專利名稱：證明cd44表面表達(dá)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性介導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥疾病的診斷和治療，尤其涉及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的介導(dǎo)；且最尤其涉及癌癥疾病改善抗體(CDMAB)作為一種起始細(xì)胞毒性應(yīng)答的手段的應(yīng)用，該應(yīng)用可選擇地與一或多種化療試劑結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步地涉及利用本發(fā)明的CDMAB的結(jié)合分析。
背景技術(shù)：
人白血細(xì)胞的單克隆抗體的制備導(dǎo)致了 CD44抗原的發(fā)現(xiàn)；單鏈透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合糖蛋白在廣泛的正常組織和所有類型的造血細(xì)胞上表達(dá)。其起初與淋巴細(xì)胞的激活和歸巢相關(guān)。當(dāng)前，其推定的生理學(xué)作用還包括炎癥基因的激活、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)、分化和發(fā)育的誘導(dǎo)、細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞遷移以及細(xì)胞存活/抵抗凋亡的誘導(dǎo)。在人體中，⑶44的單基因拷貝位于染色體11的短臂，llpl3上。該基因包含19個 外顯子；前5個是恒定的，隨后的9個是可變的，緊接的3個是恒定的，且最后的2個是可變的。差異剪接可以造成超過1000種不同的異構(gòu)體。然而，目前僅已識別了數(shù)十種天然發(fā)生的變體。⑶44標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白由N-末端胞外(包括20個氨基酸的引導(dǎo)序列和近膜區(qū)(85個氨基酸))結(jié)構(gòu)域(270個氨基酸)、跨膜區(qū)(21個氨基酸)和胞質(zhì)尾巴(72個氨基酸)組成。胞外區(qū)還包含在N-末端的連接部分(link module) 0該區(qū)域有92個氨基酸的長度且顯示出與其它HA結(jié)合連接蛋白的同源性。在鼠型和人型CD44之間存在很高的同源性。蛋白的變體形式被插入外顯子5的羧基末端且在表達(dá)時位于胞外部分。⑶44的血清可溶形式也天然地發(fā)生且能夠通過終止密碼子(在可變區(qū)內(nèi))或蛋白水解活性產(chǎn)生。通過各種刺激包括TNF-a對細(xì)胞的激活造成⑶44受體的脫落(shedding)。在腫瘤細(xì)胞中也觀察到受體的脫落且該脫落可導(dǎo)致CD44在人血清中的濃度增加多達(dá)10倍。CD44的高血清濃度暗示著惡性腫瘤(卵巢癌除外)。⑶44的標(biāo)準(zhǔn)形式以大約37kD的分子量存在。翻譯后修飾將分子量增加至80-90kD。這些修飾包括氨基末端胞外結(jié)構(gòu)域在天冬氨酸殘基上的N-連接糖基化、在胞外結(jié)構(gòu)域的羧基末端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上的0-連接糖基化以及添加的粘多糖。剪接變體的大小可以在80-250kD之間變化。HA，一種哺乳動物胞外基質(zhì)(ECM)中的聚糖，被認(rèn)為是⑶44主要的配體。然而，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD44與諸如膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等蛋白結(jié)合。在HA結(jié)合和糖基化之間似乎存在關(guān)聯(lián)。無活性的CD44 (不結(jié)合HA)具有最高的糖基化水平，有活性的CD44 (結(jié)合HA)糖基化水平最低而可誘導(dǎo)的CD44(除非被細(xì)胞因子、單克隆抗體、生長因子等激活，否則不與HA結(jié)合或很微弱地與HA結(jié)合)的糖基化水平在活性和無活性形式之間。⑶44通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠介導(dǎo)其的一些功能，這些通路依賴于細(xì)胞的相互作用、刺激以及環(huán)境。這樣的一些通路包括NF K B信號級聯(lián)(涉及炎癥反應(yīng))、Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(涉及細(xì)胞周期和增殖的激活)、Rho蛋白家族(涉及細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞遷移)以及PI3-K相關(guān)信號通路(涉及細(xì)胞存活)。上述所有的功能與腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。⑶44也被暗示通過各種額外的機理在癌癥中發(fā)生作用。這些機理包括⑶44細(xì)胞表面的細(xì)胞表面蛋白聚糖將生長因子、化學(xué)因子和細(xì)胞因子呈現(xiàn)給惡性腫瘤中的受體。同樣的，在CD44-HA復(fù)合物內(nèi)化后由溶酶體透明質(zhì)酸酶進(jìn)行的HA的胞內(nèi)降解也潛在地增加了腫瘤入侵和通過ECM的血管新生誘導(dǎo)的可能性。此外，已經(jīng)顯示存活或凋亡信號的傳遞通過標(biāo)準(zhǔn)或可變⑶44受體發(fā)生。⑶44也被暗示涉及細(xì)胞分化和遷移。這些機理中的很多但非全部是環(huán)境和細(xì)胞依賴性的且一些機理產(chǎn)生了不同的發(fā)現(xiàn)。因此，在得出任何結(jié)論之前需要更多的研究。為了證實⑶44在癌癥中潛在的功能作用，進(jìn)行了⑶44的表達(dá)研究以確定受體的差異性表達(dá)是否與疾病的進(jìn)程相關(guān)。然而，在大部分的腫瘤類型中觀察到不一致的現(xiàn)象，且這可能是由于研究人員之間在試劑、技術(shù)、病理學(xué)評分和細(xì)胞類型上的差異的混和造成的。腎細(xì)胞癌和非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤似乎是例外，因為具有⑶44高表達(dá)腫瘤的患者一致地比低或無⑶44表達(dá)的患者存活時間短。
由于其與癌癥的關(guān)聯(lián)，⑶44已經(jīng)成為發(fā)展抗癌治療的靶點。關(guān)于⑶44的標(biāo)準(zhǔn)或變體形式是否是腫瘤進(jìn)程所必需的仍然存在爭論。兩種觀點都有體內(nèi)動物數(shù)據(jù)支持，同樣的，這可能是腫瘤類型甚至是細(xì)胞類型依賴的。不同的治療手段已包括可溶CD44蛋白、透明質(zhì)酸合成酶cDNA、透明質(zhì)酸酶的注射，反義CD44和CD44專一性抗體的使用。各種手段已經(jīng)實現(xiàn)了一定程度的成功由此為抗CD44癌癥治療提供了支持。實驗中已經(jīng)產(chǎn)生了變體和標(biāo)準(zhǔn)⑶44的專一性單克隆抗體，但絕大部分這樣的抗體除了與它們識別的CD44類型專一性地結(jié)合外，沒有固有的生物學(xué)活性。然而，存在某些抗體具有體外活性或體內(nèi)活性，但通常沒有兼具這兩種活性。已經(jīng)顯示一些抗CD44抗體介導(dǎo)細(xì)胞事件。例如，針對人紅血球Lutheran抗原⑶44標(biāo)準(zhǔn)型的小鼠抗體A3D8顯示增強⑶2 (9-1抗體)和⑶3 (0KT3抗體)介導(dǎo)的T細(xì)胞激活；另一種抗⑶44抗體具有相似的效應(yīng)。A3D8也誘導(dǎo)IL-I從單核細(xì)胞的釋放和IL-2從T淋巴細(xì)胞的釋放。有趣的是，A3D8與藥物如柔紅霉素、米托蒽醌和依托泊甙結(jié)合使用通過消除第二信使神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生抑制了HL60和NB4AML細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)。沒有固有活性且靶向CD44的相似抗原決定簇的J173抗體未抑制藥物誘導(dǎo)的凋亡。靶向⑶44的85-110KD和200KD形式的NIH44-1抗體通過一通路增強了 T細(xì)胞的增殖，作者推斷該通路為CD44的交聯(lián)或聚集。綜上所述，沒有證據(jù)說明諸如這些抗體適合作為癌癥治療，因為它們抑或不針對癌癥(例如激活淋巴細(xì)胞)，抑或誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，或者在與細(xì)胞毒性試劑一同使用時抑制癌細(xì)胞的藥物誘導(dǎo)死亡。