專利名稱：顯示cd44表面表達(dá)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性介導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌性疾病的診斷和治療，具體涉及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性 的介導(dǎo)；最具體地涉及癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)作為起始細(xì)胞毒性反 應(yīng)的手段的用途，所述CDMAB任選地與一種或者多種化療劑聯(lián)用。本 發(fā)明還涉及利用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合分析。
背景技術(shù)：
癌癥中的CD44:抗人白細(xì)胞的單克隆抗體的培養(yǎng)導(dǎo)致了 CD44抗原 的發(fā)現(xiàn)；單鏈透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合糖蛋白在廣泛的正常組織和所有類型的 造血細(xì)胞上表達(dá)。其起初與淋巴細(xì)胞的激活和歸巢相聯(lián)系。當(dāng)前，其推 定的生理學(xué)作用還包括炎癥基因的激活、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的 誘導(dǎo)、分化和發(fā)育的誘導(dǎo)、細(xì)胞骨架重組的誘導(dǎo)和細(xì)胞遷移以及細(xì)胞存 活/4氏抗凋亡。
在人體中，CD44的單基因拷貝位于染色體11的短臂，11pl3上。該 基因包含19個(gè)外顯子；前5個(gè)是恒定的，接下來(lái)的9個(gè)是可變的，隨后 的3個(gè)是恒定的，最后的2個(gè)是可變的。差異剪接可以造成超過(guò)1000種 不同的亞型。然而，目前僅已鑒定出幾十種天然存在的變體。
CD44標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白由N-末端胞外(包括20個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列和近膜 區(qū)(85個(gè)氨基酸))結(jié)構(gòu)域(270個(gè)氨基酸)、跨膜區(qū)(21個(gè)氨基酸)和胞質(zhì)尾巴 (72個(gè)氨基酸)組成。胞外區(qū)還包含位于N-末端的連接模塊。該區(qū)域有92 個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度且顯示出與其它HA結(jié)合連接蛋白的同源性。在鼠型和 人型CD44之間存在很高的同源性。該蛋白的變體形式被插入外顯子5 的羧基末端且在表達(dá)時(shí)位于胞外。
CD44的血清可溶形式也是天然存在的，且能夠通過(guò)終止密碼子(在 可變區(qū)內(nèi))或蛋白水解活性產(chǎn)生。通過(guò)各種刺激包括TNF-a對(duì)細(xì)胞的激活 造成CD44受體的脫落。在胂瘤細(xì)胞中也觀察到受體的脫落，且該脫落可導(dǎo)致CD44在人血清中的濃度增加多達(dá)10倍。CD44的高血清濃度暗 示著惡性肺瘤(卵巢癌除外)。
CD44的標(biāo)準(zhǔn)形式以大約37 kD的分子量存在。翻譯后修飾將分子量 增加至80-90 kD。這些修飾包括氨基末端胞外結(jié)構(gòu)域在天冬氨酸殘基上 的N-連接糖基化、在胞外結(jié)構(gòu)域的羧基末端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上的 O-連接糖基化以及添加的粘多糖。剪接變體的大小可以為80-250 kD。
HA， 一種位于哺乳動(dòng)物胞外基質(zhì)(ECM)中的聚糖，被認(rèn)為是主要的 CD44配體。然而，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD44與諸如膠原、纖維連接蛋白、層粘 連蛋白等蛋白結(jié)合。HA結(jié)合和糖基化之間看起來(lái)存在關(guān)聯(lián)。無(wú)活性的 CD44 (不結(jié)合HA)具有最高的糖基化水平，有活性的CD44 (結(jié)合HA)糖 基化水平最低而可誘導(dǎo)的CD44 (除非被細(xì)胞因子、單克隆抗體、生長(zhǎng)因 子等激活，否則不與HA結(jié)合或很微弱地與HA結(jié)合)的糖基化水平在活 性和無(wú)活性形式之間。
CD44通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠介導(dǎo)其的一些功能，這些通路依賴于細(xì) 胞的相互作用、刺激以及環(huán)境。這樣的一些通路包括NFKB信號(hào)級(jí)聯(lián)(涉 及炎癥反應(yīng))、Ras-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(涉及細(xì)胞周期和增殖的激活)、 Rho蛋白家族(涉及細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞遷移)以及PI3-K相關(guān)信號(hào)通路 (涉及細(xì)胞存活)。上述所有的功能與肺瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。 CD44也被暗示通過(guò)各種額外的機(jī)理在癌癥中發(fā)生作用。這些機(jī)理包括 CD44細(xì)胞表面的細(xì)胞表面蛋白聚糖將生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子呈 遞給涉及惡性腫瘤的受體。同樣的，在CD44-HA復(fù)合物內(nèi)化后由溶酶體 透明質(zhì)酸酶進(jìn)行的HA的胞內(nèi)降解也潛在地增加了腫瘤入侵和通過(guò)ECM 誘導(dǎo)血管生成的可能性。此外，已經(jīng)顯示存活或凋亡信號(hào)的傳遞通過(guò)標(biāo) 準(zhǔn)或可變CD44受體發(fā)生。CD44也被暗示涉及細(xì)胞分化和遷移。這些機(jī) 理中的很多但非全部是環(huán)境和細(xì)胞依賴性的且一些機(jī)理產(chǎn)生了不同的發(fā) 現(xiàn)。因此，在得出任何結(jié)論之前需要更多的研究。
為了證實(shí)CD44在癌癥中潛在的功能作用，進(jìn)行了 CD44的表達(dá)研究 以確定受體的差異性表達(dá)是否與疾病的進(jìn)程相關(guān)。然而，在大部分的胂 瘤類型中觀察到不一致的現(xiàn)象，且這可能是由于研究人員之間在試劑的 組和、技術(shù)、病理學(xué)評(píng)分和細(xì)胞類型上的差異造成的。腎細(xì)胞癌和非霍奇金氏(non-Hodgkin，s)淋巴瘤看起來(lái)是例外，因?yàn)榫哂懈逤D44表達(dá)腫瘤 的患者始終比那些低CD44表達(dá)或無(wú)CD44表達(dá)的對(duì)應(yīng)患者存活時(shí)間短。
由于其與癌癥相關(guān)，CD44已經(jīng)成為抗癌治療研發(fā)的靶點(diǎn)。CD44的 標(biāo)準(zhǔn)形式還是變體形式是肺瘤進(jìn)程所必需的仍然存在爭(zhēng)論。兩種觀點(diǎn)都 有體內(nèi)動(dòng)物數(shù)據(jù)支持，同樣的，這可能是肺瘤類型甚至是細(xì)胞類型依賴 的。不同的治療手段已包括可溶CD44蛋白、透明質(zhì)酸合成酶cDNA、透 明質(zhì)酸酶的注射，反義CD44和CD44特異性抗體的使用。各種手段已經(jīng) 實(shí)現(xiàn)了 一定程度的成功，由此為抗CD44癌癥治療提供了支持。
實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)產(chǎn)生了變體和標(biāo)準(zhǔn)CD44的特異性單克隆抗體，但絕大 部分這樣的抗體除了與它們識(shí)別的CD44類型特異性地結(jié)合外，沒(méi)有固 有的生物學(xué)活性。然而，存在某些抗體具有體外活性或體內(nèi)活性，但通 常沒(méi)有兼具這兩種活性。已經(jīng)顯示一些抗-CD44抗體介導(dǎo)細(xì)胞事件。例 如，針對(duì)人紅血球Lutheran抗原CD44標(biāo)準(zhǔn)型的小鼠抗體A3D8顯示增 強(qiáng)CD2 (9-1抗體)和CD3 (OKT3抗體)介導(dǎo)的T細(xì)胞激活；另 一種抗-CD44 抗體具有相似的效應(yīng)。A3D8也誘導(dǎo)IL-1從單核細(xì)胞的釋放和IL-2從T 淋巴細(xì)胞的釋放。有趣的是，A3D8與諸如柔紅霉素、米托蒽醌和依托泊 戒的藥物結(jié)合使用，通過(guò)消除第二信使神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生抑制了 HL60和 NB4 AML細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)。沒(méi)有固有活性且靶向CD44的相似表位的 J173抗體未抑制藥物誘爭(zhēng)的凋亡。靶向CD44的85-110 KD和200 KD形 式的NiH44-l抗體通過(guò)一通^^增強(qiáng)了 T細(xì)胞的增殖，作者推斷該通路為 CD44的交聯(lián)或聚集。綜上所述，沒(méi)有證據(jù)說(shuō)明諸如這些的抗體適合作為 癌癥治療劑使用，因?yàn)樗鼈円只虿会槍?duì)癌癥(例如激活淋巴細(xì)胞)、誘導(dǎo)細(xì) 胞增殖，或者在與細(xì)胞毒性試劑一同使用時(shí)抑制癌細(xì)胞的藥物誘導(dǎo)死亡。
一些抗-CD44抗體已被描述，這些抗體證實(shí)了體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)。 抗體I.IASML， 一種靶向CD44的v6變體的小鼠IgGl，已經(jīng)顯示降低 了大鼠胰腺癌BSp73ASML的淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移。治療后的動(dòng)物的存活隨 之提高。該抗體僅當(dāng)在淋巴結(jié)定植之前給藥有效，且據(jù)推斷其干擾淋巴 結(jié)中的細(xì)胞增殖。在體外，該抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有直接的細(xì)胞毒性，且 抗體沒(méi)有提高補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒性或免疫效應(yīng)細(xì)胞功能。沒(méi)有說(shuō)明該抗體 針對(duì)人細(xì)胞的應(yīng)用。Breyer等說(shuō)明了 一種商業(yè)可獲取的抗CD44s抗體在破壞原位移植大 鼠的惡性膠質(zhì)瘤的進(jìn)程中的應(yīng)用。將大鼠惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6植入額 葉， 一周后通過(guò)腦內(nèi)注射用抗體對(duì)大鼠進(jìn)行3次治療。和緩沖液或同型 對(duì)照治療后的大鼠相比，治療后的大鼠證實(shí)了降低的腫瘤生長(zhǎng)以及更高 的體重。在體外，該抗體能夠抑制細(xì)胞對(duì)由胞外基質(zhì)成分包被的蓋玻片 的粘附，但對(duì)細(xì)胞沒(méi)有直接的細(xì)胞毒性效應(yīng)。該抗體沒(méi)有對(duì)人細(xì)胞進(jìn)行 測(cè)試。
進(jìn)行了比較抗CD44s抗體(IM7.8.1)和CD44vl0抗體(K926)功效的研 究。將表達(dá)兩種CD44亞型的高度轉(zhuǎn)移的小鼠黑素瘤細(xì)胞系B16F10靜脈 內(nèi)植入小鼠。兩天后，在研究期間每三天給予抗體。兩種抗體在肺轉(zhuǎn)移 的數(shù)量上均造成了大于50%的顯著降低；在兩種抗體的功效之間沒(méi)有顯 著的差別。抗體在體外不影響增殖，且作者Zawadzki等推測(cè)胂瘤生長(zhǎng)的 抑制是因?yàn)榭贵w阻斷了 CD44和其配體的相互作用。在使用IM-7.8.1的 另 一研究中，Zahalka等證實(shí)了該抗體及其F(ab，)2片段能夠阻斷小鼠T細(xì) 胞淋巴瘤LB對(duì)淋巴結(jié)的浸潤(rùn)。這賦予了小鼠顯著的存活益處。 Wallach-Dayan等顯示用CD44v4-v10轉(zhuǎn)染不會(huì)自發(fā)形成腫瘤的LB-TRs 小鼠淋巴瘤導(dǎo)致其具有形成胂瘤的能力。IM-7.8.1的給藥和同型對(duì)照抗體 相比降低了移植后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的腫瘤大小。這些實(shí)驗(yàn)沒(méi)有一個(gè)證實(shí)了該抗 體在人體中的應(yīng)用。
GKW.A3, —種小鼠IgG2a,對(duì)人CD44具有特異性且在SCID小鼠 中防止了人黑素瘤異種移植物的形成和轉(zhuǎn)移。將該抗體與轉(zhuǎn)移性人細(xì)胞 系SMMU-2混和并隨后皮下注射。治療在隨后的3周內(nèi)持續(xù)。4周后，10 只小鼠中僅1只在注射位點(diǎn)形成了腫瘤，而未治療動(dòng)物全部生成胂瘤。 該抗體的F(ab，)2片段證實(shí)了對(duì)肺瘤形成相同的抑制，暗示該行為機(jī)理不 依賴于補(bǔ)體或抗體依賴性細(xì)胞毒性。如果在第一次抗體注射前一周注射 腫瘤細(xì)胞，有80°/。的動(dòng)物在原發(fā)部位形成肺瘤。然而，注意到存活時(shí)間 仍然顯著增長(zhǎng)了。盡管延遲的抗體給藥對(duì)原發(fā)瘤的形成沒(méi)有效應(yīng)，其完 全地防止了在未治療動(dòng)物中出現(xiàn)的肺、腎、腎上腺、肝和腹膜的轉(zhuǎn)移。 在體外，該抗體對(duì)細(xì)胞系沒(méi)有任何直接的細(xì)胞毒性且其不干擾SMMU-2 細(xì)胞的增殖，看起來(lái)通過(guò)影響轉(zhuǎn)移或生長(zhǎng)對(duì)胂瘤的形成產(chǎn)生主要的效應(yīng)。該抗體的一個(gè)需要注意的特征是其識(shí)別CD44的所有亞型，這暗示著其 在治療應(yīng)用中有限的可能性。
Strobel等說(shuō)明了抗-CD44抗體(克隆515)在小鼠異種移植模型中抑制 人卵巢癌細(xì)胞腹膜移植的應(yīng)用。在抗CD44抗體或?qū)φ湛贵w的存在下， 將人卵巢細(xì)胞系36M2腹腔內(nèi)植入小鼠，且在隨后的20天中進(jìn)行治療。 5周后，在抗體治療組的腹膜腔中有顯著更少的節(jié)結(jié)。來(lái)自抗-CD44和對(duì) 照治療組的節(jié)結(jié)具有相同的大小，暗示著一旦細(xì)胞被移植，抗體對(duì)腫瘤 的生長(zhǎng)沒(méi)有效應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞被皮下植入時(shí)，對(duì)肺瘤生長(zhǎng)也沒(méi)有效應(yīng)，意味 著該抗體本身沒(méi)有抗增殖或細(xì)胞毒性效應(yīng)。此外，抗體在體外對(duì)細(xì)胞生 長(zhǎng)沒(méi)有效應(yīng)。
VFF-18,也被稱作BIWA 1，是對(duì)CD44的v6變體具有高度親和性 的抗體，其對(duì)該多肽的360-370區(qū)域具有特異性。在對(duì)12例患者進(jìn)行的 I期臨床試驗(yàn)中，該抗體已被用作"m锝標(biāo)記偶聯(lián)物。在患有頭部和頸部 鱗狀細(xì)胞癌的患者中對(duì)該抗體的安全性以及靶向潛能進(jìn)行了測(cè)試。在注 射40小時(shí)后，注射劑量的14%被腫瘤吸收，且在其它器官包括腎、脾和 骨髓中具有最少的積聚。高度選擇性的肺瘤結(jié)合暗示著該抗體在放射免 疫治療中的作用，盡管該抗體異常高的親和力阻止其對(duì)腫瘤深層的穿透 力。進(jìn)一步限制BIWA1應(yīng)用的是小鼠抗體的免疫原性(12例患者中的11 例產(chǎn)生了人抗-鼠抗體(HAMA))、遍及胂瘤的異源性積聚以及抗體-可溶 CD44復(fù)合物的形成。WO 02/094879公開(kāi)了 VFF-18的人源化形式，其被 設(shè)計(jì)用于克服HAMA反應(yīng)，被命名為BIWA 4。據(jù)發(fā)現(xiàn)，BIWA 4和VFF 18抗體相比，其抗原結(jié)合親和力顯著降低。意外的是，更低親和力的BIWA 4抗體比更高親和力的BIWA 8人源化VFF-18抗體具有較高的肺瘤吸收 特征。在33名患者的1期臨床試驗(yàn)中對(duì)"m锝標(biāo)記的和186錸標(biāo)記的BIWA 4抗體進(jìn)行評(píng)價(jià)以確定安全性、耐受能力、腫瘤積聚和版錸標(biāo)記BIWA4 的最大耐受劑量。"，c標(biāo)記的BIWA 4中顯示存在腫瘤相關(guān)的吸收。在 ^Re標(biāo)記的BIWA 4所有劑量中沒(méi)有觀察到腫瘤的應(yīng)答，盡管一些具有 穩(wěn)定的病情；劑量限制毒性發(fā)生在60 mCi/m2。存在50-65%的不良事件 發(fā)生率，33例患者中的12例被認(rèn)為發(fā)生了嚴(yán)重的不良事件(血小板減少、 白血球減少以及發(fā)熱)，且均接受186Ke標(biāo)記的BIWA:4治療的6例患者由于疾病惡化在治療期間死亡或隨訪中死亡。2例患者產(chǎn)生了人抗-人抗體
(HAHA)。在20名患者中進(jìn)行了 I86Re標(biāo)記的BIWA 4 I期劑量遞增試驗(yàn)。 觀察到口腔粘膜炎和劑量限制血小板減少和白血球減少； 一例患者產(chǎn)生 了 HAHA反應(yīng)。在以60 mCi/n^的最高劑量治療的5例患者中觀察到穩(wěn) 定的病情。盡管在獲得功效的安全性和耐受能力上被認(rèn)為可以接受，這 些研究相比于臨床研究中其它非放射性同位素偶聯(lián)的生物學(xué)治療具有更 高的不良事件發(fā)生率。美國(guó)專利申請(qǐng)US 2003/0103985公開(kāi)了用于腫瘤治 療的與美登醇偶聯(lián)的VFF-18人源化形式，被命名為BIWI 1 。人源化VFF 18抗體BIWA4，在與毒素偶聯(lián)時(shí)，即BIWIl,被發(fā)現(xiàn)在人外陰皮膚癌、 咽喉鱗狀細(xì)胞癌或乳腺癌的小鼠模型中具有顯著的抗肺瘤效應(yīng)。未偶聯(lián) 的形式BIWA 4沒(méi)有抗肺瘤作用，且偶聯(lián)形式BIWI 1沒(méi)有在人體中的安 全性或功效的證據(jù)。
Mab U36是通過(guò)UM-SCC-22B人下咽骨癌細(xì)胞免疫和癌及組織特異 性選擇產(chǎn)生的小鼠IgGl抗體。通過(guò)cDNA克隆和序列分析進(jìn)行的抗原表 征將角質(zhì)細(xì)胞特異性的CD44剪接變體表元(epican)的v6結(jié)構(gòu)域識(shí)別為 MabU36的耙點(diǎn)。免疫組織化學(xué)研究顯示該表位限于細(xì)胞膜上。此外， Mab U36對(duì)94。/。的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)發(fā)生了強(qiáng)標(biāo)記，且在這些 腫瘤中細(xì)胞染色不均一。IO例患者的"m丁c標(biāo)記的Mab U36研究顯示該 抗體對(duì)HNSCC癌癥的選擇性積聚(2天內(nèi)20.4+A12.4。/。的注射劑量/kg); 沒(méi)有不良反應(yīng)的報(bào)道，2例患者產(chǎn)生了 HAMA。在放射性碘化的小鼠Mab U36的研究中，在18例患者中有3例HAMA以及HNSCC的選擇性均勻 吸收。為了降低Mab U36的抗原性以及降低HAMA的發(fā)生率，構(gòu)建了嵌 合抗體。嵌合或原始的小鼠Mab U36均沒(méi)有ADCC活性。沒(méi)有Mab U36 天然功能活性的證據(jù)。^Re標(biāo)記的嵌合Mab U36被用于確定Mab U36 作為治療試劑的應(yīng)用。在該I期劑量遞增試驗(yàn)中，13例者接受了 ""Tc標(biāo) 記的嵌合Mab U36的試-驗(yàn)劑量和隨后的186Re標(biāo)記的嵌合Mab U36。沒(méi) 有急性不良事件的報(bào)道但隨后的治療中觀察到3例患者中的2例有劑量 限制髓毒性(1.5 GBq/m2),且觀察到1例接受最大耐受劑量(l.0 GBq/m2) 治療的患者血小板減少。盡管對(duì)腫瘤大小有某些效應(yīng)，這些效應(yīng)沒(méi)有滿 足對(duì)治療產(chǎn)生客觀應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)。^Re標(biāo)記的嵌合MabU36的進(jìn)一步的研究采用使用粒細(xì)胞群落刺激因子刺激的全血回輸?shù)牟呗詫⒆畲竽褪芑钚?br> 加倍至2.8 Gy。在對(duì)患有頭部和頸部各種胂瘤的9例患者的該研究中，3 例因?yàn)樗幬锵嚓P(guān)貧血需要輸血。其它毒性包括3級(jí)髓毒性和2級(jí)粘膜炎。 盡管在5例患者中實(shí)現(xiàn)了 3-5個(gè)月的穩(wěn)定病情，但沒(méi)有客觀腫瘤應(yīng)答的報(bào) 道。因此，可以看出盡管MabU36是高度特異性的抗體，其要求放射免 疫偶聯(lián)物以實(shí)現(xiàn)抗癌效應(yīng)的缺點(diǎn)限制了其用途，因?yàn)槠渑c獲得臨床效應(yīng) 相關(guān)的治療有伴隨的毒性。
