專利名稱：特異性抑制nk細胞受體kir3dl1的小核酸干擾分子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分 子及其應用。
背景技術：
艾滋病是20世紀80年代開始流行的新發(fā)傳染性疾病。自1981年在美國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病人以來，艾滋病已廣泛分布于全球五大洲210多個國家和地區(qū)，UNAIDS/WH0《2009年全球艾滋病流行趨勢》報告指出，截至2009年底，目前全球有大約3340萬艾滋病感染者，其中2009年新增感染者260萬人，180萬人死干與艾滋病相關的疾病。艾滋病已經(jīng)成為嚴重危害人類生命和健康的疾病。從2009年開始，艾滋病是我國法定報告?zhèn)魅静∷劳鍪孜坏募膊。捎谀壳鞍滩〔《灸退幎局甑牟粩喈a(chǎn)生和流行，導致艾滋病抗病毒治療和抗機會性感染治療的疾病負擔也日益加重。所以，在目前的形勢下，探索和研制一些療效明確并且毒副作用小的艾滋病抗病毒治療方法和藥物就顯得尤為重要。在過去的幾十年間，人們把研究重點都集中在獲得性免疫對HIV-I感染的免疫應答上，但到目前為止還沒有免疫治療和疫苗研究的突破性進展。NK細胞(natural killercell)是ー個獨立于T細胞和B細胞的淋巴細胞亞群，NK細胞殺傷病原微生物的作用是天然的，無需抗體存在或預先加以致敏。通常知道，活化的NK細胞可分泌較高水平的IFN-Y、GM-CSF和TNF-α等細胞因子，在抗病毒、抗細菌及抗腫瘤中發(fā)揮著極其重要的作用ト3]。近來的研究發(fā)現(xiàn)，HIV-I感染的患者外周血中NK細胞的數(shù)量和功能發(fā)生改變，提示NK細胞在對HIV-I感染的免疫應答以及對HIV-I感染細胞的清除中可能發(fā)揮著重要的作用[4]。NK細胞有不同的類型，外周血中大部分NK細胞為⑶3-⑶56+的細胞。NK細胞表面還具有不同的活化/抑制性受體，并在生理和不同病理條件下，其功能發(fā)生變化，影響NK細胞對靶細胞的作用發(fā)揮。KIR3DL1是NK細胞的抑制性受體，其配體為含有Bw4表型的MHC-I分子。HIV-I感染者體內(nèi)KIR3DL1的變化與疾病的進程、感染者體內(nèi)病毒RNA的載量以及NK細胞對HIV-I病毒感染細胞的清除等方面關系極為密切[5_9]。我們對江蘇省10例HIV-I陰性(對照組)、不同傳播途徑的實驗組分別為25例輸血感染HIV-I者、8例吸毒感染HIV-I者、20例異性感染HIV-I者、17例同性感染HIV-I者和11例母嬰傳播的HIV-I兒童感染者NK細胞的數(shù)量和NK細胞上KIR3DL1受體也進行了初步研究，結(jié)果顯示在實驗組和對照組比較，NK細胞的數(shù)量在實驗組中明顯下降，并和對照組有顯著性的差異；KIR3DL1在實驗組NK細胞上的表達明顯降低，并和對照組有顯著差異[1°]。目前小核酸干擾技術(RNAi)是生物科技和創(chuàng)新藥物研究中最熱門的領域之一，它已經(jīng)吸引了許多大型制藥公司的投資。2006年贏得諾貝爾醫(yī)學獎的科學成果就是以小核酸干擾技術為基礎的?？茖W界普遍認為，通過利用小核酸干擾技術，有可能產(chǎn)生出前景不錯的治療藥物，用于治療癌癥和感染性疾病這類采用通常技術難以提高療效的疾病。目前國際上已有12個對稱性小核酸干擾siRNA藥物進入一到三期臨床試驗，但是絕大部分是外用和
4局部給藥，只有ニ項是全身靜脈給藥，其中靶向腫瘤相關基因核糖核苷酸還原酶M2亞基的CALAA-Ol對稱小核酸干擾藥物和抑制肝癌相關基因的ALN-VSP，已被FDA批準進入腫瘤靜脈給藥的I期臨床試驗[n]。經(jīng)流式細胞儀檢測、qRT-PCR法、Westernblot蛋白印跡實驗、殺傷功能檢測等，這種小核酸干擾分子能顯著抑制KIR3DL1基因的表達，并明顯提高NK細胞對HIV感染細胞的殺傷作用。與目前艾滋病抗病毒藥物比較，小核酸干擾分子是ー種作用機理新穎、高效快速、特異穩(wěn)定、靶向性好、副作用小新的抗艾滋病藥物分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供特異性抑制自然殺傷細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子SiRNA0本發(fā)明的另ー目的是提供該siRNA的應用。特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子，其靶向的KIR3DL1的mRNA的 genbank 登錄號為 NM 013289。本發(fā)明所述的特異性抑制人NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子siRNA是通過如下方法設計，并經(jīng)化學合成得到的首先在基因庫中尋找靶向基因KIR3DL1的mRNA序列，并從起始密碼后75個堿基開始尋找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(N19為任意19個mRNA核苷酸序列)，然后計算所選擇的19-23nts mRNA堿基序列中G/C比例在30%到70%之間，再將19-23nts mRNA序列用Blast搜尋EST基因庫，確認所靶向的基因是唯一的，再設計19-23個反義RNA，且每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，并合成雙鏈的