一些抗⑶44抗體已被描述，這些抗體證實了體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)?？贵wI. 1ASML，一種靶向⑶44的v6變體的小鼠抗大鼠IgGl抗體，已經(jīng)顯示降低了大鼠胰腺癌BSp73ASML的淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移。治療后的動物的存活隨之提高。該抗體僅當(dāng)在淋巴結(jié)定植(colonization)之前給藥有效,且據(jù)推斷其干擾淋巴結(jié)中的細(xì)胞增殖。在體外，該抗體對腫瘤細(xì)胞沒有直接的細(xì)胞毒性，且抗體沒有提高補體介導(dǎo)細(xì)胞毒性或免疫效應(yīng)細(xì)胞功能。沒有說明該抗體針對人細(xì)胞的應(yīng)用。Breyer等說明了一種商業(yè)可獲取的抗⑶44s抗體在破壞原位移植大鼠的神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤的進(jìn)程中的應(yīng)用。將大鼠神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤細(xì)胞系C6植入額葉，一周后通過腦內(nèi)注射用抗體對大鼠進(jìn)行3次治療。和緩沖液或同型對照治療后的大鼠相比，治療后的大鼠證實了降低的腫瘤生長以及更高的體重。在體外，該抗體能夠抑制細(xì)胞對由基質(zhì)成分包被的蓋玻片的粘附，但對細(xì)胞沒有直接的細(xì)胞毒性效應(yīng)。該抗體沒有對人細(xì)胞進(jìn)行測試。進(jìn)行了比較抗⑶44s抗體(M7. 8. I)和⑶44vl0抗體(K926)功效的研究。將表達(dá)兩種CD44異構(gòu)體的高度轉(zhuǎn)移的小鼠黑素瘤細(xì)胞系B16F10靜脈內(nèi)植入小鼠。兩天后，在研究期間每三天給予抗體。兩種抗體在肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量上均造成了大于50%的顯著降低；在兩種抗體的功效之間沒有顯著的差別。抗體在體外不影響增殖，且作者Zawadzki等推測腫瘤生長的抑制是因為抗體阻斷了⑶44和其配體的相互作用。在使用M-7. 8. I的另一研究中，Zahalka等證實了該抗體及其F (ab’)2片段能夠阻斷小鼠T細(xì)胞淋巴瘤LB對淋巴結(jié)的浸潤。這賦予了小鼠顯著的存活益處。Wallach-Dayan等顯示用⑶44v4_vl0轉(zhuǎn)染不會自發(fā)形成腫瘤的LB-TRs小鼠淋巴瘤導(dǎo)致其具有形成腫瘤的能力。M-7. 8. I的給藥和同型對照抗體相比降低了移植后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的腫瘤體積。這些實驗沒有一個證實了該抗體在人體中的應(yīng)用。GKW. A3，小鼠的IgG2a，對人⑶44具有專一性且在SCID小鼠模型中防止了人黑素·瘤異種移植物的形成和轉(zhuǎn)移。將該抗體與轉(zhuǎn)移性人細(xì)胞系SMMU-2混和并隨后皮下注射。治療在隨后的3周內(nèi)持續(xù)。4周后,相比于未治療動物的10010只小鼠中僅I只在注射位點形成了腫瘤。該抗體的F(ab’)2片段證實了對腫瘤形成相同的抑制，暗示該行為機理不依賴于補體或抗體依賴性細(xì)胞毒性。如果在第一次抗體注射前一周注射腫瘤細(xì)胞，有80%的動物在原始位點形成腫瘤。然而，注意到存活時間仍然顯著增長了。盡管延遲的抗體給藥對原發(fā)瘤的形成沒有效應(yīng)，其完全地防止了在未治療動物中出現(xiàn)的肺、腎、腎上腺、肝和腹膜的轉(zhuǎn)移。在體外，該抗體對細(xì)胞系沒有任何直接的細(xì)胞毒性或干擾SMMU-2細(xì)胞的增殖，且似乎通過影響轉(zhuǎn)移或生長對腫瘤的形成產(chǎn)生主要的效應(yīng)。該抗體的一個需要注意的特征是其識別CD44的所有異構(gòu)體，這暗示著其在治療應(yīng)用中有限的可能性。Strobel等說明了抗⑶44抗體(克隆515)在小鼠異種移植模型中抑制人卵巢癌細(xì)胞腹膜移植的應(yīng)用。在抗CD44抗體或?qū)φ湛贵w的存在下，將人卵巢細(xì)胞系36M2腹腔內(nèi)植入小鼠，且在隨后的20天中進(jìn)行治療。5周后，在抗體治療組的腹膜腔中有顯著更少的節(jié)結(jié)(nodules)。來自抗CD44和對照治療組的節(jié)結(jié)具有相同的大小，暗示著一旦細(xì)胞被移植，抗體對腫瘤的生長沒有效應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞被皮下植入時，對腫瘤生長也沒有效應(yīng)，意味著該抗體本身沒有抗增殖或細(xì)胞毒性效應(yīng)。此外，抗體在體外對細(xì)胞生長沒有效應(yīng)。VFF-18，也被稱作BIWA 1，是對⑶44的v6變體具有高度親和性的抗體，其對該多肽的360-370區(qū)域具有專一性。在對12個患者進(jìn)行的I期臨床試驗中，該抗體已被用作99m锝標(biāo)記偶聯(lián)物。對該抗體的安全性以及在患有頭部和頸部鱗狀細(xì)胞癌的患者中的靶向潛能進(jìn)行了測試。在注射40小時后，注射劑量的14%被腫瘤吸收，且在其它器官包括腎、脾和骨髓中具有最少的積聚。高度選擇性的腫瘤結(jié)合暗示著該抗體在發(fā)射免疫治療中的作用，盡管該抗體異常高的親和力阻止其對腫瘤深層的穿透力。進(jìn)一步限制BIWA I應(yīng)用的是小鼠抗體的免疫原性(12名患者中的11個產(chǎn)生了人抗鼠抗體(HAMA))、在腫瘤中的不均勻積聚以及抗體-可溶CD44復(fù)合物的形成。WO 02/094879公開了 VFF-18的人源化形式，其被設(shè)計用于克服HAMA反應(yīng)，被命名為BIWA 4。據(jù)發(fā)現(xiàn)，BIWA 4和VFF-18母抗體相比，其抗原結(jié)合親和力顯著降低。意外的是，更低親和力的BIWA 4抗體比更高親和力的BIWA 8人源化VFF-18抗體具有較高的腫瘤吸收特征。在33名患者的I期臨床試驗中對99m锝標(biāo)記的和186錸標(biāo)記的BIWA4抗體進(jìn)行評價以確定安全性、耐受能力、腫瘤積聚和186錸標(biāo)記BIWA4的最大耐受劑量。99mTc標(biāo)記BIWA 4中似乎存在腫瘤相關(guān)的吸收。在186Re標(biāo)記BIWA 4的所有劑量中沒有觀察到腫瘤的應(yīng)答，盡管一些具有穩(wěn)定的病情；劑量限制毒性發(fā)生在60mCi/m2。存在50-65%的不良事件發(fā)生率，33名患者中的12位被認(rèn)為發(fā)生了嚴(yán)重的不良事件(血小板減少、白血球減少以及發(fā)熱)，且均接受186Re標(biāo)記BIWA 4治療的6名患者在治療期間死亡或因為疾病惡化隨后死亡。2名患者產(chǎn)生了人抗人抗體(HAHA)。在20名患者中進(jìn)行了186Re標(biāo)記BIWA 4的I期劑量遞增試驗。觀察到口腔粘膜炎和劑量限制血小板減少和白血球減少；一名患者產(chǎn)生了 HAHA反應(yīng)。在以60mCi/m2的最高劑量治療的5名患者中觀察到穩(wěn)定的病情。盡管在獲得功效的安全性和耐受能力上被認(rèn)為可以接受，這些研究相比于臨床研究中其它非放射性同位素偶聯(lián)的生物學(xué)治療具有更高的不良事件發(fā)生率。美國專利申請2003/0103985公開了用于腫瘤治療的與maytansinoid偶聯(lián)的VFF-18人源化形式，被命名為BIWI I。人源化VFF 18抗體BIWA 4，在與一毒素偶聯(lián)時，即BIWI 1，被發(fā)現(xiàn)在人外陰皮膚癌、咽喉鱗狀細(xì)胞癌或乳腺癌的小鼠模型中具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)。未偶聯(lián)的形式BIWA4沒有抗腫瘤活性，且偶聯(lián)形式BIWI I沒有在人體中的安全性或功效的證據(jù)。Mab U36通過UM_SCC_22B人下咽骨癌細(xì)胞免疫和癌及組織專一性選擇產(chǎn)生的小 鼠IgGl抗體。通過cDNA克隆和序列分析進(jìn)行的抗原表征將角質(zhì)細(xì)胞專一性的CD44剪接變體表元(epican)的v6結(jié)構(gòu)域識別為Mab U36的祀點。免疫組織化學(xué)研究顯示該抗原決定簇限于細(xì)胞膜上。此外，Mab U36對94%的頭部和頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)發(fā)生了強標(biāo)記，且在這些腫瘤中細(xì)胞染色不均一。10名患者的99mTc標(biāo)記Mab U36研究顯示該抗體對HNSCC癌癥的選擇性積聚(2天內(nèi)20. 4+/-12. 4%的注射劑量/kg);沒有不良反應(yīng)的報道但2名患者產(chǎn)生了 HAMA。