專利名稱：一種具有減少泡沫細胞脂質(zhì)積累的杏鮑菇多糖及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及杏鮑菇多糖的分離純化，具體是ー種具有減少泡沫細胞脂質(zhì)積累的杏鮑菇多糖的制備方法。
背景技術：
近年來，隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生活質(zhì)量的提高，不合理的飲食習慣而帶來的疾病例如肥胖癥、高血脂、動脈粥樣硬化等呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，而有大量研究結果表明若能有效地控制血脂水平，則能有效地預防疾病的發(fā)生。食用藥用菌杏鮑菇具有很高的營養(yǎng)價值，其多糖等活性組分因其出色的保健和治療功能越來越受到人們的重視，但是目前絕大多數(shù)的研究限于多糖提取エ藝的優(yōu)化，大量地徘徊在低水平的重復研究上，對其和活性成分的分離和代謝調(diào)控機制的研究還相對較少，因此很難有創(chuàng)新性的突破。通過體外生化試驗研究·證明了杏鮑菇水溶性的多糖(PEPE)具有較強的清除自由基的能力，且在四氯化碳誘導的肝損傷小鼠模型上證實了 PEPE通過提高抗氧化物酶的活性從而保護肝；同時在高血脂動物模型研究結果表明其具有降血脂的作用，但是目前在活性多糖的分離純化及結構鑒定上仍然是難題。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)兩種杏鮑菇中具有潛在降血脂的単一的多糖組分，提供了一種有效地制備和鑒定單ー組分的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了ー種可以從杏鮑菇水溶性多糖中分離純化得到具有減少泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)積累的単一多糖的方法，本發(fā)明制備得到了兩種水溶性的，產(chǎn)量較高的，エ藝簡單的，具有清除自由基、減少泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)積累的兩種單一的杏鮑菇多糖，并對這兩種單ー組分進行了結構鑒定。在此基礎上進行單ー組分的結構檢測，得到了多糖的分子量，構型，單糖構成和比例，以及單糖間連接鍵等相關結構信息。該兩種組分經(jīng)過在細胞學水平上的檢測結果表明均具有顯著減少泡沫細胞脂質(zhì)積累的作用，并且具有較好地清除自由基作用
本發(fā)明所述的具有減少泡沫細胞脂質(zhì)積累活性的杏鮑菇多糖的制備方法，其步驟如
下
(O首先進行杏鮑菇活性多糖的分離純化，將烘干的杏鮑菇子實體菇粉用90°c熱水浸提3 h，四倍體積こ醇沉淀得到的粗多糖；
(2)粗多糖經(jīng)過分子截留量為3.5 kDa的透析膜，去離子水透析過夜，去除小分子量的雜質(zhì)，干燥沉淀后復溶于去離子水，加入胰蛋白酶去除去蛋白質(zhì)，加入雙氧水去除色素，最后加入四倍體積的無水こ醇沉淀多糖，離心干燥后得到水溶性的杏鮑菇多糖(PEPE)；
(3)將步驟(2)中所獲得的PEPE通過DEAE-52陰離子交換柱，采用濃度為O.05M磷酸緩沖液(PBS)洗脫ー個柱床體積，接著用濃度分別為O. 05 M、0，1 M、0，2 M、0，4 M、0，8 MUM的氯化鈉溶液逐級進行進行濃度梯度洗脫，流速lml/min，每管收集8 ml，收集第一洗脫峰的洗脫液，命名為PEPE-A ；
(4)將步驟(3)得到的PEPE-A經(jīng)過凝膠柱S印hadex G-IOO進行進一歩洗脫，洗脫液為O. 05 M氯化鈉溶液，流速O. 5 ml/min,每管收集2 ml，分別收集第一和第二洗脫峰的洗脫液得到兩種杏鮑菇多糖，命名為PEPE-I和PEPE-2。對PEPE-I和PEPE-2進行單ー組分的結構檢測，得到了多糖的分子量，構型，單糖構成和比例，以及單糖間連接鍵等相關結構信息。PEPE-I平均分子量37. 50 kDa，單糖組成主要為葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳糖，其中PEPE-I中甘露糖葡萄糖半乳糖的比例為I. 42 96. 26 :2. 32，高碘酸氧化實驗和核磁結果檢測顯示，主要為β (I — 3)連接鍵構型，同時含有α (I —4，1 —6)連接。PEPE-2平均分子量30.00 kDa，單糖組成主要為葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳 糖，PEPE-2中甘露糖葡萄糖半乳糖的比例為I. 