專(zhuān)利名稱(chēng)：：動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的基因?qū)W鑒定，特別是涉及動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：華支睪吸蟲(chóng)病是由后睪科支睪屬的華支睪吸蟲(chóng)(ao"orc/^w'"era/s)寄生于犬、貓、豬等動(dòng)物及人膽管內(nèi)所引起的一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病，俗稱(chēng)肝吸蟲(chóng)病。華支睪吸蟲(chóng)寄生在淡水螺、淡水魚(yú)、淡水蝦、犬、豬、牛、鼠、家兔、豚鼠、狐貍和家禽等動(dòng)物，人為終末宿主，本病可使肝臟腫大并導(dǎo)致其他肝病變，病情多呈慢性經(jīng)過(guò)，臨床上可見(jiàn)精神沉郁，食欲減退和下痢等癥狀，重者可致肝硬化甚至癌變，少數(shù)兒童和青少年患者可致侏儒癥，并發(fā)癥多達(dá)21種，對(duì)人類(lèi)健康的影響不容忽視。華支睪吸蟲(chóng)病呈地方性流行，在東南亞國(guó)家較常見(jiàn)，該病在我國(guó)已有很長(zhǎng)的歷史，流行廣泛，目前華支睪吸蟲(chóng)病有逐年上升的趨勢(shì)，其發(fā)生和流行除了跟人們的一些不良飲食習(xí)慣如生食魚(yú)蝦等有關(guān)系外，其中間宿主(淡水螺、淡水蝦等)以及保蟲(chóng)宿主(保蟲(chóng)宿主有貓、犬、豬、牛、鼠、狐貍和家禽等動(dòng)物)在其流行過(guò)程中是十分重要和關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。分子生物學(xué)方法已開(kāi)始應(yīng)用于華支睪吸蟲(chóng)的分子鑒定上。PCR以其高度的特異性和敏感性，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，尤其對(duì)各種病原體的檢測(cè)和疾病的診斷中。目前，在寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域，用于疾病診斷和蟲(chóng)體檢測(cè)的PCR方法很多，如常規(guī)PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、套式PCR、免疫磁性捕獲PCR、熒光定量PCR(FQ-PCR)等。Le(LeTH，VanDeN，BlairD,etal.ClonorchissinensisandOpisthorchisviverrini:developmentofamitochondrial-basedmultiplexPCRfortheiridentificationanddiscrimination.ExpParasitol.2006,112(2):109-14)通過(guò)設(shè)i十兩對(duì)線粒體DNA引物，用多重PCR方法成功對(duì)華支睪吸蟲(chóng)和麝貓后睪吸蟲(chóng)進(jìn)行鑒別診斷，能檢測(cè)到最低樣品DNA量為0.78ng;Parvathi等(ParvathiA,JieyuanL，IddyaK,etal.C7o"wr/^w'"e脂、Developmentandevaluationofanestedpolymerasechainreaction(PCR)assay.ExpParasitol,2007,115(3):291-295)首先對(duì)華支睪吸蟲(chóng)的基因組用隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，選擇合適的部位設(shè)計(jì)兩對(duì)引物進(jìn)行巢式PCR，結(jié)果表明，該方法具有很好的敏感性和特異性，能檢測(cè)到魚(yú)肉中最低華支睪吸蟲(chóng)囊呦的DNA為10'5ng，有望在華支睪吸蟲(chóng)魚(yú)的流行情況調(diào)查以及動(dòng)物的糞便檢査中得到應(yīng)用。人體華支睪吸蟲(chóng)病診斷技術(shù)的研究一直是醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，已建立了多種診斷檢測(cè)方法，包括蟲(chóng)卵檢查、皮內(nèi)試驗(yàn)(IT)、B超、CT、間接血凝免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、單克隆抗體ELISA(McAb-ELISA)以及免疫膠體金方法等，但在獸醫(yī)領(lǐng)域，均未見(jiàn)應(yīng)用于動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的診斷，目前動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病主要還是依靠糞檢患畜蟲(chóng)卵的方法進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，因?yàn)榇朔N方法敏感性不高，極易漏檢，也易誤診。從糞便中提取DNA—直是個(gè)難點(diǎn)，糞便的成分復(fù)雜，含有各種各樣抑制PCR的物質(zhì)，如膽鹽、多糖等。目前能從糞便中提取DNA的方法要么就是需要繁瑣的步驟，如免疫磁性分離法、梯度離心法、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)等，要么就是需要用到昂貴的DNA提取試劑盒。如能用快速、簡(jiǎn)便的方法從糞便中提取到寄生蟲(chóng)的DNA，將會(huì)有重大的意義，能對(duì)疾病進(jìn)行及早的診斷，預(yù)防疾病的發(fā)生。PCR檢測(cè)方法敏感性高、一次檢測(cè)大量樣品、避免主觀偏差等優(yōu)越性預(yù)示著它在特異性診斷、流行病學(xué)調(diào)查和藥物治療監(jiān)控等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer,ITS)是核糖體DNA中介于18S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括第一、第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS-l和ITS-2)兩段序列，ITS序列存在于高度重復(fù)的核糖體中，進(jìn)化速度快且長(zhǎng)度不大，加上協(xié)同進(jìn)化使該片段在基因組不同單元間十分一致，因而十分適合進(jìn)行各種分子操作。