總之，已經(jīng)顯示，CD44v6(l.lASML)和CD44vl0(K926)單克隆抗體 在用轉(zhuǎn)移型胰腺癌注射的大鼠或在用惡性黑素瘤注射的小鼠中分別降低 了轉(zhuǎn)移活性。另一種抗-CD44v6抗體(VFF-18及其衍生物)僅在與美登醇 或放射性同位素偶聯(lián)時(shí)具有抗肺瘤活性?？?標(biāo)準(zhǔn)CD44單克隆抗體也已 經(jīng)顯示抑制大鼠惡性膠質(zhì)瘤的腦內(nèi)進(jìn)程(抗-CD44)、小鼠T細(xì)胞淋巴瘤的 淋巴結(jié)侵入(IM-7.8.1)以及抑制人卵巢癌細(xì)胞在棵鼠中的移植(克隆515)、 小鼠黑素瘤細(xì)胞系的肺轉(zhuǎn)移(IM-7.8.1)以及在SCID小鼠中人黑素瘤細(xì)胞 的轉(zhuǎn)移(GKW.A3)。放射性同位素偶聯(lián)的Mab U36抗-CD44v6抗體及其衍 生物在臨床試驗(yàn)中具有抗腫瘤活性并伴隨著顯著的毒性。盡管這些結(jié)果 是鼓舞人心的且支持將抗-CD44單克隆抗體發(fā)展成為潛在的癌癥治療法， 它們說(shuō)明了對(duì)人體癌癥有限的效應(yīng)、安全性或適用性。
因此，如果分離出一種抗體成分，該成分介導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性， 作為其與所述細(xì)胞上的CD44細(xì)胞表面表達(dá)相互吸引的功能，將會(huì)實(shí)現(xiàn) 有價(jià)值的診斷和治療方式。
用作癌癥療法的單克隆抗體每個(gè)顯示癌癥的個(gè)體都是獨(dú)特的，就 像人的身份不同一樣其癌癥也不同于其他癌癥。盡管這樣，現(xiàn)有療法在 相同階段用相同方式治療患有相同類型癌癥的所有患者。這些患者中的 至少30%在一線治療中失敗，從而導(dǎo)致額外的療程以及治療失敗、轉(zhuǎn)移 和最終死亡的可能性增加。優(yōu)良的治療方法應(yīng)該是對(duì)于特定個(gè)體的個(gè)體 化療法?，F(xiàn)有唯一的個(gè)體化療法是手術(shù)?；熀头暖煙o(wú)法針對(duì)患者量體 裁衣，而手術(shù)本身在大部分情況下不足以產(chǎn)生療效。
隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，開(kāi)發(fā)個(gè)體化療法的可能性變得更加現(xiàn)實(shí)， 因?yàn)槊糠N抗體可以針對(duì)單一表位。此外，有可能制備抗體的組合，所述組合針對(duì)表位的集合，所述集合唯一地限定出特定個(gè)體的肺瘤。
在意識(shí)到癌性細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著差異是癌性細(xì)胞包含對(duì)轉(zhuǎn) 化細(xì)胞特異的抗原后，科學(xué)界長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為可以將單克隆抗體設(shè)計(jì)為通
過(guò)特異結(jié)合這些癌癥抗原特異的耙向轉(zhuǎn)化細(xì)胞；因此相信單克隆抗體可
以用作消滅癌細(xì)胞的"魔力子彈"。但是，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛意識(shí)到?jīng)]有單一 的單克隆抗體可以在癌癥的所有情況下起作用，并且單克隆抗體作為類 可以被用作靶向癌癥治療。根據(jù)即將公開(kāi)的本發(fā)明的教導(dǎo)而分離的單克 隆抗體已經(jīng)顯示以有益于患者的方式調(diào)節(jié)癌性疾病過(guò)程，例如通過(guò)減輕 腫瘤負(fù)荷，所述分離的單克隆抗體在本文將多樣地稱為癌性疾病調(diào)節(jié)抗
體(CDMAB)或者"抗癌癥"抗體。
目前，通常供癌癥患者選擇的治療方法很少。癌癥療法的組合方法 改善了全世界的存活和患病率。但是，對(duì)于特定個(gè)體，這些改善的統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)不 一定和他們個(gè)人狀況的改善必然相關(guān)。
因此，如果有方法學(xué)能夠使醫(yī)師獨(dú)立于相同群組中的其他患者來(lái)治 療每種肺瘤，那么將允許用僅僅針對(duì)那個(gè)人療法的獨(dú)特方法。理論上這 種療法過(guò)程將提高治愈率，產(chǎn)生更好的結(jié)果，從而滿足長(zhǎng)期感受到的需 要。
過(guò)去，多克隆抗體已經(jīng)被用于人類癌癥的治療，但只取得了有限的 成功。已經(jīng)用人血漿來(lái)治療淋巴瘤和白血病，但很少獲得持久的癥狀緩 解或者應(yīng)答。此外，與化療相比，缺乏重現(xiàn)性，也沒(méi)有額外的益處。諸 如乳腺癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌的實(shí)體瘤也已經(jīng)用人血液、黑猩猩血清、 人血漿和馬血清進(jìn)行治療，但是相應(yīng)的結(jié)果是不可預(yù)見(jiàn)和無(wú)效的。
對(duì)于實(shí)體瘤有很多單克隆抗體的臨床試驗(yàn)。在20世紀(jì)80年代，利 用抗特異抗原或者基于組織選擇性的抗體對(duì)人乳腺癌進(jìn)行了至少4次臨 床試驗(yàn)，在至少47例患者中只產(chǎn)生了 1例應(yīng)答者。直至1998年，才有 成功的臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)聯(lián)用了人源化抗-Her2/neu抗體(赫賽汀 (Herceptir^))和順粕。在這次試驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了 37例患者的應(yīng)答，其中大 約l/4具有部分應(yīng)答率，另外1/4具有輕微或者穩(wěn)定的疾病進(jìn)展。應(yīng)答者 中的中位進(jìn)展時(shí)間(median time to progression)為8.4個(gè)月，中位應(yīng)答持續(xù) 曰于間(median response duration )為5.3個(gè)月。1998年赫賽汀被批準(zhǔn)與泰素(Taxof)—線聯(lián)用。臨床研究結(jié)果顯示， 與只接受泰素(3個(gè)月)的組相比，接受抗體療法加泰素(6.9個(gè)月)的患者的 中位疾病進(jìn)展時(shí)間增加。中位存活時(shí)間也有輕;微的增加；赫賽汀加泰素 治療方式為22個(gè)月，泰素單獨(dú)治療方式為18個(gè)月。此外，所述抗體加 泰素聯(lián)合組與單獨(dú)的泰素相比，完全(8%對(duì)2%)和部分應(yīng)答者(34%對(duì)15%) 的數(shù)目均有所增加。但是，用赫賽汀和泰素治療相對(duì)于單用泰素治療導(dǎo) 致更高的心臟毒發(fā)病率(分別為13%對(duì)1%)。并且，赫賽汀療法只對(duì)過(guò)表
的患者和j大約25%的患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者有效:所述人表皮生長(zhǎng)因
子受體2是目前還沒(méi)有已知功能或者生物上重要配體的受體。因此，對(duì) 于患有乳腺癌的患者來(lái)說(shuō)仍然存在遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有得到滿足的需要。甚至那些 從赫賽汀治療獲益的患者依然需要化療，因此仍然(至少在一定程度上) 不得不面對(duì)這種治療的副作用。
研究結(jié)腸直腸癌的臨床試驗(yàn)涉及同時(shí)抗糖蛋白和糖脂靶的抗體。對(duì) 腺癌具有一定特異性的諸如17-1A的抗體，已經(jīng)進(jìn)行了超過(guò)60例患者的 2期臨床試驗(yàn)，其中僅有1例患者有部分應(yīng)答。在其他試驗(yàn)中，在使用另 外的環(huán)磷酰胺的實(shí)—驗(yàn)方案的52例患者中，使用17-lA僅產(chǎn)生l例完全應(yīng) 答和2例輕微應(yīng)答。迄今為止，17-lA的III期臨床試驗(yàn)沒(méi)有證明其作為 III期結(jié)腸癌輔助療法的改善功效。使用最初批準(zhǔn)用于成像的人源化鼠單 克隆抗體也沒(méi)有產(chǎn)生腫瘤消退。
近期才在使用單克隆抗體的結(jié)腸直腸癌臨床研究中得到 一 些陽(yáng)性結(jié) 果。2004年，愛(ài)必妥(￡朋1111乂@)被批準(zhǔn)用于表達(dá)60 11的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直 腸癌患者的二線治療，所述患者對(duì)基于依立替康(irinotecan)的化療是耐受 的。雙臂II期臨床研究和單臂研究的結(jié)果表明，愛(ài)必妥與依立替康聯(lián)用 的應(yīng)答率分別為23%和15%,中位疾病進(jìn)展時(shí)間分別為4.1個(gè)月和6.5個(gè) 月。相同雙臂II期臨床研究和另一單臂研究的結(jié)果表明，單用愛(ài)必妥治 療的應(yīng)答率分別為11%和9%，中位疾病進(jìn)展時(shí)間分別為1.5個(gè)月和4.2 個(gè)月。
因此，愛(ài)必妥與依立替康聯(lián)合治療在瑞士和美國(guó)，以及愛(ài)必妥單獨(dú) 治療在美國(guó)，都已經(jīng)被批準(zhǔn)作為依立替康一線療法失敗的結(jié)腸癌患者的二線治療。因此，類似赫賽汀，在瑞士的治療只被批準(zhǔn)作為單克隆抗體 和化療的聯(lián)用。此外，在瑞士和美國(guó)的治療只是被批準(zhǔn)作為患者的二線
療法。2004年，阿瓦斯丁(AVASTIN )也被批準(zhǔn)與靜脈內(nèi)基于5-氟尿嘧啶 的化療聯(lián)用作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療。III期臨床研究結(jié)果證明， 用阿瓦斯丁加5-氟尿嘧啶治療的患者比單獨(dú)用5-氟尿嘧啶治療的患者的 中位存活時(shí)間延長(zhǎng)(分別為20個(gè)月對(duì)16個(gè)月)。但是，還是和赫賽汀和愛(ài) 必妥一樣，治療只被批準(zhǔn)作為與單克隆抗體和化療的聯(lián)用。
對(duì)于肺癌、腦癌、卯巢癌、胰^^癌、前列腺癌和胃癌也繼續(xù)存在差 的結(jié)果。近期對(duì)于非小細(xì)胞肺癌最有希望的的結(jié)果來(lái)自II期臨床試驗(yàn)， 其中治療涉及偶聯(lián)到細(xì)胞殺傷藥物阿霉素的單克隆抗體(SGN-15 ; dox-BR96,抗-Sialyl-LeX)與化療劑泰素帝(Taxotere)聯(lián)用。泰素帝是唯一 經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于肺癌二線治療的化療劑。原始數(shù)據(jù)顯示相對(duì)于單用泰素 帝，總體存活率提高。該研究招募的62例患者中，2/3接受SGN-15與泰 素帝聯(lián)用，而剩余的1/3接受單獨(dú)的泰素帝。對(duì)于接受SGN-15與泰素帝 聯(lián)用的患者，中位總體存活時(shí)間為7.3個(gè)月，與之相對(duì)，接受單獨(dú)的泰素 帝的患者為5.9個(gè)月。接受SNG-15加泰素帝的患者在1年和18個(gè)月時(shí) 的總體存活率分別為29%和18%,與之相比，接受單獨(dú)的泰素帝的患者 分別為24%和8%。已計(jì)劃進(jìn)一 步的臨床試-險(xiǎn)。
臨床前，對(duì)于黑素瘤使用單克隆抗體只獲得某種有限的成功。這些 抗體中幾乎沒(méi)有進(jìn)行到臨床試驗(yàn)階段，到目前為止沒(méi)有一個(gè)被批準(zhǔn)或者 在III期臨床試驗(yàn)中被證明為有利結(jié)果。
缺乏對(duì)明確促進(jìn)疾病發(fā)病機(jī)理的30,000種已知基因的產(chǎn)物中的相關(guān) 靶標(biāo)的鑒定，阻礙了用于治療疾病的新藥的發(fā)現(xiàn)。在腫瘤學(xué)研究中，潛 在的藥物靶標(biāo)經(jīng)常被選出，就因?yàn)樗鼈冊(cè)谀[瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。然后，篩 選如此鑒定的靶標(biāo)與大量化合物的相互作用。對(duì)于可能的抗體療法，這 些候選化合物一般衍生自單克隆抗體生成的傳統(tǒng)方法，所述方法如 Kohler和Milstein規(guī)定的基本原則(1975， Nature, 256， 495-497， Kohler和 Milstein)所述。從用抗原(例如全細(xì)胞，細(xì)胞部分，純化抗原)免疫的小鼠 收集脾細(xì)胞，并與永生化雜交瘤伴侶融合。對(duì)所獲雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選， 選取分泌與所述靶標(biāo)結(jié)合最緊密的抗體的雜交瘤。利用這些方法制備、并根據(jù)它們的親和力選4奪到了許多針對(duì)癌細(xì)胞的治療性和診斷性抗體抗 體，包括赫賽汀和利妥昔單抗。這種策略的缺點(diǎn)是雙重的。首先，關(guān)于 組織特異性致癌過(guò)程認(rèn)識(shí)的匱乏和由此產(chǎn)生的鑒定這些把標(biāo)的過(guò)分簡(jiǎn)單 的方法(諸如通過(guò)過(guò)表達(dá)來(lái)篩選)，限制了對(duì)于治療性或者診斷性抗體結(jié)合 的合適靶標(biāo)的選擇。其次，以下假設(shè)不一定總是正確的，即通常與受體 以最大親和力結(jié)合的藥物分子起始或者抑制信號(hào)的可能性最高。
盡管在乳腺癌和結(jié)腸癌的治療中取得了 一些進(jìn)展，但對(duì)作為單 一 藥 劑或者協(xié)同治療的有效抗體療法的鑒定和開(kāi)發(fā)已經(jīng)不足以應(yīng)對(duì)所有類型 的癌癥。
現(xiàn)有專利
美國(guó)第5,750,102號(hào)專利公開(kāi)了方法，其中用MHC基因轉(zhuǎn)染患者的 腫瘤細(xì)胞，該基因可從患者的組織或細(xì)胞中克隆。然后用這些轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞接種患者。
美國(guó)專利4，861，581公開(kāi)了方法，其包括以下步驟獲取單克隆抗體， 該抗體對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分是特異的，對(duì)細(xì)胞
外成分沒(méi)有特異性；標(biāo)記單克隆抗體；將該標(biāo)記的抗體與哺乳動(dòng)物的組 織接觸，該哺乳動(dòng)物已接受殺傷腫瘤細(xì)胞的治療；及，通過(guò)測(cè)量該標(biāo)記 抗體與退化的肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分的結(jié)合來(lái)確定治療的有效性。在制 備針對(duì)人類細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體時(shí)，專利權(quán)所有人認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞是這類 抗原的方便來(lái)源。
美國(guó)專利5,171,665提供了新型抗體及其制備方法。具體的，該專利 教導(dǎo)單克隆抗體的制備，該抗體具有與人類腫瘤(例如腸和肺的腫瘤)相關(guān) 的蛋白抗原強(qiáng)烈結(jié)合的特性，而與正常細(xì)胞的結(jié)合程度弱得多。
美國(guó)專利5,484,596提供了癌癥治療的方法，其包括手術(shù)切除人類 癌癥患者的腫瘤；處理腫瘤組織以獲得腫瘤細(xì)胞；照射腫瘤細(xì)胞，使其 能成活但不致瘤；用這些細(xì)胞來(lái)制備抑制原發(fā)性腫瘤復(fù)發(fā)，同時(shí)抑制腫 瘤轉(zhuǎn)移的患者疫苗。該專利教導(dǎo)可與腫瘤細(xì)胞表面抗原反應(yīng)的單克隆抗 體的開(kāi)發(fā)。如在第4欄，第45行等處提到的，專利權(quán)所有人在研發(fā)單克 隆抗體中應(yīng)用了自體腫瘤細(xì)胞，該單克隆抗體對(duì)人類胂瘤表現(xiàn)出活性特異的免疫治療。
美國(guó)專利5，693，763教導(dǎo)人類癌細(xì)胞的糖蛋白抗原特性且不依賴于來(lái) 源的上皮組織。
美國(guó)專利5,783,186涉及誘導(dǎo)表達(dá)Her2的細(xì)胞凋亡的抗-Her2抗體， 產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞系，用該抗體和包括所述抗體在內(nèi)的藥物組合 物治療癌癥的方法。
美國(guó)專利5，849，876描述了產(chǎn)生單克隆抗體的新的雜交瘤細(xì)胞系，該 抗體是針對(duì)從腫瘤細(xì)胞和非肺瘤細(xì)胞來(lái)源純化的粘液素抗原。
美國(guó)專利5，869，268公開(kāi)了生成產(chǎn)生特異針對(duì)所需抗原的人類淋巴細(xì) 胞的方法，制備單克隆抗體的方法及該方法制備的單抗。該專利特別涉 及用于癌癥診斷和治療的抗-HD人類單克隆抗體的制備。美國(guó)專利5,869,045涉及與人類癌細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體 偶聯(lián)物和單鏈免疫毒素。這些抗體的作用機(jī)制是雙重的，因?yàn)樵摲肿涌?與人類癌細(xì)胞表面的細(xì)胞膜抗原反應(yīng)，而且該抗體可進(jìn)一步內(nèi)化入癌細(xì) 胞內(nèi)，隨后結(jié)合，使它們對(duì)形成抗體-藥物和抗體-毒素的偶聯(lián)物尤其有用。 未經(jīng)修飾的抗體在特定濃度下，也表現(xiàn)出細(xì)胞毒性質(zhì)。
美國(guó)專利5，780，033公開(kāi)了用于肺瘤治療和預(yù)防的自身抗體的使用。 不過(guò)，這種抗體是來(lái)自老年哺乳動(dòng)物的抗核自身抗體。這里，自身抗體 是指一種存在于免疫系統(tǒng)的天然抗體。因?yàn)樽陨砜贵w來(lái)自"老年哺乳動(dòng) 物，，，所以就不要求自身抗體真正來(lái)自受治患者。除此之外，該專利公開(kāi) 了來(lái)自老年哺乳動(dòng)物的天然單克隆抗核自身抗體及產(chǎn)生單克隆抗核自身
抗體的雜交瘤細(xì)i包系。
美國(guó)專利5,916,561公開(kāi)了靶向CD44基因變體外顯子v6的特異性 抗體VFF-18及其變體。該抗體是對(duì)比較抗體的改進(jìn)，因?yàn)槠渥R(shí)別人CD44 v6變體而不識(shí)別大鼠的CD44 v6變體。此外，該抗體7>開(kāi)了對(duì)于CD44 v6 表達(dá)的診斷分析。對(duì)于該抗體沒(méi)有公開(kāi)任何體外或體內(nèi)的功能。
