專利名稱：一種提高肝片吸蟲Cat L1(FhCat L1)DNA疫苗免疫保護(hù)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高抗肝片吸蟲FhCat LI DNA疫苗免疫保護(hù)率的方法。具體涉及利用樹突狀細(xì)胞(DC)表面分子DEC-205的單鏈抗體SCFVNU)e_145靶向DC細(xì)胞，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat LI基因的DNA疫苗后對(duì)肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高抗肝片吸蟲Cat LI DNA疫苗的免疫保護(hù)率。
背景技術(shù)：
肝片吸蟲是一種寄生性蠕蟲，能引起牛、羊等反芻動(dòng)物及人的嚴(yán)重吸蟲病[I]。在世界范圍內(nèi)，肝片吸蟲病直接影響著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康，據(jù)估計(jì)每年可造成約20億美元的經(jīng)濟(jì)損失[2]，是一種不可忽視的重要人畜共患寄生蟲病。對(duì)此病的防治一般采用三氯苯咪唑等化學(xué)藥物，但這些藥物只對(duì)早期的未成熟蟲體或成蟲具有良好效果，對(duì)感染后期的治療不佳。最近發(fā)現(xiàn)，家畜已對(duì)三氯苯咪唑等化學(xué)藥物產(chǎn)生耐藥性[3-5]。同時(shí)，人們對(duì)畜產(chǎn)品中化學(xué)藥物殘留量的要求也越來越嚴(yán)格，這給利用化學(xué)藥物控制吸蟲病帶來極大困難。因此，防治吸蟲病急切需要一種能替代化學(xué)藥物的治療方法，這就給疫苗發(fā)展帶來了良好契機(jī)[6]。事實(shí)上，到目前為止，有很多肝片吸蟲的疫苗候選分子如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，亮氨酸氨肽酶(LAP)，脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)及組織蛋白酶L (Cat L)被用于開發(fā)諸如重組蛋白疫苗及DNA疫苗，雖然這些疫苗能在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和大動(dòng)物上產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)[7，8]，但至今仍沒有一種商品化疫苗能投入到臨床生產(chǎn)，這在很大程度上受制于疫苗的保護(hù)率低下的現(xiàn)狀，而這種現(xiàn)狀與如何提高抗原的呈遞有著密切的關(guān)系[9-12]。理想的疫苗應(yīng)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，并能誘導(dǎo)長(zhǎng)期持久的免疫記憶以保護(hù)機(jī)體免受疾病侵襲。作為一種成 功的疫苗，其抗原可被抗原提呈細(xì)胞(antigen presentingcells，APC)所提呈，并激活機(jī)體免疫系統(tǒng)引起抗原特異性免疫反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞(DC)是已知體內(nèi)最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，其最大的特點(diǎn)是能夠刺激初始T細(xì)胞增殖和啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)。單鏈抗體是一種分子量小，穿透力強(qiáng)，可避免非特異性細(xì)胞毒性及免疫原性，目前被認(rèn)為是最為理想的具有體內(nèi)特異性導(dǎo)向作用的載體片段[13，14]。DEC205作為小鼠DC表面特異性標(biāo)志，DEC205抗體NLDC-145具有特異靶向DC的作用，是體內(nèi)DC修飾的理想載體。所以抗DEC205的單鏈抗體可將特定抗原定向呈遞給DC，激活初始免疫細(xì)胞，使抗原提呈給T細(xì)胞，引起有效的抗原特異性免疫反應(yīng)。組織蛋白酶L是一種半胱氨酸蛋白酶，通常情況下這種酶以非活性狀態(tài)存在于分泌囊泡的腸上皮細(xì)胞中[15，16]，當(dāng)前體酶活化并被釋放后，寄生蟲即可利用活化的組織蛋白酶行使多種重要的功能，如能在肝臟中將蛋白分解為多肽從而利于營(yíng)養(yǎng)的吸收、降解基質(zhì)蛋白從而有利于寄生蟲從腸道遷移到肝臟[17，18]。研究還表明，組織蛋白酶L還在免疫逃避和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。它可分解宿主的免疫球蛋白從而破壞宿主的免疫攻擊，并能介導(dǎo)和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活性、抑制Thl免疫反應(yīng)[19-21]。
目前，對(duì)肝片吸蟲組織蛋白酶L的疫苗開發(fā)主要集中在重組蛋白疫苗和DNA疫苗的研究上。有研究表明重組肝片吸蟲組織蛋白酶L具有與天然蛋白相似的功能[22]，且在荷斯坦牛身上免疫后獲得了 48.2%的減蟲率和顯著升高的總IgG [23]。在DNA疫苗的研究中，肝片吸蟲Cat L DNA疫苗免疫大鼠能獲得70%的免疫保護(hù)[24]。然而，要想開發(fā)出高效率的抗肝片吸蟲的疫苗，這樣的免疫保護(hù)率仍顯不足。因此，如何提高疫苗的保護(hù)率就成了目前疫苗開發(fā)的熱點(diǎn)。本發(fā)明正是著眼于提高肝片吸蟲Cat LI DNA疫苗的免疫保護(hù)率，從提高其抗原在樹突狀細(xì)胞中的呈遞作用入手，利用樹突狀細(xì)胞(DC)的表面分子DEC-205的單鏈抗體ScFvm45能靶向DC細(xì)胞的重要作用機(jī)理，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat LI基因的DNA疫苗后對(duì)肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高肝片吸蟲Cat LI DNA疫苗的免疫保護(hù)率。