者將辨識進一步用于本文提供 的抗體的醫(yī)藥可接受的鹽，包含 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed.，Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418(1985)中所列者。通常，醫(yī)藥可接受的酸或堿鹽可 通過任何傳統(tǒng)化學(xué)方法從含有堿性或酸性部分的母體化合物合成。簡要地，此鹽可通過使 此等化合物的游離酸或堿形式與化學(xué)計量含量的適當(dāng)堿或酸在適當(dāng)溶劑中反應(yīng)而制備。
[0080] 術(shù)語〃病人〃或〃受試者〃是指治療、觀察或?qū)嶒灥哪繕?biāo)動物。通過例舉的方式 可知，受試者僅包含，但非限于，哺乳動物，包含，但非限于，人類或非人類哺乳動物，諸如非 人類靈長類、牛、馬、犬、羊或貓。
[0081] 如本文所使用，術(shù)語〃預(yù)防（prevent) 〃、〃預(yù)防（preventing) 〃、〃預(yù)防 (prevention) 〃或〃預(yù)防性（prophylactic)治療〃等是指減少在不會具有疾病或適應(yīng)癥但 有易于發(fā)展疾病或適應(yīng)癥的風(fēng)險的受試者中發(fā)展疾病或適應(yīng)癥的概率。
[0082] 所謂"減少〃是表示相對于參考物，至少約10%、25%、50%、75%或100%地負(fù)向變化。
[0083] 所謂"參考〃是表示標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ諣顟B(tài)。
[0084] 所謂"特異性地結(jié)合〃是表示識別和結(jié)合本發(fā)明的多肽，但不會實質(zhì)上辨識和結(jié)合 樣本（例如，生物樣本）中的其它分子（其自然包含本發(fā)明的多肽）的化合物或抗體，。 [0085] 抗體與表位或蛋白質(zhì)〃特異性地結(jié)合"，表示抗體較另外物質(zhì)（包含不相關(guān)的蛋 白質(zhì)）更頻繁、更快速、以更大持續(xù)時間、以更大親和力或一些以上者的組合，而與表位或 蛋白質(zhì)反應(yīng)或相關(guān)聯(lián)。于某些具體實施例中，"特異性地結(jié)合"表示，例如，抗體以約〇. ImM 更少的KD與蛋白質(zhì)結(jié)合，但在其它時后更常少以約1 μ Μ的KD與蛋白質(zhì)結(jié)合。于某些具體 實施例中，〃特異性地結(jié)合〃表示抗體有時以至少約〇. 1 μ Μ更少的KD與蛋白質(zhì)結(jié)合，而在 其它時間以至少約〇. 01 μ Μ或更少的KD與蛋白質(zhì)結(jié)合。因為不同物種中的同源蛋白質(zhì)之 間的序列同一性，特異性地結(jié)合可在超過一種物種中包含識別特別蛋白質(zhì)的抗體。應(yīng)理解 與第一個目標(biāo)特異性地結(jié)合的抗體或結(jié)合部分可或可不與第二目標(biāo)特異性地結(jié)合。因此，" 特異性地結(jié)合〃不會一定需要（雖然其可包含）排除性結(jié)合，即，與單一目標(biāo)結(jié)合。一般， 但非必需，關(guān)于結(jié)合是意指特異性地結(jié)合。
[0086] 如本文所使用，〃實質(zhì)上純〃是指物料為至少50%純（S卩，不含污染物），更優(yōu)選為 至少90%純，更優(yōu)選為至少95%純，更優(yōu)選為至少98%純，更優(yōu)選為至少99%純。
[0087] 如本文所使用，術(shù)語〃治療（treat) 〃、治療（treating) 〃、〃治療（treatment) 〃等 是指減少或改善與其相關(guān)聯(lián)的病癥及/或癥狀。所謂"改善"，是表示減少、阻抑、衰減、遞 減、阻止、或穩(wěn)定疾病的發(fā)展或進展。應(yīng)理解，雖然非排除，但治療病癥或適應(yīng)癥不會需要將 與其相關(guān)聯(lián)的病癥、適應(yīng)癥或癥狀完全消除。
[0088] 術(shù)語〃治療功效〃是指一定程度上緩解病癥的一個或多個癥狀或其相關(guān)病理。所 述術(shù)語是指治療處理和預(yù)防或預(yù)防措施兩者，其中目的為預(yù)防針對的病理狀態(tài)或病癥或使 其變慢（減少）。需要治療者包含已具有病癥者以及易于具有病癥者或那些待預(yù)防病癥者。 若根據(jù)本發(fā)明的方法接受治療量的抗體之后，對于下列情況的一個或多個，病人顯示可觀 察的及/或可測量的減少或沒有，則受試者或哺乳動物的感染被成功地"治療"：減少感染 細(xì)胞的數(shù)目或沒有感染細(xì)胞；減少感染總細(xì)胞的百分率；緩解一個或多個與特異性感染相 關(guān)的癥狀（例如，與流行性感冒感染相關(guān)的癥狀）至一定程度；減少發(fā)病率和死亡率，以及 的改善生活質(zhì)量問題?？扇菀椎匾葬t(yī)師熟悉的常規(guī)步驟測量用于評估成功的疾病治療和改 善的以上參數(shù)。
[0089] 〃治療有效量〃意欲定性需要達(dá)成治療功效的含量。本領(lǐng)域中具有通常知識的醫(yī) 師或獸醫(yī)可容易測定和規(guī)定需要的醫(yī)藥組合物的〃治療有效量〃（例如，ed 5(i)。例如，醫(yī)師 或獸醫(yī)會在醫(yī)藥組合物中以低于達(dá)成期望的治療功效所需的劑量采用本發(fā)明的化合物而 開始，然后緩慢地增加劑量直到達(dá)成期望的功效。
[0090] 短語〃組合治療〃采用流行性感冒抗體和第二治療劑的給藥，以作為意欲由此等 治療劑的共同作用提供有益功效的特定治療養(yǎng)生法的一部分。組合的有益功效包含，但非 限于，由組合的治療劑所造成的藥物動力或藥效共同作用。此等治療劑的組合給藥典型是 于定義時期（取決于選擇的組合，通常為分鐘、小時、天或周）進行?！ńM合治療〃通常非 意欲涵蓋兩種或更多種此等治療劑的給藥作為順便地和任意地造成本發(fā)明的組合物的個 別單一治療養(yǎng)生法的一部分?！ńM合治療〃意欲以依序的給藥方式采用此等治療劑，其中 各治療劑是于不同時間給藥，以及此等治療劑或至少兩種的治療劑是以實質(zhì)上同時方式給 藥。實質(zhì)上同時給藥可通過例如對受試者給藥具有固定比率的各治療劑的單一膠囊，或各 治療劑的多個單一膠囊而實現(xiàn)。例如，本發(fā)明的一種組合在相同或不同時間包括流行性感 冒抗體和至少一種另外的治療劑（例如，抗病毒劑，包含抗流行性感冒劑），或其可調(diào)配成 單一共同調(diào)配的包括兩種化合物的醫(yī)藥組合物。作為另一個實例，本發(fā)明的組合（例如，流 行性感冒抗體和至少一種另外的治療劑，諸如抗病毒劑）調(diào)配成可在相同或不同時間給藥 的個別醫(yī)藥組合物。各治療劑的依序或?qū)嵸|(zhì)上同時給藥可以任何適當(dāng)路徑包含，但非限于， 口路徑、靜脈內(nèi)路徑、肌內(nèi)路徑以及直接吸收通過粘膜組織（例如，鼻、口、陰道以及直腸） 而起效。治療劑可通過相同路徑或不同路徑給藥。例如，特別組合的一個組分可通過靜脈 內(nèi)注射而給藥，同時組合的其它組分可口服給藥。組分可以任何治療有效的序列給藥。
[0091] 短語〃組合〃采用有用為組合物治療的一部分的化合物或非藥物治療的群組。
[0092] 術(shù)語〃載體〃表示能在宿主細(xì)胞中遞送和表達(dá)感興趣的一個或多個基因或序列的 構(gòu)筑物。載體的實例包含，但非限于，病毒載體、無改性的DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)體、粘粒 或噬菌體載體、與陽離子性縮合劑相關(guān)的DNA或RNA表達(dá)載體、包囊于脂質(zhì)體的DNA或RNA 表達(dá)載體以及某些真核細(xì)胞諸如生產(chǎn)細(xì)胞。
[0093] 除非具體注明或從語境顯而易見，如本文所使用，術(shù)語〃約〃應(yīng)理解為本領(lǐng)域中的 正常公差范圍內(nèi)，例如均值的2標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)。可理解為注明值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、 2%、1%、0. 5%、0. 1%、0. 05%或0. 01%內(nèi)。除非從語境指出清楚，本文提供的所有數(shù)值是以術(shù)語 "約〃修改。
[0094] 本文提供的范圍應(yīng)理解為范圍內(nèi)的所有值的略寫。例如，1至50的范圍應(yīng)理解為 包含由 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 所組 成組的任何數(shù)字、數(shù)字的組合、或子范圍。
[0095] 本文的變量的任何定義中化學(xué)基團列表的敘述包含所述變量為任何單一基團或 所列基團的組合的定義。本文變量或方面的具體實施例的敘述包含以任何單一具體實施例 或與任何其它具體實施例或其部分組合的方式的具體實施例。
[0096] 本文提供的任何組合物或方法提供可為與本文提供的一個或多個的任何其它組 合物和方法合并。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0097] 圖1. (A)克隆860的推測譜系。左圖：從供體單離的三個抗體的未突變的一般原 始種型（UCA)(以其數(shù)字顯示，右圖）。（B)譜系中的重鏈（頂圖）和輕鏈（底圖）的序列 比對。（C)來自CH65的與HAL接觸的Fab。重鏈為深藍(lán)色；輕鏈為淺藍(lán)色；(B)中標(biāo)示⑶R 為有顏色者；HA為紅色，而原子表面顯示為部分透明覆蓋。從UCA突變的殘基為綠色棒狀 物表示。
[0098] 圖2. (A)具有結(jié)合的CH65Fab的HA三聚體。一個HA鏈為紅色（HA1)和綠色（HA2); 其它兩個鏈為灰色；聚糖為黃色。結(jié)合有顏色的HA鏈的Fab為深藍(lán)色（重鏈）和淺藍(lán)色 (輕鏈），而接觸的CDR為圖1B標(biāo)示為有顏色者。（B)Fv區(qū)及其與HAI接觸的放大圖。顏色 與圖1相同。注意重鏈⑶R3(洋紅色）伸入HAI上的受體結(jié)合袋狀結(jié)構(gòu)，同時剩余的⑶R 具有更受限制的表面接觸。（C)和（D)為FabCH65和HAI之間的接觸的表面表示圖，如箭頭 所示處打開。一個HA亞單元上的唾液酸袋狀結(jié)構(gòu)為深紅色；剩余的亞單元為暗紅色；剩余 的兩種亞單元為灰色；聚糖為黃色。
[0099] 圖3. CH65 (A)和α -2, 6-唾液基乳糖⑶的交互作用的比較。
[0100] 圖4. CH65-CH67譜系成員與Η1和Η3流行性感冒病毒株的反應(yīng)性的酶鏈接免疫吸 附檢測法（ELISA)。293Τ細(xì)胞以來自病毒株Χ31(Η3)的全長度ΗΑ轉(zhuǎn)染（頂格，Α至C)或 以來自A/Solomon Islands/3/2006[Hl]的表達(dá)在細(xì)胞表面的球狀頭轉(zhuǎn)染（底格，E至G)。 將細(xì)胞以甲醛固定，并且以CH65Fab(b和f)或CH66全長抗體（C和G)針探（probed)，接著 以對人類Fab有特異性的FITC-偶聯(lián)的第二抗體特異性針探。細(xì)胞以FITC發(fā)射（532nm) 成像。至于對照組，轉(zhuǎn)染細(xì)胞僅以第二抗體針探（A和E)。
[0101] 圖5. CH65的VDJ重組位點的序列?；a（key)表示重鏈編碼區(qū)段（V、D、J以及 η-核苷酸）的原點。
[0102] 圖6. CH65-CH67HA抗體的重鏈DNA序列。
[0103] 圖7. CH65-CH67HA抗體的輕鏈DNA序列。
[0104] 圖8. CH65-CH67HA抗體的重鏈氨基酸序列。
[0105] 圖9. CH65-CH67HA抗體的輕鏈氨基酸序列。
[0106] 圖 10. CL860UCA、CH65、CH66 以及 CH67 的 VH DNA 序列的比對。
[0107] 圖 1L CL860UCA、CH65、CH66 以及 CH67 的 VL DNA 序列的比對。
[0108] 圖12. CL860UCA、CH65、CH66以及CH67的VH氨基酸序列的比對。
[0109] 圖13. CL860UCA、CH65、CH66以及CH67的VL氨基酸序列的比對。
[0110] 圖14.來自H1(A)、H2(B)、H3(C)以及Η5Φ)血凝素的代表性受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 CH65-CH67抗體結(jié)合表位是加底線。
[0111] 圖15.來自HI、H2、H3以及H5血凝素的代表性受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列比對。與 CH65-CH67抗體交互作用的氨基酸殘基是加底線。

【具體實施方式】
[0112] 本發(fā)明的特征為廣泛中和流行性感冒抗原變異體的新穎抗體。本發(fā)明亦提供含有 新穎抗體的組合物和試劑盒、以及使用此等新穎治療分子治療或預(yù)防（例如，疫苗接種）流 行性感冒感染的方法。