美國(guó)專利5,616,468公開(kāi)了單克隆抗體Var3.1，該抗體針對(duì)包含由人 的CD44基因的外顯子6A編碼的序列的合成肽制備。特別地，該抗體與 人CD44的90kD形式不發(fā)生結(jié)合且可以與Hermes-3抗體相區(qū)別。提供 了檢測(cè)CD44的v6變體的方法以及根據(jù)該抗原對(duì)惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)行篩選和分析的方法。還提供了根據(jù)檢測(cè)血清中的抗原篩選炎癥疾病的方法。
美國(guó)專利5,879,898公開(kāi)了與人CD44變體6的129 bp的外顯子結(jié)合 的特異性抗體，該外顯子產(chǎn)生43個(gè)氨基酸的肽。該單克隆抗體可由若干 雜交瘤細(xì)胞系制備MAK<CD44>M-1.1.12、 MAK<CD44>M-2.42.3 、 MAK〈CD44〉M-4.3.16。該抗體從一融合蛋白產(chǎn)生，該蛋白包含新CD44 v6 氨基g吏序列的至少一個(gè)六肽。此外，公開(kāi)了用于檢測(cè)外顯子6變體的免 疫分析，該分析可被用作癌癥的診斷。值得注意地，沒(méi)有公開(kāi)該抗體的 體外或體內(nèi)功能。
美國(guó)專利5,942,417公開(kāi)了編碼CD44樣多肽的多核苷酸，以及使用 該多核苷酸及其變體制備重組蛋白的方法。這些多肽的抗體被要求保 護(hù)，但沒(méi)有具體實(shí)施例，也沒(méi)有分泌這些抗體的保藏的克隆。Northern 印記法證實(shí)該多核菩酸在一些類型的組織中出現(xiàn)，但沒(méi)有該多核苷酸翻 譯和表達(dá)的相應(yīng)證據(jù)。因此，沒(méi)有證據(jù)說(shuō)明針對(duì)該多核苷酸的基因產(chǎn)物 制備了抗體，且這些抗體是否具有體外或體內(nèi)功能，以及它們是否與人 類癌癥疾病相關(guān)。
美國(guó)專利5，885，575公開(kāi)了與CD44的變體表位反應(yīng)的抗體，以及通 過(guò)使用該抗體識(shí)別該變體的方法。從大鼠細(xì)胞中分離出編碼該變體的分 離的多核苷酸，且靶向該變體的抗體mAbl.lASML識(shí)別分子量為120kD、 150kD、 180kD和200kD的蛋白。單克隆抗體1.1ASML的給藥延緩了大 鼠BSp73ASML在同基因大鼠中的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。值得注意地，正如其缺 乏對(duì)LCLC97人大細(xì)胞肺癌的活性所證實(shí)的，1.1ASML不識(shí)別人類腫瘤。 從LCLC97中分離出人的同源物，但沒(méi)有制備出識(shí)別該同源物的等價(jià)抗 體。由此，盡管制備了對(duì)大鼠CD44的變體具有特異性的抗體且該抗體 顯示影響大鼠腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，沒(méi)有證據(jù)說(shuō)明該抗體對(duì)人類腫瘤具有 效應(yīng)。更具體地，該發(fā)明人指出該抗體不識(shí)別人類癌癥。
發(fā)明概述
本發(fā)明人此前已被授予了 "個(gè)體化患者特異性抗癌抗體"的美國(guó)專利 6,180,357，該專利涉及選4奪個(gè)體化定制抗癌抗體的方法，所述抗體可用 于治療癌性疾病。本領(lǐng)域公知可以改變多肽中的某些氨基酸序列而不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生顯著的影響。在抗體的分子重排中，對(duì)骨架 區(qū)域的核酸或氨基酸序列的修飾通常是可以耐受的。這些修飾包括但不 限于取代(優(yōu)選地是保守取代)、刪除或添加。此外，將標(biāo)準(zhǔn)的化療模式，
例如放射性核素，與本發(fā)明的CDMAB偶聯(lián)，從而集中所述化療劑的應(yīng) 用，在本發(fā)明的范圍內(nèi)。CDMAB還可以與毒素、細(xì)胞毒性部分、酶(例 如生物素偶聯(lián)酶)或者造血細(xì)月包偶聯(lián)，從而形成抗體偶聯(lián)物。
本申請(qǐng)使用6,180,357專利中教導(dǎo)的制備患者特異性抗癌抗體的方 法，以分離雜交瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系編碼癌性疾病調(diào)節(jié)單克隆抗體。 這些抗體可以被制備為特異性地針對(duì)一個(gè)腫瘤，由此使得癌癥療法的個(gè) 性化成為可能。在本申請(qǐng)上下文中，具有細(xì)胞殺傷(細(xì)胞毒性的)或細(xì)胞生 長(zhǎng)抑制(抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的)性質(zhì)的抗癌抗體在下文將被稱作細(xì)胞毒性的。這 些抗體可用于幫助癌癥的分期和診斷，并且可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。還可 以通過(guò)預(yù)防性治療利用這些抗體預(yù)防癌癥。與傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)模式下產(chǎn)生 的抗體不同，利用這種方式產(chǎn)生的抗體可以耙向于之前未顯示參與惡性
組織的生長(zhǎng)和/或存活的分子和通路。此外，這些抗體的結(jié)合親和力滿足 細(xì)胞毒性事件起始的要求，所述事件不一定需要更強(qiáng)的親和力相互作用。 個(gè)體化抗癌治療的前景將給患者的治療方式帶來(lái)改變。可能出現(xiàn)的 臨床情景是在腫瘤出現(xiàn)時(shí)獲取并保存腫瘤樣品。通過(guò)這個(gè)樣品，可以從 預(yù)存在的癌性疾病調(diào)節(jié)抗體組中對(duì)該腫瘤分型。對(duì)患者進(jìn)行常規(guī)分期， 但是提供的抗體可以用于對(duì)患者進(jìn)-步的分期。可以用現(xiàn)有的抗體立即
篩選方法的噬菌體展示文庫(kù)制備對(duì)腫瘤具有特異性的抗體組。將生成的 所有抗體加入抗癌抗體文庫(kù)，因?yàn)槠渌[瘤可能與正在接受治療的腫瘤 具有一些相同的表位。如本方法產(chǎn)生的抗體可用于治療任意數(shù)量患者的 癌性疾病，所述患者具有結(jié)合這些抗體的癌癥。
除抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦的療法作為多模式治 療方案的一部分。通過(guò)本方法分離的抗體對(duì)非癌性細(xì)胞是相對(duì)無(wú)毒的事 實(shí)允許使用高劑量抗體的組合，或者單獨(dú)使用，或者與常規(guī)療法聯(lián)用。 高治療指數(shù)還允許按短時(shí)量程重復(fù)治療，這將降低治療抗性細(xì)胞出現(xiàn)的 可能性。如果患者耐受治療的初始階段或發(fā)生轉(zhuǎn)移，可以重復(fù)產(chǎn)生腫瘤特異 性抗體的過(guò)程用于再治療。此外，可以將抗癌抗體與從該患者獲得的紅 血細(xì)胞偶聯(lián)并回輸用于轉(zhuǎn)移的治療。對(duì)轉(zhuǎn)移性癌癥很少有有效的治療且 轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著導(dǎo)致死亡的不良結(jié)果。但是，轉(zhuǎn)移性癌癥常常是充分血 管化的，且紅細(xì)胞對(duì)抗癌抗體的遞送具有在胂瘤部位聚集抗體的作用。 甚至在轉(zhuǎn)移前，大部分癌細(xì)胞的存活依賴于宿主的血液供應(yīng)，與紅細(xì)胞 偶聯(lián)的抗癌抗體對(duì)原位肺瘤也是有效的?？蛇x擇地，抗體可以與其它造 血細(xì)胞偶聯(lián)，所述細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷 細(xì)胞等等。
有5類抗體，且各類抗體與由其重鏈賦予的功能關(guān)聯(lián)。 一般認(rèn)為， 棵抗體的癌細(xì)胞殺傷是由抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞
毒性介導(dǎo)的。例如鼠IgM以及IgG2a抗體可以通過(guò)與補(bǔ)體系統(tǒng)中的C-1 成分結(jié)合激活人的補(bǔ)體，由此激活補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑，該途徑可導(dǎo)致 腫瘤裂解。對(duì)于人抗體，最有效的補(bǔ)體激活抗體一般為IgM和IgGl。鼠 IgG2a和IgG3同種型抗體有效募集具有Fc受體的細(xì)胞毒性細(xì)胞，由此造 成單核細(xì)胞、巨謹(jǐn)細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)^^的細(xì)胞殺傷。人的IgGl 和IgG3同種型抗體均介導(dǎo)ADCC。
抗體介導(dǎo)的癌癥殺傷的另一個(gè)可能機(jī)制可能通過(guò)抗體的使用，所述
抗體能夠催化細(xì)胞膜及其結(jié)合的糖蛋白或糖脂中的多種化學(xué)鍵的水解， 即所謂的催化抗體。
有另外三種抗體介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷機(jī)制。第--種機(jī)制是將抗體用作 疫苗以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)駐留于癌細(xì)胞的推定抗原的免疫反應(yīng)。第二種 機(jī)制是將抗體用于靶向生長(zhǎng)受體并干擾它們的功能或者下調(diào)該受體以有 效地使其功能喪失。第三種機(jī)制是這類抗體對(duì)細(xì)胞表面部分直接結(jié)合的 作用，這可以導(dǎo)致直接的細(xì)胞死亡，例如死亡受體的結(jié)合，所述死亡受 體例如TRAIL Rl或者TRAIL R2，或是諸如aV卩3等的整合素分子的結(jié) 合。
癌癥藥物的臨床應(yīng)用基于該藥物在可接受的風(fēng)險(xiǎn)范圍下對(duì)患者的有 益效果，在癌癥治療中，存活率竭常是最重要的獲J^目標(biāo)，但是除了延 長(zhǎng)生命外，還存在大量其他公認(rèn)的益處。治療對(duì)存活率沒(méi)有負(fù)面影響的情況下，這些其他益處包括癥狀的減輕、防止負(fù)面事件、延長(zhǎng)復(fù)發(fā)或者 無(wú)疾病存活的時(shí)間和延長(zhǎng)進(jìn)展時(shí)間。這些標(biāo)準(zhǔn)被普遍接受，像美國(guó)食品
藥品管理局(F.D.A.)等管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)產(chǎn)生這些益處的藥物(Hirschfeld W aL Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002)。除了這些標(biāo)準(zhǔn) 外，還充分意識(shí)到還有其他指標(biāo)可以預(yù)示這些類型的益處。部分地，美 國(guó)F.D.A.授予的快速審批程序確認(rèn)了存在很可能預(yù)測(cè)患者荻益的替代 品。到2003年末，有16種藥物被這種程序批準(zhǔn)，其中4種已經(jīng)進(jìn)入完 全審批，即，后續(xù)研究已證明如替代指標(biāo)所預(yù)示的直接患者獲益。確定 對(duì)實(shí)體瘤的藥物作用的一個(gè)重要指標(biāo)是通過(guò)測(cè)量對(duì)治療的反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)腫 瘤負(fù)荷(Therasse Journal of the National Cancer Institute 92(3):
205-216 2000)。這種評(píng)價(jià)的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))已經(jīng)由實(shí)體瘤反應(yīng)評(píng) 價(jià)標(biāo)準(zhǔn)工作組(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group)公布，所述工作組由國(guó)際癌癥專家組成。正如RECIST標(biāo)準(zhǔn)的客觀 療效顯示的，與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組相比，對(duì)腫瘤負(fù)荷有確切作用的藥物易于 最終對(duì)患者產(chǎn)生直接的益處。通常，能夠更直接地評(píng)價(jià)和記錄臨床前設(shè) 置的腫瘤負(fù)荷。因?yàn)榕R床前研究可以轉(zhuǎn)化成臨床設(shè)置，所以在臨床前模 型中延長(zhǎng)患者存活率的藥物應(yīng)該有最大的預(yù)期臨床效用。與臨床治療產(chǎn) 生的積極作用相似，在臨床前設(shè)置中減輕腫瘤負(fù)荷的藥物也對(duì)疾病有明 顯的直接影響。盡管延長(zhǎng)生存時(shí)間是癌癥藥物治療結(jié)果中最關(guān)注的臨床 結(jié)果，但仍有其他有臨床作用的益處，顯然，降低肺瘤負(fù)荷也能導(dǎo)致直 接的益處，并具有臨床作用，其與疾病進(jìn)展的延遲、生存時(shí)間的延長(zhǎng)或 兩者都有關(guān)系(Eckhardt "/， Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds(發(fā)展的治療學(xué)輩巴 化合物的臨床試驗(yàn)-沒(méi)計(jì)的成功與失敗)；ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003， pages 209-219)。
基本使用US 6,180,357的方法，在用患者肺腫瘤活檢細(xì)胞使小鼠免 疫之后，獲得小鼠單克隆抗體H460-16-2。 H460-16-2抗原在來(lái)自不同組 織的廣泛的人細(xì)胞系的細(xì)胞表面表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 (MB-231)和皮膚癌細(xì)胞系A(chǔ)2058是體外對(duì)H460-16-2細(xì)胞毒性效應(yīng)敏感 的細(xì)J包系。H460-16-2對(duì)培養(yǎng)的MB-231細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果，通過(guò)在其被移植 進(jìn)小鼠時(shí)對(duì)這些癌細(xì)胞的抗腫瘤活性得以進(jìn)一步擴(kuò)大(如S.N. 10/603,000 中公開(kāi)的)。臨床前異種移植腫瘤模型被認(rèn)為是治療功效的有效預(yù)測(cè)。
在人乳腺癌的預(yù)防性體內(nèi)模型中，在治療期間，H460-16-2治療比同 型對(duì)照抗體顯著更有效地(p〈0.0001)抑制腫瘤生長(zhǎng)。在治療期結(jié)束時(shí)， 接受H460-16-2的小鼠其肺瘤生長(zhǎng)只有對(duì)照組的1.3%。在治療后的隨訪 期間，H460-16-2的治療效應(yīng)繼續(xù)維持，治療組的平均腫瘤體積繼續(xù)顯著 地小于對(duì)照組，直到測(cè)量期結(jié)束。使用存活作為抗體功效的衡量指標(biāo)， 據(jù)估計(jì)在治療后的70天，H460-16-2治療組中的死亡風(fēng)險(xiǎn)是抗體緩沖液 對(duì)照組的大約71% (p = 0.028)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明H460-16-2治療與對(duì)照治療 組相比具有存活益處。由于沒(méi)有誘導(dǎo)任何毒性跡象，包括體重降低和臨 床痛苦，H460-16-2治療看起來(lái)是安全的。因此，H460-16-2治療是有效 的，因?yàn)樵谕晟频娜巳橄侔┠Ｐ椭兴c對(duì)照治療組相比延緩了腫瘤的生 長(zhǎng)并提高了存活。
此外，H460-16-2在確立的體內(nèi)腫瘤才莫型中證明了對(duì)MB-231細(xì)胞的 抗腫瘤活性(如S.N. 10/603,000中描述的)。將H460-16-2的治療和標(biāo)準(zhǔn)化 療藥物順鉑進(jìn)行了比較，比較顯示順鉑和H460-16-2治療組相比于接受 抗體稀釋緩沖液或同型對(duì)照抗體治療的組，具有顯著小的平均腫瘤體積(p 〈0.001)。 H460-16-2治療介導(dǎo)了大約為順鉑化療2/3的胂瘤抑制，但沒(méi) 有順鉑治療中觀察到的顯著的(19.2。/。)體重降低(p〈0.003)和臨床痛苦，包 括在順鈉治療中^見(jiàn)察到的2例治療相關(guān)的死亡。H460-16-2的抗腫瘤活性 及其最小化的毒性使其成為 一種具有吸引力的抗癌治療劑。
在治療后階段，H460-16-2顯示了顯著的存活益處(p〈0.02)，因?yàn)樵?治療后70天以后，H460-16-2組的死亡風(fēng)險(xiǎn)大約是同型對(duì)照抗體組的一 半 觀察到的存活益處持續(xù)到治療后的120天，其中同型對(duì)照和順鉑治 療的小鼠100%死亡，而H460-16-2治療組的死亡率為67%。 H460-16-2 通過(guò)延緩腫瘤生長(zhǎng)維持對(duì)肺瘤的抑制，和同型對(duì)照抗體組相比延緩了 26%。在治療后的31天，H460-16-2通過(guò)減慢腫瘤生長(zhǎng)從而限制肺瘤大 小，與同型對(duì)照組相比減少48% ，這和在治療結(jié)束時(shí)》見(jiàn)，薈到的49%的降 低相當(dāng)。在乳腺癌的確立的肺瘤模型中，這些結(jié)果意味著H460-16-2在超出治療期以后維持腫瘤抑制的潛力，且證明了該抗體在哺乳動(dòng)物中降 低腫瘤負(fù)荷和提高存活的能力。
除了在確立的乳腺癌體內(nèi)肺瘤模型中顯示的有益效果，H460-16-2與 化療藥物(順柏)聯(lián)合治療在確立的體內(nèi)前列腺癌模型中也具有抗PC-3細(xì) 胞的抗腫瘤活性(如S.N. 10/810,165所公開(kāi))。利用配對(duì)t-檢驗(yàn)，在治療周 期后不久H460-16-2加順鉑的治療在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面比緩沖液對(duì)照 (pO.OOOl)、單獨(dú)的順鉑治療(p^.004)或者單獨(dú)的H460-16-2治療 (pO.0001)顯著更為有效。在療程結(jié)束時(shí)，給予H460-16-2加順鉑的小鼠 生長(zhǎng)的肺瘤只有緩沖液對(duì)照組的28.5%。對(duì)于PC-3 SCID異種移植模型， 體重可以用作疾病進(jìn)展的替代指標(biāo)。所有組的小鼠都經(jīng)歷嚴(yán)重的體重減 輕。該研究中，所有組的小鼠在療程結(jié)束時(shí)體重減輕大約23%至35%。 使用H460-16-2治療的組顯示最小程度的體重減輕(21.7%)。治療后第48 天，與緩沖液對(duì)照相比，與H460-16-2和順鉑的治療有關(guān)的體重減輕沒(méi) 有顯著的增加^=0.5042)。因此，H460-16-2加順鉑治療是有效的，因?yàn)?與同種型對(duì)照治療組相比，其在已建立的人軒列腺癌模型中延緩腫瘤生 長(zhǎng)。
為了證實(shí)H460-16-2表位是藥物靶點(diǎn)，此前確定了 H460-16-2抗原在 正常人體組織中的表達(dá)(S.N. 10/603,000)通過(guò)與抗-CD44抗體、克隆L178 (如S.N, 10/647,818所公開(kāi))和克隆BU75 (如S.N. 10/810,165所公開(kāi)))的比 較，此項(xiàng)工作得到了擴(kuò)展。通過(guò)H460-16-2的IHC染色，大部分組織未 能表達(dá)H460-16-2抗原，包括重要器官的細(xì)胞，如肝、腎(管狀上皮細(xì)胞 的少量染色除外)、心臟和肺。組織染色的結(jié)果表明H460-16-2顯示了對(duì) 各種細(xì)胞類型的受限結(jié)合，但顯示對(duì)侵潤(rùn)性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖 維細(xì)胞的結(jié)合。BU75抗體顯示類似的染色模式。但是，存在至少一個(gè)值 得注意的差異與H460-16-2相比，BU75對(duì)淋巴細(xì)胞的染色更強(qiáng)。