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過(guò)對(duì)動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病ITS序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)得到的能專(zhuān)一性鑒別動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種運(yùn)用上述動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物對(duì)動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病進(jìn)行簡(jiǎn)便、高效的特異性檢測(cè)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物的試劑盒。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明人根據(jù)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)研究室已測(cè)得的華支睪吸蟲(chóng)ITS序列，還有來(lái)自GenbankTM的貓后睪吸蟲(chóng)和部分麝貓后睪吸蟲(chóng)ITS序列，以及其它一些寄生于肝臟的吸蟲(chóng)的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)出能專(zhuān)一性鑒別動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)鑒定動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病。上述特異性引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。采用上述特異性引物，用常規(guī)的PCR方法即可實(shí)現(xiàn)動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的特異性檢測(cè)。一種動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)華支睪吸蟲(chóng)囊呦DNA的提取或蟲(chóng)卵DNA的提?。?2)以步驟(1)提取的DNA為模板，采用上述動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物(上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增；(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，紫外光下觀察特異性擴(kuò)增條帶，陽(yáng)性結(jié)果會(huì)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，陰性結(jié)果則不會(huì)出現(xiàn)；上述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增條件采用常規(guī)操作即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明；實(shí)際應(yīng)用時(shí)還可選擇如下PCR擴(kuò)增體系總體系為2.5ml，含有上述動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物，終濃度各為0.5pmol4d;pH8.3的Tris-HCl,終濃度為10mM;KC1，終濃度為50mM，4個(gè)dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)，終濃度各200iaM，MgCl2，終濃度為2.5mM;TaqDNA聚合酶按每個(gè)PCR反應(yīng)含0.625U加入。上述步驟(3)中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，紫外光下觀察特異性擴(kuò)增條帶，以華支睪吸蟲(chóng)陽(yáng)性DNA作為陽(yáng)性對(duì)照品，以無(wú)DNA超純水作為陰性對(duì)照，待檢樣品若觀察到一條與華支睪吸蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照同一位置出現(xiàn)的400bp的片段，而該位置處陰性對(duì)照沒(méi)有條帶，則說(shuō)明該待測(cè)樣品感染有華支睪吸蟲(chóng)病。針對(duì)上述檢測(cè)方法，本發(fā)明人從MgCl2的濃度和退火溫度兩方面進(jìn)行調(diào)整來(lái)優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，MgCl2的濃度梯度分別為1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM和3.5mM、4.0mM，退火溫度梯度分別為50°C、54°C、58°C、61。C和68°C，以期獲得本發(fā)明特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得特異性片段的最佳Mg^濃度和最佳退火溫度，經(jīng)試驗(yàn)確定，最佳退火溫度為61°C，MgCl2的濃度為2.5mM，循環(huán)數(shù)選擇為30個(gè)循環(huán)。上述PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性5分鐘；94。C變性30秒、61'C退火30秒、72t延伸30秒，30個(gè)循環(huán)；72'C后延伸5分鐘。采用上述動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性引物，制備檢測(cè)試劑盒，可使得動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的檢測(cè)更加快速、便利。一種動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性，包括如下部分a.PCR反應(yīng)液總體系為2.5ml，含有上述動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物，終濃度各為0.5pmol4d，終濃度為10mM的pH8.3的Tris-HCl，終濃度為50mM的KC1，4個(gè)dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)，終濃度各200pM和終濃度為2.5mM的MgCl2;b.陽(yáng)性對(duì)照品華支睪吸蟲(chóng)陽(yáng)性DNA，lOOpl;c.陰性對(duì)照品無(wú)DNA超純水，100pl。上述檢測(cè)試劑盒還包括TaqDNA聚合酶5U/)il，每個(gè)PCR反應(yīng)含0.625U加入(12.5jil)。