[0113] 受體流行性感冒病毒的受體為唾液酸，由α-2,3或α-2, 6端鏈接附接至糖蛋白 質(zhì)或糖脂質(zhì)上的聚糖（Wiley, D. C. and Skehel, J. J. Annu. Rev. Biochem. 56 :365-394 (1987) 中評論）。大部分的中和抗體阻擋細(xì)胞附接，因為其足跡與受體結(jié)合位點重疊或因為當(dāng) 在HA表面上的別處結(jié)合時發(fā)揮立體干擾（Knossow，M.and Skehel，J.J.Immunologyll9: 1-7(2006))。已測定Fab :HA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的兩種小鼠單克隆中和抗體具有伸入HA上的唾 液酸結(jié)合袋狀結(jié)構(gòu)的環(huán)，而且在唾液酸羧酸酯大致所在處呈現(xiàn)天冬氨酸側(cè)鏈（Fleur y，D. et al.，Nat. Struct. Biol. 5 :119-123(1998);以及 Barbey-Martin，C· et al.，Virology294 : 70-74(2002))。但此等抗體皆亦與其中逃逸突變會較受體位點更容易發(fā)生的其它表面區(qū)有 廣泛接觸，。
[0114] 本發(fā)明至少部分基于在受體袋狀物中發(fā)現(xiàn)具有主要接觸的新穎抗體。一種此抗體 被指定為CH65,而且其發(fā)現(xiàn)是通過從已接受2007三價疫苗的受試者獲得的分選的單一漿 細(xì)胞單離重排的重鍵和輕鏈基因。CH65中和非常廣泛范圍的跨越超過三十年H1季節(jié)性單 離物。其19個殘基重鏈互補性測定區(qū)3 (⑶R-H3)插置入受體袋狀結(jié)構(gòu)，仿真以唾液酸進 行的許多交互作用。重鏈和輕鏈CDR兩者參與和HA1的朝外表面的更為限制的另外接觸。 CH65的推測且未突變的原始種型與成熟親和力的抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的12個位置和 在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的6個位置有所不同。因此，人類B-細(xì)胞庫（repertiore)包含產(chǎn)生 主要針對受體結(jié)合位點的抗體的可能性。大量季節(jié)性H1病毒是由抗體CH65中和，暗示此 反應(yīng)平常太少見以致無法選擇抗性，或抗性造成不適合的代價太高（其為若潛在的逃逸突 變損害受體結(jié)合會發(fā)生的情況）。因此，令人驚奇的是，
【發(fā)明者】已發(fā)現(xiàn)廣泛中和流行性感冒 病毒的可通過仿真那些受體所具者的接觸的抗體而達(dá)成。從而，本發(fā)明提供模擬流行性感 冒HA和唾液酸受體之間的接觸的新穎抗體。此等新穎抗體可有效地治療及/或預(yù)防流行 性感冒感染的漂移株。因此，本發(fā)明的特征為含有新穎抗體的組合物和試劑盒、以及使用此 等治療分子治療及/或預(yù)防流行性感冒感染的方法。本發(fā)明亦有關(guān)包含新穎抗體的組合物 治療。
[0115] CH65-CH67血凝素抗體
[0116] 本發(fā)明提供與流行性感冒血凝素（HA)的表位特異性地結(jié)合的新穎抗流行性感冒 抗體?？贵w與HA的結(jié)合減少或抑制流行性感冒血凝素與唾液酸的結(jié)合。
[0117] 于具體實施例中，流行性感冒HA的表位包括唾液酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0118] 于具體實施例中，HA為H1HA、H2HA、H3HA或H5HA(來自適應(yīng)人類的H5病毒株的 HA)。
[0119] 于相關(guān)具體實施例中，流行性感冒HA表位包括對應(yīng)于來自A/Solomon Islands/3/2006 的 CDR HI 殘基 158 ;CDR H2 殘基 158 至 160 ;CDR H3 殘基 135 至 136、190 至195以及226 ;⑶R L1殘基222、225以及227 ;以及⑶R L3殘基187和189的氨基酸。
[0120] 于相關(guān)具體實施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID N0 :17至44中任一者所表 示的氨基酸。
[0121] 于相關(guān)具體實施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID N0 :17至44中任一者中的 CH65-CH67結(jié)合殘基（例如，圖15中辨識的CH65-CH67結(jié)合殘基）。
[0122] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括可變重（VH)鏈，其中VH鏈包 括 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11 或 SEQ ID N0:12 中所表示的氨基酸序列。
[0123] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括一個或多個存在于SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12的可變重（VH)鏈氨基酸序列中的重 鏈⑶R區(qū)。于相關(guān)具體實施例中，一個或多個重鏈⑶R區(qū)包括存在于SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12的可變重（VH)鏈氨基酸序列中的CDR3區(qū)。
[0124] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括可變輕（VJ鏈，其中 '鏈包 括 SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15 或 SEQ ID N0:16 所表示的氨基酸序列。
[0125] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括一個或多個包括存在于SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15 或 SEQ ID NO :16 的可變輕（VJ 鏈氨基酸序列中 的輕鏈⑶R區(qū)。于相關(guān)具體實施例中，一個或多個輕鏈⑶R區(qū)包括存在于SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15或SEQ ID NO :16的可變重（VJ鏈氨基酸序列中的CDR3區(qū) 的。
[0126] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括i)包括SEQ ID N0 :10所表 示的氨基酸序列的可變重（VH)鏈氨基，以及ii)包括SEQ ID N0 :14所表示的氨基酸序列 的可變輕（')鏈。
[0127] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段包括可變重（VH)鏈，其中V H鏈的 CDR3 區(qū)包括 Argl04、Serl05、Vall06、Aspl07、Tyrl09、Tyrll0、Tyrll2 或其組合。
[0128] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體為其單克隆抗體或抗體片段。
[0129] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體為人源化抗體。
[0130] 于具體實施例中，抗體片段為Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb 片段、F(ab'）2片段、單鏈片段、雙鏈抗體或線性抗體。
[0131] 于具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段進一步包括與抗流行性感冒抗體 或其抗體片段偶聯(lián)的劑。于相關(guān)具體實施例中，與抗體或其抗體片段偶聯(lián)的劑為治療劑或 可檢測的標(biāo)記。
[0132] 治療劑可為適合與新穎抗體共享的任何治療劑。此劑為本領(lǐng)域中周知者，而且包 含小分子、納米粒子、多肽、放射性同位素、抑制性核酸等。于具體實施例中，治療劑為抗病 毒劑或毒素。于具體實施例中，治療劑為減少流行性感冒病毒產(chǎn)生的siRNA、shRNA或反義 核酸分子。
[0133] 可檢測的標(biāo)記可為適合與新穎抗體共享的任何可檢測的標(biāo)記。此標(biāo)記為本領(lǐng)域周 知者，而且包含可以光譜、光化學(xué)、生化、免疫化學(xué)、物理或化學(xué)方式檢測的標(biāo)記。于具體實 施例中，可檢測的標(biāo)記為已制成可檢測的酶、熒光分子、顆粒標(biāo)記、電子致密試劑、放射性標(biāo) 記、微泡、生物素、地高辛或半抗原或蛋白質(zhì)。
[0134] 于任何以上具體實施例中，流行性感冒可為H1N1、H2N2、H3N2或適應(yīng)人類的H5病 毒株。
[0135] 本發(fā)明的抗體可通過任何本領(lǐng)域中已知的傳統(tǒng)工具制備。例如，多克隆抗體可通 過以多重皮下或腹膜內(nèi)注射視需要地偶聯(lián)適合半抗原（例如，鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)、血清白 蛋白等）的相關(guān)抗原（例如，純化肽片段、全長重組蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)等），而免疫接種動 物（例如，兔子、大鼠、小鼠、驢、山羊、倉鼠、豚鼠、綿羊、有蹄類動物、牛、駱騎、禽、雞等）而 制備。抗原可以任何適合載液（例如，無菌食鹽水）稀釋，并且與佐劑（例如，完整或不完 整的弗氏佐劑（Freund' sAdjuvant))合并以形成乳劑。接著，自因此免疫接種的動物的血 液、腹水等回收多克隆抗體。使采集的血液凝固，并且將血清倒出，通過離心而變清澈，以及 檢測抗體的效價。多克隆抗體可根據(jù)本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法，包含親和力色譜法、離子交換色 譜法、凝膠電泳、透析等，從血清或腹水純化。
[0136] 單克隆抗體可使用雜交瘤方法如 Kohler and Milstein, Nature256 :495 (1975) 中描述的那些方法制備。使用雜交瘤方法，將適當(dāng)宿主動物如上述免疫接種，以引發(fā)淋巴 細(xì)胞產(chǎn)生將與免疫接種抗原特異性地結(jié)合的抗體的。淋巴細(xì)胞亦可體外免疫接種。免疫 接種以后，將淋巴細(xì)胞單離，并且使用例如聚乙二醇與適合的骨髓瘤細(xì)胞系融合，以形成可 接著從未融合的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞單離的雜交瘤細(xì)胞。免疫沉淀、免疫印跡法或體外 結(jié)合檢測法（例如，放射性免疫檢測法（RIA)、酶鏈接免疫吸附檢測法（ELISA)等）測定 的產(chǎn)生特異性地針對所選的抗原的單克隆抗體的雜交瘤可接著使用標(biāo)準(zhǔn)方法而以體外培 養(yǎng)物傳播（參閱 Goding，Monoclonal Antibodies ：Principles and Practice, Academic Press, 1986)或以在動物中的腹水腫瘤方式而體內(nèi)傳播。如以上所述關(guān)于多克隆抗體者，單 克隆抗體可接著從培養(yǎng)基或腹水液體純化。
[0137] 或者，單克隆抗體亦可使用美國專利US4, 816, 567中所述重組DNA方法進行。編 碼單克隆抗體的多核苷酸是通過諸如使用具體擴增編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡 核苷酸引物的RT-PCR，而從成熟B-細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞單離，而且其序列是使用傳統(tǒng)程序 測定。接著，編碼重鏈和輕鏈的單離的多核苷酸（包含本文所述單離的多核苷酸）克隆 化入適合的表達(dá)載體，當(dāng)所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌（E.coli)細(xì)胞、猴 C0S細(xì)胞、中國倉鼠卵巢（CH0)細(xì)胞或不會產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的骨髓瘤細(xì)胞時，所述 宿主細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體。另，如所述，期望的物種的重組單克隆抗體或其片段可從表達(dá) 期望的物種的⑶R的噬菌體展示庫單離（參閱McCafferty et al.，1990, Nature, 348 : 552-554 ;Clackson et al·，1991，Nature, 352 :624-628 ;以及 Marks et al·，1991，J. Mol. Biol. , 222 :581-597)〇
[0138] 編碼單克隆抗體的多核苷酸可進一步以一些使用重組DNA技術(shù)的不同方式改性 以產(chǎn)生另外的抗體。于一些具體實施例中，例如，小鼠單克隆抗體的輕鏈和重鏈的恒定結(jié)構(gòu) 域可以下列者取代：1)例如，人類抗體的那些區(qū)以產(chǎn)生嵌合抗體，或2)非免疫球蛋白多肽 以產(chǎn)生融合抗體。于一些具體實施例中，將恒定區(qū)截短或移除，以產(chǎn)生單克隆抗體的期望的 抗體片段?？勺儏^(qū)的位點引導(dǎo)或高密度突變可用以最優(yōu)化單克隆抗體的特異性、親和力等。