在放射性碘的小鼠Mab U36的研究中，在18名患者中有3例HAMA以及HNSCC的選擇性均勻吸收。為了降低Mab U36的抗原性以及降低HAMA的發(fā)生率，構(gòu)建了嵌合抗體。嵌合或原始的小鼠Mab U36均沒有ADCC活性。沒有Mab U36天然功能活性的證據(jù)。186Re標(biāo)記的嵌合Mab U36被用于確定Mab U36作為治療試劑的應(yīng)用。在該I期劑量遞增試驗中，13名患者接受了 99mTc標(biāo)記的嵌合Mab U36的嘗試劑量和隨后的186Re標(biāo)記嵌合Mab U36。沒有急性不良事件的報道但隨后的治療中觀察到3名患者中的2名有劑量限制髓毒性(I. 5GBq/m2)，且觀察到I名接受最大耐受劑量(I. OGBq/m2)治療的患者血小板減少。盡管對腫瘤體積有某些效應(yīng)，這些效應(yīng)沒有滿足對治療產(chǎn)生客觀應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)。186Re標(biāo)記嵌合Mab U36的進(jìn)一步的研究采用使用粒細(xì)胞群落刺激因子刺激的全血回輸?shù)牟呗詫⒆畲竽褪芑钚约颖吨?. SGy0在對患有頭部和頸部各種腫瘤的9名患者的該研究中，3名因為藥物相關(guān)貧血需要輸血。其它毒性包括3級髓毒性和2級粘膜炎。盡管在5名患者中實現(xiàn)了 3-5個月的穩(wěn)定病情，沒有客觀腫瘤應(yīng)答的報道。因此，可以看出盡管Mab U36是高度專一的抗體，其要求放射免疫偶聯(lián)物以實現(xiàn)抗癌效應(yīng)的缺點限制了其用途，因為其與獲得臨床效應(yīng)相關(guān)的治療相關(guān)聯(lián)的毒性。總之，已經(jīng)顯示，CD44v6(l. 1ASML)和CD44vlO (K926)單克隆抗體在用轉(zhuǎn)移型胰腺癌注射的大鼠或在用惡性黑素瘤注射的小鼠中分別降低了轉(zhuǎn)移活性。另一種抗CD44v6抗體(VFF-18及其衍生物)僅在與maytansinoid或放射性同位素偶聯(lián)時具有抗腫瘤活性?？箻?biāo)準(zhǔn)CD44單克隆抗體也已經(jīng)顯示抑制大鼠神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤的腦內(nèi)進(jìn)程(抗CD44)、小鼠T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴結(jié)侵入(頂-7. 8. I)以及抑制人卵巢癌細(xì)胞在裸鼠中的移植(克隆515)、小鼠黑素瘤細(xì)胞系的肺轉(zhuǎn)移(IM-7.8. I)以及在SCID小鼠中人黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(GKW.A3)。放射性同位素偶聯(lián)的Mab U36抗CD44v6抗體及其衍生物在臨床試驗中具有抗腫瘤活性并伴隨著顯著的毒性。盡管這些結(jié)果是鼓舞人心的且支持將抗CD44單克隆抗體發(fā)展成為潛在的癌癥治療法，它們說明了對人體癌癥有限的效應(yīng)、安全性或適用性。因此，如果分離出一種抗體成分，該成分介導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，作為其與所述細(xì)胞上的CD44細(xì)胞表面表達(dá)相互吸引的功能，將會實現(xiàn)有價值的診斷和治療方式?，F(xiàn)有專利美國專利號5，750，102公開了一種工藝，其中使用從患者細(xì)胞或組織克隆的MHC基因轉(zhuǎn)染來自患者腫瘤的細(xì)胞。隨后使用這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對患者進(jìn)行預(yù)防接種。美國專利號4，861，581公開了一種工藝，其包括步驟有獲得對哺乳動物的癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的胞內(nèi)成分具有專一性但對胞外成分沒有專一性的單克隆抗體，標(biāo)記該單克隆抗體，將標(biāo)記的抗體與已經(jīng)接受治療哺乳動物的組織接觸以殺死腫瘤細(xì)胞，并且通過測定標(biāo)記的抗體與退化的腫瘤細(xì)胞的胞內(nèi)成分的結(jié)合確定治療的效力。在制備靶向人胞內(nèi)抗 原的抗體中，專利權(quán)人認(rèn)識到惡性細(xì)胞代表了這些抗原的便捷來源。美國專利號5，171，665提供了一新穎的抗體及其制備方法。特別地，該專利指導(dǎo)了單克隆抗體的形成，該抗體具有與人腫瘤相關(guān)蛋白抗原緊密結(jié)合的性質(zhì)，例如結(jié)腸癌和肺癌，而與正常細(xì)胞以低得多的水平發(fā)生結(jié)合。美國專利號5，484，596提供了癌癥治療的方法，包括從人癌癥患者體內(nèi)手術(shù)去除腫瘤組織，處理腫瘤組織獲得腫瘤細(xì)胞，照射腫瘤細(xì)胞使其存活但非腫瘤原性并使用這些細(xì)胞為患者制備疫苗，該疫苗能夠抑制原發(fā)瘤的復(fù)發(fā)并同時抑制轉(zhuǎn)移。該專利指導(dǎo)了與腫瘤細(xì)胞表面抗原反應(yīng)的單克隆抗體的開發(fā)。如第4列，第45行及以后所述的，專利權(quán)人將內(nèi)源性腫瘤細(xì)胞用于單克隆抗體的開發(fā)，呈現(xiàn)了人腫瘤的活性專一性免疫療法。美國專利號5，693，763指導(dǎo)了人癌的特征性的糖蛋白抗原且其不依賴于來源的上皮組織。美國專利號5，783，186提出了誘導(dǎo)Her2表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗Her2抗體，生成抗體的雜交瘤細(xì)胞系，用抗體和含有所述抗體的藥物組合物治療癌癥的方法。美國專利號5，849，876描述了新的雜交瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系可生成從腫瘤和非腫瘤組織源中純化出的粘蛋白抗原的單克隆抗體。美國專利號5，869，268提出了人淋巴細(xì)胞的生成方法，該淋巴細(xì)胞產(chǎn)生專一針對目標(biāo)抗原的抗體，生產(chǎn)單克隆抗體的方法以及用這種方法生產(chǎn)的單克隆抗體。該專利特別提到一種抗HD人單克隆抗體的制備，該抗體可用于癌癥的診斷和治療。美國專利號5，869，045涉及與人體癌癥細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體偶聯(lián)物和單鏈免疫毒素。這些抗體的功能機制是雙重的，分子與人癌表面上的細(xì)胞膜抗原反應(yīng)，進(jìn)一步地抗體在結(jié)合之后能夠內(nèi)化進(jìn)癌細(xì)胞，使它們特別適于形成抗體-藥物和抗體-毒素偶聯(lián)物。在特定濃度下未修飾的抗體同樣具有明顯的細(xì)胞毒性。美國專利號5，780，033公開了自身抗體在腫瘤治療和預(yù)防中的應(yīng)用。但是，該抗體是源自老年哺乳動物的抗細(xì)胞核自身抗體。在該例中，自身抗體據(jù)稱是免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一類天然抗體。因為自身抗體來自“老年哺乳動物”，因此不要求自身抗體真正來自接受治療的患者。此外該專利公開了老年哺乳動物中的天然和單克隆抗核自身抗體，以及制備單克隆抗核自身抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
美國專利號5，916，561公開了靶向⑶44基因變體外顯子v6的專一性抗體VFF-18及其變體。該抗體相對于其它同類抗體有所改進(jìn)，因為其識別人CD44v6變體而不識別大鼠的⑶44v6變體。此外,該抗體公開了對于⑶44v6表達(dá)的診斷分析。對于該抗體沒有公開任何體外或體內(nèi)的功能。美國專利號5，616，468公開了單克隆抗體Var3. I，該抗體針對包含由人的⑶44基因的外顯子6A編碼的序列的合成肽制備。特別地，該抗體與人⑶44的90kD形式不發(fā)生結(jié)合且可以與Hermes-3抗體相區(qū)別。提供了檢測CD44的v6變體的方法以及根據(jù)該抗原對惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)行篩選和分析的方法。還提供了根據(jù)檢測血清中的抗原篩選炎癥疾病的方法。美國專利號5，879，898公開了與人⑶44變體6的129bp的外顯子結(jié)合的專一性抗體，該外顯子產(chǎn)生43個氨基酸的肽。該單克隆抗體可由若干雜交瘤細(xì)胞系制備MAK〈CD44>M-1. I. 12、MAK〈CD44>M_2. 42. 3、MAK〈CD44>M_4. 3. 16。該抗體從一融合蛋白產(chǎn)生，該蛋白包含新⑶44v6氨基酸序列的至少一個六肽。此外，公開了用于檢測外顯子6變體的 免疫分析，該分析可被用作癌癥的診斷。