H460-16-1抗原的定位及其在人群例如乳腺癌患者中普遍性的測(cè)定， 在評(píng)價(jià)H460-16-2的治療用途和設(shè)計(jì)有效的臨床試驗(yàn)中非常重要。為了 闡明H460-16-2抗原在癌癥患者乳腺腫瘤中的表達(dá)，之前對(duì)來(lái)自50例乳 腺癌患者的腫瘤組織樣品中H460-16-2抗原的表達(dá)進(jìn)行了篩選(S.N. 10/603,000)，并與L178 (S.N. 10/647,818)、 BU75 (S.N. 10/810，165)和抗-Her2抗體c-erbB-2 (S.N. 10/810，165)進(jìn)行了比較這些研究的結(jié)果是相似 的，并顯示62°/。的組織樣品為H460-16-2抗原染色陽(yáng)性而73%的乳腺肺 瘤組織是BU75表位陽(yáng)性的?；颊邩悠分蠬460-16-2的表達(dá)顯示對(duì)癌細(xì)胞 的特異性，因?yàn)槿旧抻趷盒约?xì)胞。H460-16-2染色了來(lái)自乳腺癌患者的 10個(gè)正常組織樣品中的4個(gè)，而B(niǎo)U75染色了 8個(gè)。H460-16-2和BU75 抗原的乳腺肺瘤表達(dá)看起來(lái)主要定位于惡性細(xì)胞的細(xì)胞膜，這使CD44 成為治療上引人注目的靶標(biāo)。基于荷爾蒙雌激素和黃體酮受體在乳腺腫 瘤中的表達(dá)對(duì)H460-16-2表達(dá)做了進(jìn)一步評(píng)價(jià)，所述受體在乳腺腫瘤的 發(fā)展、治療和預(yù)后中發(fā)揮重要作用。H460-16-2抗原的表達(dá)與雌激素或者 黃體酮受體的表達(dá)之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性。當(dāng)根據(jù)腫瘤的階段或者癌癥 進(jìn)展的程度分析腫瘤時(shí)，H460-16-2抗原表達(dá)和腫瘤階段之間仍然沒(méi)有明 顯的相關(guān)'比使用BU75獲得了類似的結(jié)l與c-erbB-2相比，H460-16-2 顯示完全不同的染色模式，其中52%的H460-16-2抗原陽(yáng)性的乳腺腫瘤 組織樣品是Her2表達(dá)陰性的，表明仍然尚未得到滿足的乳腺癌患者對(duì)靶 向治療的需要。在對(duì)H460-16-2和Her2都呈陽(yáng)性的乳腺腫瘤組織切片之 間存在染色強(qiáng)度的差異"c-erbB-2抗體還陽(yáng)性染色了 一個(gè)正常乳腺組織切 片。
為了進(jìn)一步拓展H460-16-2的潛在治療益處，先前確定了抗原在各 種人類癌癥組織中的頻率和定位(S.N. 10/603,000)并與克隆L178進(jìn)4亍了 比較(S.N. 10/647,818)。這些腫瘤類型中的大部分對(duì)L178抗原也是陽(yáng)性 的。和人乳腺腫瘤組織一樣，H460-16-2和L178的定位主要發(fā)生在腫瘤 細(xì)胞的細(xì)胞膜上。但是，和H460-16-2抗體相比，L178基本上更多的定 位于膜。并且，在對(duì)于IT460-16-2和L178均發(fā)生染色的腫瘤類型中，43% 的組織對(duì)L178抗體顯示了更高強(qiáng)度的染色。
根據(jù)與文獻(xiàn)中IHC數(shù)椐的比較，表明沒(méi)有CD44的形式與此處顯示 的IHC數(shù)據(jù)精確匹配CD44的標(biāo)準(zhǔn)形式通常在人腦中表逸而H460-16-2 抗原不是這樣。靶向pan-CD44亞型的抗體不對(duì)肝(包括Kuppfer細(xì)胞)發(fā) 生染色，并且對(duì)生殖周期的所有階段的子宮內(nèi)膜腺陽(yáng)性染色。H460-16-2 抗原清晰地存在于Kuppfer細(xì)胞上并且只存在于生殖周期的分泌子宮內(nèi) 膜腺上。H460-16-2抗原清楚地存在于組織巨噬細(xì)胞上，并且只有變體形式V4/5和V8/9顯示了偶爾的巨噬細(xì)胞染色。與抗-CD44 L178和現(xiàn)在的 BU75相比，觀察到的H460-16-2相似但不同的結(jié)合沖莫式說(shuō)明H460-16-2 抗原是CD44獨(dú)特的表位。
如先前所公開(kāi)的(S.N. 10/647,818)，其他的生化數(shù)據(jù)也說(shuō)明H460-16-2 識(shí)別的抗原是CD44的形式之一。這得到了下述研究的支持，所述研究 顯示與CD44反應(yīng)的單克隆抗體(L178)識(shí)別通過(guò)免疫沉淀與H460-16-2結(jié) 合的蛋白。Western印跡研究也表明H460-16-2識(shí)別的CD44的表位在v6 或v10上不存在。H460-16-2表位也可按照是糖和構(gòu)象依賴性的而被區(qū) 分，而很多抗CD44抗體是靶向CD44的肽部分。這些IHC和生化結(jié)果 證明H460-16-2與CD44抗原的變體結(jié)合。因此優(yōu)勢(shì)證據(jù)顯示H460-16-2 通過(guò)與CD44變體上獨(dú)特的糖依賴性構(gòu)象表位的連接介導(dǎo)抗癌作用。為 了本發(fā)明的目的，所述表位定義為"CD44抗原性部分"，其特征為與雜交 瘤細(xì)胞系H460-16-2編碼的單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段或者其抗體偶 聯(lián)物相結(jié)合的能力。
為了進(jìn)一步闡明H460-16-2抗癌作用的機(jī)制，進(jìn)行透明質(zhì)酸(HA)結(jié) 合分析(如S.N. 10/810,165所公開(kāi))。已經(jīng)確定抑制50%的MDA-MB-231 細(xì)胞與HA的粘附需要平均濃度為1.87 (+/- 1.01)微克/mL的H460-16-2。 這些結(jié)果表明H460-16-2與CD44上負(fù)責(zé)結(jié)合HA的區(qū)域至少發(fā)生部分相 互作用，因此能夠利用通過(guò)血管發(fā)生的下調(diào)或者利用ECM的腫瘤入侵的 下調(diào)來(lái)介導(dǎo)其抗癌作用。
除HA結(jié)合分析外，進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)以便確定H460-16-2的體外和 體內(nèi)抗癌作用是否歸因于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)(如S.N. 10/810,165所公開(kāi)》在 使用20 !ig/mL的H460-16-2 24小時(shí)后，與同種型對(duì)照相比，MDA-MB-231 凋亡細(xì)胞的數(shù)目增加。這種作用看起來(lái)也是劑量依賴性的。因此， H460-16-2的效果也可能全部或者部分歸因于其凋亡誘導(dǎo)能力。
總體來(lái)說(shuō)，該數(shù)據(jù)表明H460-16-2抗原是癌癥相關(guān)抗原并在人體中 表達(dá)，是一種病理相關(guān)的癌癥靶標(biāo)。此外，該數(shù)據(jù)還證明了 H460-16-2 抗體與人類癌癥組織的結(jié)合，并可以適用于可以是診斷、治療預(yù)測(cè)或者 預(yù)后的分析。另外，因?yàn)樵诖蟛糠址菒盒约?xì)胞中缺乏該抗原的表達(dá)，該 抗原的細(xì)胞膜定位指示了細(xì)胞的癌癥狀態(tài)，該發(fā)現(xiàn)允許該抗原、其基因或者衍生物、其蛋白或者其變體用于可以是診斷、治療預(yù)測(cè)或者預(yù)后的 分析。
其它涉及抗CD44抗體使用的研究具有H460-16-2所沒(méi)有表現(xiàn)的治療 潛力的限制。H460-16-2證實(shí)了體外和體內(nèi)的抗肺瘤活性。此前說(shuō)明的抗 體如MAK<CD44>M-1.1.12、 MAK<CD44>M-2.42.3和MAK<CD44>M-4.3.16沒(méi)有屬于它們的體外和體內(nèi)細(xì)胞毒性，且VFF-18與MabU36沒(méi)有 表現(xiàn)固有的腫瘤細(xì)胞毒性。此外，其它表現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤效應(yīng)的抗-CD44 抗體也具有某些H460-16-2所沒(méi)有的限制。例如，ASMLl.l、 K926、抗 -CD44s和IM-78.1分別顯示了對(duì)大鼠、小鼠、異種移檔^莫型中的大鼠和 小鼠腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤活性。H460-16-2在人體癌癥模型中證實(shí)了抗腫瘤 活忱H460-16-2也靶向人CD44，而抗體如ASMLl.l只識(shí)別大鼠CD44。 克隆515抗CD44抗體對(duì)人卵巢細(xì)胞系的腹膜腫瘤移植發(fā)生抑制但不防 止或抑制腫瘤的生長(zhǎng)。H460-16-2在SCID小鼠異種移植模型中能夠抑制 人乳腺肺瘤的生長(zhǎng)。GKW.A3是一種抗-人CD44單克隆抗體，能夠在預(yù) 防性但非已確立的模型中抑制小鼠中生長(zhǎng)的人轉(zhuǎn)移'性黑素瘤的腫瘤生 長(zhǎng)。H460-16-2已在預(yù)防性和已確立的人乳腺癌小鼠異種移植模型中證實(shí) 了顯著的抗腫瘤活性。因此，很明顯，H460-16-2和此前說(shuō)明的抗-CD44 抗體相比具有更好的抗肺瘤性質(zhì)。其在SCID小鼠的人乳腺肺瘤上的體外 和體內(nèi)抗腫瘤活性已被證實(shí)并且靶向人CD44。該抗體還在人乳腺癌的預(yù) 防性和已確立(更加臨床相關(guān)的)模型中顯示了活性，并且它還與順鉑在人 前列腺癌的已確立模型中顯示了活性。
總而言之，本發(fā)明教導(dǎo)了 H460-16-2抗原作為治療劑靶標(biāo)的用途， 當(dāng)其被給藥時(shí)能夠降低哺乳動(dòng)物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷(因此延 緩疾病進(jìn)展)，還能夠?qū)е卤恢委煵溉閯?dòng)物的存活延長(zhǎng)。本發(fā)明還教導(dǎo)了 CDMAB (H460-16-2)和它的衍生物的用途靶向它的抗原以降^氐哺乳動(dòng) 物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷，并延長(zhǎng)具有表達(dá)該抗原的腫瘤的哺 乳動(dòng)物的存活。此外，本發(fā)明還教導(dǎo)了在結(jié)合其抗原后，H460-16-2能夠 干擾癌細(xì)胞與透明質(zhì)酸相互作用的能力，且能造成癌細(xì)胞經(jīng)受凋亡。此 外，本發(fā)明還教導(dǎo)了在癌性細(xì)胞中檢測(cè)H460-16-2抗原的用途，其可用 于具有表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物的診斷、療法預(yù)測(cè)和預(yù)后。本發(fā)明描述了按照專利US 6， 180,357中描述的方法研發(fā)的H460-16-2 的發(fā)展和用途，并通過(guò)其在細(xì)胞毒性測(cè)定、動(dòng)物^^莫型中未確立和已確立 的肺瘤生長(zhǎng)以及在延長(zhǎng)癌性疾病患者存活時(shí)間中的作用來(lái)進(jìn)行鑒定。本 發(fā)明還描述了通過(guò)專利US 6，180，357描述的方法研發(fā)的AR37A335.8的 發(fā)展和用途，并在細(xì)胞毒性測(cè)定和動(dòng)物模型腫瘤生長(zhǎng)的預(yù)防性阻止中鑒 定其作用。本發(fā)明代表了癌癥治療領(lǐng)域的進(jìn)展，因?yàn)樗谝淮蚊枋隽伺c 靶分子CD44上存在的一個(gè)或者多個(gè)表位特異結(jié)合的棵抗體，所述抗體 還具有抗惡性腫瘤細(xì)胞而不是正常細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性質(zhì)，并且所述抗 體在人類癌癥的體內(nèi)模型中還直接介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)的抑制和存活的延長(zhǎng)。 這是涉及任意其他先前描述的抗-CD44抗體的進(jìn)展，因?yàn)闆](méi)有一種顯示 具有相似的性質(zhì)。它還提供了本領(lǐng)域內(nèi)的進(jìn)展，因?yàn)槠涫状吻宄C明了 CD44直接參與某些類型腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展相關(guān)的事件。它還代表了癌癥 療法的進(jìn)展，因?yàn)槠渚哂性谌祟惢颊咧斜憩F(xiàn)類似抗癌性質(zhì)的潛力。另一 個(gè)進(jìn)展是在抗癌癥抗體文庫(kù)中包含這些抗體，這將通過(guò)確定不同抗癌抗 體的合適組合，提高扭向表達(dá)不同抗原標(biāo)志物的腫瘤的可能性，以便最 有效的靶向和抑制所述腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。
總而言之，本發(fā)明教導(dǎo)了 H460-16-2抗原作為治療劑靶標(biāo)的用途， 當(dāng)其被給藥時(shí)能夠降低哺乳動(dòng)物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷，還能 夠?qū)е卤恢委煵溉閯?dòng)物的存活延長(zhǎng)本發(fā)明還教導(dǎo)了 CDMAB (H460-16-2 和AR37A335.8)和它們的衍生物、其配體和抗原結(jié)合片段的用途靶向 它們的抗原以降低哺乳動(dòng)物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷，并延長(zhǎng)具 有表達(dá)該抗原的胂瘤的哺乳動(dòng)物的存活。此外，本發(fā)明還教導(dǎo)了在癌性 細(xì)胞中檢測(cè)H460-16-2和AR37A335.8抗原的用途，所述用途可用于具有 表達(dá)該抗原的腫瘤哺的乳動(dòng)物的診斷、治療預(yù)測(cè)和預(yù)后。
因此，本發(fā)明的目的是利用產(chǎn)生培養(yǎng)的抗癌性細(xì)胞的癌性疾病調(diào)節(jié) 抗體(CDMAB)的方法來(lái)分離雜交瘤細(xì)胞系和相應(yīng)的由所述雜交瘤細(xì)胞系 編碼的分離的單克隆抗體和其抗原結(jié)合片段，所述癌性細(xì)胞來(lái)自特定個(gè) 體或者一種或者多種特定癌細(xì)胞系，其中CDMAB對(duì)癌細(xì)胞是細(xì)胞毒性 的但同時(shí)對(duì)非癌性細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是教導(dǎo)癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其配體和其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體和配體，其細(xì)胞毒性 通過(guò)抗體依賴的細(xì)刃包毒性介導(dǎo)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體和配體，其細(xì)胞毒 性通過(guò)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性介導(dǎo)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體和配體，其細(xì)胞毒 性是它們催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解的能力的功能。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體或配體，其可用于 癌癥診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)的結(jié)合分析中。
本發(fā)明其他的目的和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)本發(fā)明下述的i兌明、舉例和實(shí)施例、 一些實(shí)施方式的描述將變得明顯。
附圖簡(jiǎn)述


圖1比較了 AR37A335.8雜交瘤上清抗細(xì)胞系PC-3、 LnCap和 CCD-27sk的百分比細(xì)胞毒性和結(jié)合水平。
圖2是細(xì)胞毒性分析中AR37A335.8與陽(yáng)性和陰性對(duì)照的比較。
圖3表示AR37A335.8和抗-EGFR對(duì)照對(duì)癌癥和正常細(xì)胞系的結(jié)合。 數(shù)據(jù)制成表格，以高于同種型對(duì)照的倍數(shù)的增加來(lái)表示平均熒光強(qiáng)度。
圖4包括針對(duì)癌和非癌細(xì)胞系的AR37A335.8和抗-EGFR抗體的代 表性FACS直方圖。
圖5顯示預(yù)防性MDA-MB-231乳腺癌模型中AR37A335.8對(duì)腫瘤生 長(zhǎng)的作用。垂直虛線指示抗體施用的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+/-8￡]^。
圖6顯示預(yù)防性MDA-MB-231乳腺癌模型中AR37A336.8對(duì)體重的 作用。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值l /- SEM。
圖7顯示預(yù)防性SW1116結(jié)腸癌模型中AR37A337.8對(duì)肺瘤生長(zhǎng)的作 用。垂直虛線指示抗體施用的時(shí)期。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+ASEM。
圖8顯示預(yù)防性SW1116結(jié)腸癌模型中AR38A338.8對(duì)體重的作用。 數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+/- SEM。
圖9.來(lái)自MDA-MB-231細(xì)胞(泳道l)的全細(xì)胞膜部分的樣品以及來(lái) 自PC-3 (泳道2)和CCD-27sk (泳道3)細(xì)胞系的全細(xì)胞裂解產(chǎn)物的樣品的Western印跡，用AR37A335.8和H460-16-2作為探針片企測(cè)。
圖10.使用抗-CD44 H460-16-2從MDA-MB-231細(xì)胞系的全細(xì)胞膜 部分免測(cè)沉淀制備的免疫復(fù)合物的Western印跡。印跡的各條泳道分別用 AR37A335.8 (泳道1)、 H460-16-2 (泳道2)或者同種型對(duì)照抗體(泳道3)作 為探針。
圖11是人前列腺腫瘤和正常組織微陣列上H460-16-2結(jié)合的概要。
圖12.顯示在人組織微陣列中使用H460-16-2 (A)或者同種型對(duì)照抗 體(B)獲得的前列腺腫瘤組織的結(jié)合模式、以及使用H460-16-2(C)或者同 種型對(duì)照抗體(D)獲得的正常前列腺組織的結(jié)合模式的代表性顯微照 片。H460-16-2對(duì)肺瘤細(xì)胞顯示強(qiáng)陽(yáng)性染色，而對(duì)正常組織的基質(zhì)成纖維 細(xì)胞顯示弱染色。放大率是200x。
圖13是人肝胂瘤和正常組織微陣列上H460-16-2結(jié)合的概要。
圖14.顯示在人組織微陣列中使用H460-16-2 (A)或者同種型對(duì)照抗 體(B)獲得的肝腫瘤組織的結(jié)合模式、以及使用H460-16-2(C)或者同種型 對(duì)照抗體(D)獲得的非肺瘤肝組織的結(jié)合模式的代表性顯微照片。 H460-16-2對(duì)腫瘤細(xì)胞界示強(qiáng)陽(yáng)性染色，并且染色限于竇內(nèi)皮細(xì)胞(黑色 箭頭)和非腫瘤肝組織的侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(綠色箭頭)。放大率是200x。
圖15是H460-16-2或者緩沖液治療后，通過(guò)TUNEL分析或者H&E 染色確定的MDA-MB-231腫瘤異種移植物中凋亡細(xì)胞數(shù)量的概要。