[0139] 于本發(fā)明的一些具體實施例中，單克隆抗體為人源化抗體。人源化抗體為含有來 自非人類（例如，嚙齒動物）抗體的最小序列，所述非人類抗體在包括各抗體鏈內(nèi)有三個互 補決定區(qū)（CDR)的抗原決定或高度可變區(qū)內(nèi)。治療地使用此抗體以減少當(dāng)給藥人類受試者 時的抗原性和HAMA (人類抗小鼠抗體）反應(yīng)。實務(wù)上，人源化抗體為典型具有最小至實際 上無非人類序列的人類抗體。人類抗體為人類產(chǎn)生的抗體或具有對應(yīng)于人類所產(chǎn)生的抗體 的氨基酸的抗體。
[0140] 人源化抗體可使用多種本領(lǐng)域中已知的技術(shù)產(chǎn)生?？贵w可通過以那些具有期望的 特異性、親和力以及能力的非人類抗體（例如，小鼠、大鼠、兔子、倉鼠等）的CDR取代人類 抗體的 CDR而人源化（參閱，例如，Jones et al.，Nature321 :522-5(1986) ;Riechmann et al.，Nature332 :323-327 (1988);以及 Verhoeyen et al.，Science239 :1534-1536 (1988) 的方法。人源化抗體可通過可變?nèi)祟惞羌軈^(qū)中及/或置換的非人類殘基內(nèi)的另外的殘基的 取代而進一步改性，以細(xì)化和最優(yōu)化抗體特異性、親和力及/或能力。
[0141] 選擇用于制造人源化抗體的人類重鏈及/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)τ跍p少抗原性而 言可為重要的。根據(jù)〃最佳適配〃方法，針對已知人類可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的整個庫 篩選非人類抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列。因此，于某些具體實施例中，與從其中取CDR的非 人類抗體的氨基酸序列最同源的人類氨基酸序列是用作人源化抗體的人類骨架區(qū)（FR) (參閱 Sims et al.，J. Immunol. 151 :2296 (1993) ;Chothia et al.，J. Mol. Biol. 196: 901 (1987))。另一個方法使用衍生自特別輕鏈或重鏈子群的所有人類抗體的共有序列的特 別FR，而且可使用于許多不同的人源化抗體（參閱Carter et al.，PNAS89;4285(1992); Presta et al.，J. Immunol. 151 :2623(1993))。于具體實施例中，使用一組方法以挑出用于 產(chǎn)生人源化抗體的人類可變FR。
[0142] 應(yīng)進一步理解待人源化的抗體必須保留與抗原的高親和力以及其它有利的生物 性質(zhì)。為了達(dá)成此目標(biāo)，人源化抗體可通過分析來自待人源化的非人類抗體的親本序列和 的多個候選人源化序列的過程而制備。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員可用和熟悉三維免疫球蛋白模 型。計算機程序可用以說明和展示選擇的候選抗體序列的可能三維構(gòu)形結(jié)構(gòu)。使用此等模 型允許對殘基在待人源化的抗體的功能中的可能角色進行分析，即，分析影響候選抗體與 其抗原結(jié)合的能力的殘基。以此方式，可從親本抗體選擇FR殘基，并將其與接受者人源化 抗體合并以便達(dá)成期望的抗體特征。通常，人源化抗體中的親本抗體（例如，具有期望的抗 原結(jié)合性質(zhì)的非人類抗體）保留抗原決定區(qū)（或高度可變區(qū)）的CDR中的殘基，以進行抗 原結(jié)合。于某些具體實施例中，人源化抗體中的親本抗體保留可變FR內(nèi)的至少一個另外的 殘基。于某些具體實施例中，人源化抗體中的親本抗體保留可變FR內(nèi)的最多六個另外的殘 基。
[0143] 來自免疫球蛋白分子的成熟重鏈和輕鏈的可變區(qū)的氨基酸分別指定為Hx和 Lx,其中X為根據(jù)美國衛(wèi)生部門和人類服務(wù)（U.S.Department of Health and Human Services)，1987, 1991，免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest)Kabat的方案所指定的氨基酸位置數(shù)目。Kabat針對各子群列出 抗體的許多氨基酸序列，并且針對所述子群中各殘基位置列出最常出現(xiàn)的氨基酸以產(chǎn)生共 有序列。Kabat使用一種對列表序列中的各氨基酸分配殘基數(shù)的方法，而且此分配殘基數(shù)的 方法已成為本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)。Kabat的方案擴展至不包含于他的概要中的其它抗體，通過以 參考保守氨基酸的方式而比對有疑問的抗體與Kabat中的共有序列之一。Kabat編號系統(tǒng) 的使用容易辨識在不同抗體中的相等位置的氨基酸。例如，在人類抗體的L50位置的氨基 酸占據(jù)小鼠抗體的L50氨基酸位置的相等位置。再者，通過使用Kabat編號系統(tǒng)以便將一 個抗體序列中的各氨基酸與具有相同Kabat數(shù)字的其它序列中的氨基酸對齊，而使任何兩 種抗體序列可獨特地對齊，例如，以測定同一性百分率。比對之后，若受試者抗體區(qū)（例如， 重鏈或輕鏈的整個成熟可變區(qū)）與參考抗體的相同區(qū)比較，則受試者和參考抗體區(qū)之間的 序列同一性百分率為受試者和參考抗體區(qū)兩者中相同氨基酸占據(jù)的位置數(shù)除以兩區(qū)的總 比對位置數(shù)（不算空位），并且乘以100以換算成百分率。
[0144] 除了人源化抗體之外，完整人類抗體可直接使用本領(lǐng)域中的已知多種技術(shù)制備。 可產(chǎn)生體外免疫接種的永生化人類B淋巴細(xì)胞或從針對目標(biāo)抗原產(chǎn)生抗體的免疫接種的 個體單離的永生化人類B淋巴細(xì)胞（參閱，例如，Cole et al·，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ；Boemer et al. , J. Immunol. 147 ： 86-95(1991);以及美國專利US5, 750, 373)。另，人類抗體可為選自噬菌體庫，其中所述噬 菌體庫表達(dá)人類抗體（參閱 Vaughan et al.，Nat.Biotech. 14 :309-314(1996) ;Sheets et al. , Proc. Nat'1. Acad. Sci. 95 :6157-6162 (1998) ；Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 :381 (1991);以及 Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581 (1991))。人類抗體亦可 在含有人類免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中制造，所述基因座能在免疫接種時于缺乏 內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生下產(chǎn)生完整庫的人類抗體。此方法描述于美國專利第5, 545, 807 ; 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;以及 5, 661，016 號。
[0145] 本發(fā)明亦涵蓋雙特異性抗體。雙特異性抗體為能特異性地識別和結(jié)合至少兩種不 同表位的抗體。不同表位可在相同分子內(nèi)（例如，流行性感冒HA)或在不同分子上，致使雙 特異性抗體可特異性地辨識和結(jié)合感興趣的抗原中的表位（例如，流行性感冒HA)以及， 例如，另一種病毒蛋白質(zhì)（例如，神經(jīng)氨酸酶、M2等）。雙特異性抗體可為完好抗體或抗體 片段。制造雙特異性抗體的技術(shù)為本領(lǐng)域中常見者（參閱Millstein et al.，Nature305: 537-539(1983) ；Brennan et al.,Science229：81 (1985) ；Suresh et al, Methods in Enzymol. 121 ： 1 (1986) ；Traunecker et al. , ΕΜΒ0 J. 10 :3655-3659(1991) ；Shalaby et al. , J. Exp. Med. 175 :217-2 (1992) ；Kostelny etal. , J. Immunol. 148 ： 1547-1553 (1992)； Gruber et al.，J. Immunol. 152 :5368 (1994);以及美國專利第 5,731，168 號）。亦預(yù)期具 有超過兩個配價的抗體。例如，可制備三特異性抗體（參閱Tutt et al.，J. Immunol. 147 : 60(1991))。
[0146] 于具體實施例中，本發(fā)明的抗體為抗體片段。已知有多種產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)：傳 統(tǒng)上，此等片段經(jīng)由蛋白水解消化完好抗體而衍生（參閱，例如，Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods24 ： 107-117(1993)；以及 Brennan et al.，Science229:81(1985))?？贵w片段亦可重組地產(chǎn)生。Fab、Fv以及scFv抗體片段皆可 于大腸桿菌或其它宿主細(xì)胞中表達(dá)或從其分泌，因此允許生產(chǎn)大量的此等片段。此抗體片 段亦可從上述的抗體噬菌體庫分離?？贵w片段亦可為，例如，美國專利第5, 641，870號中描 述的線性抗體，而且可為單特異性或雙特異性。其它生產(chǎn)的抗體片段的技術(shù)將對本領(lǐng)域技 術(shù)人員而目是容易顯而易見的。
[0147] 根據(jù)本發(fā)明，可修改技術(shù)以生產(chǎn)對本發(fā)明的多肽有特異性的單鏈抗體（參 閱美國專利第4,946,778號）。此外，可修改方法以構(gòu)筑Fab表達(dá)庫（參閱Huse et al·，Science246 :1275-1281 (1989))，以允許快速和有效辨識對流行性感冒HA有期望的特 異性的單克隆Fab片段。可通過本領(lǐng)域中的技術(shù)產(chǎn)生含有本發(fā)明的多肽的獨特型的抗體片 段，所述抗體片段包含，但非限于：（a)通過胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生的F(ab'）2片段； (b)通過還原F(ab'）2片段的雙硫橋而產(chǎn)生的Fab片段；（c)通過以木瓜蛋白酶和還原劑處 理抗體分子而產(chǎn)生的Fab片段；以及（d)Fv片段。
[0148] 可進一步期望，尤其是在抗體片段的情況下，改性抗體以增加其血清半衰期。這可 通過，例如，將補救受體結(jié)合表位以使抗體片段中的適當(dāng)區(qū)突變的方式并入抗體片段，或?qū)?表位并入接著以端或中間點融合抗體片段（例如，通過DNA或肽合成）的肽標(biāo)記而達(dá)成。
[0149] 異種偶聯(lián)抗體亦落入本發(fā)明的范疇。異種偶聯(lián)抗體是由兩個共價連結(jié)抗體所組 成。已提議用此抗體以例如使免疫細(xì)胞以無用細(xì)胞為目標(biāo)（美國專利第4, 676, 980號）。 預(yù)期抗體可使用已知的合成蛋白質(zhì)化學(xué)的方法體外制備，包含那些涉及交聯(lián)劑的方法。例 如，免疫毒素可使用雙硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵而構(gòu)筑。用于此目的適合試劑的 實例包含亞氨基硫醇酯和甲基-4-巰基丁酰亞氨酸酯。
[0150] 本發(fā)明預(yù)期的另一個變化為重鏈和輕鏈兩者中的可變結(jié)構(gòu)域以一個或多個CDR 的至少部分置換而改變，而且若需要，通過部分骨架區(qū)置換和序列改變而改變。雖然CDR可 衍生自與從其中衍生骨架區(qū)的抗體屬于相同類別或甚至子類的抗體，預(yù)知CDR將衍生自不 同類別的抗體和優(yōu)選地衍生自不同物種的抗體?？赡懿恍枰詠碜怨w可變區(qū)的完整CDR 置換所有CDR以將一個可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移成另一者。而是，可能只需要將那 些需要維持抗原結(jié)合位點的活性的殘基者轉(zhuǎn)移。有鑒于美國專利第5, 585, 089、5, 693, 761 以及5, 693, 762號所載說明，進行常規(guī)實驗或通過嘗試錯誤試驗而獲得具有獲得減少免疫 原性的功能抗體將在那些本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