值得注意地，沒有公開該抗體的體外或體內(nèi)功能。美國專利號5，942，417公開了編碼類⑶44多肽的多核苷酸以及使用該多核苷酸及其變體制備重組蛋白的方法。該專利權(quán)利要求了這些多肽的抗體但沒有具體實施例也沒有分泌這些抗體的保藏的克隆。Northern印記法證實該多核苷酸在一些類型的組織中出現(xiàn)，但沒有該多核苷酸翻譯和表達(dá)的相應(yīng)證據(jù)。因此，沒有證據(jù)說明針對該多核苷酸的基因產(chǎn)物制備了抗體，且這些抗體是否具有體外或體內(nèi)功能，以及它們是否與人癌癥疾病相關(guān)。美國專利號5，885，575公開了與⑶44的變體抗原決定簇反應(yīng)的抗體以及通過使用該抗體識別該變體的方法。從大鼠細(xì)胞中分離出編碼該變體的分離的多核苷酸，且靶向該變體的抗體mAbl. IASML識別分子量為120kD、150kD、180kD和200kD的蛋白。單克隆抗體I. IASML的給藥延緩了大鼠BSp73ASML在同基因大鼠中的生長和轉(zhuǎn)移。值得注意地，正如其缺乏對LCLC97人大細(xì)胞肺癌的活性所證實的，I. IASML不識別人腫瘤。從LCLC97中分離出人的同源體但沒有制備出識別該同源體的等價抗體。由此，盡管制備了對大鼠CD44的變體具有專一性的抗體且該抗體顯示影響大鼠腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，沒有證據(jù)說明該抗體對人腫瘤具有效應(yīng)。更具體地，該發(fā)明人指出該抗體不識別人癌癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明者此前已被授予名為“個別患者特異性抗癌抗體(IndividualizedPatient Specific Anti-Cancer Antibodies) ” 的美國專利 6，180，357,該專利提出了選擇用于治療癌癥疾病的個別定制的抗癌抗體的方法。為了本文的目的，術(shù)語“抗體”和“單克隆抗體”(mAb)可交替使用來指雜交瘤(例如鼠或人的)生成的完整的免疫球蛋白、免疫偶聯(lián)物和由免疫球蛋白衍生出的合適的免疫球蛋白片段和重組蛋白，如嵌合的和人源化免疫球蛋白、F(ab’ )和F(ab’)2片段、單鏈抗體、重組免疫球蛋白可變區(qū)(FV) S、融合蛋白等。本領(lǐng)域充分已知可以變化多肽中的一些氨基酸序列而不會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生顯著的影響。在抗體的分子重排中，對骨架區(qū)域的核酸或氨基酸序列的修改通常是可以接受的。這些修改包括但不限于取代(優(yōu)選地是保守取代)、刪除或增加。此外，將標(biāo)準(zhǔn)的化療模式例如放射核與本發(fā)明的CDMAB偶聯(lián)由此關(guān)注所述化療的應(yīng)用也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。CDMAB還可以與毒素、細(xì)胞毒性基序(moiety)、酶如生物素偶聯(lián)酶或造血細(xì)胞偶聯(lián)。
本申請基本使用‘357專利中指導(dǎo)的制備患者專一性抗癌抗體的方法分離雜交瘤細(xì)胞系，這些細(xì)胞系編碼癌癥疾病改善單克隆抗體。這些抗體可以專一性地針對一種腫瘤制備，由此使得癌癥治療的個性化成為可能。在本申請全文中，具有細(xì)胞殺死(細(xì)胞毒性的)或細(xì)胞生長抑制(抑制細(xì)胞生長的)性質(zhì)的抗癌抗體在此后將被稱作細(xì)胞毒性的。這些抗體可用于幫助癌癥的定級和診斷，也可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移及原發(fā)瘤。個性化抗癌治療的前景將給患者的管理方式帶來改變?？赡艹霈F(xiàn)的臨床情景是在腫瘤出現(xiàn)時獲取并儲存腫瘤樣品。通過這個樣品，可以用一組既存的癌癥疾病改善抗體檢測腫瘤的類型?；颊邔闯Ｒ?guī)定級但是適用的抗體可以用于對患者進(jìn)一步的定級?？梢杂么嬖诘目贵w立即對患者進(jìn)行治療，且/或可以使用在此概述的方法或通過噬菌體表面展示文庫結(jié)合在此公開的篩選方法制備一組對腫瘤具有專一性的抗體。將生成的所有抗體加入抗癌抗體文庫，因為其它腫瘤可能與正在接受治療的腫瘤存在部分相同的抗原決定簇。根據(jù)本方法生產(chǎn)的抗體可用于治療任意數(shù)量患者的癌癥疾病，如果這些患者的癌癥可以與這些抗體結(jié)合?；臼褂妹绹鴮＠?，180，357的方法，在用患者肺腫瘤活檢細(xì)胞使小鼠免疫之后，獲得小鼠單克隆抗體H460-16-2。H460-16-2抗原在來自不同組織的廣泛的人細(xì)胞系的細(xì)胞表面表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(MB-231)和皮膚癌細(xì)胞A2058是體外對H460-16-2細(xì)胞毒性效應(yīng)敏感的細(xì)胞系。在細(xì)胞培養(yǎng)中H460-16-2對MB-231細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果通過在其被移植進(jìn)小鼠時對這些細(xì)胞的抗腫瘤活性得以進(jìn)一步延伸(如S. N. 10/603, 000中公開的)。臨床前異種移植腫瘤模型被認(rèn)為是治療功效的有效預(yù)測。在人乳腺癌的預(yù)防性體內(nèi)模型中，在治療期間，H460-16-2治療比同型對照抗體顯著更有效地(P < 0. 0001)抑制腫瘤生長，同型對照抗體在結(jié)構(gòu)和大小上與H460-16-2相同但不能結(jié)合MB-231細(xì)胞。在治療期結(jié)束時，接受H460-16-2的小鼠其腫瘤生長只有對照組的I. 3%。在治療后的后續(xù)期間，H460-16-2的治療效應(yīng)繼續(xù)維持，且直到測量期結(jié)束，治療組的平均腫瘤體積一直顯著地小于對照組。使用存活作為抗體功效的衡量指標(biāo)，據(jù)估計在治療后的70天，H460-16-2治療組中的死亡風(fēng)險是抗體緩沖液對照組的大約71% (p =
0.028)。這些數(shù)據(jù)說明H460-16-2治療與對照治療組相比具有存活益處。由于沒有誘導(dǎo)任何毒性跡象，包括體重降低和臨床痛苦，H460-16-2治療似乎是安全的。因此，H460-16-2治療是有效的，因為在完善的人乳腺癌模型中它與對照治療組相比延緩了腫瘤的生長并提高了存活。此外，H460-16-2在成熟體內(nèi)腫瘤的模型中證明了對MB-231細(xì)胞的抗腫瘤活性(如S. N. 10/603, 000中描述的)。將H460-16-2的治療和標(biāo)準(zhǔn)化療藥物順鉬進(jìn)行了比較，比較顯示順鉬和H460-16-2治療組和接受抗體稀釋緩沖液或同型對照抗體治療的組相比具有顯著小的平均腫瘤體積(P < 0. 001)。H460-16-2治療介導(dǎo)了大約為順鉬化療2/3的腫瘤抑制但沒有順鉬治療中觀察到的顯著的(19. 2% )體重降低(p < 0. 003)和臨床痛苦，包括在順鉬治療中觀察到的2例治療相關(guān)的死亡。H460-16-2的抗腫瘤活性及其最小化的毒性使其成為一種具有吸引力的抗癌治療試劑。在治療后階段，H460-16-2顯示了顯著的存活益處(p < 0. 02)，因為在治療后的>70天，H460-16-2組的死亡風(fēng)險大約是同型對照抗體組的一半。觀察到的存活益處持續(xù)到治療后的120天，其時相比于67%的H460-16-2治療組，100%的同型對照和順鉬治療小鼠死亡。和同型對照抗體組相比,通過以26%的比例延緩腫瘤生長，H460-16-2維持對腫瘤的抑制。在治療后的31天，H460-16-2通過以相對于同型對照組48%的比例減慢腫瘤生長從而限制腫瘤體積，這和在治療結(jié)束時觀察到的49%的降低相當(dāng)。在乳腺癌的成熟腫瘤模型中，這些結(jié)果意味著H460-16-2在治療期以外維持腫瘤抑制的潛力且證明了該抗體在哺乳動物體內(nèi)降低腫瘤負(fù)荷和提高存活的能力。為了證實H460-16-2抗原決定簇是藥物靶點，此前確定了 H460_16_2抗原在正常人體組織中的表達(dá)(S. N. 10/603, 000)。通過與抗⑶44抗體(克隆L178)的比較，此項工作得到了延伸。通過H460-16-2的IHC染色，大部分組織又一次無法表達(dá)H460-16-2抗原，包括要害器官的細(xì)胞，如肝、腎(管狀上皮細(xì)胞的少量染色除外)、心臟和肺。組織染色的結(jié)果意味著H460-16-2呈現(xiàn)對各種細(xì)胞類型的受限結(jié)合但與浸潤性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞結(jié)合。L178抗體顯示了相似的染色模式。然而，注意到一些差別；和財60-16-2相比，L178對淋巴細(xì)胞的染色更強且具有更廣泛的分布。并且在一個肝臟樣品中L178對Kupffer細(xì)胞發(fā)生了染色而H460-16-2沒有。