18 95. 54 :3. 28，高碘酸氧化實驗和核磁結果檢測顯示，主要為β (I — 3)連接鍵構型，同時含有α (I —4，I —6)連接。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有的優(yōu)點為(I) PEPE-I和ΡΕΡΕ-2兩種多糖組分單一，得率較高，制備簡單，且溶于水；(2)ΡΕΡΕ-1和PEPE-2兩種單一多糖組分具有顯著地抗氧化和減少泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)積累的作用；(3)該方法制備的PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分安全無毒，可以作為食品添加劑使用。


圖I為PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的分離純化圖和高效液相圖譜。圖2為PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的氣相色譜圖。圖3為PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的紅外光譜。圖4為PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的核磁共振譜。圖5為在oxLDL誘導的泡沫細胞模型上檢測PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的減少脂質(zhì)積累的效果及其量化數(shù)據(jù)圖。圖6為PEPE-I和PEPE-2清除DPPH自由基結果。
具體實施例方式下面結合數(shù)據(jù)和圖對本發(fā)明做進ー步描述。實施例一、多糖的制備
(O首先進行杏鮑菇活性多糖的分離純化，將烘干的杏鮑菇子實體菇粉用90°c熱水浸提3 h，四倍體積こ醇沉淀得到的粗多糖PE ；
(2)粗多糖PE經(jīng)過分子截留量為3.5 kDa的透析膜，去離子水透析過夜，去除小分子量的雜質(zhì)，干燥沉淀后復溶于去離子水，加入胰蛋白酶去除去蛋白質(zhì)，加入雙氧水去除色素，最后加入四倍體積的無水こ醇沉淀多糖，離心干燥后得到水溶性的杏鮑菇多糖(PEPE)；
(3)對PEPE進行DEAE-52陰離子交換柱分離純化，采用濃度為O.05 M磷酸緩沖液(I3BS)洗脫ー個柱床體積，接著用濃度分別為O. 05 Μ、0· I Μ、0·2 Μ、0· 4 Μ、0· 8 M、1 M的氯化鈉溶液逐級進行進行濃度梯度洗脫，流速I mL/min，每管收集8 ml，苯酚-硫酸法跟蹤檢測每管多糖含量，合并洗脫峰的各管溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干濃縮干燥后得到兩種主要組分，分別按出峰時間先后順序命名為PEPE-A和PEPE-B，如圖I中A圖所示。在oxLDL誘導的泡沫細胞RAW264. 7的檢測結果表明PEPE-A能有效地減少泡沫細胞內(nèi)的脂質(zhì)積累，而PEPE-B不具有相關減少泡沫細胞脂質(zhì)積累作用；
(4)對PEPE-A經(jīng)過凝膠柱S印hadex G-IOO進行進一步的洗脫，洗脫液為O. 05 M氯化鈉溶液，流速O. 5 mL/min,每管收集2 ml,苯酚硫酸法跟蹤檢測每管多糖含量，合并洗脫峰的各管溶液，得到兩種主要組分，按苯酚硫酸法跟蹤監(jiān)測得到的出峰先后順序分別命名為PEPE-I和PEPE-2 ;如圖I中B圖所示，對得到的兩種單一多糖組分PEPE-I和PEPE-2進行高效液相檢測，結果表明均為單ー對稱峰，可以證明PEPE-I和PEPE-2均為單ー純品，如圖I中C圖所示；根據(jù)標準分子量葡萄糖在在色譜柱Aminex HPX-87H對應的保留時間制作的標準曲線，計算出兩種多糖PEPE-I和PEPE-2的平均分子量分別為37. 50 kDa和30. 00 kDa
O實施例ニ 對PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分進行衍生化后進行氣相色譜檢測，對于PEPE-I和PEPE-2的單糖組成分析采用完全酸水解的方法(TFA水解)后氣相色譜 分析的方法。在110°C下用2 mol/L的TFA 4 mL水解樣品4 h，水解后的樣品溶液減壓蒸干后再向樣品中加入O. 5 mL左右的甲醇使樣品完全溶解，反復減壓低溫(30°C)蒸干三次得到完全水解的的單糖組分。將得到的樣品酸水解產(chǎn)物及標準單糖進行こ?；筮M行氣相檢測，最后根據(jù)標準單糖的保留時間及峰面積從而估算出樣品的單糖組成及比例，得到結果如表I所示。表I樣品單糖組成氣相分析結果