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)肝片吸蟲疫苗保護(hù)率和疫苗抗原呈遞效率低下的現(xiàn)狀，本發(fā)明主要著眼于提供一種利用DC特異性單鏈抗體提高肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI )DNA疫苗免疫保護(hù)率的新方法，用于指導(dǎo)抗肝片吸蟲DNA疫苗的研發(fā)。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種提高肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI)免疫保護(hù)率的方法，所述方法包括以下步驟:1.運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈 式反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增目的基因，將擴(kuò)增得到的Cat LI基因回收后連接入PMD18-T載體，得到pMD-Cat LI (SEQ ID N0.2)；2.利用大腸桿菌工程菌(Escherichia coli)和真核細(xì)胞Cos7表達(dá)目的蛋白；3.Cat LI多克隆抗體的制備；4.純化和鑒定目的蛋白；5.設(shè)計(jì)合成單鏈抗體scF/.145的核苷酸序列(SEQ ID N0.1):用單鏈抗體片斷ScFvm45序列，在其5’和3’分別加入CACC堿基和BamH I序列后進(jìn)行全基因合成，合成片斷命名為SF,同時(shí)合成SF的i sotype序列；6.構(gòu)建并鑒定編碼ScFVNU)G_145及目的蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒:將pVAXl和合成的SF進(jìn)行體外連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒pVAXl- SF及步驟I中獲得的pMD-Cat LI分別用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109中，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定后獲得陽性 pVAXl-SF- Cat LI 重組質(zhì)粒(SEQ ID N0.3)；7.動(dòng)物免疫及感染試驗(yàn)；8.動(dòng)物體液及細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)；9.免疫保護(hù)率評(píng)價(jià)。本發(fā)明利用樹突狀細(xì)胞(DC)的表面分子的DEC-205的單鏈抗體scFv 45靶向DC細(xì)胞，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat LI的DNA疫苗后對(duì)肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高FhCat LI的DNA疫苗的免疫保護(hù)率，其優(yōu)點(diǎn)在于:1、與非DC靶向DNA疫苗相比，所采用的DC特異性單鏈抗體能靶向DC細(xì)胞，可特異性提高抗原的呈遞效率，從而提高免疫保護(hù)率(83.1%)。2、采用的骨架質(zhì)粒pVAXl為真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1的升級(jí)構(gòu)件，具有更多的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。3、pVAXl-SF-Cat LI質(zhì)粒免疫后獲得的免疫保護(hù)率顯著高于對(duì)照組，且獲得了較pcDNA-Cat LI疫苗(36.3%)高的免疫保護(hù)率，也較別的學(xué)者以Cat LI為抗原研究的DNA疫苗保護(hù)率(70%)高。本發(fā)明技術(shù)具有針對(duì)性強(qiáng)、效率高、易于操作、效果明顯等特點(diǎn)。該技術(shù)為肝片吸蟲DNA疫苗的開發(fā)提供了一種新的方法，適宜在其他肝片吸蟲候選疫苗分子上引申應(yīng)用，對(duì)抗肝片吸蟲疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)及肝片吸蟲病的免疫防控具有重要的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值。


圖1是本發(fā)明所構(gòu)建的疫苗質(zhì)·粒及其結(jié)構(gòu)。圖2 是 pVAXl-SF- Cat LI 質(zhì)粒及其 isotype 的結(jié)構(gòu)。圖中 scDEC 即 SF, targetprotein即Cat LI。DEC-H, DEC-L分別為SF的重鏈和輕鏈。圖3是單鏈抗體ScFvnK45的核苷酸序列組成(SEQ ID N0.1)。加粗斜體分別為CACC接頭序列和BamH I酶切位點(diǎn)；下劃線為序列的信號(hào)肽SP，該序列廣泛應(yīng)用于真核表達(dá)系統(tǒng)，可促進(jìn)目的基因表達(dá)；斜體下劃線序列為L(zhǎng)inker (G4S)3 ；Linker前為重鏈VH，后為輕鏈VL (見圖2)。圖4是PCR檢測(cè)scFVNU)e_145，Cat LI及二者連接后的質(zhì)粒正確性。A為Cat LlPCR電泳圖，目標(biāo)長(zhǎng)度為720bp。B為ScFvnldc-145PCR電泳圖，目標(biāo)長(zhǎng)度為819bp。C為scFv.145連接Cat LI后PCR電泳圖，目標(biāo)長(zhǎng)度為1539bp。圖5中A是pET32a_Cat LI在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果。M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量。