[0151] 雖然可變區(qū)有變化，那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到本發(fā)明的改性抗體可包括抗體 或其免疫反應(yīng)性片段，其中當(dāng)與具有包括天然或未變化的恒定區(qū)的大約相同免疫原性的抗 體比較時，一個或多個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的至少小部分已缺失或變化以便提供期望的生化的特 征，諸如，增加腫瘤局部化或減少血清半衰期。于一些具體實施例中，改性抗體的恒定區(qū)將 包括人類恒定區(qū)。與本發(fā)明兼容的恒定區(qū)的改性包括一個或多個結(jié)構(gòu)域中的一個或多個 氨基酸的添加、缺失或取代。亦即，本文揭露的改性抗體可包括三個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域（CH1、 CH2或CH3)及/或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域（CL)的一者或多者的變化或改性。于本發(fā)明的一些具 體實施例中，預(yù)期其中一個或多個結(jié)構(gòu)域部分地或全部地缺失的改性恒定區(qū)。于一些具體 實施例中，改性抗體將包括結(jié)構(gòu)域缺失的構(gòu)筑物或變異體，其中整個CH2結(jié)構(gòu)域已被移除 (ACH2構(gòu)筑物）。于一些具體實施例中，省略的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域?qū)⒁蕴峁┮恍┑湫陀扇狈?定區(qū)展現(xiàn)的分子柔度的短氨基酸間隔物（例如，10個殘基）置換。
[0152] 本發(fā)明進一步采用實質(zhì)上與本文表示的嵌合、人源化以及人類抗體或其抗體片段 實質(zhì)上同源的變異體和相等者。這些可含有，例如，保守取代突變，亦即，以相似的氨基酸取 代一個或多個氨基酸。例如，保守取意指以相同一般類別內(nèi)的其它者取代的氨基酸，諸如， 例如，一個酸性氨基酸以另一個酸性氨基酸取代，一個堿性氨基酸以另一個堿性氨基酸取 代，或一個中性氨基酸以另一個中性氨基酸取代。所謂保守氨基酸取代的含義為本領(lǐng)域中 周知者。
[0153] 可以本領(lǐng)域中已知的任何方法檢測本發(fā)明的抗體的免疫特異性結(jié)合?？墒褂玫?免疫檢測法包含，但非限于，使用技術(shù)諸如BIAcore分析、FACS分析、免疫熒光、免疫細(xì)胞化 學(xué)、免疫印跡法、放射性免疫檢測法、ELISA、〃三明治〃免疫檢測法、免疫沉淀檢測法、沉淀 素反應(yīng)、凝膠擴散沉淀素反應(yīng)、免疫擴散檢測法、凝集檢測法、補體固定檢測法、免疫放射分 析檢測法、熒光免疫檢測法、蛋白質(zhì)A免疫檢測法等的競爭和非競爭檢測法系統(tǒng)。此檢測法 為常規(guī)而且為本領(lǐng)域中周知者（參閱，例如，Ausubel et al，eds, 1994, Current Protocols in MolecularBiology，Vol.l，John Wiley&Sons，Inc.，New York，其是以參考方式全部并入 本文）。
[0154] 于具體實施例中，針對流行性感冒HA的抗體的免疫特異性是使用ELISA測定。 ELISA檢測法包括制備抗原，以抗原涂布微孔板的孔、在孔中添加與抗體偶聯(lián)的可檢測的 化合物諸如酶物質(zhì)（例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶），培養(yǎng)一段時期以及檢測抗原 的存在。于一些具體實施例中，抗體非與可檢測化合物偶聯(lián)，但而是在孔中添加識別針對 流行性感冒HA抗原的抗體的第二偶聯(lián)抗體。于一些具體實施例中，不是以抗原涂布孔， 而是可涂布抗體，而且可在涂布的孔中添加抗原后，添加與可檢測的化合物偶聯(lián)的第二 抗體。本領(lǐng)域中技術(shù)人員會了解可修改參數(shù)以增加偵測的信號以及其它本領(lǐng)域中已知 的 ELISA 變化（參閱例如，Ausubel et al，eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1，John Wiley&Sons, Inc.，New York atll. 2. 1) 〇
[0155] 抗體與流行性感冒HA的結(jié)合親和力和抗體-抗原交互作用的解離速率可通過競 爭結(jié)合檢測法測定。競爭結(jié)合檢測法的一個實例為放射性免疫檢測法，其包括在增加量的 未標(biāo)示的抗原的存在下，培養(yǎng)標(biāo)示的抗原（例如， 3H或1251)或其片段或變異體與感興趣的 抗體，接著偵測與標(biāo)示的抗原結(jié)合的抗體?？贵w與抗原的親和力和結(jié)合解離速率可從斯卡 查德（scatchard)圖分析的數(shù)據(jù)測定。于一些具體實施例中，BIAcore動力分析是用以測 定抗體與癌癥干細(xì)胞標(biāo)記物的結(jié)合和解離速率。BIAcore動力分析包括分析抗體與在其表 面上有固相化癌癥干細(xì)胞標(biāo)記物抗原的芯片的結(jié)合與分尚。
[0156] 流行性感冒血凝素抗體多肽和多核苷酸
[0157] 本發(fā)明亦涵蓋單離的多核苷酸，其編碼包括流行性感冒血凝素（HA)抗體或其片 段的多肽。
[0158] 術(shù)語〃編碼多肽的多核苷酸〃涵蓋僅包含多核苷酸的編碼序列以及包含另外的編 碼及/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可為RNA形式或DNA形式。DNA包含 cDNA、基因組DNA以及合成DNA ;以及可為雙鏈或單鏈，以及若為單鏈，則可為編碼鏈或非編 碼（反義）鏈。
[0159] 本發(fā)明進一步有關(guān)多核苷酸的變異體，例如，片段、類似物以及衍生物。多核苷酸 的變異體可為多核苷酸的天然存在的等位基因變異體或多核苷酸的非天然存在的變異體。 于某些具體實施例中，多核苷酸可具有為揭露的多肽的編碼序列的天然存在的等位基因變 異體的編碼序列。如本領(lǐng)域中已知，等位基因變異體為具有，例如，一個或多個核苷酸的取 代、缺失或添加的多核苷酸序列的替代的形式，而且不會實質(zhì)上改變編碼的多肽的功能。
[0160] 于具體實施例中，多核苷酸可包括與協(xié)助例如多肽的表達(dá)和其從宿主細(xì)胞分泌 (例如，作用為控制多肽從細(xì)胞傳送的分泌序列的前導(dǎo)序列）的多核苷酸以相同閱讀框融 合的成熟多肽的編碼序列。多肽具有為前蛋白的前導(dǎo)序列，且所述前導(dǎo)序列可被宿主切斷 細(xì)胞以形成成熟形式的多肽。多核苷酸亦可編碼為成熟蛋白質(zhì)加上另外的5'氨基酸殘基 的原蛋白。具有的原序列的成熟蛋白質(zhì)為原蛋白，為且失活形式的蛋白質(zhì)。一旦原序列被 斷裂，則剩下活性成熟蛋白質(zhì)。
[0161] 于具體實施例中，多核苷酸可包括與允許例如純化編碼的多肽的標(biāo)記物序列以相 同閱讀框融合的成熟多肽的編碼序列。例如，標(biāo)記物序列可為由PQE-9載體所供應(yīng)的六組 氨酸標(biāo)記，以在細(xì)菌宿主的情況下提供與標(biāo)記物融合的成熟多肽的純化，或當(dāng)使用哺乳動 物宿主（例如，C0S-7細(xì)胞）時標(biāo)記物序列可為衍生自流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的血凝素 (HA)標(biāo)記。另外的標(biāo)記包含，但非限于，Calmodulin標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、Myc標(biāo)記、S標(biāo)記、SBP 標(biāo)記、軟標(biāo)記（Softage) 1、軟標(biāo)記3、V5標(biāo)記、Xpress標(biāo)記、Isopep標(biāo)記、Spy標(biāo)記、生物素、 竣基載體蛋白質(zhì)（BCCP)標(biāo)記、GST標(biāo)記、突光蛋白質(zhì)標(biāo)記（例如，綠色突光蛋白質(zhì)標(biāo)記）、麥 芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)標(biāo)記、Nus標(biāo)記、Strep-標(biāo)記、硫氧還蛋白標(biāo)記、TC標(biāo)記、Ty標(biāo)記等。
[0162] 于具體實施例中，本發(fā)明提供單離的核酸分子，其具有與編碼包括本發(fā)明的流行 性感冒HA抗體或抗體片段的多肽的多核苷酸具有為至少80%同一性，至少85%同一性，至 少90%同一性，至少95%同一性，或至少96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。
[0163] 所謂多核苷酸具有，例如，與參考核苷酸序列具有為至少95%"同一'丨生〃的核苷酸 序列意指多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同，但針對參考核苷酸序列的每各1〇〇核苷 酸，所述多核苷酸序列可包含最多五個點突變。換句話說，為了獲得具有與參考核苷酸序列 具有為至少95%同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中高達(dá)5%核苷酸可缺失或以其 它核苷酸取代，或參考序列中可插入所述參考序列中高達(dá)5%總核苷酸的一些核苷酸。參考 序列的此等突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的氨基或羧基端位置或在那些端位置之間的隨 處，所述突變是在參考序列中的核苷酸之間個別穿插或在參考序列內(nèi)的一個或多個鄰接的 基團中穿插。
[0164] 作為一個實際的問題，可傳統(tǒng)上使用已知計算機程序測定，諸如最佳適 配程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version8for Unix,Genetics Group，University Research Park, 575Science Drive，Madison，WI53711)任何特別核 酸分子是否與參考序列為具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性，以及 于一些具體實施例中，至少95%、96%、97%、98%或99%同一性。最佳適配使用Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics2 :482489(1981)的局部同源性算法，以得到 兩個序列之間的同源性的最佳區(qū)段。當(dāng)使用最佳適配或任何其它序列比對程序測定特別序 列是否與根據(jù)本發(fā)明的參考序列具有，例如，95%同一性時，參數(shù)是設(shè)定成計算參考核苷酸 序列的全長的同一性百分率，并且允許同源性中的空位為高達(dá)5%的參考序列中的核苷酸 總數(shù)。
[0165] 多核苷酸變異體可含有編碼區(qū)、非編碼區(qū)或兩者中的變化。于一些具體實施例中， 多核苷酸變異體含有產(chǎn)生靜止取代（silent substitution)、添加或缺失的變化，但不會改 變編碼多肽的性質(zhì)或活性。于一些具體實施例中，由于遺傳密碼的簡并性，核苷酸變異體是 由靜止取代產(chǎn)生。多核苷酸變異體可因各種原因產(chǎn)生，例如，最優(yōu)化特別宿主的密碼子表達(dá) (將人類mRNA中的密碼子改成那些細(xì)菌宿主諸如大腸桿菌者首選者）。
[0166] 本發(fā)明的多肽可為對抗流行性感冒HA的重組多肽、天然多肽、或包括抗體的合成 多肽或其片段，本領(lǐng)域?qū)⒆R別本發(fā)明的一些氨基酸序列可變異，但對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能 無顯著效果。因此，本發(fā)明進一步包含顯示對流行性感冒HA有實質(zhì)活性或包含人源化抗體 或其片段的多肽的變異。此突變體包含缺失、插入、倒位、重復(fù)和類型取代。
[0167] 多肽和類似物可進一步改性以含有通常并非蛋白質(zhì)的一部分的另外的化學(xué)部 分。那些衍生的部分可改善蛋白質(zhì)的溶解度、生物半衰期或吸收。所述部分亦可減少或消 除蛋白質(zhì)等的任何期望副作用。Remington's Pharmaceutical Sciences, Sciences, 20th ed·，Mack Publishing Co·, Easton, PA (2000)中可找到那些部分的概觀。
[0168] 本文中的單離的多肽可描述為由任何本領(lǐng)域中已知的適合方法產(chǎn)生。此方法的 范圍是從直接蛋白質(zhì)合成方法至構(gòu)筑編碼單離的多肽序列的DNA序列和在適合的轉(zhuǎn)化宿 主中表達(dá)那些序列的方法。于一些具體實施例中，通過單離或合成編碼感興趣的野生型蛋 白質(zhì)的DNA序列，而使用重組技術(shù)構(gòu)筑DNA序列。視需要地，序列可通過位點特異性突變 誘變，以提供其功能類似物。參閱，例如，Zoeller et al.，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA81 : 5662-5066(1984)和美國專利第 4, 588, 585 號。
