專利名稱：北豆根抗腫瘤提取物、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種北豆根抗腫瘤提取物、制備方法及用途。
背景技術(shù)：
北豆根系防已科植物蝙蝠葛的干燥根莖，現(xiàn)在的北豆根有效成分提取工藝均采用生物堿的常規(guī)提取方法即酸提堿沉結(jié)合堿化后有機溶劑萃取，此提取方法存在有機試劑殘留，而且操作繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用一種北豆根抗腫瘤提取物的制備方法，此方法只用到了水和乙醇，使提取物無有機殘留，可以與藥物賦形劑制成適合于臨床使用的中藥有效部位的抗腫瘤藥物。上述的目的通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)
一種北豆根抗腫瘤提取物的制備方法，該方法包括如下步驟
(1)浸泡提取取北豆根藥材用8 10倍重量的75% 95%乙醇溶液浸泡24小時后，用超聲波提取器提取三次，將所述的三次提取液充分混合；
(2)濃縮、分散、離心將混合后的提取液減壓濃縮至無醇味后，再把濃縮液和水按體積比1:1稀釋，進行離心分離處理；
(3)用大孔吸附樹脂取離心處理后的上清液注入已處理好的AB-8大孔吸附樹脂，上清液與樹脂的重量比例為I :2 ；
(4)洗脫將吸附樹脂進行洗脫，流速為I倍柱床體積/小時，依次用3 5倍柱床體積的蒸餾水洗脫、5倍柱床體積的10%乙醇溶液洗脫和4倍柱床體積的70%乙醇溶液洗脫；
(5)制得抗腫瘤提取物收集70%的乙醇洗脫液，進行濃縮收干，得到干燥的固體即為北豆根抗腫瘤提取物。一種北豆根抗腫瘤提取物在抗腫瘤領(lǐng)域藥品制備中的應(yīng)用。一種北豆根抗腫瘤提取物，通過以下方法制得
I)浸泡提取取北豆根藥材用8 10倍重量的75% 95%乙醇溶液浸泡24小時后，用超聲波提取器提取三次，將所述的三次提取液充分混合；
(2 )濃縮、分散、離心將混合后的提取液減壓濃縮至無醇味后，再把濃縮液和水按體積比1:1稀釋，進行離心分離處理；
(3)用大孔吸附樹脂取離心處理后的上清液注入已處理好的AB-8大孔吸附樹脂，上清液的與樹脂的重量比例為I :2 ；
(4)洗脫將吸附樹脂進行洗脫，流速為I倍柱床體積/小時，依次用3 5倍柱床體積的蒸餾水洗脫、5倍柱床體積的10%乙醇溶液洗脫和4倍柱床體積的70%乙醇溶液洗脫；
(5)制得抗腫瘤提取物收集70%的乙醇洗脫液，進行濃縮收干，得到干燥的固體即為北豆根抗腫瘤提取物。—種北豆根抗腫瘤提取物在抗腫瘤領(lǐng)域藥品制備中的應(yīng)用，抑制人乳腺癌細胞MCF-7的活性實驗是細胞培養(yǎng)、細胞毒測定、藥效學(xué)試驗及試驗方法細胞培養(yǎng)
人乳腺癌細胞MCF-7培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基，補加10%胎牛血清、L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素以及100 mg/ml鏈霉素，將細胞置于37 °C, 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，孵育2-3天后再用O. 25%胰蛋白酶進行消化傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)的實驗。細胞毒測定