1，pET32a- Cat LI陽性質(zhì)粒在BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中的表達(dá)，所用條件是37°C 1.0mM IPTG誘導(dǎo)4h。2，pET32a空載體;B是Cat LI蛋白純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果。M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量。1-4為純化后蛋白條帶。圖6 中 A 是 pVAXl-Cat LI 轉(zhuǎn)染 Cos7 細(xì)胞后 Western blotting 結(jié)果，1-3 為目標(biāo)蛋白，大小為26.lkD，4為空白對(duì)照PVAXI質(zhì)粒。B是pVAXl-SF轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞后Western blotting結(jié)果，1-3為目標(biāo)蛋白，大小為29.6kD，4為空白對(duì)照pVAXl質(zhì)粒。圖1是質(zhì)粒中目標(biāo)序列的測(cè)序結(jié)果(SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3)。圖8是大鼠免疫后血清中抗體水平。與pVAXl-Cat LI及pcDNA-Cat LI相比，pVAX1-SF-Cat LI能刺激大鼠產(chǎn)生顯著高水平的IgGl。*，#分別代表與pVAXl_SF_Cat LI組相比差異顯著和極顯著(p〈0.05, p〈0.01)。圖9是外周血細(xì)胞因子IL4、IL5和IFNy的含量。與pVAXl-Cat LI及pcDNA-CatLI相比，pVAX 1-SF-Cat LI能刺激大鼠產(chǎn)生顯著高水平的IL4和IL5。*，林分別代表與pVAX 1-SF-Cat LI組相比差異顯著和極顯著(ρ〈0.05, ρ〈0.01)。圖10是脾細(xì)胞增殖反應(yīng)結(jié)果。與pVAXl-Cat LI及pcDNA-Cat LI相比，pVAX 1-SF-Cat LI能刺激大鼠脾細(xì)胞顯著增殖。*代表與pVAXl_SF_Cat LI組相比差異顯著(ρ〈0.05)。圖11是疫苗免疫后受囊蝴感染攻擊后成活的蟲體數(shù)量。與pVAXl-Cat LI及pcDNA-Cat LI相比，pVAXl_SF_Cat LI使大鼠中蟲體成活數(shù)量較pVAXl組顯著降低。*代表與pVAXl組相比差異顯著(p〈0.05)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明具體的方法按如下步驟操作:1.運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增目的基因根據(jù)GenBank收錄的肝片吸蟲Cathepsin LI (登錄號(hào)AY573569.1)序列(序列ORF總長(zhǎng)720bp，蛋白大小26.1KDa)，應(yīng)用Oligo 5.0設(shè)計(jì)特異性克隆(Pl，P2)。Pl- 5’CCGGATCCGTA CTG ACT ATT GGA TTGTG 3’，P2-5’ CC GAATTCTCA CGG AM TCG TGC CAC CA3’，在克隆引物P1，P2的上下游分別引入BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)(劃線部分)。肝片吸蟲Cat LI的總RNA提取采用Trizol試劑盒進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 5min，95°C 40s, 55°C 45s，72°C 60s，30 個(gè)循環(huán)。最后 72°C延伸 lOmin。每次PCR設(shè)陽性和空白對(duì)照。將擴(kuò)增得到的Cat LI基因回收后連接入pMD18-T載體(pMD-CatLI )，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109中，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行初步1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后測(cè)序確定序列的正確性。2.利用大腸桿菌工程菌(Escherichia coli)表達(dá)和純化目的蛋白應(yīng)用Oligo 5.0 設(shè)計(jì)特異性表達(dá)引物Pel, Pe2，Pel_5’ GGGAATTCCATATG GTA CTGACT ATT GGA TTG TG 3’，Pe2~5'~CGG CTCGAG TCA CGG MA TCG TGC CAC CA 3’，并在其上下游分別引入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)(劃線部分)。以陽性質(zhì)粒pMD-Cat LI為模板，用表達(dá)引物Pel, Pe2進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，95°C 45s, 56 °C 40s, 72 °C60s, 30個(gè)循環(huán)。最后72°C延伸lOmin。將擴(kuò)增得到的帶酶切位點(diǎn)的Cat LI基因回收后進(jìn)行Nde I和Xho I酶切，所得片斷與同樣經(jīng)Nde I和Xho I酶切的pET32a載體連接過夜(4°C),構(gòu)建pET32a- Cat LI表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化陽性質(zhì)粒入BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。