上述檢測(cè)試劑盒還可以包括DNA裂解液含有100mM的NaCl、10mM的Tris-Cl(pH8.0)、25mM的EDTA(pH8.0)、1%(質(zhì)量/體積，W/V)的十二烷基磺酸鈉(SDS)和1.7pg/pL的蛋白酶K。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明根據(jù)動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的ITS區(qū)序列數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)的高度特異性檢測(cè)引物，可以準(zhǔn)確地鑒定動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)??；2.本發(fā)明采用特異性檢測(cè)引物配制成的檢測(cè)試劑盒，其成本低、準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)便快速，有利于大規(guī)模推廣；3.本發(fā)明提供的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單高效，通過(guò)特異性檢測(cè)引物，通過(guò)簡(jiǎn)單的PCR，可方便地檢測(cè)動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)??；4.本發(fā)明對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇退火溫度為6rC，MgCl2的濃度為2.5mM，循環(huán)數(shù)選擇為30個(gè)循環(huán)，從而可提高整個(gè)PCR反應(yīng)的特異性，取得更好的檢測(cè)效果；5.本發(fā)明應(yīng)用華支睪吸蟲(chóng)的ITS重復(fù)DNA片段作為遺傳標(biāo)記，建立了用于動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病診斷的快速、特異、敏感的PCR方法；6.本發(fā)明試劑盒操作簡(jiǎn)單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定客觀，可用于動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的診斷和流行病學(xué)調(diào)査。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋?zhuān)唧w實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明作任何限定。實(shí)施例1動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性引物的特異性試驗(yàn)本實(shí)施例選擇經(jīng)過(guò)DNA有效性驗(yàn)證的11陰性對(duì)照寄生蟲(chóng)樣品日本血吸蟲(chóng)、大片吸蟲(chóng)、肝片吸蟲(chóng)、東畢吸蟲(chóng)、犬弓首蛔蟲(chóng)、犬鉤口線蟲(chóng)、貓弓首蛔蟲(chóng)、豬毛首線蟲(chóng)、食道口線蟲(chóng)、豬蛔蟲(chóng)和麝貓后睪吸蟲(chóng)。本實(shí)施例的陽(yáng)性對(duì)照是華支睪吸蟲(chóng)陽(yáng)性DNA。以上述11個(gè)對(duì)照寄生蟲(chóng)樣品DNA各lpL為模板，采用本發(fā)明的動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性引物(上游引物核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)，按照如下PCR反應(yīng)條件進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(超純水)和陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件為94"C預(yù)變性5分鐘；94'C變性30秒，61"C復(fù)性30秒，72'C延伸30秒，30個(gè)循環(huán)；72'C后延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物在P/。TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。結(jié)果顯示華支睪吸蟲(chóng)DNA陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出約400bp的條帶，而上述ll種陰性對(duì)照樣品除麝貓后睪吸蟲(chóng)外，其他10種對(duì)照寄生蟲(chóng)樣品和空白對(duì)照均無(wú)條帶出現(xiàn)。當(dāng)擴(kuò)增條件改為退火溫度為68"C、MgCl2的濃度為1.0mM時(shí)，結(jié)果顯示僅有試劑盒華支睪吸蟲(chóng)DNA陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出約400bp的條帶，而擴(kuò)增不出麝貓后睪吸蟲(chóng)，其它10個(gè)對(duì)照樣品也無(wú)條帶出現(xiàn)。麝貓后睪吸蟲(chóng)主要分布在泰國(guó)、老撾、越南、馬來(lái)西亞和印度，貓后睪吸蟲(chóng)主要流行于俄羅斯及東歐等地區(qū)。由此說(shuō)明，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物能擴(kuò)增出華支睪吸蟲(chóng)病，條帶明亮清晰，與其它蟲(chóng)種無(wú)交反應(yīng)，可用于我國(guó)華支睪吸蟲(chóng)的PCR流行病學(xué)調(diào)查。實(shí)施例2試劑盒的制備本實(shí)施例的試劑盒由如下組分組成a.DNA裂解液30ml:含有l(wèi)OOmM的NaCl、pH8.0的lOmM的Tris-Cl、pH8.0的25mM的EDTA、1%(W/V)的SDS和1.7昭/pL的蛋白酶K;b.PCR反應(yīng)液(100個(gè)反應(yīng)，25pL/反應(yīng))，2.5ml:含有動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性引物(上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)，終濃度各為0.5pmol/nl;終濃度10mM的Tris-HCl(pH8.3)，終濃度50mM的KC1，終濃度各200pM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，終濃度2.5mM的MgCl2;c.陽(yáng)性對(duì)照品華支睪吸蟲(chóng)陽(yáng)性DNAlO(Hil;d.