10批北豆根藥材按照上述的制備過程制備的抗腫瘤提取物，用培養(yǎng)液稀釋至不同濃度后，用O. 22 mm的微孔濾膜過濾，將所得的續(xù)濾液用于腫瘤細胞增殖抑制實驗，在無菌的96孔板中，接種的細胞密度為每孔I X IO5個/ml,用量為每孔100 ml,然后分別加入5 mg/ml、l mg/ml>O. 2 mg/ml>O. 04 mg/ml四個梯度濃度的樣品溶液,每孔加入100 ml,每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，另外設(shè)4個空白對照孔，空白對照孔中只加100 ml的完全培養(yǎng)基，不加細胞；設(shè)4個陰性對照孔，只加100 ml細胞懸液。將其進行48 h培養(yǎng)，采用MTT法進行測定，SP培養(yǎng)后的細胞，加入10 ml MTT5 mg/ml磷酸鹽緩沖液，37° C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，離心，取上清液150 ml棄去，加入175ml DMS0，振搖10分鐘后，用酶標(biāo)儀在550 nm測定吸光值。根據(jù)公式計算得IC5tl。對照孔僅加細胞不加藥物，空白孔僅加溶劑不加細胞和藥物，實驗孔加細胞再加藥物。藥效學(xué)試驗
試驗動物昆明種小鼠，體重18g-22g，雌雄兼用。藥物與試劑注射用生理鹽水，5-氟尿嘧啶，北豆根提取物，瘤株小鼠肝癌H22。試驗方法
(I)對小鼠瘤重及免疫器官指數(shù)的影響小鼠隨機分組，雌雄各半。分別為給藥組，5-氟尿嘧啶組，生理鹽水組。各組小鼠于右前腋皮下常規(guī)接種H22瘤細胞懸液O. 2ml (約I X 106-2 X IO6個細胞)，接種后各組給藥，連續(xù)7d，末次給藥后處死小鼠，稱體重，稱瘤塊、胸腺及脾臟質(zhì)量，計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。(2)對H22小鼠生命延長率的影響小鼠腹腔接種H22瘤細胞懸液O. 2ml，每天觀察并記錄小鼠死亡情況。有益效果
I.本發(fā)明提供了一種未報道過的具有抗腫瘤作用的北豆根提取物，通過對癌細胞抑制試驗和藥效學(xué)試驗，證明了該提取物具有優(yōu)良的抗癌活性，可與多種醫(yī)用輔料如賦形劑、稀釋劑、香味劑、潤滑劑等配合，制成多種劑型的藥物，如凍干粉針、注射液、片劑、膠囊、顆粒劑以及口服液等，廣泛應(yīng)用于臨床。本發(fā)明采用的浸泡提取，濃縮、洗脫及干燥的方法只用到了乙醇溶液，且最后又蒸干排出，無有機物殘留，保證了提取物的純凈性，對后續(xù)的抗腫瘤藥物的制備提供了安全保障。本發(fā)明采用的大孔吸附樹脂的方法，對北豆根抗腫瘤組分進行分離富集，代替了傳統(tǒng)的堿化，有機溶劑萃取，不僅保證了所得組分的抗腫瘤活性，且避免了乳化、有機物殘
留等缺點。本發(fā)明采用的浸后再用超聲波提取器對北豆根抗腫瘤組分進行提取的方法，不僅避免了加熱回流對成分的破壞，還克服了單純用浸取法提取效率低的缺點。
本發(fā)明提供的北豆根抗腫瘤提取物的制備方法操作簡便，容易制取，有利于降低成本，進行抗腫瘤藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。


附圖I是本發(fā)明的10批北豆根抗腫瘤活性組分的細胞毒性試驗IC5tl值。附圖2是本發(fā)明對小鼠藥效學(xué)試驗數(shù)據(jù)。
具體實施例方式 實施例I:
一種北豆根抗腫瘤提取物的制備方法，該方法包括如下步驟
(1)浸泡提取取北豆根藥材用8 10倍重量的75% 95%乙醇溶液浸泡24小時后，用超聲波提取器提取三次，將所述的三次提取液充分混合；
(2)濃縮、分散、離心將混合后的提取液減壓濃縮至無醇味后，再把濃縮液和水按體積比1:1稀釋，進行離心分離處理；
(3)用大孔吸附樹脂取離心處理后的上清液注入已處理好的AB-8大孔吸附樹脂，上清液與樹脂的重量比例為I :2 ；