選取經(jīng)PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行體外IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌在37°C生長(zhǎng)至0D600nm的濃度為0.6時(shí)加入ImM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)，將所得細(xì)菌6000g離心30min后獲取沉淀并稱重。然后按lg/5ml His-Tag結(jié)合緩沖液的比例加入緩沖液后作用20min，然后用超聲波反復(fù)作用30次(條件為24KHz，30sec開，30sec關(guān))。將處理后產(chǎn)物于6000g離心30min，取上清，并利用His-Tag融合蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，然后用PBS緩沖液透析24小時(shí)后備用。蛋白濃度測(cè)定采用Coomasie proteinassay測(cè)定。3.Cat LI多克隆抗體的制備將5只6-7周齡雌性SD大鼠分別后腿肌肉注射30 μ g/只的純化后的Cat LI蛋白，總共進(jìn)行3次免疫，每次間隔I周，最后I次免疫后I周采血分離血清備用。抗體的濃度測(cè)定米用Coomasie protein assay測(cè)定。4.Western blotting 鑒定目的蛋白將步驟2中利用His-Tag融合蛋白純化試劑盒純化后的蛋白進(jìn)行SDS_PAGE(30V，Ih)電泳后轉(zhuǎn)至尼龍膜上進(jìn)行Western blotting鑒定。將膜用15ml I XTBS清洗2次后加入5%脫脂奶粉TBS液封閉未結(jié)合蛋白位點(diǎn)。經(jīng)過2次IXTTBS再清洗后，將尼龍膜撫育在多克隆抗體中l(wèi)h，用所獲得的Cat LI多克隆血清(1:300稀釋)，再經(jīng)2次IXTTBS清洗后加入羊抗鼠IgG (1:5000)孵育8h，經(jīng)2次IXTTBS清洗后加入發(fā)光底物Chemi Glow，然后進(jìn)行成像處理以鑒定蛋白的表達(dá)情況。5.設(shè)計(jì)合成單鏈抗體ScFvnldg-145的核苷酸序列(SEQ ID N0.1)根據(jù)文獻(xiàn)[25]報(bào)道的單鏈抗體片斷scFv 45序列，在其5’和3’分別加入CACC堿基和BamH I序列后進(jìn)行全基因合成，合成片斷命名為SF，同時(shí)合成SF的isotype序列。6.質(zhì)粒 pVAXl- SF-Cat LI 的構(gòu)建將pVAXl和合成的SF進(jìn)行體外連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒pVAXl- SF及方法I中獲得的pMD-Cat LI分別用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4 DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109中，利用質(zhì)粒提取試劑盒(QIANGEN)提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定后獲得陽性pVAXl-SF- Cat LI重組質(zhì)粒。疫苗的設(shè)計(jì)和構(gòu)建示意圖見圖1，2。7.質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染及鑒定經(jīng)過柱分離純化后的陽性重組子pVAXl-SF-Cat LLpVAXl-1SOSF-Cat LI及pVAXl空質(zhì)粒，分別用質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染至70-85%單層Cos7細(xì)胞，即準(zhǔn)備兩個(gè)Eppendorf管,在第一管中加入1.25 μ g質(zhì)粒和500 μ I Opt1-MEM I (invitrogrn)。在第二管中加入2μ IIipofectamine 和 500 μ I Opt1-MEM I jmin后將兩管混合并再作用 20min后，將此 1000 μ I混合液與3ml70-85%單層Cos7細(xì)胞(含有10%FCS的RMPI1640)混合并孵育5min。將細(xì)胞清洗2次后于IlOOg離心lmin，然后再與3mllO%FCS的RMPI1640 37°C孵育48h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，12，OOOg離心5min后分別收集上清和細(xì)胞沉淀。上清液經(jīng)離心沉淀后，用所獲得的Cat LI多克隆血清(1:300稀釋)或SF抗體(1:500)，羊抗鼠IgG (1:5000)發(fā)光底物Chemi Glow進(jìn)行Western Blotting鑒定質(zhì)粒的表達(dá)情況。8.DNA質(zhì)粒的大量制備將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌后接種500ml含有50 μ g/ml氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)物于4°C 6000g離心30min后收集沉淀，并按照QIAGEN-tip 500試劑盒說明進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取。獲得的質(zhì)粒用UV260nm測(cè)定其濃度后儲(chǔ)存于4°C備用。9.肝片吸蟲囊蝴的獲取從自然感染肝片吸蟲的牛糞便中收集蟲卵并置于平皿中于室溫孵育18天，然后將蟲卵暴露在光線下刺激2h以獲取毛蝴。將2只毛蝴感染I只截口土蝸，然后正常飼喂截口土蝸68天。此后即可收集囊蝴。將收集到的囊蝴置于透明玻璃紙，于4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?0.動(dòng)物免疫，感染試驗(yàn)及保護(hù)率評(píng)估

