專利名稱：Dcx和sparc雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種基因藥物，尤其涉及DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應 用。
背景技術：
膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，故亦稱神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮腫瘤。腦膠質(zhì)瘤的基本治療手段是手術切除+放療和化療。隨著分子生物學、免疫生物學、腫瘤免疫學和醫(yī)學生物工程的發(fā)展，腦膠質(zhì)瘤治療的新方法新技術不斷出現(xiàn)，如細胞免疫治療、分子靶向治療、熱療等。在這些治療方法中，各種都有自身的局限性。腦膠質(zhì)瘤因其惡性程度對放射治療不甚敏感，一般認為分化差的腫瘤較分化好的為高。放療的臨床效果也不是很令人滿意，一是受到放射劑量的限制，再者就是大多數(shù)腦膠質(zhì)瘤細胞對射線具有抗性，加大照射劑量又會増加對周圍正常腦組織的輻射損傷。隨著基因技術的不斷深入研究，如何能利用基因有效治療膠質(zhì)瘤已成為當今研究的熱點?；蛑委煹姆肿硬呗灾饕毎芷谡{(diào)節(jié)、自殺基因療法、免疫基因療法、抑癌基因治療、抗血管生成治療、以及生長因子等。而且于同一載體上同時表達多個外源基因在生物學領域中具有廣泛的應用價值，尤其在針對腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)設計多基因共表達載體的聯(lián)合基因治療更備受關注。因而構(gòu)建合適的載體獲得多個外源基因的高效轉(zhuǎn)移與表達具有重要意義。雙基因或多基因的構(gòu)建現(xiàn)主要采取兩種途徑一是將多個攜帶不同治療基因的獨立載體系統(tǒng)同時轉(zhuǎn)染靶細胞表達多個基因[20]，優(yōu)點是可以自由調(diào)節(jié)各表達載體的比例，但是效率太低，載體的副作用明顯；ニ是在同一載體上實現(xiàn)多基因共表達，其實現(xiàn)多個基因共同表達的方式主要有在多個基因之間插入獨立啟動子表達盒、內(nèi)部核糖體結(jié)合位(LRES)或連接2A序列、Furin切割序列等。與多個攜帶不同治療基因的獨立載體實現(xiàn)共表達相比，于同一載體上實現(xiàn)多基因共表達可提高轉(zhuǎn)移及表達效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供ー種DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用，以解決膠質(zhì)瘤對放療不敏感的問題。為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案是DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用。具體地，通過構(gòu)建DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體，由重組腺病毒對膠質(zhì)瘤細胞進行感染，增加G2期細胞的比例，以提高膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性。所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法是
(I)針對DCX和SPARC基因序列，制備PCR引物，所述PCR引物由 DCX 正義引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反義引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、
SPARC 正義引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和
SPARC 反義引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 構(gòu)成，在 DCX 兩端分別引入 BglII 和KpnI酶切位點，SPARC兩端分別引入NotI和XhoI酶切位點，擴增得到DCX和SPARC目的片段；
(2)雙酶切目的基因PCR產(chǎn)物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶將其4°C連接過夜，構(gòu)建單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter, pAdTrack-CMV-polyA+promoter-SPARC,和 pAdTrack-DCX-poIyA-promo t er-SPARC ；
(3)將構(gòu)建的單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用PmeI單酶切線性化后，與pAdEasy-Ι腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BJ5183大腸桿菌，用PacI單酶切鑒定并轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌；· (4)將成功重組的 pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter>pAd-poIyA+promoter-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 α 大腸桿菌擴增抽提，PacI酶切線性化后用脂質(zhì)體2000 (Iipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染293Α細胞，所得腺病毒為 Ad-GFP, Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。由于上述技術方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點
本發(fā)明提供了 DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體，獲得的腺病毒Ad-DCX-SPARC具有感染細胞的能力，并且顯著提高了感染細胞中DCX和SPARC的表達水平，能夠有效提高膠質(zhì)瘤的放射敏感性。