[0169] 于具體實施例中，編碼感興趣的多肽的DNA序列會通過使用寡核苷酸合成器進行 化學(xué)合成而構(gòu)筑。此寡核苷酸可基于期望多肽的氨基酸序列而設(shè)計，并且選擇在其中將產(chǎn) 生感興趣的重組多肽的宿主細(xì)胞中有利的那些密碼子。可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法以合成編碼感興趣 的單離的多肽的單離的多核苷酸序列。例如，完整氨基酸序列可用以構(gòu)筑回譯基因。又，可 合成含有編碼特別的單離的多肽的核苷酸序列的DNA寡聚體。例如，可合成編碼期望的多 肽的小部分的許多小寡核苷酸，接著將其連接。個別的寡核苷酸典型含有5'或3'單鏈突 出（overhang)端以進行互補組裝。
[0170] 一旦組裝（例如，通過合成、位點引導(dǎo)突變或其它方法），編碼單離的特別感興趣 的多肽的多核苷酸序列將插置入表達(dá)載體，并且視需要地與適合在期望的宿主中表達(dá)蛋白 質(zhì)的表達(dá)控制序列操作鏈接。適當(dāng)組裝可通過核苷酸定序、限制性酶切作圖以及在適合宿 主中表達(dá)生物活性多肽而確認(rèn)。如本領(lǐng)域中周知，為了在宿主中獲得高表達(dá)水平的轉(zhuǎn)染基 因，基因可與在選擇的表達(dá)宿主中有功能性的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)控制序列。
[0171] 重組表達(dá)載體用以擴增和表達(dá)編碼流行性感冒HA抗體的DNA。重組表達(dá)載體為 具有編碼流行性感冒HA抗體的合成或衍生自cDNA的DNA片段或生物相等類似物的可復(fù)制 DNA構(gòu)筑物，所述生物相等類似物操作鏈接衍生自哺乳動物、微生物、病毒或病毒基因的適 合轉(zhuǎn)錄或翻譯的調(diào)節(jié)組件。轉(zhuǎn)錄單元通常包括以下者的組合：（1)基因組件或在基因表達(dá) 中具有調(diào)節(jié)角色的組件，例如，轉(zhuǎn)錄啟動子或增強子，（2)轉(zhuǎn)錄成mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)的結(jié) 構(gòu)或編碼序列，以及（3)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止序列，如以下詳述。此調(diào)節(jié)組件可包 含控制轉(zhuǎn)錄的操作子或序列。在宿主中復(fù)制的能力通常是由復(fù)制的原點所賦予，而且可另 外并入促進轉(zhuǎn)化體的辨識的選擇基因。當(dāng)DNA區(qū)彼此功能性相關(guān)時，是操作鏈接的。例如， 若信號肽（分泌前導(dǎo)物）的DNA表達(dá)為參與多肽的分泌的前驅(qū)體時，則其與多肽的DNA操 作鏈接；若啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，則其與編碼序列操作鏈接；或若核糖體結(jié)合位點定位 成以允許翻譯，則其與編碼序列操作鏈接。一般，操作鏈接表示鄰近，而且在分泌前導(dǎo)物的 情況下，表示鄰接且在閱讀框中。意欲用于酵母表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組件包含前導(dǎo)序列，使得宿 主細(xì)胞能細(xì)胞外分泌翻譯的蛋白質(zhì)?；蛘撸?dāng)表達(dá)重組蛋白質(zhì)，但無前導(dǎo)或傳送序列時，其 可包含N-端甲硫氨酸殘基。后來，此殘基可視需要地從表達(dá)的重組蛋白質(zhì)斷裂，以提供最 終產(chǎn)物。
[0172] 表達(dá)控制序列和表達(dá)載體的選擇將取決于宿主的選擇?？刹捎脧V泛多種的表達(dá)宿 主/載體組合。真核宿主的有用表達(dá)載體包含，例如，包括來自SV40、牛乳突病毒、腺病毒以 及巨細(xì)胞病毒的表達(dá)控制序列的載體。細(xì)菌宿主的有用表達(dá)載體包含已知細(xì)菌質(zhì)體，諸如 來自大腸桿菌的質(zhì)體，包含pCRl、pBR322、pMB9以及其衍生物、更廣的宿主范圍質(zhì)體，諸如， M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。
[0173] 表達(dá)多肽的適合宿主細(xì)胞包含在適當(dāng)啟動子的控制下的原核生物、酵母、昆蟲或 更高真核細(xì)胞。原核生物包含格蘭氏陰性或格蘭氏陽性生物體，例如，大腸桿菌或桿菌 (Bacilli)。更高真核細(xì)胞包含哺乳動物來源的已建立的細(xì)胞系。亦采用不含細(xì)胞的翻 譯系統(tǒng)。適合與細(xì)菌、真菌、酵母以及哺乳動物細(xì)胞宿主共享的克隆化和表達(dá)載體為本領(lǐng) 域中周知（參閱 Pouwels et al·，Cloning Vectors :A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y. , 1985) 〇
[0174] 亦有利地采用多種哺乳動物或病毒細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以表達(dá)重組蛋白質(zhì)?？蛇M行重 組蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，因為此蛋白質(zhì)通常正確折疊，適當(dāng)?shù)馗男砸约巴耆?用。適合哺乳動物宿主細(xì)胞系的實例包含Gluzman(Cell23 :175，1981)描述的猴腎細(xì)胞 的C0S-7系和其它能表達(dá)適當(dāng)載體的細(xì)胞系，包含，例如，L細(xì)胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢 (CHO)、HeLa以及BHK細(xì)胞系。哺乳動物表達(dá)載體可包括非轉(zhuǎn)錄組件諸如復(fù)制的原點、適合 啟動子以及與待表達(dá)的基因鏈接的增強子以及其它5'或3'側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列、以及5'或 3'非翻譯的序列諸如需要的核糖體結(jié)合位點、多聚腺苷化位點、剪切供體以及受體位點、 以及轉(zhuǎn)錄終止序列。用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)是由Luckow and Summers, Bio/Technology6 :47(1988)評論。
[0175] 由轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可根據(jù)任何適合方法純化。此標(biāo)準(zhǔn)方法包含色譜法 (例如，離子交換、親和力以及尺寸篩分柱色譜法等）、離心、差異溶解度，或通過蛋白質(zhì)純 化用的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。親和力標(biāo)記諸如六組氨酸、麥芽糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域、流行性感冒病 毒膜序列、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等可附接至蛋白質(zhì)，以允許通過穿過適當(dāng)親和力柱而容易純 化。單離的蛋白質(zhì)亦可使用蛋白質(zhì)水解、核磁共振以及X射線結(jié)晶學(xué)等技術(shù)而物理地特性 化。
[0176] 例如，來自分泌重組蛋白質(zhì)入培養(yǎng)基的系統(tǒng)的上清液可使用商業(yè)可用蛋白質(zhì)濃縮 過濾器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超過濾單元先濃縮。此濃縮步驟之后，濃縮 物可施加于適合的純化基質(zhì)?；蛘?，可采用陰離子交換樹脂，例如，具有側(cè)二乙基氨基乙基 (DEAE)的基質(zhì)或物質(zhì)?；|(zhì)可為丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或其它常在蛋白質(zhì)純化 中采用的類型?；蛘?，可采用陽離子交換步驟。適合的陽離子交換劑包含包括磺酸丙基或 羧基甲基的多種不溶基質(zhì)。最后，可采用疏水性RP-HPLC介質(zhì)，例如，具有側(cè)甲基或其它脂 族基的二氧化硅凝膠，的一個或多個反相高效液相色譜法（RP-HPLC)步驟，以進一步純化 癌癥干細(xì)胞蛋白質(zhì)-Fc組合物。亦可采用一些或所有的前述純化步驟的多種組合以提供均 質(zhì)重組蛋白質(zhì)。
[0177] 細(xì)菌培養(yǎng)中產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)可通過，例如，從細(xì)胞團塊進行最初萃取，接著進行 濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻色譜法步驟的一者或多者而分離?？刹捎酶咝б合嗌?譜法（HPLC)進行最終純化步驟。重組蛋白質(zhì)的表達(dá)中采用的微生物細(xì)胞可通過任何便利 方法破壞，包含凍融循環(huán)、超聲處理、機械破壞，或使用細(xì)胞溶解劑。
[0178] 治療方法
[0179] 本發(fā)明提供治療或預(yù)防流行性感冒感染的方法。
[0180] 于方面中，本發(fā)明提供治療或預(yù)防有需要的受試者的流行性病毒感染的方法。所 述方法涉及對受試者給藥有效量的本文所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或含有所述 抗體或抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述治療或預(yù)防受試者的流行性感冒病毒感染的方法，包 含減少或緩和與感染相關(guān)的癥狀。
[0181] 于方面中，本發(fā)明提供中和有需要的受試者的流行性感冒病毒的方法。所述方法 涉及對受試者給藥有效量的本文所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或含有所述抗體或 抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法中和受試者的流行性感冒病毒，從而治療或預(yù)防受試者 的流行性感冒病毒感染，包含減少或緩和與感染相關(guān)的癥狀。
[0182] 于方面中，本發(fā)明提供在有需要的受試者中建立流行性感冒病毒感染的方法。所 述方法涉及對受試者給藥有效量的本文所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或含有所述 抗體或抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法在受試者中抑制流行性感冒病毒感染的建立，從 而預(yù)防與感染相關(guān)的癥狀。
[0183] 于方面中，本發(fā)明提供在抑制有需要的受試者的流行性感冒病毒感染的散播的方 法。所述方法涉及對受試者給藥有效量的本文所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或所 述含有抗體或抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法抑制受試者的流行性感冒病毒感染的散 播，從而減少或緩和與感染相關(guān)的癥狀。
[0184] 于方面中，本發(fā)明提供抑制流行性感冒病毒進入受試者中的細(xì)胞的方法。所述方 法涉及對受試者給藥有效量的本文所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或所述含有抗體 或抗體片段的醫(yī)藥組合物。所述方法抑制流行性感冒病毒進入受試者中的細(xì)胞，從而預(yù)防 與感染相關(guān)的癥狀或減少或緩和與感染相關(guān)的癥狀。
[0185] 于方面中，本發(fā)明提供抑制流行性感冒病毒進入細(xì)胞的方法。所述方法涉及使具 有流行性感冒病毒感染或有發(fā)展流行性感冒病毒感染的風(fēng)險的細(xì)胞與本文所述的抗流行 性感冒抗體或抗體片段或含有所述抗體或抗體片段的醫(yī)藥組合物接觸。所述方法抑制流行 性感冒病毒進入細(xì)胞。
[0186] 于任何以上方面，流行性感冒可為H1N1、H2N2、H3N2或適應(yīng)人類的H5病毒株。
[0187] 于以上方面中任一者，受試者具有流行性感冒感染或有發(fā)展流行性感冒感染的風(fēng) 險。于相關(guān)具體實施例中，受試者為哺乳動物（例如，人類）。于相關(guān)具體實施例中，受試者 易受病毒感染（例如，懷孕女性、年輕受試者或嬰兒受試者、老年受試者）。
[0188] 于任何以上方面和具體實施例中，抗流行性感冒抗體或抗體片段或醫(yī)藥組合物是 通過肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、或吸入而給藥。
[0189] 醫(yī)藥組合物