將70只6-8周齡雌性SD大鼠隨機(jī)分成7組，每組10只，分別在腿部肌肉注PBS空白對(duì)照，40 μ g/ 只 PVAXI 空質(zhì)粒，pVAXl-Cat LI, pVAXl- SF, pVAXl-1SOSF-Cat LI,pVAX 1-SF-Cat LI和pcDNA-Cat LI (對(duì)照質(zhì)粒，由實(shí)驗(yàn)室保存)質(zhì)粒，總共進(jìn)行2次免疫，每次間隔7天。第2次免疫后14天將其中35只大鼠采血I次進(jìn)行抗體水平測(cè)定，同時(shí)將其中的35只(每組5只)用作囊蝴感染，每只大鼠經(jīng)口感染30個(gè)囊蝴，在感染后63天即可處死大鼠，根據(jù)最后獲得的肝片吸蟲數(shù)量來評(píng)估疫苗保護(hù)率。11.動(dòng)物體液免疫評(píng)估采用間接ELISA對(duì)肝片吸蟲特異性IgGl和IgG2a進(jìn)行測(cè)定，即應(yīng)用本試驗(yàn)pET32a表達(dá)載體表達(dá)的CatLl蛋白(5mg/ml，50l.! I/孔)包被96孔ELISA平板，于4°C過夜。然后用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育，在進(jìn)行2次TBST洗滌后加入50 μ I/孔的倍比系列稀釋的血清(起始濃度1:100)，于4°C孵育過夜。將平板洗滌后加入1:6000稀釋的IgGl或1:4000稀釋的IgG2a，并于室溫孵育2h，然后加入50 μ I/孔的50% ΤΜΒ-50%Η202顯色，當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)加入50 μ I/孔IMmH2SO4終止反應(yīng)并于450nm讀數(shù)OD值。抗體效價(jià)的判定標(biāo)準(zhǔn)為:取大于標(biāo)準(zhǔn)差3倍的0.D值所對(duì)應(yīng)的最大稀釋度為抗體效價(jià)。12.動(dòng)物細(xì)胞免疫評(píng)估采用夾心ELISA對(duì)肝片吸蟲感染引起的外周血中細(xì)胞因子水平進(jìn)行測(cè)定，所用試劑均為商品試劑盒。分別于96孔板加入50μ I/孔的捕獲抗體(IL4，1:500 ;IL5，1:500 ；IFN y , 1:250)進(jìn)行抗體包被，并于4°C過夜。在用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育2h后分別加入5(^1/孔倍比倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗體(起始濃度11^4，8叩/1111 ；IL5,10ng/ml ；IFN y , 50ng/ml)及50 μ I/孔的血清樣品，并于4°C過夜。洗滌3次后加入生物素標(biāo)記的抗體(終濃度IL4，IL5，IFN Y I μ g/ml),于室溫孵育Ih后加入AMDEX鏈霉親和素孵育30min。洗滌3次后加Λ 50 μ I/孔50% ΤΜΒ-50%Η202顯色，當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)加入50 μ I/孔lMmH2S04終止反應(yīng)并于450nm讀數(shù)OD值。13.T細(xì)胞增殖試驗(yàn) 于大鼠第二次免疫后14天獲取大鼠脾臟，在無菌條件下獲取脾單細(xì)胞培養(yǎng)物，用紅細(xì)胞裂解液處理后重懸細(xì)胞，以IO6/孔的細(xì)胞密度在96孔板上培養(yǎng)脾細(xì)胞(培養(yǎng)液為Sigma公司的RPM1-1640)。然后分別加入重組表達(dá)的CatLl蛋白(10 μ g/ml)，刀豆蛋白A(ConA, I μ g/ml)進(jìn)行體外刺激培養(yǎng)。以RPMI基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照組。培養(yǎng)48小時(shí)后，力口A 10% Alamar Blue (Invitrogen)后24小時(shí)于540nm讀取OD值，以此測(cè)定T細(xì)胞的體外增殖情況。注:所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 4.0軟件進(jìn)行處理,使用ANOVA方法并結(jié)合Mann Whitney U test進(jìn)行分析處理，P < 0.05判為差異顯著，P 0.001判為差異極顯者。實(shí)驗(yàn)例:本發(fā)明主要分為兩大板塊。一是設(shè)計(jì)并構(gòu)建實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒，一是對(duì)疫苗免疫大鼠的效果評(píng)價(jià)。以下將結(jié)合附圖進(jìn)行詳細(xì)闡述:一、設(shè)計(jì)并構(gòu)建實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒首先，為獲取候選疫苗基因FhCat LI，將從牛體肝臟中獲取的新鮮蟲體用于提取mRNA(具體提取方法見QIAGEN mRNA試劑盒)。然后將用RT-PCR方法獲取FhCat LI基因的cDNA及所需要的ORF片斷，并將其連接到pMD-18克隆載體中，形成pMD-Cat LI質(zhì)粒，然后進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定(見圖4)，測(cè)序結(jié)果見圖7 (SEQ ID N0.2)，與預(yù)期結(jié)果完全吻合。接下來就進(jìn)行FhCat LI ORF片斷的表達(dá)，此時(shí)可用設(shè)計(jì)好的引物(Pel，Pe2)以pMD-Cat LI為模板，擴(kuò)增目標(biāo)基因片斷，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET32a- Cat LI，經(jīng)測(cè)序等鑒定為陽性質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)，在37°C和適當(dāng)濃度IPTG的刺激下獲得高度表達(dá)的Cat LI蛋白，然后將此蛋白經(jīng)HiS-Tag柱純化后透析，最后收獲蛋白，蛋白濃度為1.54mg/ml。