標準品Iレ鼠李糖|D-阿拉伯糖|D-木糖|D-甘露糖|D-葡萄糖|D-半乳糖|D-巖藻糖
滯留時間5.794 6.1396.27 8.588 8. 707 9.039 11.863
PEPE-1 滯留時間一一一 8.59 8. 708 9.018 —
PEPE-2 滯留時間 I—J-I— ]8.601 [8. 723 19.042 [―
表2樣品中單糖含量
Wuj甘露糖(%)j葡萄糖(%)j半乳糖(%)—
PEPE-1I. 4296. 262. 32
PEPE-2]l.18]95. 54]3· 28
表2為氣相色譜中檢測得到樣品的組成情況和含量比，同一組分在同一位置出峰表I為其中混合單糖衍生化后經(jīng)過氣相檢測得到的出峰時間，其中各組分分別為(I)L-rhamnose, (2) D-araoinose, (3) D-xylose,⑷ D-mannose, (5) D-glucose, (6)D-galactose, (7) D-fucose ;出峰時間如表格所示。對PEPE-1和PEPE-2通過同樣的方法進行衍生化并記錄出峰時間，與標準單糖出峰時間對比得到單糖組成，并通過峰面積法計算得出PEPE-I和PEPE-2的各單ー組成成分的含量比，如表2所示。由氣相色譜結果可以看出兩種多糖的單糖組成主要為葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳糖，其中PEPE-I中甘露糖葡萄糖半乳糖的比例為I. 42 96. 26 :2. 32 ;PEPE_2中甘露糖葡萄糖半乳糖的比例為 I. 18 95. 54 3. 28。實施例三對PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的傅里葉紅外光譜檢測，顯示結果如圖3所示，PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的紅外圖譜顯示，該組高聚物無衍生基團的存在其為多羥基化合物，且多糖是吡喃糖構型。高碘酸可以選擇性地氧化和斷裂糖分子中連ニ羥基或連三羥基處，生成相應的多糖醛、甲醛或甲酸。反應定量地進行，每開裂ー個C-C鍵消耗一分子高碘酸。以I — 2位鍵合的糖基經(jīng)高碘酸氧化，平均每個糖基僅消耗一分子高碘酸，并且無甲酸釋放；以I — 4位鍵合的糖基經(jīng)高碘酸氧化，平均每個糖基僅消耗一分子高碘酸，并且無甲酸釋放；以I — 3位鍵和的糖基不被高碘酸氧化；以I — 6位鍵和的糖基或非還原末端基(I —)經(jīng)高碘酸氧化，消耗二分子高碘酸，同時釋放一分子甲酸。稱取多糖樣品25 mg，用少量水溶解，加入30 mmol/L高碘酸鈉溶液，定容至25 ml,置于暗處，室溫下進行反應，于0,6,12, 24, 36,48…小時間隔取樣O. I ml,蒸懼水稀釋250倍后，使用紫外分光光度計在223 nm處測定光密度。至光密度值達ー穩(wěn)定值時，加こニ醇破壞過量的高碘酸以終止反應。由此光密度值根據(jù)標準曲線計算出高碘酸的消耗量。取2ml上述反應溶液，加一滴溴甲酚藍作指示劑，用O. 01 mol/L氫氧化鈉溶液滴定甲酸的釋放量。PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分通過高碘酸氧化檢測平均每個糖基僅消耗一分子高碘酸，溴甲酚藍作指示劑，用O. 01 mol/L氫氧化鈉溶液滴定甲酸的釋放量，經(jīng)檢測無甲酸釋放，證明PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分可能含有I — 4和I — 2位鍵合的糖基，有部分糖不被高碘酸氧化，對高碘酸氧化后產(chǎn)物進行高效液相色譜法檢測含有葡萄糖，說明含有I — 3連接鍵，也可能含有I — 4，I — 6連接。實施例四JiPEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的核磁共振譜多糖的核磁共振譜見圖6。在IH-NMR中有兩個信號，表明多糖結構中存在α構象(δ 5.1-5. 3 ppm)和β 構象(δ 4. 1-4. 8 ppm) ;13C_NMR 核磁譜中高場 98. 91 ppm (97-101 ppm)表證了 Cl 的 α構象，而低場 103. 64 ；103. 77 ；104. 04 ；104. 33 ；104. 79 ；105. 11 ；105. 32 (103-105 ppm)表證的為Cl的β構象。