圖16. H460-16-2 mRNA的RT-PCR產(chǎn)物。輕鏈反應(yīng)(圖A)利用 MuIgKVL 5'-F (泳道l)或者M(jìn)uIgKVL 5'-C (泳道2)正向引物進(jìn)行擴(kuò)增。重 鏈反應(yīng)(圖B)利用MuIgVH5'-A、 B、 C、 D和F正向引物的混合物進(jìn)行擴(kuò) 增。兩個(gè)輕鏈反應(yīng)(圖A，泳道1和2)均顯示450 bp處的強(qiáng)條帶，以及 850bp處的弱條帶。450bp條帶是包含H460-16-2 Vk基因的靶條帶。重 鏈反應(yīng)(圖B，泳道l)顯示500bp處的強(qiáng)條帶和1000bp處的弱條帶。500 bp處的條帶是對(duì)應(yīng)H460-16-2 Vh基因的靶條帶。
圖17.EcoRI消化的質(zhì)粒所述質(zhì)粒分離自用pCR2.1 (H460-16-2 Vk) 轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(五.co/f)。頂部標(biāo)明克隆編號(hào)。第一個(gè)數(shù)字表示使用的正 向引物(MuIgKVL5'-F是1 ，而MuIgKVL5'-C是2)，第二個(gè)數(shù)字表示克隆 編號(hào)(l-5)。分子量標(biāo)記標(biāo)在左側(cè)。箭頭指明期望的H460-16-2插入物的位置。
圖18. EcoRI消化的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒分離自用pCR2.1 (H460-16-2 Vh) 轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。頂部標(biāo)明克隆編號(hào)。分子量標(biāo)記標(biāo)在左側(cè)?？寺、 2、 3、 4、 5和8顯示對(duì)應(yīng)H460-16-2 Vh基因的期望的500bp條帶。
圖19.pCR2.1 (H460-16-2 Vh)克隆的原始序列數(shù)據(jù)。
圖20. EcoRI消化的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒分離自用pCR2.1(H460-16-2 Vh) 轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。頂部標(biāo)明克隆編號(hào)。分子量標(biāo)記標(biāo)在左側(cè)。箭頭指明 期望的H460-16-2 Vh插入物的位置。
圖21. pCR2.1(H460-16-2 Vk)和pCR2.1(H460-16-2 Vh)克隆的原始序 列數(shù)據(jù)。
圖22.pHC-huCgl載體(也稱為pCH-huIgl)的質(zhì)粒示意圖。人Cyl的 恒定區(qū)位于Hind III和Xho I限制性位點(diǎn)之間。顯示了細(xì)菌(氨千青霉素) 和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(新霉素)的選擇標(biāo)記物。該質(zhì)粒由G. R. McLean等提供。
圖23.引物序列。
圖24. PCR擴(kuò)增的pCH-huIgl (圖A，泳道1)、 H460-16-2 Vk (圖A， 泳道2)和H460-l6_2 Vh (圖B,泳道l)。 PCR擴(kuò)增在現(xiàn)有模板中添加合 適的限制性酶切位,l緊接在pCH-huIgl載體的現(xiàn)有Hind III位點(diǎn)的下游 添加BsiW I位點(diǎn)。1100 bp條帶(泳道l)是位于Hind III和Xba I位點(diǎn)之間 的質(zhì)粒擴(kuò)增區(qū)。在H460-16-2 Vk基因的5'端添加Mie I位點(diǎn)，3'端添加 Not I位點(diǎn)。在該基因的5'端添加Nhe I位點(diǎn)，3'端添加BsiW I位點(diǎn)。所 獲H460-16-2 Vk (圖A,泳道2)和H460-16-2 Vh (圖B，泳道l)條帶的大 小與原來(lái)基因(約450bp)的大小相似，因?yàn)閹缀鯖](méi)有添加核苷酸。
圖25.人IgGl重鏈恒定區(qū)PCR產(chǎn)物(泳道l)和pCH-hulgl質(zhì)粒(泳道 2)的消化。圖A是利用Hind III的單一消化。圖B是利用Hind III和Xho I的雙重消化。兩種消化之間(圖A和B) PCR產(chǎn)物的大小(泳道l)仍保持 約1000 bp不變，因?yàn)橄瘞缀鯖](méi)有去除核苷酸。pCH-hulgl質(zhì)粒(泳道 2)被Hind III完全線性化(圖A)。在質(zhì)粒雙重消化中出現(xiàn)與PRC消化產(chǎn)物 大小相等的條帶(泳道2，圖B)，約為1000 bp。這是將用PCR產(chǎn)物替換 的質(zhì)粒部分，其包含新的BsiWI位點(diǎn)。
圖26. BsiW I用改變的切割位點(diǎn)消化pCH-huIgl。給pCH-hulgl添加BsiWI限制性位點(diǎn)以促進(jìn)H460-16-2 (其包含一個(gè)內(nèi)部的Hind III位點(diǎn))的 克隆。從改變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞分離質(zhì)粒，并用BsiWI消化以 確定是否并入了切割位點(diǎn)。除了泳道ll外，在每條泳道標(biāo)明克隆編號(hào)， 所述泳道11是未消化的對(duì)照質(zhì)粒(克隆#5)。除了 4和8外的所有克隆在 消化時(shí)被線性化，這證實(shí)它們包含新的切割位點(diǎn)?？寺?和8表現(xiàn)的與 未切割對(duì)照的泳道11 一樣，表明它們不包含新的切割位點(diǎn)。
圖27. pCL-huCk載體的質(zhì)粒示意圖。人Ck的恒定區(qū)位于Not I和 Xho I限制性位點(diǎn)之間?？勺儏^(qū)位于Nhe I和Not I位點(diǎn)之間。顯示了細(xì) 菌(氨芐青霉素)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(嘌呤霉素)的選^奪標(biāo)記物。該質(zhì)粒由G.R. McLean等提供。
圖28. Bgl II和Not I消化的pCL-huCk和H460-16-2 Vk。 pCL-huCk 質(zhì)粒(泳道l)和H460-16-2 Vk PCR產(chǎn)物(泳道2)用Bgl II和Not I消化以有 利于克隆。消化的質(zhì)粒(泳道l)表現(xiàn)為一條大分子量條帶，該條帶是質(zhì)粒 骨架，以及一條大約400 bp的條帶，該條帶是將被H460-16-2 Vk替換的 輕鏈可變區(qū)。H460-16-2 VkPCR產(chǎn)物(泳道2)也表現(xiàn)為約400bp,這是輕 鏈可變區(qū)的預(yù)期大小。
圖29. BsiW I和Nhe I消化的H460-16-2 Vh和pCH-huIgl。圖A顯 示450 bp處的BsiW I和Nhe I消化的H460-16-2 Vh PCR產(chǎn)物。圖B顯 示用BsiW I (泳道l)消化以及用BsiW I和Nhe I (泳道2)消化的 pCH隱huIgl。單一pCH匿huIgl消化(圖B，泳道l)表現(xiàn)為大分子量條帶， 而在雙重消化中是具有450bp插入物的大分子量條帶(圖B,泳道2)，其 對(duì)應(yīng)將被H460-16-2 Vh替換的重鏈可變區(qū)。
圖30. Bgl II和Not I消化的質(zhì)粒在1%瓊脂糖凝膠中電泳，所述質(zhì)粒 從pCL-huCk (H460-16-2 Vk)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分離。泳道上方的數(shù)字標(biāo)明 克隆編號(hào)。除了#1之外的所有克隆顯示對(duì)應(yīng)H460-16-2 Vk基因的期望的 約400 bp插入物。
圖31. BsiW I和Nhe I消化的質(zhì)粒在1.2°/。瓊脂糖凝膠中電泳，所述 質(zhì)粒從用pCH-hulgl (H460-16-2 Vh)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分離。泳道上方的數(shù) 字標(biāo)明克隆編號(hào)。所有克隆具有對(duì)應(yīng)H460-16-2 Vh基因的期望的450 bp 插入物。圖32. pNEF38表達(dá)載體(ICOS, Seattle, WA)的質(zhì)粒示意圖。利用Mlu I和Xba I限制性酶切位點(diǎn)，嵌合H460-16-2 Vk基因被克隆入多克隆位點(diǎn) (MCS)。該質(zhì)粒的選擇標(biāo)記物是新霉素抗性(NeoR)基因，其使轉(zhuǎn)染細(xì)胞具 有在Geneticin (G418石克酸鹽)存在條件下生長(zhǎng)的能力。
圖33. pDEF38表達(dá)載體(ICOS, Seattle, WA)的質(zhì)粒示意圖。利用Mlu I和Xba I限制性位點(diǎn)，嵌合H460-16-2 Vh基因被克隆入多克隆位點(diǎn) (MCS)。該質(zhì)粒的選擇標(biāo)記物是二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，其使轉(zhuǎn)染 的DHFR缺陷細(xì)胞具有在缺乏胸腺嘧咬核苷和次黃噤呤的條件下生長(zhǎng)的 能力。
圖34.改變限制性位點(diǎn)的H460-16-2 Vk(圖A)和Vh(囹B)PCR產(chǎn)物 分別在1.2°/。和1.0%瓊脂糖凝膠中電泳。嵌合輕鏈PCR反應(yīng)(圖A,泳道 l)在約800 bp產(chǎn)生一條單一條帶，其對(duì)應(yīng)輕鏈可變區(qū)(420 bp)和恒定區(qū) (320 bp)組合的預(yù)期大小。重鏈PCR反應(yīng)(圖B)在約1500 bp產(chǎn)生一條單 一條帶，其對(duì)應(yīng)重鏈可變區(qū)(450bp)和恒定區(qū)(990bp)兩者的預(yù)期大小。
圖35. Xba I和Mul I消化的質(zhì)粒所述質(zhì)粒從pNEF38 (H460-16-2 Vk) (圖A)和pDEF38 (H460-l6_2 Vh)(圖B)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分離。重鏈質(zhì)粒(圖 B)還用XbaI、 MulI和BsiWI三重消化(泳道1B、 2B、 4B和6B)。對(duì)于 輕鏈質(zhì)粒(圖A)，除了#3外的所有克隆都具有期望的750 bp插入物，其 對(duì)應(yīng)輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。對(duì)于重鏈質(zhì)粒，XbaI和MluI消化物(圖B， 泳道1A、 2A和6A)顯示1500 bp的插入物，其對(duì)應(yīng)重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。 Xba I、 Mlu I和BsiW I消化的重鏈質(zhì)粒(圖B,泳道1B、 2B和6B)在1000 bp和500 bp處顯示條帶，其分別對(duì)應(yīng)重鏈恒定區(qū)和可變區(qū)?？寺?(圖 B)根本不顯示條帶，標(biāo)明反應(yīng)設(shè)置存在問(wèn)題。
圖36. pNEF38(H460-16-2 Vk)和pDEF38(H460-16-2 Vh)克隆的原始 序列數(shù)據(jù)。
圖37. pMPGCR5 IgGl-Vk+hH460的圖謙。R&B poly A:兔卩-球蛋白 聚腺苷酰作用信號(hào)；phCMV:巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；Ad Tpl:腺病毒三聯(lián) 前導(dǎo)序列；P2 (6): cumate反式激活因子(cTA)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域； IgGl-VhH460: H460-16-2重4連的編碼序列；VkH460: H460-16-2輕鏈的 編碼序列。BKT3': BK病毒的大T抗原部分；TK:胸苷激酶；enhMPL:腺病毒主要晚期啟動(dòng)子的增強(qiáng)子。
圖38. pMPGCR5B43k的圖譜。 圖39. pkCR5B43G3的圖譜。
圖40.通過(guò)Western印跡對(duì)不同克隆產(chǎn)生的H460-16-2 (IgGl同種型) 的定量(泳道1-6:分別為0、 25、 50、 100、 150和200 ng的人IgG;泳 道7:克隆17;泳道8:克隆71;泳道9:克隆80;泳道10:克隆6'; 泳道11:克隆47，;泳道12:克隆147，；泳道13: 100 ng純的H460-16-2; 泳道14: IO微升雜交瘤血清)。
圖41.通過(guò)SDS-PAGE對(duì)不同克隆產(chǎn)生的H460-16-2 (IgGl同種型) 的定量(泳道l-5:分別為50、 100、 150、 200和0ng的人IgG ;泳道6: 克隆17;泳道7:克隆71;泳道8:克隆80;泳道9:克隆6，；泳道10: 克隆47，；泳道ll:克隆147，；泳道12: 100 ng細(xì)胞上清中的人IgG; 泳道13: 100 ng純的H460-16-2;泳道14: l(H鼓升雜交瘤血清)。
圖42. pMPGCR5VK+h460-IgG2的圖譜。R&B poly A:兔(3-球蛋白 聚腺苷酰作用信號(hào)；phCMV:巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；Ad Tpl:腺病毒三聯(lián) 前導(dǎo)序列；P2 (6): cumate反式激活因子(cTA)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域； Vh-H460IgG2: H460-16-2重鏈的編碼序列；Vk-H460: H460-16-2輕鏈 的編碼序列。BKT: BK病毒的大T抗原部^; TK:胸苦激酶；enhMPL: 腺病毒主要晚期啟動(dòng)子的增強(qiáng)子。
圖43.用于構(gòu)建H460-16-2的嵌合IgG2同種型的引物列表。
圖44.第一輪克隆后，western印跡檢測(cè)的H460-16-2的IgG2同種型 的表達(dá)。來(lái)源于篩選所得克隆的250 000個(gè)細(xì)胞重懸于500微升培養(yǎng)基。 置于37°C 24小時(shí)后，利用偶聯(lián)HRP的抗人抗體通過(guò)western印跡分析 IO微升上清。
圖45.在37。C將來(lái)源于不同亞克隆的細(xì)胞以5.0xl()S細(xì)胞/mL涂板。 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1.5至2.0xl()S細(xì)胞/mL時(shí)，它們被轉(zhuǎn)移到30°C置于30。C 7天后，通過(guò)SDS-PAGE繼之以考馬斯Fluor-Orange染色來(lái)分析指定量 的上清量。顯示了產(chǎn)生的抗體量(ng/微升)。
圖46.通過(guò)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞全細(xì)胞膜部分的Western印跡，對(duì) 嵌合(ch) ARH460-16-2-IgGl克隆的表征。圖47.通過(guò)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞全細(xì)胞膜部分的Western印跡，對(duì) 嵌合(ch) ARH460-16-2-IgG2克隆的表征。
圖48.通過(guò)SDS-PAGE繼之以考馬斯Fluo-Orange染料的染色，對(duì) CHOcTA克隆6'產(chǎn)生抗體的抗體濃度的分析。
圖49.通過(guò)SDS-PAGE繼之以考馬斯Fluo-Orange染料的染色，對(duì) 克隆40B7產(chǎn)生抗體的抗體濃度的分析。
圖50顯示人乳腺癌的小鼠模型中，H460-16-2、 (ch)ARH460-16-2-IgGl和(ch)ARH460-16-2-IgG2治療對(duì)肺瘤生長(zhǎng)的作用。胂瘤體積表示為 組平均值士SEM。垂直虛線指示給藥的第一天和最后一天。
圖51顯示研究期間單克隆抗體治療對(duì)體重的影響。體重表示為組平 均值± SEM。
圖52顯示兩個(gè)獨(dú)立的膜聯(lián)蛋白-V染色實(shí)驗(yàn)中獲得的鼠和嵌合 H460-16-2抗體的總凋亡作用。
發(fā)明詳述
下面用于概述、描述、實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)中的字詞或短語(yǔ)通常都 有其指定的含義。
術(shù)語(yǔ)"抗體"使用其最廣泛的涵義，且特別包括，例如單克隆抗體(包 括激動(dòng)劑、拮抗劑和中和抗體，脫免疫的、鼠的、嵌合的或人源化的抗 體)、攜帶有多表位特異性的抗體組合物、單鏈抗體、抗體的免疫偶聯(lián)物 和抗體片段(見(jiàn)下文)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的 抗體，也就是說(shuō)，包括這群抗體的單個(gè)抗體是相同的，除了可以少量存 在的可能的自然發(fā)生的變異。單克隆抗體針對(duì)單一抗原部位是高度特異 性的。而且，與包含針對(duì)不同決定基(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑 相比，每一種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一的決定基。除了特異性之外，
單克隆抗體在合成方面也是有優(yōu)勢(shì)的，其合成可以不受其他抗體的污染。 修飾語(yǔ)"單克隆的"指從基本同質(zhì)的抗體群中獲得的抗體的特征，而不能
解釋為需要通過(guò)任何特定方法的抗體產(chǎn)生。例如，本文使用的單克隆抗 體可以通過(guò)由Kohler " a/.， Atowe， 256:495 (1975)首次描述的雜交瘤(鼠或人)方法制備或由重組DNA方法制備(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第4,816,567 號(hào))。"單克隆抗體"也可以從噬菌體抗體文庫(kù)中分離，使用的技術(shù)在例如 Clackson ef a/., iV"^/re, 352:624- 628 (1991)禾口 Marks e/ a/， 《/ Mo/. B/o/, 222:581-597 (1991)中描述過(guò)。
"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結(jié)合區(qū)域或其 可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括非全長(zhǎng)的抗體、Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片 段；雙功能抗體(diabodies);線形抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體，單結(jié) 構(gòu)域抗體分子，融合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。
"完整"抗體指不但包含輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CO和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CHl、 CH2、 CH3,還包含結(jié)合抗原的可變區(qū)的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序 列的恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列的變體。 優(yōu)選地，完整抗體有一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)功能。