圖I是本發(fā)明實施例中的雙基因連接方式示意 圖2是腺病毒構(gòu)建及包裝示意 圖3是實施例中PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖 4 是實施例中 PacI 單酶切鑒定 pAd-po I yA+pr omo ter、pAd-DCX-po I yA+pr omo t er >pAd-poIyA+promoter-SPARC>pAdTrack-DCX-polyA-promoter-SPARC ；
圖5是實施例中RT-PCR鑒定Ad-DCX-SPARC的表達；
圖6是實施例中重組腺病毒體外感染U251細胞熒光表達情況；
圖7是實施例中腺病毒感染后GFP陽性細胞的比例；
圖8是實施例中重組腺病毒對U251生長的影響；
圖9是實施例中重組腺病毒感染后照射對U251生長的影響；
圖10是實施例中重組腺病毒對U251細胞周期的影響；
圖11實施例中重組腺病毒感染后照射對U251細胞凋亡的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進ー步描述
實施例
一.構(gòu)建DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體 技術流程
1、針對DCX和SPARC設計引物(表1)，在DCX兩端分別引入BglII和KpnI酶切位點，SPARC兩端分別引入NotI和XhoI酶切位點。以人cDNA文庫為模板，在Phusion高保真DNA聚合酶的作用下擴增得到DCX和SPARC的目的片段，并進行瓊脂糖電泳鑒定。表I. PCR 引物
細通
For GCAAGATCTATGMMCACTCOCCCTTC
Dd -
8ct TMGGTAGLTTACATGGAATCACCAAGCG
SPARC For TMGCGGODGCATCAGGGOCTGGATOT
Rct : TAGCrCKA&raCATaOAGATOCTTCT
2、雙酶切目的基因PCR產(chǎn)物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，用T4DNA連接酶將其4°C連接過夜(連接方式見圖I)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，用LB瓊脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)篩選抗性克隆。在DNA序列測定后，將陽性克隆保種備用。構(gòu)建的單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體為pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter,pAdTrack-CMV-poIyA+promoter-SPARC, pAdTrack-DCX-poIyA-promoter-SPARC。3、將構(gòu)建的單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用PmeI單酶切線性化后，與pAdEasy-Ι腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BJ5183大腸桿菌，用LB瓊脂平板(含50 μ g/ml卡那霉素)篩選抗性克隆。用PacI單酶切鑒定并轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌。4、將成功重組的 pAd-po I yA+promoter、pAd-DCX-po I yA+pr omo t er >pAd-po I yA+pr omo t er-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 a 大腸桿菌擴增抽提，PacI酶切線性化后用Iipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293A細胞，2周后觀察細胞形態(tài)變化，腺病毒構(gòu)建及包裝總體步驟如圖2所示，所得腺病毒命名為Ad-GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。5、在半數(shù)細胞脫壁后，收獲細胞和上清液，反復凍融3次，釋放腺病毒Ad-GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。將獲得的病毒再感染293A細胞，抽提總RNA進行RT-PCR鑒定雙基因的表達。實驗結(jié)果
(I)引入限制性酶切位點的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳如圖3所示，DCX為1326bp，SPARC為 912bp。(2)重組 Ad-GFP, Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC 用 PacI 單酶切后，瓊脂糖電泳鑒定抗卡那霉素小片段(4. 5kb)的釋放，如圖4所示。(3)轉(zhuǎn)染293A細胞2周后出現(xiàn)細胞空斑，收獲腺病毒Ad_GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC,Ad-DCX-SPARC,再次感染293A細胞，觀察細胞病變情況，RT-PCR檢測雙基因的表達，PCR產(chǎn)物如圖5所示，可見Ad-DCX-SPARC感染的細胞中DCX和SPARC的表達水平顯著提高。實驗結(jié)果表明成功構(gòu)建了 DCX和SPARC雙基因共表達的重組腺病毒，獲得的腺病毒Ad-DCX-SPARC具有感染細胞的能力，并且顯著提高了感染細胞中DCX和SPARC的表達水平。ニ、構(gòu)建的DCX和SPARC雙基因功能實驗方法
I重組腺病毒的大量擴增
將第一部分構(gòu)建獲得的pAd-po lyA+promoter(以下簡稱為Ad-GFP)、pAd-DCX-polyA+promoter (以下簡稱 Ad-DCX) > pAd-polyA+promoter-SPARC (以
下簡稱 Ad-SPARC)和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC(以下簡稱 Ad-DCX-SPARC)腺病毒再分別多輪感染QBI-293A細胞中進行大量繁殖，待出現(xiàn)細胞病變效應明顯，熒光顯著增強時，收集細胞并反復凍融3次，2000r/min離心5min，取病毒上清，于_80°C保存。2.重組腺病毒的效價檢測