(4)洗脫將吸附樹脂進行洗脫，流速為I倍柱床體積/小時，依次用3 5倍柱床體積的蒸餾水洗脫、5倍柱床體積的10%乙醇溶液洗脫和4倍柱床體積的70%乙醇溶液洗脫；
(5)制得抗腫瘤提取物收集70%的乙醇洗脫液，進行濃縮收干，得到干燥的固體即為北豆根抗腫瘤提取物。實施例2:
一種北豆根抗腫瘤提取物，其特征是通過以下方法制得
I)浸泡提取取北豆根藥材用8 10倍重量的75% 95%乙醇溶液浸泡24小時后，用超聲波提取器提取三次，將所述的三次提取液充分混合；
(2 )濃縮、分散、離心將混合后的提取液減壓濃縮至無醇味后，再把濃縮液和水按體積比1:1稀釋，進行離心分離處理；
(3)用大孔吸附樹脂取離心處理后的上清液注入已處理好的AB-8大孔吸附樹脂，上清液與樹脂的重量比例為I :2 ；
(4)洗脫將吸附樹脂進行洗脫，流速為I倍柱床體積/小時，依次用3 5倍柱床體積的蒸餾水洗脫、5倍柱床體積的10%乙醇溶液洗脫和4倍柱床體積的70%乙醇溶液洗脫；
(5)制得抗腫瘤提取物收集70%的乙醇洗脫液，進行濃縮收干，得到干燥的固體即為北豆根抗腫瘤提取物。實施例3
一種北豆根抗腫瘤提取物在抗腫瘤領(lǐng)域藥品制備中的應(yīng)用。抑制人乳腺癌細胞MCF-7的活性實驗是
細胞培養(yǎng)
人乳腺癌細胞MCF-7培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基，補加10%胎牛血清、L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素以及100 mg/ml鏈霉素，將細胞置于37 °C, 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，孵育2-3天后再用O. 25%胰蛋白酶進行消化傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)的實驗。細胞毒測定10批北豆根藥材按照上述的制備過程制備的抗腫瘤提取物，用培養(yǎng)液稀釋至不同濃度后，用O. 22 mm的微孔濾膜過濾，將所得的續(xù)濾液用于腫瘤細胞增殖抑制實驗，在無菌的96孔板中，接種的細胞密度為每孔I X IO5個/ml,用量為每孔100 ml,然后分別加入5 mg/ml、l mg/ml、0.2 mg/ml、0.04 mg/ml四個梯度濃度的樣品溶液,每孔加入100 ml,每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，另外設(shè)4個空白對照孔，空白對照孔中只加100 ml的完全培養(yǎng)基，不加細胞；設(shè)4個陰性對照孔，只加100 ml細胞懸液。將其進行48 h培養(yǎng)，采用MTT法進行測定，SP培養(yǎng)后的細胞，加入10 ml MTT5 mg/ml磷酸鹽緩沖液，37° C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，離心，取上清液150 ml棄去，加入175ml DMS0，振搖10分鐘后，用酶標(biāo)儀在550 nm測定吸光值。根據(jù)公式計算，得IC5(I。 抑制率(%)=(對照孔A值-空白孔A值)-(試驗孔A值-空白孔A值)
對照孔A值-空白孔A值
X 100%
對照孔僅加細胞不加藥物。空白孔僅加溶劑不加細胞和藥物。_
實驗孔加細胞再加藥物。批北豆根抗腫瘤活性組分的細胞毒性試驗結(jié)果見圖I表IC5tl值
藥效學(xué)試驗
試驗動物昆明種小鼠，體重18g-22g，雌雄兼用。藥物與試劑注射用生理鹽水，5-氟尿嘧啶，北豆根提取物，瘤株小鼠肝癌H22。試驗方法