整個(gè)蛋白的表達(dá)見圖5，其中A為蛋白在ImM IPTG刺激下獲得的SDS-PAGE蛋白條帶，B為過柱純化后獲得的片斷SDS-PAGE蛋白條帶，所有條帶大小均符合蛋白預(yù)期分子量。在運(yùn)用western blotting方法鑒定此蛋白前,需要獲得Cat LI的多克隆抗體,為此，將5只6-7周齡雌性SD大鼠分別后腿肌肉注射30 μ g/只的純化后的Cat LI蛋白，總共進(jìn)行3次免疫,每次間隔I周,最后I次免疫后I周采血分離血清用于western blotting。在獲得Cat LI的多克隆抗體后，將方法2中利用His-Tag融合蛋白純化試劑盒純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE (30V，Ih)電泳后轉(zhuǎn)至尼龍膜上進(jìn)行Western blotting鑒定。將膜用15ml IXTBS清洗2次后加入5%脫脂奶粉TBS液封閉未結(jié)合蛋白位點(diǎn)。經(jīng)過2次IXTTBS再清洗后，將尼龍膜撫育在多克隆抗體中l(wèi)h，用所獲得的Cat LI多克隆血清(1:300稀釋)，再經(jīng)2次I X TTBS清洗后加入羊抗鼠IgG (1:5000)孵育8h，經(jīng)2次I X TTBS清洗后加入發(fā)和光底物Chemi Glow,然后進(jìn)行成像處理以鑒定蛋白的表達(dá)情況。結(jié)合在真核細(xì)胞Cos7中的表達(dá)(圖6A)并進(jìn)行的Western blotting鑒定,可以確定所獲得的目的蛋白為正確的FhCat LI蛋白。然后設(shè)計(jì)合成單鏈抗體ScFvm45的核苷酸序列。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的單鏈抗體片斷ScFvm45序列，在其5’和3’分別加入CACC堿基和BamH I序列后進(jìn)行全基因合成，合成片斷命名為SF,同時(shí)合成SF的isotype序列。其中的isotype序列是SF的同形異構(gòu)體，不具有特異結(jié)合DEC205的功能。具體的結(jié)構(gòu)見圖3，其中加粗紅色斜體分別為CACC接頭序列和BamH I酶切位點(diǎn)；下劃線為序列的信號(hào)肽SP，該序列廣泛應(yīng)用于真核表達(dá)系統(tǒng)，可促進(jìn)目的基因表達(dá)；黃色序列為L(zhǎng)inker (G4S)3 ；Linker前為重鏈VH，后為輕鏈VL (見圖2)。合成scFvNLDC-1 45的核苷酸序列后即可構(gòu)建質(zhì)粒pVAXl- SF-Cat LI。將pVAXI和合成的SF進(jìn)行體外連接后 轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒pVAXl- SF及方法I中獲得的pMD-Cat LI分別用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4 DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109中，利用質(zhì)粒提取試劑盒(QIANGEN)提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定后獲得pVAXl-SF- Cat LI陽性質(zhì)粒。然后PCR鑒定(見圖3)，并進(jìn)行序列測(cè)定(見圖7 (SEQ ID N0.3))，所得結(jié)果證明序列完全正確，獲得P VAX 1- SF-Cat LI陽性質(zhì)粒，與此質(zhì)粒同時(shí)構(gòu)建的還有其他幾個(gè)質(zhì)粒(見圖1 )，分別都進(jìn)行了鑒定后宣告本實(shí)驗(yàn)所需要的所有質(zhì)粒構(gòu)建完成。接下來要進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，其前提是要獲得足夠的質(zhì)粒，所以進(jìn)行了 DNA質(zhì)粒的大量制備方法是將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌后接種500ml含有5(^8/!111氨芐西林的1^培養(yǎng)基中，371:培養(yǎng)1611。將培養(yǎng)物于41: 6000g離心30min后收集沉淀，并按照QIAGEN-tip 500試劑盒說明進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取。獲得的質(zhì)粒用UV260nm測(cè)定其濃度后儲(chǔ)存于4°C備用。二、對(duì)疫苗免疫大鼠的效果評(píng)價(jià)在獲得大量質(zhì)粒后，需要對(duì)大鼠進(jìn)行免疫，并對(duì)免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。在獲得大量肝片吸蟲囊蝴后(見方法9)，本試驗(yàn)將將70只6-8周齡雌性SD大鼠隨機(jī)分成7組，每組10只，分別在腿部肌肉注PBS空白對(duì)照，40μ g/只pVAXl空質(zhì)粒，pVAXl-Cat LI，pVAXl- SF,pVAXl-1SOSF-Cat LLpVAXl-SF-Cat LI 和 pcDNA-Cat LI (對(duì)照質(zhì)粒，由實(shí)驗(yàn)室保存)質(zhì)粒，總共進(jìn)行2次免疫，每次間隔7天。第2次免疫后14天將其中35只大鼠采血I次進(jìn)行抗體水平測(cè)定，同時(shí)將其中的35只(每組5只)用作囊蝴感染，每只大鼠經(jīng)口感染30個(gè)囊蝴，在感染后63天即可處死大鼠，采集血液和脾臟以備實(shí)驗(yàn)。在接下來的動(dòng)物體液免疫評(píng)估中，采用間接ELISA對(duì)肝片吸蟲特異性IgGl和IgG2a進(jìn)行測(cè)定，即應(yīng)用本試驗(yàn)pET32a表達(dá)載體表達(dá)的CatLl蛋白(5mg/ml，50 μ I/孔)包被96孔ELISA平板，于4°C過夜。