將對數(shù)生長期的QBI-293A細胞胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度為I X IO5個/mL，在96孔板上按每孔100 μ L接種細胞，培養(yǎng)24h后，將上述獲得的Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC和Ad-DCX-SPARC 重組腺病毒作 I (Γ1、I (Γ2、I (Γ3、I (Γ4、I (Γ5、I (Γ6、I (T7、I (Γ8、I (Γ9、I (Γ1。`、I (Γ11 稀釋后，每個稀釋度按每孔100 μ L接種3孔，370C，5%C02細胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)18h后，熒光顯微鏡下，進行熒光計數(shù)，按病毒效價(pfu/mL)=(每孔熒光數(shù)X 10)/稀釋度公式計算腺病毒效價。3.重組腺病毒對膠質(zhì)瘤細胞的感染效率
將經(jīng)0. 25%胰酶消化分散的人腦膠質(zhì)瘤細胞U251用10%FBS DMEM完全培養(yǎng)基懸浮，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為I X IO5個/ml，每孔100 μ L接種于96孔培養(yǎng)板，37°C，5%C02培養(yǎng)過夜。次日Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒體外分別以1、5、10、25、50、75、100、200 MOI不同劑量感染膠質(zhì)瘤細胞，各分為5組細胞對照組、空載體Ad-GFP、單基因Ad-DCX、單基因Ad-SPARC和雙基因Ad-DCX-SPARC組感染24h后在熒光顯微鏡下觀察細胞中GFP綠色熒光表達情況，以判斷重組腺病毒不同感染劑量對膠質(zhì)瘤細胞的感染效率，g在篩選最佳感染劑量進行重組腺病毒感染。三、通過增加DCX-SPARC雙基因表達聯(lián)合放療的體外實驗，探討對腦膠質(zhì)瘤生長轉(zhuǎn)移的影響及作用機制。I.流式細胞儀檢測GFP陽性細胞的比例
將U251腦膠質(zhì)瘤細胞每孔100萬接種于六孔板中，37°C，5%C02培養(yǎng)過夜。次日Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒體外分別以20M0I不同劑量感染膠質(zhì)瘤細胞，感染24h后，收集細胞后上流式細胞儀檢測GFP陽性細胞的比例。2.重組腺病毒對膠質(zhì)瘤細胞生長的影響
將處于對數(shù)生長期的U251細胞用0. 25%胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基懸浮制成單細胞懸液，計數(shù)調(diào)整細胞濃度為3X IO4個/ml，每孔100 μ L接種于96孔板，待細胞貼壁后，將Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I劑量感染細胞，每組均設5個平行孔。37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)若干天，每孔加入20 μ LMTT (5mg/mL), 37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h后在加入DMS0150 μ L/孔，于37°C充分溶解后，在酶標儀570nm下測定吸光值(0D值)，以OD值為縱坐標，天數(shù)為橫坐標繪制細胞生長活力圖。3.重組腺病毒感染后對照射后U251細胞生長的影響
將處于對數(shù)生長期的U251細胞用0. 25%胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基懸浮制成單細胞懸液，計數(shù)調(diào)整細胞濃度為5X IO4個/ml，每孔100 μ L接種于96孔板，待細胞貼壁后，將Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I劑量感染U251細胞后48h進行X射線照射(4、8Gy)，MTT檢測2天后細胞的生長活力。4.細胞周期分析
取對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液，每組三個平行樣，60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，隔日將Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I劑量感染細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h后檢測細胞周期分布。各組細胞用胰酶消化，制備單細胞懸液，1000rpm，5min離心，棄上清，PBS洗2次以去除細胞碎片，200 μ L PBS重懸細胞，緩慢加入70%冷こ醇2mL，吹打均勻，4°C固定過夜，1000rpm，5min離心，棄上清，PBS洗2遍，カロ2(^g/mL RNase 37°C水浴消化30min，再以2 (^g/mL的PI (碘化丙啶)染色液置4°C避光染30min,上機檢測。5、照射后細胞凋亡檢測
取對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液，每組三個平行樣，隔日將Ad-GFP空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I劑量感染細胞，48h后對各組細胞進行X射線照射(8Gy)。繼續(xù)培養(yǎng)48h后細胞用O. 25%胰酶消化并收集，制備單細胞懸液，IOOOrpm, 5min離心，棄上清，預冷的PBS洗2次，重懸細胞于I XBinding Buffer中，調(diào)整細胞濃度為IXlOfVmL,取IOOyL的細胞懸液分別加入5μ L PE Annexin V和
5μ L7-AAD.室溫避光作用15min，加入400 μ LI XBinding Buffer, Ih內(nèi)上機檢測細胞凋亡率。實驗結(jié)果
I聞效價腺病韋的獲得
Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC腺病毒粗提液經(jīng)過多輪感染293A細胞和擴增后，獲得了高滴度和高純度的Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC腺病毒，其效價分別為109 ；109 ；109 ；109 (pfu/ml)。2.激光共聚焦顯微鏡觀察重組腺病毒體外感染U251細胞熒光表達情況