H460-16-2抗原的定位及其在乳腺癌患者中的普遍性對評價H460_16_2免疫治療對患者的益處和設(shè)計有效臨床實驗是重要的。為了弄清H460-16-2抗原在癌癥患者乳腺腫瘤中的表達(dá)，之前對來自50個乳腺癌患者的腫瘤組織樣品中H460-16-2抗原的表達(dá)進(jìn)行了篩選(S. N. 10/603, 000)。當(dāng)前的工作將H460-16-2的染色與L178進(jìn)行比較。當(dāng)前的研究的結(jié)果與之前的結(jié)果相似并顯示62%的組織樣品為H460-16-2抗原染色陽性而76%的乳腺腫瘤組織是L178抗原決定簇陽性的。在患者樣品中H460-16-2的表達(dá)似乎對癌細(xì)胞具有專一性因為染色限制在惡性細(xì)胞。相反，H460-16-2對乳腺癌患者10個正常組織樣品中的4個發(fā)生了染色而L178染色了 6個。H460-16-2和L178抗原的乳腺腫瘤表達(dá)似乎主要定位在惡性細(xì)胞的細(xì)胞膜上，使CD44成為具有吸引力的治療靶點。基于雌激素和孕酮受體在乳腺腫瘤中的表達(dá)對H460-16-2的表達(dá)進(jìn)行了進(jìn)一步的評估，這兩種激素受體在乳腺腫瘤的發(fā)展、治療和預(yù)后中發(fā)揮重要作用。在H460-16-2抗原表達(dá)和雌激素或孕酮受體表達(dá)之間沒有明顯的關(guān)聯(lián)性。當(dāng)根據(jù)腫瘤的階段或癌癥發(fā)展的程度分析腫瘤時，再一次地，在H460-16-2抗原表達(dá)和腫瘤階段之間沒有清晰的關(guān)聯(lián)。L178獲得了相似的結(jié)果。為了進(jìn)一步延伸H460-16-2的潛在治療益處，此前確定了抗原在各種人癌癥組織中的頻率和定位(S. N. 10/603, 000)。當(dāng)前的研究將H460-16-2的染色與克隆L178進(jìn)行比較。這些腫瘤類型中的大部分對L178抗原也是陽性的。和人乳腺腫瘤組織一樣，H460-16-2和L178的定位主要發(fā)生在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上。然而，和H460-16-2相比，L178存在更多的膜定位。同樣的，在對于H460-16-2和L178均發(fā)生染色的腫瘤類型中，43%的組織對L178抗體顯示了更高強度的染色。根據(jù)與文獻(xiàn)中的IHC數(shù)據(jù)的比較，似乎沒有CD44的形式與在此呈現(xiàn)的IHC數(shù)據(jù)精確匹配。⑶44的標(biāo)準(zhǔn)形式通常在人腦中表達(dá)；H460-16-2抗原不表達(dá)。靶向全⑶44異構(gòu)體的抗體不對肝(包括Kuppfer細(xì)胞)發(fā)生染色且對生殖周期的所有階段的子宮內(nèi)膜腺陽性染色。H460-16-2抗原清晰地存在于Kuppfer細(xì)胞上且僅存在于生殖周期的分泌子宮內(nèi)膜腺上。H460-16-2抗原清楚地存在于組織巨噬細(xì)胞上且僅有變體形式V4/5和V8/9顯示了偶爾的巨噬細(xì)胞染色。與抗⑶44L178相比，觀察到的H460-16-2相似但不同的結(jié)合模式說明H460-16-2抗原是CD44獨特的抗原決定簇。
如在此概述的，額外的生化數(shù)據(jù)也說明H460-16-2識別的抗原是⑶44的一種形式。這得到了研究的支持，研究顯示與⑶44反應(yīng)的單克隆抗體(L178)識別通過免疫沉淀與H460-16-2結(jié)合的蛋白。Western印記法也暗示由H460-16-2識別的⑶44的抗原決定簇在v6或VlO上不存在。H460-16-2抗原決定簇也可由于其是糖和構(gòu)象依賴性的而被區(qū)分，而很多抗⑶44抗體是靶向⑶44的肽部分的。這些IHC和生化結(jié)果證明H460-16-2與⑶44抗原的變體結(jié)合。由此，多數(shù)證據(jù)顯示H460-16-2通過與⑶44變體上的獨特的糖依賴性構(gòu)象抗原決定簇的連接介導(dǎo)抗癌效應(yīng)?？傊@些數(shù)據(jù)說明H460-16-2抗原是癌癥相關(guān)抗原且在人體中表達(dá)，并且是病理相關(guān)癌癥靶點。此外，這些數(shù)據(jù)還說明H460-16-2抗體與人癌癥組織結(jié)合，且可被合適地用于診斷、治療預(yù)測或預(yù)后的分析。此外，由于該抗原在絕大多數(shù)非惡性細(xì)胞中沒有表達(dá)，該抗原的細(xì)胞膜定位是細(xì)胞癌癥狀態(tài)的指示，且該發(fā)現(xiàn)允許該抗原、其基因或衍生物、其蛋白或其衍生物被用于診斷、治療預(yù)測或預(yù)后的分析。其它涉及抗⑶44抗體使用的研究具有H460-16-2所沒有呈現(xiàn)的治療潛力的局限。H460-16-2證實了體外和體內(nèi)的抗腫瘤活性。此前說明的抗體如MAK〈⑶44>M-1. I. 12、 MAK〈⑶44>M-2. 42. 3和MAK〈⑶44>M_4. 3. 16沒有屬于它們的體外和體內(nèi)細(xì)胞毒性且VFF-18與Mab U36沒有呈現(xiàn)固有的腫瘤細(xì)胞毒性。此外，其它呈現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤效應(yīng)的抗CD44抗體也具有在H460-16-2上不明顯的某些局限。例如，ASML1. 1、K926、抗CD44s和頂_78. I分別顯示了對大鼠、小鼠、異種移植模型中的大鼠和小鼠腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤活性。H460-16-2在人體癌癥模型中證實了抗腫瘤活性。H460-16-2也靶向人⑶44而抗體如ASML1. I僅識別大鼠CD44?？寺?15抗CD44抗體對人卵巢細(xì)胞系的腹膜腫瘤移植發(fā)生抑制但不防止或抑制腫瘤的生長。H460-16-2在SCID小鼠異種移植模型中能夠抑制人乳腺腫瘤的生長。GKW.A3是一種能夠在預(yù)防性但非成熟腫瘤的模型中抑制小鼠中生長的人轉(zhuǎn)移性黑素瘤的腫瘤生長的抗人CD44單克隆抗體。H460-16-2已在人乳腺癌的預(yù)防性和成熟的小鼠異種移植模型中證實了顯著的抗腫瘤活性。因此，很明顯，H460-16-2和此前說明的抗⑶44抗體相比具有更好的抗腫瘤性質(zhì)。其在SCID小鼠的人乳腺腫瘤上的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性已被證實并且靶向人CD44。該抗體還在人乳腺癌的預(yù)防性和成熟(更臨床相關(guān)的)模型中呈現(xiàn)了活性?？傊?，本發(fā)明指導(dǎo)了 H460-16-2抗原作為治療試劑靶點的應(yīng)用，該試劑在給藥時能夠降低哺乳動物體內(nèi)表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷并能夠?qū)е轮委熀蟮牟溉閯游镅娱L的存活。本發(fā)明還指導(dǎo)了 CDMAB(H460-16-2)及其衍生物在靶向其抗原以降低哺乳動物體內(nèi)表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷和延長患有表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動物的壽命中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還指導(dǎo)了在癌細(xì)胞中檢測H460-16-2的用途，其可被用于對患有表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動物的診斷、治療預(yù)測和預(yù)后。如果患者對治療的初始階段不敏感或發(fā)生轉(zhuǎn)移，可以重復(fù)產(chǎn)生腫瘤專一性抗體的過程用于再治療。此外，可以將抗癌抗體與從患者體內(nèi)獲得的紅血細(xì)胞偶聯(lián)并回輸用于轉(zhuǎn)移的治療。對轉(zhuǎn)移性癌癥很少有有效的治療且轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著不理想的結(jié)果導(dǎo)致死亡。但是，轉(zhuǎn)移性癌癥常常是充分血管化的且紅血細(xì)胞對抗癌抗體的運送具有在腫瘤位點聚集抗體的作用。甚至在轉(zhuǎn)移前，大部分癌細(xì)胞的存活依賴于宿主的血液供應(yīng)，與血紅細(xì)胞偶聯(lián)的抗癌抗體對原位腫瘤也是有效的?？商鎿Q地，抗體可以與其它造血細(xì)胞偶聯(lián)，例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺手細(xì)胞等。有5類抗體且各類抗體與一種由其重鏈賦予的功能關(guān)聯(lián)。