實施例五圖5為在oxLDL誘導的泡沫細胞模型上檢測PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的減少脂質(zhì)積累的效果。通過oxLDL誘導巨噬細胞RAW264. 7形成的泡沫細胞模型，檢測分離純化得到的PEPE-I和PEPE-2兩種單一多糖組分的減少脂質(zhì)積累的效果，并通過油紅ο染脂滴和對脂質(zhì)含量的定量結果表明在杏鮑菇子實體中分離純化的到的兩種単一多糖組分具有顯著地減少脂質(zhì)積累的效果。體外的生化試驗結果如圖6所示，PEPE-I和PEPE-2具有較強的清除DPPH自由基的能力，對DPPH自由基清除率分別達到84. 6%和83. 07%,結果表明從杏鮑菇子實體多糖中分離純化得到的兩種單ー組分PEPE-I和PEPE-2具有很強的抗氧化性。
權利要求
1.ー種具有減少泡沫細胞脂質(zhì)積累的杏鮑菇多糖，是平均分子量為37. 50 kDa的杏鮑菇多糖PEPE-I，或者是平均分子量為30. 00 kDa杏鮑菇多糖PEPE-2 ;單糖組成主要為葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳糖；所述杏鮑菇多糖PEPE-I、PEPE-2是通過下述方法制得(1)將杏鮑菇干粉熱水浸提后，加入四倍體積的無水こ醇于4°C下靜置過夜，離心沉淀并干燥得到粗多糖；(2)將粗多糖復溶于去離子水，加入胰蛋白酶去除去蛋白質(zhì)，加入雙氧水去除色素，最后加入四倍體積的無水こ醇沉淀多糖，離心干燥后得到水溶性的杏鮑菇多糖；(3)將步驟(2)中所獲得的PEPE通過DEAE-52陰離子交換柱，采用濃度為O.05 M磷酸緩沖液洗脫ー個柱床體積，接著用濃度分別為O. 05 M、0. I M、0. 2 M、0. 4 M、0. 8 M、1 M的氯化鈉溶液逐級進行濃度梯度洗脫，流速I ml/min，每管收集8 ml，收集第一洗脫峰的洗脫液，命名為PEPE-A ；(4)將步驟(3)得到的PEPE-A經(jīng)過凝膠柱S印hadexG-100進行進一歩洗脫，洗脫液為O.05 M氯化鈉溶液，流速O. 5 ml/min,每管收集2 ml,分別收集第一和第二洗脫峰的洗脫液得到杏鮑菇多糖PEPE-I和PEPE-2。
2.ー種制備權利要求I所述杏鮑菇多糖的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將杏鮑菇干粉熱水浸提后，加入四倍體積的無水こ醇于4°C下靜置過夜，離心沉淀并干燥得到粗多糖；(2)將粗多糖復溶于去離子水，加入胰蛋白酶去除去蛋白質(zhì)，加入雙氧水去除色素，最后加入四倍體積的無水こ醇沉淀多糖，離心干燥后得到水溶性的杏鮑菇多糖；(3)將步驟(2)中所獲得的PEPE通過DEAE-52陰離子交換柱，采用濃度為O.05 M磷酸緩沖液洗脫ー個柱床體積，接著用濃度分別為O. 05 M、0. I M、0. 2 M、0. 4 M、0. 8 M、1 M的氯化鈉溶液逐級進行進行濃度梯度洗脫，流速I ml/min，每管收集8 ml，收集第一洗脫峰的洗脫液，命名為PEPE-A ；(4)將步驟(3)得到的PEPE-A經(jīng)過凝膠柱S印hadexG-100進行進一歩洗脫，洗脫液為O.05 M氯化鈉溶液，流速O. 5 ml/min,每管收集2 ml，分別收集第一和第二洗脫峰的洗脫液得到杏鮑菇多糖PEPE-I和PEPE-2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有減少泡沫細胞脂質(zhì)積累的杏鮑菇多糖及其制備方法。所述杏鮑菇多糖是平均分子量為37.50kDa的杏鮑菇多糖PEPE-1，或者是平均分子量為30.00kDa杏鮑菇多糖PEPE-2；單糖組成主要為葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳糖；它們是通過將杏鮑菇子實體干粉經(jīng)熱水浸提、透析后，進一步通過陰離子交換柱DEAE-52同時采用鹽濃度梯度洗脫分離純化得到PEPE-A；采用SephadexG-100對PEPE-A進行進一步分離純化，得到組分PEPE-1和PEPE-2。PEPE-1和PEPE-2均為單一峰，具有很好的預防泡沫細胞脂質(zhì)積累作用、抗氧化作用；可以作為食品添加劑使用。
文檔編號A61P39/06GK102827305SQ20121034815
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權日2012年9月18日
發(fā)明者陸玲, 雍陽陽, 陳晶晶, 邢美春 申請人:南京師范大學