(I)對小鼠瘤重及免疫器官指數(shù)的影響小鼠隨機分組，雌雄各半。分別為給藥組，5-氟尿嘧啶組，生理鹽水組。各組小鼠于右前腋皮下常規(guī)接種H22瘤細胞懸液O. 2ml (約I X 106-2 X IO6個細胞)，接種后各組給藥，連續(xù)7d，末次給藥后處死小鼠，稱體重，稱瘤塊、胸腺及脾臟質(zhì)量，計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。(2)對H22小鼠生命延長率的影響小鼠腹腔接種H22瘤細胞懸液O. 2ml，每天觀察并記錄小鼠死亡情況見圖2表
本發(fā)明提供的抗腫瘤組分對H22生長有明顯的抑制作用，并可明顯延長小鼠生存時間，具有良好的抗腫瘤作用。
權(quán)利要求
1.一種北豆根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征是該方法包括如下步驟 (1)浸泡提取取北豆根藥材用8 10倍重量的75% 95%乙醇溶液浸泡24小時后，用超聲波提取器提取三次，將所述的三次提取液充分混合； (2)濃縮、分散、離心將混合后的提取液減壓濃縮至無醇味后，再把濃縮液和水按體積比1:1稀釋，進行離心分離處理； (3)用大孔吸附樹脂取離心處理后的上清液注入已處理好的AB-8大孔吸附樹脂，上清液與樹脂的重量比例為I :2 ； (4)洗脫將吸附樹脂進行洗脫，流速為I倍柱床體積/小時，依次用3 5倍柱床體積的蒸餾水洗脫、5倍柱床體積的10%乙醇溶液洗脫和4倍柱床體積的70%乙醇溶液洗脫； (5)制得抗腫瘤提取物收集70%的乙醇洗脫液，進行濃縮收干，得到干燥的固體即為 北豆根抗腫瘤提取物。
2.一種北豆根抗腫瘤提取物在抗腫瘤領(lǐng)域藥品制備中的應(yīng)用。
3.—種北豆根抗腫瘤提取物，其特征是通過以下方法制得 (1)浸泡提取取北豆根藥材用8 10倍重量的75% 95%乙醇溶液浸泡24小時后，用超聲波提取器提取三次，將所述的三次提取液充分混合； (2)濃縮、分散、離心將混合后的提取液減壓濃縮至無醇味后，再把濃縮液和水按體積比1:1稀釋，進行離心分離處理； (3)用大孔吸附樹脂取離心處理后的上清液注入已處理好的AB-8大孔吸附樹脂，上清液與樹脂的重量比例為I :2 ； (4)洗脫將吸附樹脂進行洗脫，流速為I倍柱床體積/小時，依次用3 5倍柱床體積的蒸餾水洗脫、5倍柱床體積的10%乙醇溶液洗脫和4倍柱床體積的70%乙醇溶液洗脫； (5)制得抗腫瘤提取物收集70%的乙醇洗脫液，進行濃縮收干，得到干燥的固體即為北豆根抗腫瘤提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種北豆根抗腫瘤提取物、制備方法及用途?，F(xiàn)在的北豆根有效成分提取工藝均采用生物堿的常規(guī)提取方法即酸提堿沉結(jié)合堿化后有機溶劑萃取，此提取方法存在有機試劑殘留。步驟1)浸泡提取是用75%～95%乙醇溶液浸泡數(shù)小時后超聲提??；(2)濃縮、分散、離心是將提取液減壓濃縮至無醇味后再稀釋、離心處理；(3)用大孔吸附樹脂是取離心處理后的上清液注入處理好的AB-8大孔吸附樹脂；(4)洗脫是把吸附樹脂用流速為1倍柱床體積/小時，依次用3～5倍柱床體積的蒸餾水洗脫、5倍柱床體積的10%乙醇溶液洗脫和4倍柱床體積的70%乙醇溶液洗脫；(5)制得抗腫瘤提取物是收集70%的乙醇洗脫液，濃縮收干得到干燥固體。本發(fā)明用于醫(yī)藥領(lǐng)域。
文檔編號A61P35/00GK102961443SQ20121053815
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者劉麗娟 申請人:黑龍江大學(xué)