陰性對(duì)照品無(wú)DNA超純水lOOpl;e.TaqDNA聚合酶，5U/pl，12.5^1。實(shí)施例3試劑盒的敏感性試驗(yàn)用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定華支睪吸蟲(chóng)代表性成蟲(chóng)樣品的DNA濃度，然后將DNA原液等倍稀釋成10"、l(T2、10'3、10—4、l(T5、10_6、10—7和10'8八個(gè)稀釋度。分別取各稀釋度的模板DNAlpl，采用實(shí)施例2制備所得試劑盒，PCR總反應(yīng)體系為25pl，具體組分如表l所示，94'C預(yù)變性5分鐘；94"C變性30秒，61'C復(fù)性30秒，72'C延伸30秒，30個(gè)循環(huán)；72"C后延伸5分鐘。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，確定特異弓I物能檢測(cè)到的最低DNA濃度。表lPCR擴(kuò)增體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以確定其敏感性。試驗(yàn)結(jié)果表明該P(yáng)CR檢測(cè)方法敏感性高，最低能檢測(cè)到1.03pgDNA的華支睪吸蟲(chóng)。實(shí)施例4試劑盒的保存期試驗(yàn)取實(shí)施例2制備所得試劑盒，將其分別在4'C和-2(TC保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月，然后用保存條件不同的試劑盒對(duì)已知樣品進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增條件同實(shí)施例3，結(jié)果表明實(shí)施例1制備所得試劑盒可在4°C(Taq酶除外，須-20'C保存)和-2(TC長(zhǎng)期保存，在試驗(yàn)周期的9個(gè)月內(nèi)，在合適保存條件下陽(yáng)性樣品均能擴(kuò)增出目的亮帶，而陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)。實(shí)施例5試劑盒在華支睪吸蟲(chóng)病糞便樣品診斷中的應(yīng)用1.樣品26份華支睪吸蟲(chóng)陽(yáng)性的貓糞。2.DNA的提取取0.1克待檢糞便于1.5mlEppendorf管中，加入含有2%的TritonX-100和0.1M的氫氧化鉀的溶液lml室溫下作用10min，其間不斷搖勻；然后10000rpm離心2min，去上清，重復(fù)前面的步驟清洗兩次；離心去上清后加入1.2ml飽和硫代硫化鈉溶液，混勻，14000rpm離心5min;此時(shí)蟲(chóng)卵主要分布于液面，小部分分布于液體中；分別吸取200pl上清到另一個(gè)1.5mlEppendorf管中，加入1.21111雙蒸水，12000rpm離心2min;去上清，保留100^1左右液體，用移液器吹打使沉淀與液體混勻；然后把各管的液體都移到同一管中，離心管內(nèi)加滿(mǎn)雙蒸水，12000rpm離心2min;去上清，再加入1.2ml雙蒸水，如此重復(fù)35次。最后離心去上清，保留30pl液體，加入液體體積一半的玻璃珠，旋渦震蕩1min后瞬時(shí)離心，沸水中煮5min，最后10000rpm離心lmin，取3pl上清PCR擴(kuò)增。3.PCR擴(kuò)增應(yīng)用實(shí)施例2制備所得試劑盒對(duì)上述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系為25pl，具體組分如表l所示，94"C預(yù)變性5分鐘；94'C變性30秒，61°C復(fù)性30秒，72'C延伸30秒，30個(gè)循環(huán)；72。C后延伸5分鐘。同時(shí)做陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。4.瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物在in/。TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。5.擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列測(cè)定取與試劑盒陽(yáng)性對(duì)照帶形一致的代表性PCR產(chǎn)物送上海博尚生物技術(shù)有限公司，用相應(yīng)的種特異引物進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件進(jìn)行分析，用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。6.結(jié)果與分析26份陽(yáng)性貓糞樣品用以上的方法進(jìn)行處理后的結(jié)果顯示，全部都能擴(kuò)增出400bp大小的特異性條帶，證明了所建立的動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病診斷的PCR檢測(cè)方法可用于動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病糞便樣品的診斷與流行病學(xué)調(diào)查。實(shí)施例6試劑盒在華支睪吸蟲(chóng)病魚(yú)肉樣品診斷中的應(yīng)用1.樣品對(duì)經(jīng)鏡檢確認(rèn)的12份陽(yáng)性魚(yú)肉樣品和3份陰性樣品進(jìn)行特異PCR鑒定。2.DNA的提取取0.03g待檢魚(yú)肉，然后把魚(yú)肉放進(jìn)1.5mlEppendorf管中，剪碎，加入300^1的DNA裂解液，混勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中，37'C作用半小時(shí)，其間不時(shí)搖動(dòng)離心管，提取DNA;消化好的蟲(chóng)體懸液按Promega試劑盒WizardDNAClean-UpSystem使用說(shuō)明提取蟲(chóng)體DNA，直接使用或于-2(TC冰箱保存?zhèn)溆谩?.PCR擴(kuò)增應(yīng)用實(shí)施例2制備所得試劑盒對(duì)上述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系為25jnl，具體組分如表l所示，94"C預(yù)變性5分鐘；94"C變性30秒，61°C復(fù)性30秒，72"C延伸30秒，30個(gè)循環(huán)；72'C后延伸5分鐘。4.瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物在"/。TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。5.擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列測(cè)定取與試劑盒陽(yáng)性對(duì)照帶形一致的的代表性PCR產(chǎn)物送上海博尚生物技術(shù)有限公司，用相應(yīng)的種特異引物進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件進(jìn)行分析，用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。6.結(jié)果與分析12份陽(yáng)性樣品全部都能擴(kuò)增出400bp大小的特異性條帶，證明了所建立的動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病診斷的PCR檢測(cè)方法可用于動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病魚(yú)肉樣品的診斷與流行病學(xué)調(diào)查。動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒序列表SEQUENCELISTING<110〉華南農(nóng)業(yè)大學(xué)-<120>動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒<130〉<160>2<170>Patentlnversion3.5<210〉1<211>20<212〉腿<213>人工序列<400〉1tggcctgactggctggccgg20<210>2<211>20<212>腿<213〉人工序列<400>2cggcaccccacacacataca201權(quán)利要求1、一種動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。2、一種動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)華支睪吸蟲(chóng)囊呦DNA的提取或蟲(chóng)卵DNA的提??；(2)用權(quán)利要求1所述特異性檢測(cè)引物采用常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，紫外光下觀察特異性擴(kuò)增條帶，即可判斷樣品中是否含有動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述特異性檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增條件為94T:預(yù)變性5分鐘；94'C變性30秒、61。C退火30秒、72°C延伸30秒，30個(gè)循環(huán)；72"C后延伸5分鐘。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述特異性檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增體系為總體系2.5ml，含有權(quán)利要求1所述動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物各0.5pmol/pl、10mM的pH8.3的Tris-HCl、50mM的KC1、4個(gè)dNTP各200pM、2.5mM的MgCl2和0.625U的TaqDNA聚合酶。5、一種動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包括如下部分a.PCR反應(yīng)液總2.5ml，含有權(quán)利要求1所述動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物各0.5pmol4d、10mM的pH8.3的Tris-HCl、50mM的KC1、4個(gè)dNTP各200pM和2.5mM的MgCl2;b.陽(yáng)性對(duì)照品華支睪吸蟲(chóng)陽(yáng)性DNA，lOOpl;c.陰性對(duì)照品無(wú)DNA超純水，100|il。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括TaqDNA聚合酶，5U/pl，12.5pl。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括如下部分DNA裂解液30ml:含有100mM的NaCl、10mM的pH8.0的Tris-Cl、25mM的pH8.0的EDTA、1%W/V的十二烷基磺酸鈉和1.7pg4iL的蛋白酶K。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)一種動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病特異性檢測(cè)引物、檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，該特異性引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO2所示。本發(fā)明用上述特異性檢測(cè)引物對(duì)待測(cè)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察，陽(yáng)性結(jié)果會(huì)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，陰性結(jié)果則不會(huì)出現(xiàn)。本發(fā)明根據(jù)動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的ITS區(qū)序列數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，建立了用于動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病診斷的快速、特異、敏感的PCR方法，可準(zhǔn)確地鑒定動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病。本發(fā)明的試劑盒操作簡(jiǎn)單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定客觀，可用于動(dòng)物華支睪吸蟲(chóng)病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。文檔編號(hào)C12N15/11GK101586161SQ20091004039公開(kāi)日2009年11月25日申請(qǐng)日期2009年6月19日優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日發(fā)明者唐劍棟,宋慧群,朱興全,林瑞慶,袁子國(guó),艷鄧申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)