一般認(rèn)為由裸抗體殺死癌細(xì)胞由抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)或補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)介導(dǎo)。例如小鼠IgM以及IgG2a抗體可以通過與補體系統(tǒng)中的C-I成分結(jié)合激活人的補體，由此激活補體活化的經(jīng)典通路，該通路可導(dǎo)致腫瘤降解。對于人抗體，最有效的補體激活抗體一般為IgM和IgGl。小鼠IgG2a和IgG3同型抗體有效募集具有Fe受體的細(xì)胞毒性細(xì)胞，由此造成單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞的殺細(xì)胞作用。人的IgGl和IgG3同型抗體均介導(dǎo)ADCC?？贵w介導(dǎo)的癌癥殺死的另一個可能的機制可能通過抗體的應(yīng)用，這些抗體能夠催化細(xì)胞膜及其相關(guān)糖蛋白或糖脂中的各種化學(xué)鍵的水解，即所謂的催化抗體。有另外兩種更廣為接受的抗體介導(dǎo)癌癥細(xì)胞殺死機制。第一種機制是將抗體用作疫苗以誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生對位于癌細(xì)胞上的推定抗原的免疫反應(yīng)。第二種機制是將抗體用于靶向生長受體并干擾它們的功能或下調(diào)受體以有效地使其功能喪失。 因此，本發(fā)明的目的是利用從來自特定個體的細(xì)胞中制備癌癥疾病改善抗體的方法來分離雜交瘤細(xì)胞系和相應(yīng)的由所述雜交瘤細(xì)胞系編碼的分離的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段，該疾病改善抗體對癌細(xì)胞是細(xì)胞毒性的，但同時對非癌細(xì)胞相對無毒。本發(fā)明的另一個目的是指導(dǎo)通過利用分離出的由保藏于ATCC的保藏號為PTA-4621的克隆編碼的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段來確定表達(dá)CD44抗原性基序的細(xì)胞的存在的方法，該基序與分離出的由保藏于ATCC的保藏號為PTA-4621的克隆編碼的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段專一性結(jié)合。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是指導(dǎo)通過分離出的由保藏于ATCC的保藏號為PTA-4621的克隆編碼的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的使用提高癌癥疾病患者的存活的方法，該抗體與CD44抗原性基序?qū)Ｒ恍越Y(jié)合。本發(fā)明的另一個目的是指導(dǎo)CDMAB及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是制備CDMAB，其細(xì)胞毒性通過ADCC介導(dǎo)。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是制備CDMAB，其細(xì)胞毒性通過⑶C介導(dǎo)。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是制備CDMAB，其細(xì)胞毒性是其催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解能力的一個功能。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是制備CDMAB，該抗體在癌癥診斷、預(yù)后和監(jiān)測的結(jié)合實驗中有用。通過以下說明，其中通過圖解和實施例的方式闡述了本發(fā)明的某些具體實施方式
，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)勢將變得明顯。


本專利或中請文件包含至少一幅彩色附圖。在提出要求并支付了必要費用后，專利局將提供帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_文本的復(fù)印件。圖I、用H460-16-2作探針的MDA-MB-468細(xì)胞膜的Western印記。泳道I :還原條件下分離的膜蛋白。泳道2:非還原條件下分離的膜蛋白。左側(cè)標(biāo)明了分子量標(biāo)記。圖2、用H460-16-2作探針的細(xì)胞膜的Western印記。泳道I :MDA-MB_468細(xì)胞膜。泳道2 MDA-MB-231細(xì)胞膜。左側(cè)標(biāo)明了分子量標(biāo)記。圖3、MDA-MB-468 膜蛋白的二維 Western 印記和 SDS-PAGE。板 A 說明了 H460-16-2識別的2個蛋白的位置。板B說明了用同型對照抗體作探針的相似的印記。板C顯示了MDA-MB-468膜的SYPRORuby染色膠。箭頭表示對應(yīng)于板A的蛋白質(zhì)點的位置。圖4、MDA-MB_231膜蛋白的二維Western印記。由箭頭表示了主要的結(jié)合蛋白。圖5、去糖基化對H460-16-2和MDA-MB-231細(xì)胞膜結(jié)合的影響。板A顯示了在Western印記中H460-16-2與未處理的MDA-MB-231細(xì)胞膜(泳道2)、糖苷酶(見文)37V處理24小時的細(xì)胞膜(泳道3)、糖苷酶25°C處理24小時的細(xì)胞膜(泳道4)的結(jié)合。泳道I顯示了分子量標(biāo)簽的位置。板B說明了高甘露糖結(jié)合外源凝集素GNA與相似印記的結(jié)
八 口 o圖6、與 H460-16-2 免疫沉淀的 MDA-MB-231 膜蛋白的 SDS-PAGE (板 A)和 Western印記(板B)。泳道I :MDA-MB-231細(xì)胞膜總蛋白；泳道2 與H460-16-2免疫沉淀的蛋白。箭頭表明80-90kD的H460-16-2結(jié)合蛋白。圖7、用H460-16-2 (板A)、抗CD44 (克隆L178，板B)和抗HSP90 (板C)作探針的蛋白的Western印記。泳道I :MDA_MB_231細(xì)胞膜總蛋白；泳道2 與H460-16-2免疫沉淀的蛋白；泳道3:分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖8、用 H460-16-2(板 A，泳道 2)、抗 CD44(克隆 L178，板 B，泳道 2)、抗CD44var6 (克隆VFF-7，板C，泳道2)和抗CD44varlO (克隆VFF-14，圖D，泳道2)作探針的蛋白的Western印記。各印記中的泳道I包含分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖9、H460-16-2結(jié)合的典型的FACS直方圖。直方圖呈現(xiàn)了 H460-16-2(20ii g/mL)、107. 3 同型對照(20ii g/mL)和抗 EGFR(5 y g/mL)與乳腺癌(MDA-MB-231 和 MDA-MB-468)和正常(Hs578. Bst和CCD-27sk)細(xì)胞系的結(jié)合。圖10、顯示H460-16-2 (A)和抗⑶44 (L178)抗體⑶在來自正常人組織陣列的扁桃腺的組織切片上的結(jié)合模式的典型顯微圖。L178比ARH460-16-2對淋巴細(xì)胞具有更強且廣泛分布的染色，其中染色更局限在淋巴結(jié)的套膜區(qū)(mantle zone)(黑箭頭)，生發(fā)中心染色弱(綠箭頭)。放大倍率為200X。圖11、顯示H460-16_2(A)和抗CD44(L178)抗體⑶在來自正常人組織陣列的肝臟的組織切片上的結(jié)合模式的典型顯微圖。L178對肝竇間隙的Kupffer細(xì)胞染色(箭頭)但H460-16-2沒有。放大倍率為200X。圖12、H460-16-2與乳腺癌腫瘤結(jié)合的典型顯微圖(浸潤型導(dǎo)管癌)。圖中黃色和橙色的箭頭分別指向基質(zhì)細(xì)胞和惡性細(xì)胞層。圖13、顯示H460-16-2(A)和抗CD44(L178)抗體(B)在來自人乳腺癌組織陣列的帕哲氏病(Paget’ s disease)乳腺組織切片上的結(jié)合模式的典型顯微圖。L178對惡性細(xì)胞的膜染色(箭頭)對比于H460-16-2的陰性染色。放大倍率為200X。圖14、顯示H460-16-2(A)和抗CD44(L178)抗體(B)在來自人多腫瘤組織陣列的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的組織切片上的結(jié)合模式的典型顯微圖。H460-16-2比L178對惡性細(xì)胞發(fā)生更強的染色。放大倍率為200X。圖15、顯示H460-16-2(A)和抗⑶44(L178)抗體⑶在來自人多腫瘤組織陣列的腺癌的肺組織切片上的結(jié)合模式的典型顯微圖。L178對惡性細(xì)胞發(fā)生+++記分，相比于H460-16-2的+/-記分。放大倍率為200X。