依據(jù)完整抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，完整抗體可以分為 不同的"種類" 主要有五類完整的抗體IgA、 IgD、 TgE、 IgG和IgM, 其中幾種可進(jìn)一步分成"亞類，，(同種型)，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2 。與不同種類抗體對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別被稱為a， S， e， y和|i。 不同種類的免疫球蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)和亞結(jié)構(gòu)是公知的。
抗體"效應(yīng)功能"指那些由抗體Fc區(qū)引起的(天然序列的Fc區(qū)或氨基 酸序列變體的Fc區(qū))的生物活性?？贵w效應(yīng)功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合； 補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用；Fc受體結(jié)合；抗休依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒 性作用(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)(例如B細(xì)胞受體；BCR) 等。
"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用"和"ADCC"指細(xì)胞介導(dǎo)的反 應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性的細(xì)胞毒細(xì)胞(例如自然殺傷(NK) 細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別結(jié)合在靶細(xì)胞上的抗體，隨后導(dǎo)致該 耙細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcYRin，而 單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、 FcyRII和FcyRIII。關(guān)于造血細(xì)胞FcR表達(dá)的總結(jié) 見(jiàn)Ravetch and Kinet， j麵.i ev. /畫(huà)畫(huà)/ 9:457-92 (1991傳464頁(yè)的表3。 為了測(cè)定目標(biāo)分子的ADCC活性，可以進(jìn)行例如美國(guó)專利5,500,362或 5,821,337描述的體外ADCC活性分析。用于這類分析的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞?？蛇x擇地或附加地，目標(biāo)分
子的ADCC活性可以在體內(nèi)評(píng)價(jià)，例如在諸如Clynes " a/. /W^S" (USA) 95:652-656 (1998)中/>開(kāi)的動(dòng)物才莫型中。
"效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcR、執(zhí)行效應(yīng)功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地， 這些細(xì)胞至少表達(dá)FcyRIII，并執(zhí)行ADCC效應(yīng)功能。介導(dǎo)ADCC的人 類白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核 細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞 可以從其天然來(lái)源中分離，例如從本文中描述的血液或PBMC中分離。
術(shù)語(yǔ)"Fc受體"或"FcR"用于描述結(jié)合于抗體Fe區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR 是天然序列的人類FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合于IgG抗體(y受體)的 受體，并包括FcyRI、 FcYRII和FcyRIII亞類的受體，其包括這些受體的 等位基因變體和可選擇的剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA ("激活性受 體")和FcyRIIB ("抑制性受體")，兩者的氨基酸序列相似，主要不同在于 其胞漿結(jié)構(gòu)域。激活性受體Fc丫RIIA在其胞漿結(jié)構(gòu)域含有基于免疫受體 酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受體FcyRIIB在其胞漿結(jié)構(gòu)域含有基 于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見(jiàn)綜述ML in Dagron,i ev. /畫(huà)畫(huà)/. 15:203-234 (1997)。 FcR綜述于Ravetch and Kinet， j畫(huà).觸 7mmzmo/ 9:457-92(1991); Capel w a/" 7w腦w頻e/Ws 4:25-34 (1994)和de Haas et al.， J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)"FcR，，包 括將來(lái)要被鑒定的FcR在內(nèi)的其他FcR。該術(shù)語(yǔ)也包括負(fù)責(zé)將母體的IgG 轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)的新生受體，F(xiàn)cRn(Guyer"a/" J /附ww"o/. 117:587(1976) 和Kim " "/., ￡w / /mmw"o/. 24:2429 (1994))。
"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用"或"CDC"指分子在補(bǔ)體存在下，裂解靶細(xì) 胞的能力。補(bǔ)體激活途徑通過(guò)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與交聯(lián)了同源抗 原的分子(比如，抗體)的結(jié)合而起始。為了評(píng)價(jià)補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行如 Gazzano-Santoro " a/.， 《/ /畫(huà)謂/. Me^is 202:163 (1996)中描述的CDC 分析。
術(shù)語(yǔ)"可變的"指可變結(jié)構(gòu)域某些部分的序列在抗體間高度不同，并 用于每一種特定抗體與其特定抗原的結(jié)合及其特異性。然而，變化并不
是均勻分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)。在輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)，變化集中在所謂的高度可變區(qū)的三個(gè)區(qū)域內(nèi)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域內(nèi)更加高度保守 的部分被稱為骨架區(qū)(FR)。每個(gè)天然的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，包含主
要采用(3-片層構(gòu)型的四個(gè)FR，其由三個(gè)高度可變區(qū)連接在一起，形成環(huán) 狀連接，在一些情況下形成部分>片層結(jié)構(gòu)。每條鏈的高度可變區(qū)由FR 以密切靠近的方式結(jié)合一起，并與其他鏈的高度可變區(qū)一起，有助于抗 體的#元原結(jié)合部4立的形成(參見(jiàn)Kabat S^^e"ces 尸ra/ez'ra
7wmwm /og/ca/ /"&reW("^iC夢(mèng)《^^蛋《的y^/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， Md. (1991 ))。恒定結(jié)構(gòu)域并 不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，而是表現(xiàn)各種效應(yīng)功能，例如參與抗體 在抗體依賴性的細(xì)胞毒效應(yīng)(ADCC)中的作用。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"高度可變區(qū)"指抗體上負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的氨基酸殘 基。高度可變區(qū)通常包括"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈 可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基24-34 (Ll)、 50-56 (L2)和89-97 (L3)及重鏈可變 結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基31-35 (Hl)、 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat " a/， iSegwewcey o/ /VofezTw o/ Twwwwo/og/ca/ /",ew/(^瘦夢(mèng)^標(biāo)蛋^^^/力, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))和/或"高變環(huán)"區(qū)的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的殘基2632 (Ll)、 50-52 (L2)和91-96 (L3)及重鏈可變結(jié)構(gòu)域的26-32 (Hl)、 53-55 (H2) 和96-101 (H3); Chothia and Lesk /Mo/歷o/. 196:901-917(1987))。"骨架 區(qū)"或"FR"殘基指除了本文定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)的殘基。 木瓜蛋白酶水解抗體產(chǎn)生了兩個(gè)相同的被稱為"Fab"片段的抗原結(jié)合片 段和一個(gè)殘余的"Fc"片段，每個(gè)"Fab"片段都有單一的抗原結(jié)合部位，"Fc" 片段的名稱反映了其易結(jié)晶的能力?？贵w經(jīng)胃蛋白酶處理后，產(chǎn)生F(ab')2 片段，其有兩個(gè)抗原結(jié)合部位，仍能夠與抗原交聯(lián)。
"Fv"是包含完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合部位的最小抗體片段。此區(qū) 域由以非共價(jià)鍵的方式緊密結(jié)合的一條重鏈和一條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二 聚體構(gòu)成。以這種每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用的構(gòu)型決定 Vh-Vl 二聚體表面的抗原結(jié)合部位。六個(gè)高變區(qū)域共同賦予了抗體的抗原 結(jié)合特異性。然而，即便單一的可變結(jié)構(gòu)域(或只含有三個(gè)抗原特異性高 變區(qū)的一半的Fv)仍能夠識(shí)別和結(jié)合抗原，雖然比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和性低。Fab片段也含有輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。 Fab' 片段與Fab片段的不同在于重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端多了幾個(gè)氨基酸 殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH在本文中指 代Fab'，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基至少攜帶一個(gè)游離的硫基。最 初的F(ab')2抗體片段以Fab'片段對(duì)產(chǎn)生，之間有鉸鏈的半胱氨酸。其他 的抗體片段的化學(xué)偶聯(lián)也是公知的。
來(lái)自任意脊推動(dòng)物的抗體的"輕鏈"都可以歸于兩種截然不同的所謂 k和人鏈中的一種，k和X鏈的分類基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
"單鏈Fv，，或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和Vl結(jié)枸域，其中這些 結(jié)構(gòu)域存在于單一的多肽鏈上。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含Vh和Vl結(jié) 構(gòu)域之間的多肽連接子，使scFv形成適于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv 的綜述參見(jiàn)Pliickthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(單克 隆抗體藥理學(xué))，vol. 113, Rosenburg and Moore eds.， Springer-Verlag, New York, pp. 269- 315 (1994)。
術(shù)語(yǔ)"雙功能抗體(Diabodies)"指帶有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體 片段，其在相同多肽鏈上(vh-v。含有與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VO結(jié)合的重鏈 可變結(jié)構(gòu)域(vh)。使用連接子，該連接子過(guò)短不能在同一條鏈上使兩個(gè)結(jié) 構(gòu)域成對(duì)，這些結(jié)構(gòu)域;故迫與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此產(chǎn)生 了兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如在EP 404,097; WO 93A1161;和Hollinger w a/.,尸rac. A^/Jcad. 5W. t/&4， 90:6444-6448 (1993)中對(duì)于雙功能抗體作了 更詳細(xì)的描述。
"分離"抗體是指從其天然環(huán)境的組分中鑒別、分離和/或回收的抗體。 其天然環(huán)境下的污染成分是指干擾抗體診斷或治療性用途的物質(zhì)，可能 包括酶、激素和其它的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境中 的至少 一種組分將不存在，所以分離抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)部的原位抗體。 但是，通常分離抗體會(huì)經(jīng)過(guò)至少一步的純化步驟來(lái)制備。
"結(jié)合"目的抗原(例如，CD44抗原部分)的抗體是指能夠?qū)υ摽乖?分有充分親和力的抗體，以致該抗體在耙向表達(dá)該抗原的細(xì)胞時(shí)，可以 作為治療劑。如果抗體是結(jié)合CD44抗原部分的抗體，那么它通常會(huì)優(yōu) 先結(jié)合CD44抗原部分，而不是其它受體，這不包括諸如非特異性的Fc接觸的偶然結(jié)合或與其他抗原共有的翻譯后修飾成分結(jié)合，該抗體不會(huì) 與其他蛋白有明顯的相互作用。檢測(cè)與目的抗原結(jié)合的抗體的方法在本
領(lǐng)域中是公知的，可包括但并不局限于諸如FACS、細(xì)胞ELISA和Western 印跡等分析。
如本文使用的，"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"、"細(xì)胞培養(yǎng)物"的表述可以交替使 用，所有這些用法都包括其子代。也可以理解為由于人為的或非人為的 突變，所有的子代在DNA組成上不可能完全相同。在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)篩 選的有相同功能或生物學(xué)活性的突變子代包括在內(nèi)。在上下文中，將清 楚地有意使用不同的指代。
"治療，，既指治療性處理，也指預(yù)防性或防止的措施，其目的就是預(yù) 防或減緩(減輕)靶向的病理狀態(tài)或病癥。需要治療的個(gè)體不僅包括那些將 發(fā)展為該病癥的或欲對(duì)其病癥進(jìn)行預(yù)防的個(gè)體，還包括那些已經(jīng)存在所 述病癥的個(gè)體。因此，本文中欲被治療的哺乳動(dòng)物可已經(jīng)被診斷為患有 該病癥或可傾向于或易感于該病癥。
術(shù)語(yǔ)"癌癥"和"癌性"是指或描述哺乳動(dòng)物的生理狀態(tài)，其典型特征是 細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡不受調(diào)控。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細(xì) 胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性胂瘤。這些癌癥更多具體的實(shí)例包括鱗 狀細(xì)胞癌(例如鱗狀上皮細(xì)胞癌)，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺 癌和肺鱗癌的肺癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，包括胃腸道癌的胃癌，胰腺癌， 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝臟癌癥，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺 癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺紳瘤， 腎癌，前列腺癌，外陰腫瘤，曱狀腺癌，肝癌，肛癌，陰莖癌，還有頭 頸部癌。