[0190] 本發(fā)明提供含有本文所述的新穎流行性感冒HA抗體的醫(yī)藥組合物。于具體實施 例中，醫(yī)藥組合物含有醫(yī)藥可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，而且包含本身不會對接受組合 物的受試者誘發(fā)有害的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生的任何醫(yī)藥劑，以及可在無過度毒性的情況下給 藥。如本文所使用，術(shù)語"醫(yī)藥可接受的"表示美國聯(lián)邦或州政府的監(jiān)管機關(guān)核準(zhǔn)或美國 藥典、歐洲藥典或其它通常認(rèn)可的藥典中所列用于哺乳動物，更特別于人類者。此等組合物 可有用于治療及/或預(yù)防流行性感冒感染。
[0191] RemingtonJ s Pharmaceutical Sciences (17th ed. , Mack Publishing Company) 和 Remington :The Science and Practice of Pharmacy(21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins)中呈現(xiàn)醫(yī)藥可接受的載體、稀釋劑以及其它賦形劑的深入探討，其特此 以參考方式并入。醫(yī)藥組合物的配方應(yīng)適合給藥的模式。于具體實施例中，醫(yī)藥組合物適 合對人類給藥，而且可為無菌、非顆粒及/或無致熱源。
[0192] 醫(yī)藥可接受的載體、賦形劑或稀釋劑包含，但非限于，食鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、 水、甘油、乙醇、無菌等滲水性緩沖液以及其組合。
[0193] 組合物中亦可存在濕潤劑、乳化劑以及潤滑劑諸如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂， 以及著色劑、脫模劑、涂布劑、甜味劑、調(diào)味劑以及芳香劑、防腐劑以及抗氧化劑。
[0194] 醫(yī)藥可接受的抗氧化劑的實例包含，但非限于：（1)水溶性抗氧化劑，諸如，抗壞 血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉等；（2)油溶性抗氧化劑、諸如， 抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚（BHA)、丁基化羥基甲苯（BHT)、卵磷脂、羥乙酸丙 酯、α-生育酚等；以及⑶金屬螯合劑，諸如，檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、山梨糖醇、酒 石酸、磷酸等。
[0195] 于具體實施例中，醫(yī)藥組合物是以固體形式提供，諸如，適合復(fù)水的凍干粉劑、液 體溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、緩釋型配方或粉劑。
[0196] 于具體實施例中，醫(yī)藥組合物是以液體形式提供，例如，在表示醫(yī)藥組合物中的活 性成分的含量和濃度的密封容器中。于相關(guān)具體實施例中，醫(yī)藥組合物的液體形式是以密 封的容器提供。
[0197] 調(diào)配本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的方法為傳統(tǒng)和本領(lǐng)域中周知者（參閱Remingtonand Remington's)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易調(diào)配具有期望特性（例如，給藥路徑、生物安全性以 及釋放外廓線）的醫(yī)藥組合物。
[0198] 制備醫(yī)藥組合物的方法包含使活性成分與醫(yī)藥可接受的載體和視需要地一種或 多種次要成分相關(guān)聯(lián)的步驟。醫(yī)藥組合物的制備可通過使活性成分與液體載體或微細(xì)固 體載體或兩者均勻地和直接地相關(guān)聯(lián)，接著，若需要，使產(chǎn)物成型。制備醫(yī)藥組合物的另外 的方法包含多層劑量形式的制備在Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (9th ed.，Lippincott Williams&Wilkins)中描述，其特此以參考方式 并入。
[0199] 遞送方法
[0200] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可通過口服和非經(jīng)口的方式（例如，局部地、經(jīng)皮地、或通 過注射）而對受試者給藥。此給藥的模式和制備在其中使用的適當(dāng)醫(yī)藥組合物的方法 在 Gibaldi, s Drug Delivery Systems in Pharmaceutical Care(1st ed. , American Society' s Health-System Pharmacists)中描述，其特此以參考方式并入。
[0201] 于具體實施例中，醫(yī)藥組合物是以固體形式口服給藥。
[0202] 適合口服給藥的醫(yī)藥組合物可為膠囊、扁囊劑、丸劑、片劑、菱形錠劑（使用矯味 的基底，通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠）、粉劑、粒劑的形式，或作為水性或非水性液 體的溶液或懸浮液，或作為水包油或油包水的液體乳劑，或作為酏劑或糖楽劑，或作為錠劑 (使用惰性基底，諸如，明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯樹膠）及/或作為漱口水等，各含有預(yù) 測定量的本文所述的化合物、其衍生物或醫(yī)藥可接受的鹽或其前藥作為活性成分。活性成 分亦可以團狀物、沖劑或糊劑的方式給藥。
[0203] 于口服給藥的固體劑量形式（例如，膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸劑、粉劑、粒劑等） 中，活性成分與一種或多種醫(yī)藥可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，諸如，檸檬酸鈉或磷酸氫 隹丐及/或以下任一者混合：（1)填料或增量劑，諸如，淀粉、乳糖、鹿糖、葡萄糖、甘露糖醇及 /或硅酸；（2)粘合劑，諸如，例如，羧基甲基纖維素、海藻酸酯、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖 及/或阿拉伯樹膠；（3)保濕劑，諸如，甘油；(4)崩解劑，諸如，瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、土豆或 木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽以及碳酸鈉；（5)溶液緩聚劑，諸如，石蠟；(6)吸收加速劑， 諸如，四級銨化合物；（7)濕潤劑，諸如，例如，乙酰醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，諸如， 高嶺土和膨潤土； (9)潤滑劑，諸如，滑石，硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫 酸鈉、以及其混合物；以及（10)著色劑。膠囊、片劑以及丸劑的情況下，醫(yī)藥組合物亦可包 括緩沖劑。相似的類型的固體組合物的亦可在夾心軟和夾心硬明膠膠囊中使用填料、以及 賦形劑諸如乳糖或乳糖、以及高分子重量聚乙二醇等制備。
[0204] 片劑可通過視需要地與一種或多種次要成分壓縮或模塑而制造。壓縮片劑可通過 使用粘合劑（例如，明膠或羥基丙基甲基纖維素）、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑（例 如，糖化鈉淀粉或交聯(lián)羧基甲基纖維素鈉）、表面活化劑、及/或分散劑而制備。模塑片劑可 通過在適合機器中將濡惰性液體稀釋劑的粉狀活性成分的混合物模塑而制成。
[0205] 片劑和其它固體劑量形式，諸如，糖衣丸劑、膠囊、丸劑以及粒劑、可視需要地刻痕 (score)或與涂層和外殼制備，諸如腸涂層和其它本領(lǐng)域中周知的涂層。
[0206] 亦可調(diào)配醫(yī)藥組合物以便提供活性成分的緩慢、延長或控釋，所述活性成分中使 用，例如，不同比例的羥基丙基甲基纖維素以提供期望的釋放外廓線、其它聚合體基質(zhì)、月旨 質(zhì)體及/或微球體。醫(yī)藥組合物亦可視需要地含有乳濁劑和可為視需要地，以延遲的方式， 于胃腸道的某些部分，僅釋放或優(yōu)先釋放活性成分的組合物。包埋組合物的實例包含聚合 體物質(zhì)和蠟。若適當(dāng)，活性成分亦可為與本領(lǐng)域中周知的一種或多種醫(yī)藥可接受的載體、賦 形劑或稀釋劑成為微包囊形式（參閱，例如，Remington and Remington' s)。
[0207] 醫(yī)藥組合物可通過，例如，過濾通過使細(xì)菌留存的過濾器，或并入可溶解于無菌水 的無菌固體組合物形式的滅菌劑，或在使用前即并入一些其它無菌可注射介質(zhì)而滅菌。
[0208] 于具體實施例中，醫(yī)藥組合物是以液體形式口服給藥。
[0209] 口服給藥活性成分的液體劑量形式包含醫(yī)藥可接受的乳劑、微乳劑、溶液、懸浮 液、糖漿劑以及酏劑。除了活性成分之外，液體劑量形式還可含有本領(lǐng)域中常用的惰性稀 釋劑，諸如，例如，水或其它溶劑、增溶劑以及乳化劑，諸如，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙 酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、油（特別為棉籽油、花生油、玉米油、胚芽 油、橄欖油、蓖麻油以及芝麻油）、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇以及山梨聚糖的脂肪酸酯以 及其混合物。除了惰性稀釋劑之外，液體醫(yī)藥組合物還可包含佐劑，諸如，濕潤劑、乳化劑、 懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、芳香劑以及防腐劑等。
[0210] 除了活性成分之外，懸浮液還可含有懸浮劑，諸如，但非限于，乙氧基化異硬脂醇、 聚氧乙烯山梨糖醇以及山梨聚糖酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂-瓊脂以及黃 蓍膠、以及其混合物。
[0211] 于具體實施例中，醫(yī)藥組合物是通過非經(jīng)口的方式給藥，諸如，通過局部施用、經(jīng) 皮施用、注射等。于相關(guān)具體實施例中，醫(yī)藥組合物通過注射、注入或植入（例如，靜脈內(nèi)、 肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下等）腸道外給藥。
[0212] 非腸道使用的組合物可以單元劑量形式呈現(xiàn)，例如，含有許多劑量的安瓿或小玻 璃瓶，而且可在其中添加適合的防腐劑。此組合物可為溶液、懸浮液、乳劑、注入器件、植入 用遞送器件的形式，或其可呈現(xiàn)為待使用之前以水或其它適合載液復(fù)水的干粉劑。亦可采 用一種或多種共同載液，諸如乙醇。除了活性成分之外，組合物還可含有可并入微球體、微 膠囊、納米粒子、脂質(zhì)體等進行控釋的適合的腸道外可接受的載體及/或賦形劑或活性成 分。此外，組合物亦可含有懸浮劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)整劑及/或分散劑。
[0213] 醫(yī)藥組合物可為無菌注射的形式?；钚猿煞秩芙饣驊腋∮谀c道外可接受的液體 載液，以制備此組合物。例示性載液和溶劑包含，但非限于，水、通過添加適當(dāng)量的鹽酸、 氫氧化鈉或適合的緩沖液而調(diào)整至適合的pH的水、1，3_ 丁二醇、林格溶液（Ringer' s solution)以及等滲氯化鈉溶液。醫(yī)藥組合物亦可含有一種或多種防腐劑，例如，對羥苯甲 酸甲酯、對羥苯甲酸乙酯或?qū)αu苯甲酸正丙酯?？商砑尤芙庾饔迷鰪娀蛟鋈軇?，或溶劑可含 有10至60%重量/重量的丙二醇等，以改善溶解度。
[0214] 醫(yī)藥組合物可含有一種或多種醫(yī)藥可接受的無菌等滲水性或非水性溶液、分散 液、懸浮液或乳劑或可在使用前即復(fù)水成無菌可注射溶液或分散液的無菌粉劑。此醫(yī)藥組 合物可含有抗氧化劑；緩沖液；抑菌劑；用意欲接受者的血液使配方為等滲的溶質(zhì)；懸浮 齊U;增稠劑；防腐劑；等。
[0215] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中可采用的適合的水性和非水性載體的實例包含水、乙醇、 多元醇（諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）和其適合的混合物、植物油諸如橄欖油、以及可注 射的有機酯諸如油酸乙酯。適當(dāng)流動性可通過，例如，使用涂布物料諸如卵磷脂而維持，通 過在分散液的情況下維持所需顆粒的尺寸而維持，以及通過使用表面活性劑而維持。
[0216] 于一些具體實施例中，期望減慢對來自皮下或肌內(nèi)注射的化合物的吸收，以延長 活性成分的功效。這可通過使用具有差水溶解度的晶質(zhì)或非晶質(zhì)物料的液體懸浮液而完 成。接著，活性成分的吸收速率是取決于其溶解速率，順次，可取決于結(jié)晶尺寸和晶質(zhì)形式。 或者，腸道外給藥的活性成分的延遲吸收是通過將化合物溶解或懸浮于油載液而完成。此 夕卜，可注射的醫(yī)藥形式的延長吸收可由包含延遲吸收的劑諸如單硬脂酸鋁和明膠而導(dǎo)致。.