具體實施例方式實施例I通過Western印記法對結(jié)合蛋白的識別為了識別H460-16-2抗體識別的抗原，對表達(dá)該抗原的細(xì)胞膜進(jìn)行凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至膜上。使用Western印記法確定該抗體檢測到的蛋白。I、細(xì)胞膜制備此前的工作通過FACS證實了 H460-16-2與乳腺癌細(xì)胞系MDA_MB_231 (MB-231)和MDA-MB-468 (MB-468)的結(jié)合。因此，從這兩個細(xì)胞系進(jìn)行的膜制備被用于抗原的識別。從 MB-231或MB-468乳腺癌細(xì)胞的鋪滿培養(yǎng)制備總的細(xì)胞膜。從燒瓶中去除培養(yǎng)基并用PBS洗滌細(xì)胞3次。在最后一次洗滌后，用消化緩沖液(Gibco-BRL;Grand Island,NY)在37°C將細(xì)胞消化5分鐘。收集細(xì)胞并在4°C下用1200rpm離心10分鐘。離心后，將細(xì)胞沉淀物重懸在ImL的低滲裂解緩沖液中，該緩沖液包含IOii g/mL亮抑酶肽(Ieup印tin)、10 y g/mL抑肽酶(aprotonin)和25iig/mL 4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟。隨后使用5輪快速的凍融將細(xì)胞裂解。將細(xì)胞裂解液在4°C下用9500rpm離心10分鐘以去除細(xì)胞核碎片。收獲上清液并隨后在4°C下用75，OOOxg離心57分鐘。小心地從試管中去除上清液并將沉淀重懸于含有1% Triton X-100的0. 5至ImL的低滲裂解緩沖液中。隨后分析膜的蛋白含量并將膜儲存在_80°C。2、一維 SDS-PAGE用一維的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膜蛋白。將20y g的膜蛋白加入12%的SDS-PAGE膠的泳道中。在參照泳道中跑預(yù)染色的分子量標(biāo)記(Biorad ;Mississauga, ON)的樣品。在沒有二硫蘇糖醇(DTT)存在的非還原性條件下通過電泳分離樣品。電泳在100V下進(jìn)行10分鐘，隨后在150V下進(jìn)行65分鐘。通過在40V進(jìn)行16小時的電轉(zhuǎn)印將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至roVF(Millipore ;Billerica，MA)膜上。通過注意預(yù)染色的標(biāo)記從膠至膜的完全轉(zhuǎn)移對定量轉(zhuǎn)移進(jìn)行評估。轉(zhuǎn)移后，在含有0. 5% Tween的Tris緩沖鹽溶液(TBST)中用5%的脫脂奶粉將膜封閉2小時。隨后將膜與稀釋在含有3%脫脂奶粉的TBST中的2-2. 5 u g/mL H460-16-2共同放置2小時。在用TBST洗漆3次后，將膜與和來自Jackson Immunologicals (WestGrove,PA)的山葵過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(Fc)共同放置I小時。在該放置后用 TBST 洗漆 3 次，隨后與 HRP 底物 TMB (來自 Vector Laboratories !Burlington, ON 的底物試劑盒)共同放置。圖I顯示了所述的Western印記法的結(jié)果。H460-16-2清楚地與分離的MB-468膜蛋白(泳道2)的兩個分子量(MW)區(qū)結(jié)合。通過與分子量標(biāo)準(zhǔn)的比較，該抗體結(jié)合麗80-90kD和MW 120-150kD的蛋白質(zhì)。由抗體H460-16-2識別的抗原決定簇似乎是構(gòu)象抗原決定簇，因為抗體不能與在DTT存在的還原條件下從膠上轉(zhuǎn)移的點結(jié)合(泳道I)。圖2比較了 H460-16-2與來自MB-468 (泳道I)和MB-231 (泳道2)的細(xì)胞膜的結(jié)合。在MB-468膜上，H460-16-2以相等的強度與80-90kD和120_150kD的蛋白發(fā)生結(jié)合。在MB-231膜上，主要的結(jié)合蛋白是80-90kD蛋白，而在120-150kD識別了較弱的結(jié)合蛋白。
3、二維 SDS-PAGE為了獲得結(jié)合蛋白更好的分別率，且為了進(jìn)一步表征蛋白，進(jìn)行了二維電泳。使用PlusOne 2-D純化試劑盒(Amersham ;Baie D' Urfe, QC)沉淀如上所述制備的總的膜蛋白(75-200 yg)，并隨后將蛋白重懸于pH范圍3-10的包含兩性電解質(zhì)的重水合緩沖液中。將樣品離心去除顆粒 材料并隨后在重水合溶液的存在下加至IPG條帶(Amersham;Baie D' Urfe, QC)上。使用以下步驟將蛋白聚焦重水合16小時；500V, 250Vhrs, 1000V,500Vhrs ；5000V, 7500V hrs。隨后從條帶架上取下條帶并浸入SDS-PAGE平衡緩沖液中。15分鐘后，將條帶置于8%的膠的頂部并用瓊脂糖溶液將其封閉。預(yù)染色的MW標(biāo)記被加樣至條帶的旁邊。電泳在100V下進(jìn)行10分鐘隨后在150V進(jìn)行65分鐘。一塊膠用10%甲醇/7%乙酸固定30分鐘，并隨后用熒光染料SYPRO Ruby (Molecular Probes,Eugene, OR)染色。在UV光下觀察蛋白點。從第二和第三塊膠，通過在40V的16小時的電轉(zhuǎn)印將蛋白從膠轉(zhuǎn)移至PVDF(MiIlipore)膜上。通過確定預(yù)染色的標(biāo)記從膠至膜的完全轉(zhuǎn)移評估定量轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后，在含有0. 5% Tween的Tris緩沖鹽溶液(TBST)中用5%的脫脂奶粉將膜封閉2小時。隨后將一塊膜與稀釋在含有3%脫脂奶粉的TBST中的2-2. g/mL的H460-16-2共同放置2小時。一塊相似的膜與相同濃度的同型對照(小鼠抗苦味酸，IgGl,K ;克隆107. 3 (BDBiosciences ;0akville，ON))共同放置。在用TBST洗滌3次后，將膜與和來自Jackson Immunologicals (West Grove, PA)的山葵過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(Fc)共同放置I小時。在該放置后用TBST洗滌3次，隨后與HRP底物TMB (來自VectorLaboratories !Burlington, ON的底物試劑盒)共同放置。圖3a顯示了將MB-468膜與H460-16-2共同放置獲得的Western印記。觀察到兩個明顯的結(jié)合點，其分子量對應(yīng)于從一維電泳中獲得的分子量。觀察到的一個點根據(jù)MW標(biāo)準(zhǔn)MW在大約80-90kD，且在膠的酸性部分，其估計的pi在3-4。第二個點根據(jù)MW標(biāo)準(zhǔn)在MW120-150kD的范圍內(nèi)且具有比80-90kD的蛋白更加堿性的pi。圖3b顯示了膜與同型對照抗體共同放置獲得的Western印記。在該印記中沒有可見點，意味著H460-16-2的結(jié)合不是因為非專一性的結(jié)合。圖3c顯示了 SYPRO Ruby 染色的MB-468膜蛋白的2D膠。注意到當(dāng)對MB-231膜進(jìn)行相似了 Western印記時，只觀察到80_90kD的點(圖4)。實施例2確定與H460-16-2結(jié)合的抗原的糖基化為了確定由抗體H460-16-2識別的抗原是否為糖蛋白，根據(jù)生產(chǎn)商手冊(DeglycoPro 去糖基化試劑盒；Prozyme, San Leandro, CA)將 MB-231 膜與 PNGase F、內(nèi)切-O-糖苷酶和唾液酸酶A在室溫或37°C共同放置24小時。如上所述用ID聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膜并隨后如上所述用H460-16-2進(jìn)行Western印記。圖5中顯示了 Western印記的結(jié)果。在沒有用糖苷酶處理的MB-468膜中，H460-16-2識別了預(yù)期的85-95kD條帶(圖5，板A，泳道2)。在用糖苷酶在25°C處理的膜中，該條帶有明顯的向低分子量的移動(泳道4)。在用糖苷酶在37°C處理的膜中，H460-16-2的結(jié)合被消除(泳道3)。為了確定去糖基化的完全性，用高甘露糖結(jié)合外源凝集素雪花蓮凝集素(GNA)作為探針進(jìn)行相似的印記。圖5，板B中觀察的結(jié)果說明在25°C的去糖基化是不完全的(泳道4)且在37°C基本完全(泳道3)。因此，在完全去糖基化的條件下，H460-16-2不能與其抗原結(jié)合?？傊@些結(jié)果暗示80_90kD的條帶是糖蛋白。此外，這些結(jié)果呈現(xiàn)了由H460-16-2識別的抗原決定簇是糖依賴性的證據(jù)。實施例3H460-16-2結(jié)合的抗原的識別I、免疫沉淀用pH 6. 0 的 0. IM 的憐酸鈉緩沖液洗漆 ImL 的 Protein GDynabeads (DYNAL) 3 次。將2500 ii g的H460-16-2加入總體積為500 u L的洗滌后的珠子上。將混合物放置并溫和混 和I小時。去除未結(jié)合的抗體用2. 5mL含有0. 1%的Tween-20，pH 7. 4的0. IM磷酸鈉緩沖液將H460-16-2包被的珠子洗滌3次。用5mL pH 8. 2的0. 2M三乙醇胺將H460-16-2包被的珠子洗漆2次，隨后加入5mL。在5mL pH 8. 2的含有20mM的二甲基pimelimidate的三乙醇胺的存在下，通過溫和混和30分鐘將H460-16-2與珠子化學(xué)交聯(lián)。通過加入5mL的pH