SiRNA0
本發(fā)明所述的NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子序列優(yōu)選自以下K1 K5所 示的SiRNA中的任意一條，或者優(yōu)選由ΚΓΚ5所示的SiRNA出發(fā)，采用膽固醇、硫代、甲基化 正義鏈或/和反義鏈進行化學修飾，形成每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，經(jīng)過相關修飾，具有19-23nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈小核酸干擾分子siRNA ;所述的 ΚΓΚ5 所示的siRNA如下
Kl:5’UAUACAAAGAAGACAGAAUdTdT 3’
3，dTdTAUA腳UUCUUC腳CUUA5，；
K2:5，CUACAGAUACCAUCUUGUAdTdT3，
3’ dTdTGAU⑶CUAUG⑶AGAACAU5’ ；
K3:5 ’ UGCAAUGUUGGUCAGAUAUdTdT3，
3’ dTdTACGUUACAACCAGUCUAUA5’ ；
K4:5，ACAGAACCAAGCUCCAAAUdTdT3，
3’ dTdTU⑶CUUG⑶UCGAG⑶UUA5’ ；
K5:5，GCAAGGUCAACAGAACAUUdTdT3，
3’ dTdTC⑶UCCA⑶U⑶CUU⑶AA5’。
所述的NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子序列進ー步優(yōu)選自所述的K5所示 的siRNA，或者進ー步優(yōu)選由所述的K5所示的siRNA出發(fā)，采用膽固醇、硫代、甲基化正義鏈 或/和反義鏈進行化學修飾，形成每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，經(jīng)過相關修飾，具有19-23nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈小核酸干擾分子siRNA。
所述的由所述的K5所示的siRNA出發(fā)，采用膽固醇、硫代、甲基化正義鏈或/和反義鏈進行化學修飾，形成每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，經(jīng)過相關修飾，具有19-23nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈小核酸干擾分子siRNA更進ー步優(yōu)選自以下K6 K11所示的siRNA中的任意一條Κ6:5’ chol-ACAGAACCAAGCUCCAAAUdTdT 3’3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；K7:5’ chol-A-s-C-s-A-s-GAACCAAGCUCCAAA-s-U dTdT 3’3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；K8:5，chol-(mA)(mC)(mA)GAACCAAGCUCCAAAUdT-s-dT 3’3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；K9:5，chol-A-s-C-s-AGAACCAAGCUCCAAAUdT-s-dT 3，3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；KlO:5， chol-(mA)(mC)(mA)GAACCAAGCUCCA(mA)(mA)(mU)dT-s-dT 3’3， dT-s-dTUGUC(mU)UGGU(mU)CGAGGUU(mU)A 5，；Kl1:5，chol-(mA)(mC)(mA)GAACCAAGCUCCA(mA)(mA)(mU)dT-s-dT 3，3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5'其中，chol為膽固醇修飾、s為硫代修飾、m為甲基化修飾。本發(fā)明所述的特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子最優(yōu)選K5或KlO所示的雙鏈小核酸干擾分子siRNA。本發(fā)明所述的特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子在制備抗艾滋病藥物中的應用。有益效果本發(fā)明提供的特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾siRNA，通過干擾靶點的優(yōu)化，3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，和/或采用膽固醇、或/和硫代、或/和甲基化堿基化學修飾正義鏈或/和反義鏈的堿基，使不同結(jié)構(gòu)的siRNA更加穩(wěn)定，抑制KIR3DL1表達的活性更強，毒副作用更小，更容易進入靶細胞達到靶向抑制作用。本發(fā)明siRNA可以用于制備成穩(wěn)定、有效、低毒的抑制自然殺傷細胞受體KIR3DL1基因表達的抗艾滋病的小核酸干擾基因治療藥物。