"化療劑"是可用于癌癥治療的化合物。化療劑的實(shí)例包括諸如噻 替派和環(huán)磷酖胺(CYTOXANTM)的烷化劑；例如白消安(hisilfa,n)、英丙舒 凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯類；如苯佐替派 (benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、烏瑞替派(uredopa)的氮丙 啶類；包括六曱蜜胺，曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺、 三亞乙基硫代磷酰胺和三曱基奧羅蜜胺(trimethylolomelamine)在內(nèi)的乙 烯亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamine); 如瘤可寧(chlorambucil)、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺、 氮芥(mechlorethamine)、鹽酸曱氧氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、 苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀(uracil mustard) 等氮芥類藥物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、 雷莫司汀等硝脲類(nitrosureas);如阿克拉霉素類、放線菌素、安曲霉素、 重氮絲氨酸、博來(lái)霉素、放線菌素C、加里剎霉素、洋紅霉素、碳霉素 (camomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托咪定、 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依達(dá)比星、 麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、灰霉素、 potfiromycin、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、 殺結(jié)核菌素、烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星類的抗生素；甲氮碟呤和 5-氟尿嘧啶(5-FU)類抗代謝類藥；如二曱葉酸、氨曱喋呤、蝶羅呤、三曱 曲沙等葉酸擬似物；如氟達(dá)拉濱、6-巰噤呤、碌^米噤呤、硫鳥(niǎo)嘌呤類嘌呤 類似物；如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫 氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU等嘧啶類似物；如卡魯 睪酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯酮等男性激素類藥 物；如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦等抗腎上腺類藥物；如亞葉酸等葉 酸補(bǔ)充物；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶； bestrabucil;比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥(niǎo) 氨酸；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明； 米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶；噴司他?。坏鞍钡?；吡 柔比星；足葉草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；鍺螺 胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2',2"-三氯三乙胺；烏拉坦；長(zhǎng)春地 辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(泰素， Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)和多西他賽(泰素帝， Aventis, Rhone-Poulenc Rorer， Antony, France)等紫杉坑類；苯丁酸氮芥； 吉西他濱；6-硫鳥(niǎo)"票呤；巰噤呤；曱氨蝶呤；如順鉑和卡鉑等鉑類似物； 長(zhǎng)春堿；柏；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌； 長(zhǎng)春新i成；長(zhǎng)春瑞濱；去曱長(zhǎng)春堿；諾消靈(novantrone);替尼泊香；柔紅霉素；氨蝶呤鈉；希羅達(dá)；伊班膦酸鈉；CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑 RFS2000; 二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO);視黃酸； espemmicins; 卡培他濱； 以及上述任一種藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。調(diào)節(jié)或抑制激 素對(duì)腫瘤作用的抗激素類藥物也包括在本定義內(nèi)，像抗雌激素藥物，例 如，包括它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制劑4(5)-咪唑、4-羥基他莫 昔芬、曲沃昔芬、雷諾昔芬、LY117018、奧那司酮、托瑞米芬(法樂(lè)通)； 抗雄激素物質(zhì)，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林、戈舍瑞 林；以及上述任一種藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
用于治療目的的"哺乳動(dòng)物"指任何一種可歸于哺乳類的動(dòng)物，包括 人類、小鼠、免疫缺陷鼠或棵鼠或品系小鼠、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物及動(dòng)物園 內(nèi)的動(dòng)物、體育動(dòng)物或?qū)櫸?，比如綿羊、狗、馬、貓、母牛等。優(yōu)選地， 本文的哺乳動(dòng)物指人類。
"寡核苦酸"指短長(zhǎng)度、單鏈或雙鏈多聚脫氧核芬酸，其可利用已知 的方法化學(xué)合成(例如磷酸三酯、亞磷酸鹽、亞磷酰胺化學(xué))，利用例如發(fā) 表于1988年5月4日的EP 266,032描述的固相技術(shù)；或利用Froehler Wa/, M/c/.爿c/A i 仏，14:5399-5407， 1986描述的脫氧核香H-磷酸鹽中間物。然 后用聚丙烯酰胺凝膠純化。
除非另外指出，當(dāng)在本文使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"CD44抗原部分"是指單鏈透 明質(zhì)酸(HA)結(jié)合糖蛋白，其還稱為透明質(zhì)酸受體、H-CAM、 gp85和 Hermss。
誘導(dǎo)"凋亡，，的抗體是誘導(dǎo)程序化細(xì)胞死亡的抗體，所述程序化細(xì)胞 死亡由膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合、DNA的斷裂、細(xì)胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞 破碎和/或膜嚢(稱為凋亡體)的形成來(lái)確定。
本文的單克隆抗體特別包括"嵌合"抗體，其部分重鏈和/或輕鏈與來(lái) 自特定種屬或者屬于特定抗體種類或者亞類的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同或者 同源，同時(shí)鏈上余下序列與來(lái)源于另一種屬或者屬于另一種類或者亞類 的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同或者同源，此外還指這些抗體的片段，只要這些 片段能夠表現(xiàn)出所需的生物活性(美國(guó)專利4,816,567和Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。
非人類(例如鼠)抗體的"人源化，，形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv， Fab, Fab', F(ab)2或抗體的其他抗原結(jié)合序 列)，其包含來(lái)源自非人免疫球蛋白的最小序列。在絕大多數(shù)情況下，人 源化抗體是人的免疫球蛋白(受者抗體)，其中，所述受者抗體的互補(bǔ)決定 區(qū)(CDR)的殘基被諸如具有所需的特異性、親和力、能力的小鼠、大鼠或 兔等的非人類抗體(供者抗體)的CDR的殘基所替代。在一些情況下，人 類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類FR殘基所替代。此 外，人源化抗體可以包括既不在受者抗體也不在引入的CDR或FR序列 的殘基。這些修飾進(jìn)一步改善和優(yōu)化了抗體的性能。通常，人源化抗體 包括至少一個(gè)，通常是兩個(gè)可變區(qū)的基本上全部，其中全部或基本上全 部的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，且全部或基本上全部的 FR殘基是人類免疫球蛋白共有序列的FR殘基。人源化抗體也最適宜包 含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人類免疫球蛋白的恒定 區(qū)。
"脫免疫化"抗體是對(duì)給定的物種沒(méi)有免疫原性或免疫原性較差的免 疫球蛋白。通過(guò)改造抗體的結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)脫免疫化。任何本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的脫免疫化技術(shù)都可以使用。例如，在發(fā)表于2000年6月15日 的WO 00/34317中，描述了 一項(xiàng)使抗體脫免疫原性的適當(dāng)?shù)募夹g(shù)。
"同源性"凈皮定義為比對(duì)序列和必要時(shí)引入間隔，以實(shí)現(xiàn)最大百分比 同源性后，氨基酸序列變體中相同殘基的百分比。用于比對(duì)的方法和計(jì) 算機(jī)程序是本領(lǐng)域公知的。
本說(shuō)明書(shū)自始至終，將雜交瘤細(xì)胞系以及從其產(chǎn)生的分離的單克隆 抗體，通過(guò)其固有命名法而分別稱作H460-16-2和AR37A335.8,或者用 保藏命名，分別稱作ATCC保藏號(hào)PTA-4621或者IDAC 280104-06。
本文使用的"配體，，包含對(duì)靶抗原顯示結(jié)合特異性的部分，其可以是 完整的抗體分子和至少具有抗原結(jié)合區(qū)或者其部分(即，抗體分子的可變 部分)的任意分子，例如，F(xiàn)v分子，F(xiàn)ab分子，F(xiàn)ab'分子，F(xiàn)(ab')2分子， 雙特異抗體，融合蛋白，或者任意遺傳工程化分子，所述分子特異識(shí)別 并結(jié)合與分離的單克隆抗體結(jié)合的抗原，所述單克隆抗體由命名為ATCC 保藏號(hào)PTA-4621或者IDAC 280104-06 (ATCC PTA-4621或者IDAC 280104-06抗原)的雜交瘤細(xì)月包系產(chǎn)生。本文使用的"抗原結(jié)合區(qū)"表示識(shí)別靶抗原的分子的部分。
本文使用的"竟?fàn)幮砸种?，，表示能夠識(shí)別并結(jié)合決定簇位點(diǎn)，在常規(guī)
抗體相互竟?fàn)幏治鲋?，由命名為PTA-4621或者IDAC 280104-06的雜交 瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體(PTA-4621或者IDAC 280104-06抗體)針對(duì)所 述決定蔟位點(diǎn)(Belanger L， Sylvestre C. and Dufour D. (1973)， Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竟?fàn)幒蛫A心法的甲胎蛋白的酶聯(lián)免疫測(cè)定).Clinica Chimica Acta 48， 15)。
本文使用的"靶抗原"是PTA-4621或者IDAC 280104-06抗原或者其 部分。
如本文所用，"免疫偶聯(lián)物，，指以化學(xué)或生物學(xué)方式與細(xì)胞毒素、放 射性試劑、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療劑結(jié)合的諸如抗體的任何分子或 配體。該抗體可以在所述分子的任一部位與細(xì)J包毒素、》支射性試劑、抗 腫瘤藥或治療劑連接，只要它能夠與其靶標(biāo)結(jié)合。免疫偶聯(lián)物的實(shí)例包 括抗體毒素化學(xué)偶聯(lián)物和抗體-毒素融合蛋白。
如本文所用，"融合蛋白"指任一嵌合蛋白，其中，抗原結(jié)合區(qū)與例 如毒素、酶或蛋白藥物的生物活性分子連接。
為了更充分理解本文中描述的發(fā)明，進(jìn)行下述說(shuō)明。
本發(fā)明提供配體(即，PTA-4621或者IDAC 280104-06配體)，其特異 識(shí)別并結(jié)合PTA-4621或者IDAC 280104-06抗原。
本發(fā)明的配體可以釆用任何形式，只要它具有抗原結(jié)合區(qū)，所述抗 原結(jié)合區(qū)竟?fàn)幮砸种齐s交瘤PTA-4621或者IDAC 280104-06產(chǎn)生的單克 隆抗體與其耙抗原的免疫特異結(jié)合。因此，與IDAC 280104-06抗體具有 相同結(jié)合特異性的任意重組蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗體與諸如 淋巴因子或者腫瘤抑制生長(zhǎng)因子的另 一蛋白結(jié)合)也屬于本發(fā)明的范圍。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述配體是PTA-4621或者IDAC 280104-06抗體。
在其他實(shí)施方案中，所述配體是抗原結(jié)合片段，其可以是具有 PTA-4621或者IDAC 280104-06抗體的抗原-結(jié)合區(qū)的Fv分子(例如單鏈 Fv分子)、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、融合蛋白、雙特異抗體、異種抗體或者任意重組分子。本發(fā)明的配體針對(duì)PTA-4621或者IDAC 280104-06單克隆抗體針對(duì)的表位。
本發(fā)明的配體可以被修飾，即，通過(guò)分子內(nèi)的氨基酸修飾，從而產(chǎn) 生衍生物分子。化學(xué)修飾也是可能的。
衍生物分子將保留所述多肽的功能性性質(zhì)，即，具有這類取代的分 子將仍然允許所述多肽與PTA-4621或者IDAC 280104-06抗原或者其部 分結(jié)合。
這些氨基酸取代包括在本領(lǐng)域中公知的"保守"氨基酸取代，但并不 局限于此。
舉例來(lái)說(shuō)，某些被稱為"保守氨基酸取代"的氨基酸取代能夠在蛋白 中經(jīng)常出現(xiàn)，但并不改變?cè)摰鞍椎臉?gòu)象或功能，這是蛋白質(zhì)化學(xué)中已建 立的法則。
這些改變包括任一異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)取代任何其他 的疏水氨基酸；天門(mén)冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q) 取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)，反之亦然。 其他的取代也可被認(rèn)為是保守的，這取決于特定氨基酸的環(huán)境和其在蛋 白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可經(jīng)?；Q，丙氨 酸和纈氨酸(V)也是。相對(duì)疏水的曱石克氨酸(M)可經(jīng)常與亮氨酸和異亮氨 酸互換，有時(shí)與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)經(jīng)常互換，其發(fā)生部 位氨基酸殘基的明顯特征是其帶電，這兩種氨基酸殘基的不同pK的差別 并不明顯。在特定情境下，仍有其他的一些變化可以被認(rèn)為是"保守的"。
給定一種抗體，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以生成竟?fàn)幮砸种婆潴w，例 如竟?fàn)幮钥贵w，其可識(shí)別相同的表位(Belanger & "/., 1973)。 一種方法是 用表達(dá)該抗體識(shí)別抗原的免疫原產(chǎn)生免疫，該樣品可以包括組織、分離 的蛋白或細(xì)胞系，但并不局限于這些?？梢杂镁?fàn)幮苑治龊Y選產(chǎn)生的雜 交瘤，該分析能鑒定抑制所檢測(cè)抗體結(jié)合的抗體，所述分析例如ELISA、 FACS或免疫沉淀。另一種方法可以利用噬菌體展示文庫(kù)，淘選識(shí)別所述 抗原的抗體(Rubinstein"a/., 2003)。在任一情況下，雜交瘤的選擇都是基 于它們的竟?fàn)庍^(guò)原抗體與其靶抗原的結(jié)合的能力。因此，這些雜交瘤的 特征是識(shí)別與所述原抗體相同的抗原，并且這些雜交瘤將更為特異地識(shí)別同樣的表位。 實(shí)施例1
雜交瘤制備-雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R37A335.8
依據(jù)布達(dá)佩斯條約，雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R37A335.8于2004年1月28 日保藏于加拿大國(guó)際微生物保藏單位(IDAC),位于加拿大馬尼托巴省 R3E 3R2溫尼伯市阿林頓潛f道1015的加拿大衛(wèi)生部微生物局，保藏號(hào)為 280104-06。依據(jù)37 CFR 1.808的規(guī)定，保藏者保證在專利授權(quán)時(shí)將不可 撤銷地取消對(duì)公眾獲取該保藏材料的所有限制。
為了制備產(chǎn)生抗癌抗體AR37A335.8的雜交瘤，在PBS中制備新鮮 的PC-3前列腺癌細(xì)胞系的單細(xì)胞懸液，所述PC-3前列腺癌細(xì)胞系已經(jīng) 在SCID小鼠中生長(zhǎng)為實(shí)體瘤。將IMMUNEASY (Qiagen, Venlo， Netherlands)佐劑輕輕混合后備用。通過(guò)皮下注射含2百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的50微 升抗原-佐劑來(lái)免疫五到七周齡的BALB/c小鼠。初次免疫后2和5周， 用新鮮制備的含2百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的50微升抗原-佐劑腹腔注射加強(qiáng)免疫小 鼠。末次免疫后第3天，取出脾臟用于融合。將分離的脾細(xì)胞與NSO-l 骨髓瘤細(xì)胞伴侶融合，制備雜交瘤。檢測(cè)雜交瘤亞克隆融合的上清。
為了檢測(cè)雜交瘤分泌的抗體是IgG,還是IgM同種型，進(jìn)行ELISA 分析。將4。C包被緩沖液(0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH9.2-9,6)中的 濃度為2.4 pg/ml的山羊抗小鼠的IgG + IgM (H+L)，按100 pl/孔加入 ELISA板過(guò)夜。該ELISA板用洗滌緩沖液(PBS + 0.05% Tween)洗三次。 按IOO (il/孔加入封閉緩沖液(5。/。奶洗滌緩沖液)，室溫1小時(shí)，隨后用洗 滌緩沖液洗三次。按100 pl/孔加入雜交瘤上清，將該板室溫孵育1小時(shí)。 該板用洗滌緩沖液洗三次，按100 iliI/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣 根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物的1/100,000稀釋液(用含5%奶的PBS稀釋)。室溫 孵育l小時(shí)后，該板用洗滌緩沖液洗三次。按100pl/孔加入TMB溶液， 室溫孵育1-3分鐘。按100 (il/孔加入2M H2S04,終止顏色反應(yīng)，用 Pcrkin-Elmcr HTS7000讀板儀在450 nm處讀板。如圖1所示'AR37A335.8 雜交瘤主要分泌IgG同種型抗體。
為了確定雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的亞類，使用小鼠單克隆抗體分型試劑盒(GE Healthcare, Piscataway, NJ)進(jìn)行分型實(shí)驗(yàn)。向檢測(cè)管中添加包含 抗體的雜交瘤上清(用TBS-T 1:10稀釋)，所述檢測(cè)管包含載有對(duì)不同類 型肽鏈特異的山羊抗體的分型檢測(cè)條。將檢測(cè)管搖動(dòng)15分鐘。邊搖動(dòng)邊 用TBS-T清洗檢測(cè)條兩次，每次5分鐘。向檢測(cè)管中添加過(guò)氧化物酶標(biāo) 記的、種特異性的抗小鼠抗體(用TBS-T l:500稀釋)15分鐘以測(cè)定與檢測(cè) 條上山羊抗體結(jié)合的單克隆抗體。邊搖動(dòng)邊用TBS-T再清洗檢測(cè)條兩 次，每次5分鐘。然后利用過(guò)氧化物酶底物系統(tǒng)檢測(cè)與檢測(cè)條結(jié)合的過(guò) 氧化物酶標(biāo)記抗體。在10 mL冰乙醇中溶解一顆4-氯-l-萘酚的30 mg片 劑，并在50 mL TBS中稀釋一滴過(guò)氧化氫溶液(30% v/v)。這兩種溶液僅 在使用前直接混合，邊攪拌邊向分型檢測(cè)條中添加3 mL 15分鐘。然后 倒掉底物溶液，邊攪拌邊用5mL蒸餾水清洗檢測(cè)條三次。然后從檢測(cè)管 中取出分型檢測(cè)條并分析結(jié)果。抗癌抗體AR37A335.8是IgG2b， X同種 型。