7.5的50mM Tris終止反應(yīng)。在放置15分鐘后，用含有0. I % Tween-20的PBS將H460-16-2交聯(lián)的珠子洗滌3次。通過與pH 3的0. IM檸檬酸鹽共同放置3分鐘將H460-16-2交聯(lián)的珠子預(yù)洗脫并隨后用含有0. 1% Tween-20的pH7. 4的0. IM磷酸鈉緩沖液將珠子洗滌3次。在4°C將MB-231細(xì)胞的3mg細(xì)胞膜總蛋白與H460-16-2化學(xué)交聯(lián)的珠子在含有
0.1% Tween-20、5%葡萄糖、5%甘露糖、5%半乳糖和蛋白酶抑制劑的pH 7. 4的0. IM磷酸鈉緩沖液中共同放置4小時。放置后，用含有150mM NaCl和0. 1% Tween-20的PBS將免疫沉淀物洗滌3次。通過將H460-16-2交聯(lián)的珠子與pH 3的0. IM檸檬酸鹽共同放置4分鐘將蛋白從珠子上洗脫。將洗脫的蛋白保存在_80°C。將從3mg蛋白中免疫沉淀的蛋白加樣至8%非還原性的SDS-PAGE膠的一個泳道中。在參考泳道中跑預(yù)染色分子量標(biāo)記(Biorad ；Mississauga, ON)的樣品。通過在100V下10分鐘，隨后150V下65分鐘的電泳將樣品分離。用SYPRO Ruby 對蛋白染色。在平行Western印記中，如前所述從IOOiig MB-231膜蛋白中免疫沉淀出的蛋白在電泳中分離。通過在40V下電轉(zhuǎn)印16小時將蛋白從膠轉(zhuǎn)移至PVDF (Millipore ；Billerica, MA)膜上。通過注意預(yù)染色的標(biāo)記從膠至膜的完全轉(zhuǎn)移評估定量轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后，在含有0. 5% Tween的Tris緩沖鹽溶液(TBST)中用5%的脫脂奶粉將膜封閉2小時。隨后將稀釋在含有3%脫脂奶粉的TBST中的5 ii g/mL的H460-16-2作為探針對膜處理2小時。在用TBST洗滌3次后，將膜與合適的次級抗體和來自JacksonImmunologicals (West Grove,PA)的山葵過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(Fc)共同放置I小時。在該放置后用TBST洗滌3次，隨后與HRP底物TMB (來自Vector Laboratories ；Burlington, ON的底物試劑盒)共同放置。圖6說明了由H460-16-2免疫沉淀的蛋白獲得的膠和印記。在膠上(板A)，在泳道的80-90kD區(qū)域有一條帶含有免疫沉淀蛋白(見箭頭，泳道2)。高分子量條帶包含完整的抗體。在樣品中沒有其它蛋白。在相應(yīng)的Western印記中(板B)，H460-16-2與免疫沉淀的蛋白強烈反應(yīng)(泳道2)，具有與在總膜蛋白中觀察到的相似的結(jié)合圖像(泳道I)。2、質(zhì)譜用無菌的加樣槍槍頭切割對應(yīng)于由H460-16-2免疫沉淀的80_90kD蛋白的膠區(qū)域(圖6，板A，泳道2)。隨后將該膠塊用于質(zhì)譜對蛋白的識別。使用胰蛋白酶(ProGest)對樣品進(jìn)行自動的膠內(nèi)消化且一部分生成的消化上清液被用于MALDI/MS分析。使用ZipTips進(jìn)行自動點樣(ProMS);從的C18材料上洗脫出肽和基質(zhì)(a-氰4-羥基肉桂酸)，其制備在60%乙氰、0.2% TFA中。在Micromass Q-Tof2上使用75 u mC18柱以200nL/min的流速通過nano LC/MS/MS分析樣品。使用MASCOT的本地拷貝搜索MS/MS數(shù)據(jù)。表I中呈現(xiàn)了由LC/MS/MS分析識別的H460-16-2免疫沉淀材料中的蛋白。進(jìn)行記分，該分?jǐn)?shù)是根據(jù)匹配的肽的數(shù)目和一致性水平的復(fù)合分?jǐn)?shù)(composite score)。表I由H460-16-2對MDA-MB-231細(xì)胞膜的免疫沉淀識別的蛋白
權(quán)利要求
1.保藏于ATCC的保藏號為PTA-4621的克隆編碼的單克隆抗體用于體外鑒定表達(dá)⑶44的細(xì)胞的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中所述CD44是人CD44。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述人⑶44是具有NCBI登錄號gi|2134882的CD44。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤細(xì)胞是皮膚、乳腺、淋巴結(jié)、骨、軟組織、鼻腔、喉、肺、舌、腿腺、肝、膽囊、胰腺、食管、胃、結(jié)腸、直腸、腎、膀胱、前列腺、睪丸、子宮、子宮頸、甲狀腺、胸腺或腦細(xì)胞。
6.體外鑒定對由保藏于ATCC的保藏號為PTA-4621的克隆編碼的單克隆抗體治療敏感的人腫瘤的方法，其包括使用保藏于ATCC的保藏號為PTA-4621的克隆編碼的單克隆抗體鑒定表達(dá)⑶44的人腫瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述CD44是具有NCBI登錄號gi|2134882的CD44。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述腫瘤是皮膚、乳腺、淋巴結(jié)、骨、軟組織、鼻腔、喉、肺、舌、腮腺、肝、膽囊、胰、食管、胃、結(jié)腸、直腸、腎、膀胱、前列腺、睪丸、子宮、子宮頸、甲狀腺、胸腺或腦腫瘤。
9.確定表達(dá)CD44的人細(xì)胞的存在的測定法，其包括 提供由保藏于ATCC的PTA-4621的克隆編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段； 將所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述細(xì)胞樣品接觸；和 確定所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述細(xì)胞樣品的結(jié)合； 由此確定表達(dá)⑶44抗原部分的細(xì)胞的存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的測定法，其中所述⑶44是人⑶44。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的測定法，其中所述人⑶44是具有NCBI登錄號giI 2134882的 CD44。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任一項所述的測定法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的測定法，其中所述腫瘤細(xì)胞是皮膚、乳腺、淋巴結(jié)、骨、軟組織、鼻腔、喉、肺、舌、腿腺、肝、膽囊、胰、食管、胃、結(jié)腸、直腸、腎、膀胱、前列腺、睪丸、子宮、子宮頸、甲狀腺、胸腺或腦細(xì)胞。
全文摘要
抗CD44單克隆抗體H460-16-2在癌癥腫瘤的診斷和治療中的應(yīng)用，以及確定表達(dá)與單克隆抗體H460-16-2專一性結(jié)合的CD44抗原性基序的細(xì)胞的存在的結(jié)合分析。作為起始對腫瘤的細(xì)胞毒性應(yīng)答的一種手段，單克隆抗體可以選擇性與一或多種化療試劑結(jié)合使用。
文檔編號A61K49/00GK102778562SQ20121017273
公開日2012年11月14日 申請日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月22日
發(fā)明者戴維·S·F·楊, 海倫·P·芬德利, 蘇珊·E·哈恩 申請人:阿里烏斯研究公司