圖I :qRT_PCR檢測分別轉(zhuǎn)染K1-K5不同siRNA后對擴增的NK細胞中KIR3DLlmRNA的抑制效率的實驗結(jié)果。C (control)為對照試驗，即轉(zhuǎn)染不相關siRNA片段。圖2 :流式細胞儀檢測分別轉(zhuǎn)染K1-K5不同siRNA后對NK細胞膜上KIR3DL1受體在的表達情況。其中A為對照組(control)，即轉(zhuǎn)染不相關siRNA片段；B_F相對應的為K1-K5片段。圖3 qRT-PCR檢測分別轉(zhuǎn)染K6-K11不同siRNA后對擴增的NK細胞中KIR3DLlmRNA的抑制效率的實驗結(jié)果。C(control)為對照試驗，即轉(zhuǎn)染不相關siRNA片段。圖4 :流式細胞儀檢測分別轉(zhuǎn)染K6-K11不同siRNA后對NK細胞膜上KIR3DL1受體在的表達情況。其中A為對照組(control)，即轉(zhuǎn)染不相關siRNA片段；B_G相對應的為K6-K11 片段。圖5 qRT-PCR檢測分別轉(zhuǎn)染K5和KlO兩個siRNA后對擴增的NK細胞中KIR3DLlmRNA的抑制效率的實驗結(jié)果。C(control)為對照試驗，即轉(zhuǎn)染不相關siRNA片段。圖6 :流式細胞儀檢測分別轉(zhuǎn)染K5和KlOsiRNA后對NK細胞膜上KIR3DL1受體在的表達情況。其中A為對照組(control)，即轉(zhuǎn)染不相關siRNA片段；B為K5片段，C為KlO片段。圖7 :流式細胞儀檢測分別轉(zhuǎn)染K5和KlOsiRNA后IFN- Y在NK中的表達比例。control為對照試驗，即轉(zhuǎn)染不相關siRNA片段。***P〈0. 001。圖8 :流式細胞儀檢測分別轉(zhuǎn)染K5和KlOsiRNA后TNF-α在NK中的表達比例。control為對照試驗，即轉(zhuǎn)染不相關siRNA片段。***P〈0. 001。圖9 :流式細胞儀檢測分別將K5和KlOsiRNA轉(zhuǎn)染NK細胞后對K562細胞的殺傷比例。control為對照試驗，即轉(zhuǎn)染不相關siRNA片段。#*P〈0. 001。
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數(shù)據(jù)進ー步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內(nèi)容相同。實施例I特異性制自然殺傷細胞受體KIR3DL1表達的siRNA的合成。本發(fā)明利用基因庫中尋找特異性制自然殺傷細胞受體KIR3DLlmRNA，genbank登錄號為匪013289，并從起始密碼后75個堿基開始尋找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(N19為任意19個mRNA核苷酸序列)，然后計算所選擇的19-23nts mRNA堿基序列中G/C比例在30%到70%之間，再將19-23ntsmRNA序列用Blast搜尋EST基因庫，確認所靶向的基因是唯一的，再設計19-23個反義RNA，且每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，并合成雙鏈的siRNA。在此基礎上，以效果最好的K4為基礎，通過將siRNA正義鏈或反義鏈的5’或3’端采用膽固醇、或/和硫代、或/和甲基化，每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，具有經(jīng)化學修飾的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈小核酸干擾分子siRNA。所設計的siRNA見表I。表l、KIR3DLl_siRNA的編號、序列、名稱、修飾類型
權(quán)利要求
1.特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子，其特征在于所述的NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子靶向的KIR3DL1的mRNA的genbank登錄號為NM_013289。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子，其特征在于所述的NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子序列選自以下K1 K5所示的siRNA中的任意一條，或者由Κ1 (5所示的siRNA出發(fā)，采用膽固醇、硫代、甲基化正義鏈或/和反義鏈進行化學修飾，形成每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，經(jīng)過相關修飾，具有19-23nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈小核酸干擾分子siRNA ； 所述的ΚΓΚ5所示的siRNA如下K 1:5，UAUACAAAGAAGACAGAAUdTdT3， 3，dTdTAUA腳UUCUUC腳CUUA5，；K2:5，CUACAGAUACCAUCUUGUAdTdT3，3’ dTdTGAU⑶CUAUG⑶AGAACAU5’ ；K3:5 ’ UGCAAUGUUGGUCAGAUAUdTdT3，3’ dTdTACGUUACAACCAGUCUAUA5’ ；K4:5，ACAGAACCAAGCUCCAAAUdTdT3， 3’ dTdTU⑶CUUG⑶UCGAG⑶UUA5’ ；K5:5，GCAAGGUCAACAGAACAUUdTdT3， 3’ dTdTC⑶UCCA⑶U⑶CUU⑶AA5’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子，其特征在于所述的NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子序列選自所述的K5所示的siRNA，或者由所述的K5所示的siRNA出發(fā)，采用膽固醇、硫代、甲基化正義鏈或/和反義鏈進行化學修飾，形成每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，經(jīng)過相關修飾，具有19-23nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈小核酸干擾分子siRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子，其特征在于所述的由所述的K5所示的siRNA出發(fā)，采用膽固醇、硫代、甲基化正義鏈或/和反義鏈進行化學修飾，形成每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，經(jīng)過相關修飾，具有19-23nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈小核酸干擾分子siRNA選自以下K6 K11所示的siRNA中的任意一條K6:5 ’ chol-ACAGAACCAAGCUCCAAAUdTdT 3，·3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；K7:5’ chol-A-s-C-s-A-s-GAACCAAGCUCCAAA-s-U dTdT3’·3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；K8:5， chol-(mA)(mC)(mA)GAACCAAGCUCCAAAUdT-s-dT 3’·3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；K9:5’ chol-A-s-C-s-AGAACCAAGCUCCAAAUdT-s-dT 3’ · 3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ；KlO:5， chol-(mA)(mC)(mA)GAACCAAGCUCCA(mA)(mA)(mU)dT-s-dT 3’·3， dT-s-dTUGUC(mU)UGGU(mU)CGAGGUU(mU)A 5，；Kll:5， chol-(mA)(mC)(mA)GAACCAAGCUCCA(mA)(mA)(mU)dT-s-dT 3’3’ dTdTUGUCUUGGUUCGAGGUUUA 5’ ； 其中，chol為膽固醇修飾、s為硫代修飾、m為甲基化修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子，其特征在于所述的由所述的K5所示的siRNA出發(fā)，采用膽固醇、硫代、甲基化正義鏈或/和反義鏈進行化學修飾，形成每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛，經(jīng)過相關修飾，具有19-23nt的能誘發(fā)RNA干擾的雙鏈小核酸干擾分子siRNA選自KlO。
6.權(quán)利要求1飛中任意一項所述的特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子在制備抗艾滋病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子及其應用。特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子，其靶向的KIR3DL1的mRNA的genbank登錄號為NM_013289。通過大量實驗發(fā)現(xiàn)本發(fā)明siRNA片段可以明顯抑制NK細胞膜的KIR3DL1受體的表達，經(jīng)過各種化學修飾的siRNA具有相同的抑制KIR3DL1表達的效果。抑制KIR3DL1表達以后可以使NK細胞中IFN-γ和TNF-α細胞因子的表達顯著升高。同時，轉(zhuǎn)染siRNA后可以顯著增強NK細胞的殺傷功能。因此，特異性抑制NK細胞受體KIR3DL1的小核酸干擾分子可以在制備抗艾滋病藥物中應用。
文檔編號A61P31/18GK102911940SQ201210383220
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者羊海濤, 傅更鋒, 還錫萍, 徐金水, 陳國紅, 徐曉琴, 胡海洋, 郭宏雄, 邱濤, 王小亮, 張之, 劉曉燕, 閆紅靜, 丁萍, 丁建平 申請人:江蘇省疾病預防控制中心