然后用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育，在進(jìn)行2次TBST洗滌后加入50μ I/孔的倍比系列稀釋的血清(起始濃度1:100)，于4°C孵育過夜。將平板洗滌后加入1:6000稀釋的IgGl或1:4000稀釋的IgG2a，并于室溫孵育2h，然后加入50 μ I/孔的50% ΤΜΒ-50%Η202顯色，當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)加入50 μ I/孔IMmH2SO4終止反應(yīng)并于450nm讀數(shù)OD值。抗體效價(jià)的判定標(biāo)準(zhǔn)為:取大于標(biāo)準(zhǔn)差3倍的0.D值所對(duì)應(yīng)的最大稀釋度為抗體效價(jià)。所得的抗體效價(jià)見圖8，結(jié)果顯示pVAXl-SF-Cat LI免疫可刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的I gG I，且 I gG I 的水平較 I gG2a 高。pVAX I 空質(zhì)粒，pVAX 1-Cat LI，pVAX 1-SF，pVAX 1-1 SOSF-CatLI和pcDNA-Cat LI免疫大鼠后產(chǎn)生的IgGl均顯著低于pVAXl-SF-Cat LI，但在IgG2a上，組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。動(dòng)物細(xì)胞免疫評(píng)估采用夾心ELISA對(duì)肝片吸蟲感染引起的外周血中細(xì)胞因子水平進(jìn)行測(cè)定，所用試劑均為商品試劑盒。分別于96孔板加入50 μ I/孔的捕獲抗體(IL4，1:500 ;IL5，1:500 ；IFNy ,1:250)進(jìn)行抗體包被，并于 4°C過夜。在用 200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育2h后分別加入50 μ I/孔倍比倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗體(起始濃度IL4，8ng/ml ；IL5, IOng/ml ；IFNy ,50ng/ml)及50 μ I/孔的血清樣品，并于4°C過夜。洗滌3次后加入生物素標(biāo)記的抗體(終濃度IL4，IL5，IFNy I μ g/ml)，于室溫孵育Ih后加入AMDEX鏈霉親和素孵育30min。洗滌3次后加入50 μ I/孔50% ΤΜΒ-50%Η202顯色，當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)加入50 μ I/孔IMmH2SO4終止反應(yīng)并于450nm讀數(shù)OD值。結(jié)果見圖9，顯示pVAXl-SF-Cat LI能刺激大鼠產(chǎn)生 IL4 和 IL5，且較 pVAXl 空質(zhì)粒，pVAXl-Cat LI, pVAXl-SF 和 pcDNA-Cat LI 顯著增加，而IFNy的規(guī)律卻與IL4和IL5不同，各組間無明顯差異。為進(jìn)行T細(xì)胞增殖試驗(yàn)，于大鼠第二次免疫后14天獲取大鼠脾臟，在無菌條件下獲取脾單細(xì)胞培養(yǎng)物，用紅細(xì)胞裂解液處理后重懸細(xì)胞，以IO6/孔的細(xì)胞密度在96孔板上培養(yǎng)脾細(xì)胞(培養(yǎng)液為Sigma公司的RPM1-1640)。然后分別加入重組表達(dá)的CatLl蛋白(10 μ g/ml),刀豆蛋白A (ConA, I μ g/ml)進(jìn)行體外刺激培養(yǎng)。以RPMI基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照組。培養(yǎng)48小時(shí)后，加入10% Alamar Blue (Invitrogen)后24小時(shí)于540nm讀取OD值，以此測(cè)定T細(xì)胞的體外增殖情況。圖10表明，與pVAXl-Cat LI及pcDNA- Cat LI相比，pVAX 1-SF-Cat LI能刺激大鼠脾細(xì)胞顯著增殖。最后，本研究對(duì)疫苗的保護(hù)效率進(jìn)行了直觀評(píng)價(jià)，于第2次免疫后14天將將其中的35只(每組5只)用作囊蝴感染，每只大鼠經(jīng)口感染30個(gè)囊蝴，在感染后63天即可處死大鼠，根據(jù)最后獲得的肝片吸蟲數(shù)量來評(píng)估疫苗保護(hù)率。保護(hù)率的計(jì)算按照(PVAX1空質(zhì)粒免疫組的蟲體數(shù)量減去pVAXl-SF-Cat LI或pcDNA-Cat LI免疫組蟲體的數(shù)量)除以pVAXl空質(zhì)粒免疫組的蟲體數(shù)量的百分?jǐn)?shù)來記錄。試驗(yàn)結(jié)果(見圖ll)，pVAXl-SF-Cat LI獲得83.1%保護(hù)率，而對(duì)照組pcDNA-Cat LI卻只獲得36.3%減 蟲率。本發(fā)明利用樹突狀細(xì)胞(DC)的表面分子DEC-205的單鏈抗體SCFVNU)G_145靶向DC細(xì)胞，提高了 Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat LI的DNA疫苗后對(duì)肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高了 FhCat LI DNA疫苗的免疫保護(hù)率，且與常用的以pcDNA3.1為骨架且無DC靶向的疫苗(本研究為pcDNA-Cat LI)相比，具有很大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可用于我國(guó)抗肝片吸蟲病DNA疫苗的開發(fā)。參考文獻(xiàn):1.Mas-Coma MS, Esteban JGj Bargues MD.Epidemiology of humanfascioliasis: a review and proposed new classification.Bulletin of the WorldHealth Organization 1999，77(4):340 - 6.