[0217] 控釋的非腸道組合物可為水性懸浮液、微球體、微膠囊、磁性微球體、油溶液、油懸 浮液、乳劑的形式，或活性成分可并入生物兼容性載體、脂質(zhì)體、納米粒子、植入物或注入器 件。
[0218] 用于制備微球體及/或微膠囊的物料包含生物可降解/生物可腐蝕聚合體諸如， 聚交酯、聚（氰丙烯酸異丁酯）、聚（2_羥基乙基-L-谷氨酰胺）以及聚（乳酸）。
[0219] 當(dāng)調(diào)配控釋的非腸道配方時可使用的生物兼容性載體包含碳水化合物諸如，葡聚 糖、蛋白質(zhì)諸如白蛋白、脂蛋白或抗體。
[0220] 用于植入物的物料可為非生物可降解，例如，聚二甲基硅氧烷，或生物可降解諸 如，例如，聚（己內(nèi)酯）、聚（乳酸）、聚（乙醇酸）或聚（原酸酯）。
[0221] 于具體實施例中，活性成分通過氣溶膠給藥。通過制備水性氣溶膠、脂質(zhì)體制劑、 或含有所述化合物的固體顆粒而完成。可使用非水性（例如，氟碳推進劑）懸浮液。醫(yī)藥 組合物亦可使用聲波噴霧器給藥，所述聲波噴霧器會使劑暴露于剪力最小化，可造成化合 物的降解。
[0222] 平常，通過共同調(diào)配活性成分的水性溶液或懸浮液的與傳統(tǒng)醫(yī)藥可接受的載體和 穩(wěn)定劑而制造水性氣溶膠。載體和穩(wěn)定劑隨著特別化合物的需求而改變，但典型包含非離 子性表面活性劑（Tweens, Pluronics，或聚乙二醇）、無害蛋白質(zhì)諸如血清白蛋白、山梨聚 糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸諸如甘氨酸、緩沖液、鹽、糖或糖醇。氣溶膠通常從等滲溶液制 備。
[0223] 局部或經(jīng)皮給藥活性成分的劑量形式包含粉劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、霜劑、洗 齊U、凝膠、溶液、貼劑以及吸入劑。適當(dāng)時，活性成分可在無菌條件下與醫(yī)藥可接受的載體、 及與任何防腐劑、緩沖液或推進劑混合。
[0224] 適合用于本發(fā)明的經(jīng)皮貼劑揭露于Transdermal Drug Delivery:Developmental Issues and Research Initiatives(Marcel Dekker Inc. , 1989)和美國專利第 4, 743, 249、4, 906, 169、5, 198, 223、4, 816, 540、5, 422, 119、5, 023, 084 號，其特此以參考方 式并入。經(jīng)皮貼劑亦可為本領(lǐng)域中周知的任何經(jīng)皮貼劑，包含經(jīng)陰囊貼劑。此經(jīng)皮貼劑中 的醫(yī)藥組合物可含有一種或多種本領(lǐng)域中周知的吸收增強劑或皮膚滲透增強劑（參閱，例 如，美國專利第4, 379, 454和4, 973, 468號，其特此以參考方式并入）。用于本發(fā)明經(jīng)的皮 治療系統(tǒng)可基于離子透入、擴散、或此兩種效果的組合。
[0225] 經(jīng)皮貼劑具有對活性成分提供控制遞送至身體的增加的優(yōu)點。此劑量形式可通過 在適當(dāng)介質(zhì)中溶解或分散活性成分而進行。吸收增強子亦可用以增加活性成分橫跨皮膚的 通量。此通量的速率可通過提供速率控制膜片或?qū)⒒钚猿煞址稚⒂诰酆象w矩陣或凝膠劑中 而控制。
[0226] 此醫(yī)藥組合物可為霜劑、軟膏劑、洗劑、搽劑、凝膠、水凝膠、溶液、懸浮液、粘著劑、 噴霧劑、糊劑、硬膏劑以及其它種類的經(jīng)皮藥物遞送系統(tǒng)的形式。組合物亦可包含醫(yī)藥可接 受的載體或賦形劑諸如乳化劑、抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、保濕劑、穿透增強劑、螯合劑、凝 膠形成劑、軟膏劑基底、香料以及皮膚保護劑。
[0227] 乳化劑的實例包含，但非限于，天然存在的膠，例如，阿拉伯樹膠或黃蓍膠、天然存 在的磷脂酸，例如，黃豆卵磷脂以及山梨聚糖單油酸酯衍生物。
[0228] 抗氧化劑的實例包含，但非限于，丁基化羥基茴香醚（BHA)、抗壞血酸以及其衍生 物、生育酚以及其衍生物、以及半胱氨酸。
[0229] 防腐劑的實例包含，但非限于，對羥基苯甲酸酯，諸如，對羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯 甲酸丙酯以及氯化芐二甲烴銨。
[0230] 保濕劑的實例包含，但非限于，甘醇、丙二醇、山梨糖醇以及脲。
[0231] 穿透增強劑的實例包含，但非限于，丙二醇、DMS0、三乙醇胺、N，N_二甲基乙酰胺、 N，N-二甲基甲酰胺、2-吡咯啶酮以及其衍生物、四氫糠醇、丙二醇、具有丙二醇單月桂酸 酯或月桂酸甲酯的二乙二醇單乙基醚或二乙二醇單甲基醚、桉油精、卵磷脂、還氧二元醇 (Transcutof 8)以及阿佐恩（商品名）（Azone?)〇
[0232] 螯合劑的實例包含，但非限于，EDTA鈉、檸檬酸以及磷酸。
[0233] 凝膠形成劑的實例包含，但非限于，卡波普、纖維素衍生物、膨潤土、海藻酸酯、糖 漿劑以及聚乙烯吡咯啶酮。
[0234] 除了活性成分之外，本發(fā)明的軟膏劑、糊劑、霜劑以及凝膠還可含有賦形劑，諸如， 動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、膨潤土、 硅酸、滑石以及氧化鋅或其混合物。
[0235] 粉劑和噴霧劑可含有賦形劑，諸如，乳糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣以及聚酰 胺粉劑或此等物質(zhì)的混合物。噴霧劑可另外含有慣用推進劑，諸如，氯氟烴和揮發(fā)性未經(jīng)取 代的烴諸如丙烷和丙烷。
[0236] 可注射的補給形式是通過在生物可降解聚合體中形成本發(fā)明的化合物的微包覆 基質(zhì)而形成，諸如，聚交酯-聚乙醇酸交酯。取決于化合物與聚合體的比率和采用的特別聚 合體的本質(zhì)，可控制釋放的化合物的速率。其它生物可降解聚合體的實例包含聚（原酸酯） 和聚（酐）。補給可注射的配方亦可通過以與身體組織兼容的脂質(zhì)體或微乳劑包埋藥物而 制備。
[0237] 皮下植入物為本領(lǐng)域中周知者，而且適合用于本發(fā)明。皮下植入方法優(yōu)選為非刺 激性和有機械彈性。植入物可為基質(zhì)類型、儲存槽類型或其雜合體。于基質(zhì)類型器件中，載 體物料可為多孔或非多孔、固體或半固體，以及可透或不可透活性化合物或化合物。給藥之 后，載體物料可為生物可降解，或可緩慢腐蝕。于某些情況下，基質(zhì)是非可降減，且反而是仰 賴于活性化合物擴散通過基質(zhì)以使載體物料降解。另外的皮下植入方法利用儲存槽器件， 其中活性化合物或化合物是由速率控制膜片包圍，例如，與組分濃縮無關(guān)的膜片（具有零 級動力學(xué)）。亦適合使用由速率控制膜片包圍所組成的的基質(zhì)器件。
[0238] 儲存槽和基質(zhì)類型器件皆可含有諸如聚二甲基硅氧烷，諸如硅橡膠（商標(biāo)名） (Silastic?，）或其它聚硅氧橡膠等物料?；|(zhì)物料可為不溶性聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、 乙酸乙基乙烯酯、聚苯乙烯以及聚丙烯酸酯、以及棕櫚酸硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯以及 廿二酸甘油酯類型的甘油酯。物料可為疏水性或親水性聚合體和視需要地含有增溶劑。
[0239] 皮下植入物器件可為以任何適合聚合體，例如，描述于美國專利第5, 035, 891和 4, 210, 644號者（其特此以參考方式并入），而制成緩釋膠囊。
[0240] 大體上，可應(yīng)用至少四種不同方法，以對藥物化合物的釋放和經(jīng)皮釋放提供速率 的控制。此等方法為調(diào)節(jié)膜片的系統(tǒng)、控制粘性擴散的系統(tǒng)、基質(zhì)分散類型系統(tǒng)以及微儲存 槽系統(tǒng)。應(yīng)理解可通過使用此等方法的適合混合，而獲得控釋的經(jīng)皮及/或局部組合物。
[0241] 于膜片調(diào)節(jié)系統(tǒng)中，活性成分存在儲存槽中，所述儲存槽完全包囊于從不可透藥 物的層壓板（諸如，金屬塑料層壓板）和速率控制聚合體膜片（諸如微多孔或非多孔的聚 合體膜片（例如，乙烯-乙酸乙烯酯共聚體））模塑的淺隔室?；钚猿煞轴尫磐ㄟ^速率控制 聚合體膜片。于藥物儲存槽中，活性成分可分散于固體聚合體基質(zhì)中或懸浮于不可淋溶、粘 性液體介質(zhì)諸如聚硅氧液體。于聚合體膜片的外表面上，施用粘性聚合體薄層以達(dá)成經(jīng)皮 系統(tǒng)與皮膚表面的直接接觸。粘性聚合體優(yōu)選為低敏感性，而且與活性藥物物質(zhì)兼容的聚 合體。
[0242] 于控制粘性擴散的系統(tǒng)中，活性成分的儲存槽的形成是通過直接分散活性成分于 粘性聚合體中，接著通過如溶劑澆鑄在實質(zhì)上不可透藥物的金屬塑料背襯平片材上擴散含 有活性成分的粘合劑以形成藥物儲存槽薄層。
[0243] 基質(zhì)分散類型系統(tǒng)的特征為活性成分的儲存槽是通過實質(zhì)上均質(zhì)分散活性成分 于親水性或親脂性聚合體基質(zhì)而形成。接著，含有藥物的聚合體模塑入具有實質(zhì)上良好定 義的表面面積和控制厚度的圓盤。粘性聚合體沿著周長散布，以形成圍繞圓盤的粘性條帶。
[0244] 微儲存槽系統(tǒng)可被認(rèn)為是儲存槽和基質(zhì)分散類型系統(tǒng)的組合。于此情況下，活性 物質(zhì)的儲存槽的形成是通過首先懸浮藥物固體于水溶性聚合體的水性溶液，以及接著分散 藥物懸浮液于親脂性聚合體中以形成多重不可淋溶、顯微球狀的藥物儲存槽。
[0245] 任何上述控釋、延長的釋放以及持續(xù)釋放的組合物可調(diào)配成在約30分鐘至約1 周、約30分鐘至約72小時、約30分鐘至24小時、約30分鐘至12小時、約30分鐘至6小 時、約30分鐘至4小時、以及約3小時至10小時后釋放活性成分。于具體實施例中，對受 試者給藥醫(yī)藥組合物之后，在受試者中活性成分的有效濃縮持續(xù)4小時、6小時、8小時、10 小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時或更久。
[0246] 劑量
[0247] 當(dāng)本文所述的劑作為醫(yī)藥劑而對人類和動物給藥時，其可直接給藥或作為含有活 性成分與醫(yī)藥可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的組合的醫(yī)藥組合物給藥。
[0248] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中的活性成分的實際劑量水平和時程可改變，以便獲得于針 對特別病人、組合物以及給藥的模式達(dá)成期望的治療反應(yīng)是有效的，但對病人是無毒性的 活性成分的含量。一般，本發(fā)明的劑或醫(yī)藥組合物的是以足夠減少或消除癥狀與流行性感 冒感染相關(guān)的含量給藥。例示性劑量范圍包含每天〇. oimg至250mg，每天0. Olmg至lOOmg， 每天lmg至lOOmg，每天10mg至lOOmg，每天lmg至10mg，以及每天0· Olmg至10mg。優(yōu)選 劑量的劑為病人可容忍和不發(fā)展嚴(yán)重或不可接受的副作用的最大劑量。于具體實施例中， 以每天每公斤的體重約10公克（g)至約lOOmg，每天約0. 1至約10mg/kg，或每天約l.Omg 至約10mg/kg的體重的濃度給藥劑。
[0249] 于具體實施例中，醫(yī)藥組合物包括含量范圍為1和10mg之間的劑，諸如1、2、3、4、 5、6、7、8、9 或 10mg。
[0250] 于具體實施例中，產(chǎn)生劑的血清濃度的治療有效劑量為約0· lng/ml至約50至 100 μ g/ml。醫(yī)藥組合物典型應(yīng)提供每天每公斤體重約0. OOlmg至約2000mg的化合物的劑 量。例如，對人類病人全身給藥的劑量可為1至lOy/kgJO至80 μ g/kg、5至50 μ g/kg、75 至 150 μ g/kg、100 至 500 μ g/kg、250 至 750 μ g/kg、500 至 1000 μ g/kg、1 至 10mg/kg、5 至 50mg/kg、25 至 75mg/kg、50 至 100mg/kg、100 至 250mg/kg、50 至 100mg/kg、250 至 500mg/kg、 500 至 750mg/kg、750 至 1000mg/kg、1000 至 1500mg/kg、1500 至 2000mg/kg、5mg/kg、20mg/ kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、1500mg/kg 或 2000mg/kg。醫(yī)藥劑量單兀形式 是制備成每劑量單元形式提供約lmg至約5000mg，例如約100至約2500mg的化合物或必要 成分的組合。
[0251] 于具體實施例中，對受試者給藥約50nM至約1 μ Μ的劑。于相關(guān)具體實施例中，對 受試者給藥約 50 至 100ηΜ、50 至 250ηΜ、100 至 500ηΜ、250 至 500ηΜ、250 至 750ηΜ、500 至 750ηΜ、500ηΜ 至 1 μ Μ,或 750ηΜ 至 1 μ Μ 的劑。
[0252] 有效量的測定孔是在那些本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分能力內(nèi)，尤其是有鑒于本文詳細(xì) 揭示的內(nèi)容。一般，有效的或有效量的劑的測定是通過首先給藥低劑量的劑，以及接著遞增 給藥劑量或多種劑量直到在治療的受試者中觀察到期望的功效（例如，減少與流行性感冒 感染相關(guān)的癥狀）和最小或可接受的毒性副作用?？蓱?yīng)用測定給藥本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的 適當(dāng)劑量和用劑時間表的方法描述于，例如，Goodman and Gilman' s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Goodman et al. , eds. ,11th Edition, McGraw-Hi112005, and Remington ：The Science and Practice of Pharmacy, 20th and21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds. ,Lippencott Williams&Wilkins(2003and2005)，各特此以參考方式并入。
[0253] 組合物治療
[0254] 本文所述的藥劑和醫(yī)藥組合物亦可與其它治療分子組合給藥。治療分子可為任何 用以治療流行性感冒感染的化合物。此等化合物的實例包含，但非限于，減少流行性感冒病 毒生產(chǎn)的抑制性核酸、抗病毒劑（例如，金剛烷胺、金剛乙胺、扎那米韋、奧司他韋等）、毒素 以及減少與流行性感冒感染相關(guān)的癥狀的劑（例如，抗發(fā)炎劑）。
[0255] 流行性感冒HA抗體可在給藥之前、期間或給藥另外的治療劑之后給藥。于具體實 施例中，在首次給藥另外的治療劑之后給藥抗體。于具體實施例中，在首次給藥另外的治療 劑（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天）之后給藥抗體。于具體實施 例中，抗體與首先給藥另外的治療劑同時給藥。
[0256] 對受試者給藥治療劑的含量可由主治醫(yī)師或獸醫(yī)容易地測定。一般，有效的或有 效量的抗體和另外的治療的測定是通過首次給藥低劑量的一種或兩種活性劑，接著遞增給 藥劑量或多種劑量直到觀察到期望的功效（例如，減少流行性感冒感染癥狀）和最小或 無毒性副作用?？蓱?yīng)用以測定給藥本發(fā)明的組合物的適當(dāng)劑量和用劑時間表的方法描述 于，例如，Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Edition.以上，以及于Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 20th and21st Editions 以上。
[0257] 試劑盒
[0258] 本發(fā)明提供預(yù)防或治療流行性感冒感染的試劑盒；中和流行性感冒病毒；抑制流 行性感冒病毒感染的建立；抑制流行性感冒病毒感染的散播；以及抑制流行性感冒病毒進 入細(xì)胞。于具體實施例中，試劑盒含有本文所述的一種或多種劑或醫(yī)藥組合物。于具體實施 例中，試劑盒提供使用的指示。使用的指示可關(guān)于本文所述的任何方法。于相關(guān)具體實施 例中，指示關(guān)于使用治療或預(yù)防流行性感冒感染的劑或醫(yī)藥組合物。根據(jù)本發(fā)明的此方面 的試劑盒可包括載體工具，諸如盒、箱、管等，于其中一個或多個容器工具，諸如小玻璃瓶、 管、安瓿瓶等密閉空間者。于具體實施例中，試劑盒提供調(diào)控醫(yī)藥或生物產(chǎn)物的生產(chǎn)、使用 或販賣的政府機構(gòu)規(guī)定的形式的通知，所述通知反映用于人類給藥的試劑盒和其中組分的 生產(chǎn)、使用或販賣的機構(gòu)的批準(zhǔn)。