將 Ad-GFP、Ad-DCX、Ad-SPARC 和 Ad-DCX-SPARC 腺病毒分別以 1，5，10，20，50，100，200M0I不同劑量感染U251細胞。感染24h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察空載腺病毒和不同劑量重組腺病毒對U251細胞的感染情況。結(jié)果顯示(圖6)在20M0I時，U251細胞中GFP表達的細胞可達95%以上，故20M0I為這幾種腺病毒的最佳感染劑量。3.流式細胞儀檢測腺病毒感染后GFP陽性細胞的比例
流式細胞儀檢測顯示空白對照組，空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I的劑量感染U251細胞后，表達GFP的細胞比例分別為
I.49%, 98. 81%, 99. 52%, 95. 02%, 98. 96%。4.重組腺病毒感染后對U251細胞生長的影響
空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I的劑量感染U251細胞后，MTT檢測0-6天細胞的生長活力，并繪制細胞生長曲線，由圖8可見，Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC 在 20M0I 均有明顯的抑制作用，并且 Ad-DCX-SPARC 明顯強于Ad-DCX和Ad-SPARC，與空白對照組和Ad-GFP組比較呈顯著性差異(P〈0. 05)。5.重組腺病毒感染后對照射后U251細胞生長的影響
空載體腺病毒和Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因重組腺病毒以20M0I的劑量感染U251細胞后48h進行X射線照射(4、8Gy)，MTT檢測2天后細胞的生長活力，由圖9可見，Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC在照射后對細胞的抑制作用隨照射劑量增加而更為明顯，并且Ad-DCX-SPARC明顯強于Ad-DCX和Ad-SPARC，與空白對照組和Ad-GFP組比較呈顯著性差異(P〈0. 05)。6.重組腺病毒對U251細胞周期的影響
用流式細胞儀分析了各重組腺病毒感染后細胞周期分布的變化。結(jié)果顯示(圖10):Ad-DCX、Ad-SPARC、Ad-DCX-SPARC單、雙基因組均出現(xiàn)了 G2期細胞比例的增加(即G2期阻滯的出現(xiàn))(P〈0. 05)，G2 期細胞的比例分別達至Ij 19. 043%, 18. 044%, 22. 413%,且 Ad-DCX-SPARC雙基因組G2期阻滯更為顯著，與空白對照(G2期細胞比例10. 984)和Ad-GFP組(G2期細胞比例11. 296)相比差異具有統(tǒng)計學意義(p〈0. 05)，G2-M期放射敏感性最高，故増加這兩種基因的表達比增加單個基因的表達更能夠增加膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性，提高治療效果。7.重組腺病毒感染后照射對U251細胞凋亡的影響
檢測重組腺病毒感染后細胞輻照前后細胞凋亡的情況。結(jié)果表明(圖ll)，8Gy照后48h時細胞的凋亡率均較OGy組增加。而且，感染了 Ad-DCX, Ad-SPARC和Ad-DCX-SPARC細胞的凋亡率均高于空白對照組和空載腺病毒組(P〈0. 01), Ad-DCX-SPARC組凋亡率尤為顯著，表明增加DCX和SPARC的表達可提高輻射誘導的U-87MG細胞凋亡。
權(quán)利要求
1.DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應用，其特征在于通過構(gòu)建DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體實現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法是 (1)針對DCX和SPARC基因序列，制備PCR引物，所述PCR引物由DCX 正義引物 GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC、DCX 反義引物 TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG、SPARC 正義引物 TAAGCGGCCGCATGAGGGCCTGGATCTT 和 SPARC 反義引物 TAGCTCGAGTTAGATCACAAGATCCTTGT 構(gòu)成，在 DCX 兩端分別引入 BglII 和KpnI酶切位點，SPARC兩端分別引入NotI和XhoI酶切位點，擴增得到DCX和SPARC目的片段； (2)雙酶切目的基因PCR產(chǎn)物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶將其4°C連接過夜，構(gòu)建單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter,pAdTrack-CMV-polyA+promoter-SPARC,和 pAdTrack-DCX-poIyA-promo t er-SPARC ； (3)將構(gòu)建的單、雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用PmeI單酶切線性化后，與pAdEasy-Ι腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BJ5183大腸桿菌，用PacI單酶切鑒定并轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌； (4)將成功重組的 pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter>pAd-poIyA+promoter-SPARC 和 pAd-DCX-polyA+promoter-SPARC 在 DH5 α 大腸桿菌擴增抽提，PacI酶切線性化后用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293Α細胞，所得腺病毒為Ad_GFP，Ad-DCX, Ad-SPARC, Ad-DCX-SPARC。
全文摘要
本發(fā)明公開了DCX和SPARC雙基因共表達載體在制備放療增敏劑中的應用。通過構(gòu)建DCX和SPARC雙基因共表達重組腺病毒載體能夠有效提高膠質(zhì)瘤的放療敏感性。
文檔編號A61P35/00GK102836442SQ20121034034
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者劉芬菊, 徐媛媛, 蔣昕, 俞家華 申請人:蘇州大學