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25.Demangel C，Zhou J，Choo ABj Shoebridge G，Halliday GMj BrittonWJ.Single chain antibody fragments for the selective targeting of antigens todendritic cells.Mol Immunol, 2005，42:979 - 985。SEQ ID N0.1〈110〉西南大學(xué)〈120〉一種提高肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI) DNA疫苗免疫保護(hù)率的方法〈160〉3<170> PatentIn version 3.5〈210〉 I〈211〉814〈212〉DNA 〈213〉ScFvnldc-145 with CACC and BamH Icaccgccgcc accatggatt ttcaggtgca gattttcagc ttcctgctaa tcagtgcctc 60agtcataata tccagaggag aggtgaagct gcagcagtct ggaactgaag tggtaaagcc 120tggggcttca gtgaagttgt cctgcaaggc ttctggctac atcttcacaa gttatgaata 180gactgggtga ggcagacgcc tgaacaggga cttgagtgga ttggatggat ttttccggag 240aggggagtac tgaatacaat gagaagttca agggcagggc cacactgagt gtagacaagt 300cctccagcac agcctatatg gagctcacta ggctgacatc tgaggactct gctgtctatt 360tctgtgctag aggggactac tataggcgct actttgactt gtggggccaa gggaccacgg 420tcaccgtctc ctcaggcggc ggtggatcag gtggcggagg ttctggcggt ggtgggtccg 480acatccagat gacccagagc ccctccttcc tctctaccag tctgggcaac tccatcacca 540tcacctgcca cgccagccag aacatcaagg gctggctggc ctggtaccac aaaagagcgg 600caacgccccc cagctgctca tctacaaggc cagctccctg cagtccggcg tgcccagccg 660cttctccggc tctggttctg gcaccgacta catcttcacc atctccaacc tccagcccga 720ggacatcgcc acctactatt gccagcacta ccagtccttc ccctggacct tcggcggtgg 780aaccaagctg gagatcaagc gcgccgctgg atcc814SEQ ID N0.2〈210〉2〈211〉726〈212〉DNA〈213〉 Cat-Ll in pM-Cat-Ll plasmidatgccacgcg cgtccgatat actctcacac ggtatcccgt atgaggcgaa caaccgtgcc 60gtacccgaca aaattgactg gcgtgaatct ggttatgtga cgggggtgaa agatcaggga 120aactgtggtt cctgttgggc tttctcaaca accggtacta cggagggaca gtatatgaaa 180aacgagagaa ctagtatttc attctctgag caacaactgg tcgattgtag cggtccttgg 240ggaaataatg gttgcggtgg tggattgatg gaaaatgcat atgaatattt gaaacaattt 300
權(quán)利要求
1.一種提高肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI) DNA疫苗免疫保護(hù)率的方法，所述方法包括以下步驟: 1)運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR擴(kuò)增目的基因肝片吸蟲CatLI，將擴(kuò)增得到的Cat LI基因回收后連接入pMD18-T載體，獲得pMD-Cat LI (SEQ ID N0.2)； 2)利用大腸桿菌工程菌(Escherichiacoli)和真核細(xì)胞Cos7表達(dá)目的蛋白； 3)制備CatLI多克隆抗體 4)純化和鑒定目的蛋白 5)設(shè)計(jì)合成單鏈抗體ScFvm45的核苷酸序列SEQID N0.1:用單鏈抗體片斷ScFvm45序列，在其5’和3’分別加入CACC堿基和BamH I序列后進(jìn)行全基因合成，合成片斷命名為SF,同時(shí)合成SF的i sotype序列； 6)構(gòu)建并鑒定編碼SCFVNU)e_145及目的蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒:將pVAXl和合成的SF進(jìn)行體外連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒P VAX 1- SF及步驟I中獲得的pMD-Cat LI分別用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4 DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 到感受態(tài)細(xì)胞JM109中，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定后獲得PVAXl-SF- Cat LI 陽性質(zhì)粒，pVAXl- SF-Cat LI 中 SF-Cat LI 序列為 SEQ ID N0.3 ； 7)動(dòng)物免疫及感染試驗(yàn)； 8)動(dòng)物體液及細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)； 9)免疫保護(hù)率評(píng)價(jià)。
全文摘要
一種提高肝片吸蟲Cat L1(FhCat L1)DNA疫苗免疫保護(hù)率的方法，所述方法從提高其抗原在樹突狀細(xì)胞中的呈遞作用入手，利用樹突狀細(xì)胞(DC)的表面分子的DEC-205的單鏈抗體scFvNLDC-145能靶向DC細(xì)胞的重要作用機(jī)理，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat L1的DNA疫苗后對(duì)肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高FhCat L1的DNA疫苗的免疫保護(hù)率。
文檔編號(hào)A61P33/12GK103083684SQ20121050885
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者羅洪林 申請(qǐng)人:西南大學(xué)