[0259] 實施例
[0260] 應(yīng)理解本發(fā)明不應(yīng)被解釋為限制至現(xiàn)在描述的實施例；而是，本發(fā)明應(yīng)被解釋為 包含本文提供的任何和所有應(yīng)用，而且所有相等的變異是在普通技術(shù)人員的技能內(nèi)。
[0261] 實施例1 :廣泛中和抗體的克隆譜系
[0262] 重排的Ig VH和 '基因是通過RT/PCR而從外周血單核細(xì)胞分離，并且于疫苗接 種2007三價滅活疫苗（TIV)后一周自受試者采集（Liao, Η· X. et al. J. Virol. Methodsl58 : 171-179(2009))。如圖1A所示，通過定序重排的基因而檢測的克隆譜系有三段克隆 (mAbs CH65, CH66以及CH67)?？贵wCH65、CH66以及CH67的克隆譜系的未突變的一般原 始種型（UCA)的推測序列是明顯的，除了在位置99的重鏈可為甘氨酸或丙氨酸。圖1B 顯示各抗體的氨基酸序列與UCA的比對。所有三個成熟抗體與存在于疫苗（A/Solomon Islands/3/2006)中的HI血凝素（HA)以相同親和力結(jié)合；UCA的結(jié)合更弱。
[0263] 實施例2 :中和活性的廣度
[0264] CH65的重鏈與UCA在可變結(jié)構(gòu)域中的位置12以及其輕鏈的位置6有所不同； CH65IgGl和其Fab是通過如下述的瞬時轉(zhuǎn)染和純化而于293T細(xì)胞中表達(dá)。針對大組的來 自過去30年的H1單離物，包含來自1977、1991以及1995的疫苗病毒株，測試中和并且觀 察到驚人的廣泛潛力（表1)。亦針對此組的子集測試CH67 (表1)。
[0265] 表1.季節(jié)性流行性感冒病毒株A/H1N1以人類MAb CH65和CH67的廣泛中和
[0266]

【權(quán)利要求】
1. 一種單離的抗流行性感冒抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段與流行性感冒血凝 素（HA)的表位特異性地結(jié)合，從而減少或抑制與唾液酸結(jié)合的流行性感冒血凝素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述流行性感冒HA上的 所述表位包括唾液酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗流行性感冒抗體或其片段，其中所述HA為H1HA、H2HA、 H3HA 或 H5HA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述表位包括： i. 對應(yīng)于來自 A/Solomon Islands/3/2006 的 CDR H1 殘基 158 ;CDR H2 殘基 158 至 160 ;CDR H3 殘基 135 至 136、190 至 195 以及 226 ;CDR L1 殘基 222、225 以及 227 ;以及 CDR L3殘基187和189的氨基酸； ii. SEQ ID NO : 17至44中任一者所表示的氨基酸；或 iii. SEQ ID NO :17至44中任一者的CH65-CH67結(jié)合殘基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述抗流 行性感冒抗體或抗體片段包括可變重（VH)鏈，以及其中所述V H鏈包括SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12中所表示的氨基酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的抗流行性感冒抗體或其片段，其中所述抗流行 性感冒抗體或抗體片段包括可變輕鏈，以及其中所述'鏈包括SEQ ID N0:13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :15或SEQ ID NO :16中所表示的氨基酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的抗流行性感冒抗體或其片段，其中所述抗流行 性感冒抗體或抗體片段包括一個或多個重鏈⑶R區(qū)，所述重鏈⑶R區(qū)存在于SEQ ID NO :9、 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12所表示的可變重（VH)鏈氨基酸序列中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述抗流 行性感冒抗體或抗體片段包括一個或多個輕鏈⑶R區(qū)，所述輕鏈⑶R區(qū)存在于SEQ ID NO : 13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15或SEQIDN0:16所表示的可變輕（V ?)鏈氨基酸序列中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述抗流 行性感冒抗體或抗體片段包括：i)包括SEQ ID NO :10所表示的氨基酸序列的可變重（VH) 鏈氨基，以及ii)包括SEQ ID NO :14所表示的氨基酸序列的可變輕（')鏈。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述一個或多個重鏈 CDR 區(qū)包括存在于 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO :12 的可變重 (VII)鏈氨基酸序列中的CDR3區(qū)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述一個或多個輕鏈 CDR 區(qū)包括存在于 SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15 或 SEQ ID NO :16 的可變 重（')鏈氨基酸序列中的CDR3區(qū)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述抗流 行性感冒抗體或抗體片段包括可變重（VH)鏈，其中所述￥ 11鏈的所述CDR3區(qū)包括Argl04、 Serl05、Vall06、Aspl07、Tyrl09、Tyrll0、Tyrll2 或其組合。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述抗 流行性感冒抗體或抗體片段為單克隆抗體或其抗體片段。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述抗 流行性感冒抗體或抗體片段為人源化抗體或抗體片段。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述抗 體片段為Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab'） 2片段、單鏈片 段、雙鏈抗體或線性抗體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其還包括偶 聯(lián)所述抗流行性感冒抗體或抗體片段的劑。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中偶聯(lián)所述抗體或抗體 片段的所述劑為治療劑或可檢測的標(biāo)記。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述治療劑為小分 子、納米粒子、多肽、放射性同位素或抑制性核酸。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述治療劑為抗病毒 劑或毒素。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述治療劑為減少流 行性感冒病毒產(chǎn)生的siRNA、shRNA或反義核酸分子。
21. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述可檢測的標(biāo)記可 通過光譜、光化學(xué)、生化、免疫化學(xué)、物理或化學(xué)工具檢測。
22. 根據(jù)權(quán)利要求17或21所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述可檢測標(biāo)記 為已制成可檢測的酶、熒光分子、顆粒標(biāo)記、電子致密試劑、放射性標(biāo)記、微泡、生物素、地高 辛或半抗原或蛋白質(zhì)。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，其中所述流 行性感冒為H1N1、H2N2、H3N2或適應(yīng)人類的H5病毒株。
24. -種醫(yī)藥組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體或 抗體片段。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的醫(yī)藥組合物，其中所述醫(yī)藥組合物包括醫(yī)藥可接受的載 體、稀釋劑或賦形劑。
26. -種單離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的抗 流行性感冒抗體或抗體片段。
27. -種表達(dá)載體，所述載體包括根據(jù)權(quán)利要求26所述的單離的多核苷酸。
28. -種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包括根據(jù)權(quán)利要求27所述的表達(dá)載體。
29. -種在治療或預(yù)防有需要的受試者的流行性感冒病毒感染的方法，其中所述方法 包括對所述受試者給藥有效量的i)根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗 體或抗體片段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的醫(yī)藥組合物，從而治療或預(yù)防所述受試 者的流行性感冒病毒感染。
30. -種中和有需要的受試者中的流行性感冒病毒的方法，其中所述方法包括對所述 受試者給藥有效量的i)根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片 段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的醫(yī)藥組合物，從而中和所述受試者中的所述流行性 感冒病毒。
31. -種抑制有需要的受試者的流行性感冒病毒感染的建立的方法，其中所述方法包 括對所述受試者給藥有效量的i)根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體 或抗體片段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的醫(yī)藥組合物，從而抑制所述受試者中的所 述流行性感冒病毒感染的建立。
32. -種抑制有需要的受試者的流行性感冒病毒感染散播的方法，其中所述方法包括 對所述受試者給藥有效量的i)根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體或 抗體片段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的醫(yī)藥組合物，從而抑制所述受試者中的流行 性感冒病毒感染的散播。
33. -種抑制流行性感冒病毒進入細(xì)胞的方法，其中所述方法包括對所述受試者給藥 有效量的i)根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或ii) 根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的醫(yī)藥組合物，從而抑制所述流行性感冒病毒進入所述受試者 中的細(xì)胞。
34. 根據(jù)權(quán)利要求29至33中任一項所述的方法，其中所述流行性感冒為H1N1、H2N2、 H3N2,或適應(yīng)人類的H5病毒株。
35. 根據(jù)權(quán)利要求29至34中任一項所述的方法，其中所述受試者具有流行性感冒感染 或發(fā)展流行性感冒感染的風(fēng)險。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述受試者為哺乳動物。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述受試者為人類。
38. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述受試者易受病毒感染。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述受試者為懷孕女性。
40. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述受試者為年輕受試者或嬰兒受試者。
41. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述受試者為老年受試者。
42. 根據(jù)權(quán)利要求29至41中任一項所述的方法，其中i)所述抗流行性感冒抗體或抗 體片段，或ii)所述醫(yī)藥組合物是通過肌內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射、或吸入而給藥。
43. -種抑制流行性感冒病毒進入細(xì)胞的方法，其中所述方法包括使具有流行性感冒 病毒感染或有發(fā)展流行性感冒病毒感染的風(fēng)險的細(xì)胞與i)根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項 所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的醫(yī)藥組合物接 觸，從而抑制流行性感冒病毒進入所述細(xì)胞。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述流行性感冒為H1N1、H2N2、H3N2適應(yīng)人類 的H5病毒株。
45. -種治療或預(yù)防流行性感冒病毒感染的試劑盒，其中所述試劑盒包括有效量的i) 根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求 24或25所述的醫(yī)藥組合物。
46. -種中和流行性感冒病毒的試劑盒，其中所述試劑盒包括有效量的i)根據(jù)權(quán)利要 求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求24或25所 述的醫(yī)藥組合物。
47. -種抑制流行性感冒病毒感染的建立的試劑盒，其中所述試劑盒包括有效量的i) 根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求 24或25所述的醫(yī)藥組合物。
48. -種抑制流行性感冒病毒感染的散播的試劑盒，其中所述試劑盒包括有效量的i) 根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求 24或25所述的醫(yī)藥組合物。
49. 一種抑制流行性感冒病毒進入細(xì)胞的試劑盒，其中所述試劑盒包括有效量的i)根 據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的抗流行性感冒抗體或抗體片段，或ii)根據(jù)權(quán)利要求24 或25所述的醫(yī)藥組合物。
50. 根據(jù)權(quán)利要求45至49中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括治療劑。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的試劑盒，其中所述治療劑抑制流行性感冒感染。
52. 根據(jù)權(quán)利要求45至51中任一項試劑盒的試劑盒，還包括在根據(jù)權(quán)利要求29至44 中任一項所述的方法中使用所述試劑盒的指示。
53. 根據(jù)權(quán)利要求45至52中任一項試劑盒的試劑盒，其中所述流行性感冒為H1N1、 H2N2、H3N2或適應(yīng)人類的H5病毒株。
【文檔編號】A61K47/48GK104114186SQ201280046220
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月3日
【發(fā)明者】J·惠特爾, S·C·哈里森, B·F·海恩斯, H-x·廖, M·A·穆迪, T·B·開普勒, A·G·施密特 申請人:兒童醫(yī)療中心有限公司, 杜克大學(xué)