經(jīng)過(guò)一輪有限稀釋，在細(xì)胞ELISA分析中，檢測(cè)雜交瘤上清中與靶 細(xì)胞結(jié)合的抗體。檢測(cè)了 2種前列腺癌細(xì)胞系，和1種人正常皮膚細(xì)胞 系分別是PC-3、 LnCap和CCD-27sk。涂板的細(xì)胞在使用前先固定。室 溫下，該板用包含MgCl2和CaCl2的PBS洗滌三次。每孔加PBS稀釋的 2%多聚甲醛100 fJ，室溫10分鐘，然后倒掉。室溫下，該板用包含Mg(Ji2 和CaCl2的PBS再洗滌三次。每孔加100 (J溶于洗滌緩沖液(PBS + 0.05% Tween)的5%奶進(jìn)行封閉，室溫1小時(shí)。該板用洗滌緩沖液洗三次，按 75 (il/孔加入雜交瘤上清，室溫孵育1小時(shí)。用洗滌緩沖液將該板洗三次， 按100 pl/孔加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠的IgG抗體的 1/25,000稀釋液(用含5%奶的PBS稀釋)。室溫孵育l小時(shí)后，該板用洗 滌緩沖液洗三次，每孔加入100|ilTMB底物，室溫孵育1-3分鐘。每孔 加入100 jil 2M H2S04終止反應(yīng)，用Perkin-Elmer HTS7000讀板儀在450 nm處讀板。如圖i列表所示，結(jié)果表示為與實(shí)驗(yàn)室制備(in-house)的IgG 同種型對(duì)照相比，高出背景的倍數(shù)，事先已經(jīng)證明該對(duì)照不與所檢測(cè)的 細(xì)胞系結(jié)合 來(lái)源于雜交瘤AR37A335.8的抗體顯示與前列腺癌細(xì)胞系 PC-3和皮膚細(xì)胞系CCD-27sk的實(shí)質(zhì)結(jié)合。AR37A335.8不顯示與另一種 前列腺癌細(xì)胞系LnCap的任意可檢測(cè)結(jié)合。進(jìn)行抗體結(jié)合試驗(yàn)的同時(shí)，在相同細(xì)胞系PC-3、 LnCap和CCD-27sk 中檢測(cè)了雜交瘤上清的細(xì)胞毒性作用。4丐黃綠素(calcein) AM購(gòu)自 Molecular Probes (Eugene, OR)。按照下面列出的變化根據(jù)制造商的說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行分析。所述分析前將細(xì)胞以預(yù)定的合適密度進(jìn)行涂板。2天后，將 來(lái)自雜交瘤微量滴定板的100微升上清轉(zhuǎn)移到細(xì)胞板，在5% C02培養(yǎng)箱 中孵育5天。將陽(yáng)性對(duì)照孔吸凈，加入100 (al疊氮鈉(NaN3)或者放線菌 酮。經(jīng)過(guò)5天處理后，翻轉(zhuǎn)倒空所述板的液體并吸干。通過(guò)多通道擠瓶 將室溫下包含MgCl2和CaCl2的DPBS (Dulbecco's石壽酸鹽緩沖液)分入每 個(gè)孔中，敲3次，翻轉(zhuǎn)倒空，然后吸干。將用包含MgCl2和CaCl2的DPBS 稀釋的50微升熒光4丐黃綠素染料添加到每個(gè)孔中，在5% C02培養(yǎng)箱中 37°C孵育30分鐘。Perkin-Elmer HTS7000焚光讀板儀讀板，數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel進(jìn)4亍分析。結(jié)果列表于圖1。 AR37A335.8雜交瘤在LnCap 細(xì)胞中產(chǎn)生16%的特異細(xì)胞毒性，這分別是從陽(yáng)性對(duì)照疊氮鈉和放線菌 酮得到的細(xì)胞毒性的21%和30°/。。圖1的結(jié)果表明AR37A335.8的細(xì)胞 毒性作用不與其對(duì)癌細(xì)胞類型的結(jié)合水平成正比。盡管PC-3細(xì)胞中的結(jié) 合水平更高，但是與PC-3細(xì)胞相比，LnCap細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性水平 更高。因此，結(jié)合不是必然預(yù)示著抗體與其同源抗原連接的結(jié)果，而是 一種不確定的發(fā)現(xiàn)。這表明不同細(xì)胞中抗體連接的環(huán)境確定細(xì)胞毒性， 而不僅僅是抗體結(jié)合。如圖l所示，AR37A335.8在CCD-27sk正常細(xì)胞 系中不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。已知的非特異性的細(xì)胞毒性劑放線菌酮和NaN3產(chǎn) 生了預(yù)期的細(xì)胞毒性。
實(shí)施例2
抗體制備
通過(guò)在CL-1000瓶(BD Biosciences, Oakville， ON)中培養(yǎng)雜交瘤來(lái)制 備AR37A335.8單克隆抗體，每周兩次收集和再接種。然后是利用Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC)的標(biāo)準(zhǔn)抗 體純化步驟。利用人、脫免疫、人源化、嵌合或者鼠的單克隆抗體也在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。
細(xì)胞毒性分析中，AR37A335.8與大量陽(yáng)性(抗-EGFR (C225， IgGl， k，5孩吏克/mL， Cedarlane， Hornby, ON)、方文線菌酮(CHX, 0.5樣i摩爾，Sigma, Oakville， ON)和NaN3 (0.1%， Sigma, Oakville， ON))和陰性(MPC-11(抗原 特異性未知的，IgG2b, k, 20微克/mL， BD Biosciences, Oakville, ON))對(duì) 照，以及緩沖液稀釋的對(duì)照進(jìn)行比較(圖2)。檢測(cè)結(jié)腸(DLD-1和Lovo)、 印巢癌(OVCAR-3)和非癌肺(Hs888丄u)細(xì)胞系(均來(lái)自ATCC， Manassas， VA)。 4丐黃綠素AM購(gòu)自Molecular Probes (Eugene, OR)。按照下面列出 的變化根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行分析。所述分析前將細(xì)胞以預(yù)定的合適 密度進(jìn)行涂板。2天后，將100微升純化的抗體或者對(duì)照用培養(yǎng)基稀釋， 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞板，在5% C02培養(yǎng)箱中孵育5天。然后將板翻轉(zhuǎn)倒空， 吸干。通過(guò)多通道擠瓶將室溫下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每個(gè)孔 中，輕敲3次，翻轉(zhuǎn)倒空，然后吸干。將用包含MgCl2和CaCl2的DPBS 稀釋的50 熒光鈣黃綠素染料添加到每個(gè)孔中，在5% C02培養(yǎng)箱中 37°C孵育30分鐘。Perkin-Elmer HTS7000焚光讀板儀讀板，數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel進(jìn)行分析，結(jié)果列表于圖2。每種抗體得到5至50的分 數(shù)，其基于按一式三份的4個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察到的平均細(xì)胞毒性，以及得到25 至100的分?jǐn)?shù)，其基于分析間所觀察到的可變性。這兩種分?jǐn)?shù)(細(xì)胞毒性 分?jǐn)?shù))的總和顯示于圖2。大于或者等于55的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)被認(rèn)為對(duì)所測(cè) 細(xì)胞系是陽(yáng)性的。相對(duì)于同種型和緩沖液陰性對(duì)照，AR37A335.8抗體在 Lovo和DLD-1結(jié)腸癌細(xì)胞系中產(chǎn)生細(xì)胞毒性。AR37A335.8抗體在 OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系中不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。重要的是，AR37A335.8不 產(chǎn)生抗非癌細(xì)胞系Hs888丄u的特異細(xì)胞毒性，表明該抗體是對(duì)癌細(xì)胞特 異的 和預(yù)期的一樣，化學(xué)細(xì)胞毒劑誘導(dǎo)其非特異的細(xì)胞毒性。
利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)評(píng)價(jià)AR37A335.8抗體與上述癌癥和正常人 細(xì)胞系的結(jié)合。首先用0 88(不含〔3++和]^8++)洗涂細(xì)胞單層來(lái)制備用于 FACS的細(xì)胞。然后在37°C使用細(xì)胞離解緩沖液(INVITROGEN， Burlington, ON)從細(xì)胞培養(yǎng)板移出細(xì)胞。經(jīng)離心和收集后，細(xì)胞重懸于4。C 的包含MgCl2、 CaCl2和2。/。胎牛血清的DPBS(染色培養(yǎng)基)并計(jì)數(shù)，等分 到合適的細(xì)胞密度，離心以沉淀所述細(xì)胞，并在20昭/mL待測(cè)抗體 (AR37A335.8)或者對(duì)照抗體(同種型對(duì)照，抗-EGFR)存在的條件下重懸于 4°C的染色培養(yǎng)基，冰上30分鐘。在添加Alexa Fluor 488偶聯(lián)的二抗前，用染色培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。然后添加溶于染色培養(yǎng)基的Alexa Fluor 488 偶聯(lián)抗體30分鐘。然后最后一次洗滌細(xì)胞，重懸于固定培養(yǎng)基(包含1.5% 多聚曱醛的染色培養(yǎng)基)。使用CellQuest軟件(BD Biosciences, Oakville， ON)在FACScan上運(yùn)行樣品來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的流式細(xì)胞采集。通過(guò)調(diào)節(jié)FSC 和SSC檢測(cè)器上的電壓和振幅來(lái)設(shè)置細(xì)胞的前散射(FSC)和側(cè)散射 (SSC)。通過(guò)使用只用Alexa Fluor 488偶聯(lián)的二抗染色的細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)熒光 通道(FITC)的檢測(cè)器，以便細(xì)胞具有一致的峰，且中位熒光強(qiáng)度約為1-5 單位。對(duì)于每種樣品，獲得大約10,000個(gè)染色的固定細(xì)胞用于分析，結(jié) 果顯示于圖3。
圖3以高于同種型對(duì)照的倍增來(lái)表示平均熒光強(qiáng)度。AR37A335.8抗 體的代表性直方圖匯編為圖4 。 AR3 7A335.8顯示結(jié)合全部的被測(cè)細(xì)胞系。 這些數(shù)據(jù)證明AR37A335.8顯示功能特異性，因?yàn)楸M管AR37A335.8與所 有被測(cè)的癌癥類型存在明顯的結(jié)合，但其只存在與Lovo和DLD-1結(jié)腸 癌細(xì)J包相關(guān)的細(xì)月包毒性。
實(shí)施例3
MDA-MB-231細(xì)胞的體內(nèi)肺瘤實(shí)驗(yàn)
參考圖5和6， 4至6周大的雌性SCID小鼠經(jīng)頸背皮下注射植入溶 于100微升鹽水的5百萬(wàn)人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)。將所述小鼠隨機(jī) 分成2個(gè)治療組，每組5只。在植入后當(dāng)天，每組腹腔內(nèi)注入稀釋后體 積為300微升的20 mg/kg AR37A335.8測(cè)試抗體或者緩沖液對(duì)照，所述 稀釋使用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀釋劑從原液濃度稀釋。在整個(gè)研究期間以同樣方式每周給 藥一次所述抗體和對(duì)照樣品，共8次劑量。利用卡^l計(jì)大約每7天測(cè)量一 次腫瘤生長(zhǎng)。在整個(gè)研究期間每周一次記錄動(dòng)物的體重。研究結(jié)束時(shí)， 根據(jù)CCAC指南處死所有的動(dòng)物u
在人乳腺癌的MDA-MB-231體內(nèi)預(yù)防模型中，AR37A335.8顯著減 少腫瘤生長(zhǎng)。移植后第55天，最后一次治療給藥后5天，AR37A335.8 治療組的平均肝瘤體積比緩沖液對(duì)照治療組的腫瘤體積小98.8% (圖5)。 研究結(jié)束時(shí)腫瘤體積顯著不同于對(duì)照的腫瘤體積(pK).0064， t-檢驗(yàn))。在整個(gè)研究期間沒(méi)有臨床毒性癥狀。每周測(cè)量一次的體重是健康狀
況和發(fā)育停滯的表征。如圖6所示，該研究期間對(duì)照和AR37A335.8治療 組的體重增加。
總之，在這種人乳腺癌異種移植模型中，AR37A335.8被良好耐受并 且減輕腫瘤負(fù)荷。
實(shí)施例4
SW1116細(xì)胞的體內(nèi)肺瘤實(shí)驗(yàn)
參考圖7和8， 4至6周大的雌性SCID小鼠經(jīng)頸背皮下注射植入溶 于100微升鹽水的5百萬(wàn)人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW1U6)。將所述小鼠隨機(jī)分成 2個(gè)治療組，每組5只。在才直入后當(dāng)天，每組腹腔內(nèi)注入稀釋后體積為 300微升的20 mg/kg AR37A335.8測(cè)試抗體或者緩沖液對(duì)照，所述稀釋使 用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04 的稀釋劑從原液濃度稀釋。在整個(gè)研究期間以同樣方式每周給藥一次所 述抗體和對(duì)照樣品，共8次劑量。利用卡鉗大約每7天測(cè)量一次腫瘤生 長(zhǎng)。在整個(gè)研究期間每周一次記錄動(dòng)物的體重。研究結(jié)束時(shí)，根據(jù)CCAC 指南處死所有的動(dòng)物。
在人結(jié)腸癌的SW1116體內(nèi)預(yù)防模型中，AR37A335.8治療導(dǎo)致腫瘤 生長(zhǎng)的抑制。移植后第55天，最后一次治療給藥后5天，AR37A337.8 治療組的平均腫瘤體積比緩沖液對(duì)照治療組的腫瘤體積小48.7% (圖7)。 AR37A335.8治療導(dǎo)致腫瘤體積顯著小于對(duì)照的腫瘤體積(p二 0.0055)。
在整個(gè)研究期間沒(méi)有臨床毒性癥狀。每周測(cè)量一次的體重是健康狀 況和發(fā)育停滯的表征。如圖8所示，在整個(gè)研究期間對(duì)照或者AR37A335.8 治療組的體重不降低。在治療周期結(jié)束(第48天)或者治療后隨訪結(jié)束(第 63天)時(shí)，兩組間的體重也沒(méi)有差異。
因此在人結(jié)腸癌異種移植模型中，AR37A335.8被良好耐受并降低腫 瘤負(fù)荷。
實(shí)施例5
AR37A335.8和抗-CD44 H460-16-2之間交叉反應(yīng)的測(cè)定全細(xì)胞膜部分和全細(xì)胞裂解產(chǎn)物的Western印跡，利用單克隆抗體 AR37A335.8和抗-CD44單克隆抗體H460-16-2作為探針。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在 非還原條件下通過(guò)在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳對(duì)20微克全細(xì)胞 膜部分和40微克全細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析，所述全細(xì)胞膜部分從培養(yǎng)增 殖的MDA-MB-231細(xì)胞分離，而全細(xì)胞裂解產(chǎn)物,人培養(yǎng)增殖的PC-3和 CCD-27sk細(xì)胞制備。電轉(zhuǎn)到PVDF膜后，所述印跡用抗體AR37A335.8 和H460-16-2作為探針檢測(cè)，然后是Western印跡的標(biāo)準(zhǔn)步驟。利用單克 隆抗體AR37A335.8作為探針檢測(cè)的Western印跡結(jié)果與利用抗-CD44單 克隆抗體H460-16-2所獲結(jié)果非常相似(圖9)，表明兩種抗體可以識(shí)別相 同的抗原，即CD44。為了確定AR37A335.8是否與CD44分子交叉反應(yīng)， 在免疫沉淀復(fù)合物的Western印跡中利用AR37A335.8作為探針檢測(cè)，所 述免疫沉淀復(fù)合物利用抗-CD44 H460-16-2從培養(yǎng)增殖的細(xì)胞的全細(xì)胞 膜部分獲得。筒單來(lái)說(shuō)，300微克的MDA-MB-231全細(xì)胞膜部分(l mg/mL 終蛋白濃度)與H460-16-2偶聯(lián)的蛋白G Sepharose珠子在4°C孵育2小 時(shí)。洗滌后珠子在lx非還原性SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸，在10%制 備性聚丙烯酰胺凝膠中通過(guò)電泳分析樣品。在電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Western印跡實(shí)驗(yàn)步驟，所述印跡上的各條泳道用抗體 AR37A335.8、 H460-16-2和IgGl同種型對(duì)照作為探針檢測(cè)。所有一抗在 5微克/mL的工作濃度下使用。所獲印跡的圖像(圖IO)顯示AR37A335.8 和H460-16-2與相同的抗原交叉反應(yīng)，因此證明抗體AR37A335.8還識(shí)別 CD44分子內(nèi)包含的表位。
實(shí)施例6
人前列腺腫瘤組織染色
進(jìn)行IHC研究以進(jìn)一步評(píng)價(jià)H460-16-2與人前列腺腫瘤組織的結(jié)合。 此前進(jìn)行IHC優(yōu)化研究以便確定進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的條件。如上所述產(chǎn)生和純 化H460-16-2單克隆抗體。
利用人前列腺正常和腫瘤組織微陣列(Imgenex， San Diego, CA)進(jìn)行 抗體與53人前列腺腫瘤和3種正常前列腺組織的結(jié)合。組織切片在58。C 烘箱中干燥1小時(shí)脫蠟，通過(guò)將組織切片5次浸泡于染色缸中的二曱苯進(jìn)行脫蠟，每次4分鐘。經(jīng)過(guò)一系列梯度乙醇清洗(100%-75%)處理后， 切片在水中重新水合。將載玻片浸泡于pH 6的10 mM檸檬酸鹽緩沖液 (Dako, Toronto, Ontario)中，隨后用高、中、低能量設(shè)置的微波分別照射 載玻片5分鐘，最終將其浸沒(méi)在冷的PBS中。隨后將載玻片浸沒(méi)在3% 的過(guò)氧化氬溶液中6分鐘，用PBS清洗3次，每次5分鐘，干燥，并在 室溫用通用封閉液(Dako， Toronto, Ontario)孵育5分鐘。用抗體稀釋緩沖 液(Dako， Toronto, Ontario)將H460-16-2(單克隆小鼠抗前列腺特異性膜抗 原(PSMA;克隆1D11 ， North West Biotherapeutics, Bothell， WA))或者同種 型對(duì)照抗體(針對(duì)黑曲霉(v4^ erg///^ m'ger)葡萄糖氧化酶，這是一種哺乳 動(dòng)物組織中既不存在又不能誘導(dǎo)的酶Dako， Toronto, Ontario)稀釋到其工 作濃度(對(duì)于每種抗體是5微克/mL，而抗PSMA除外，其被稀釋至2微 克/mL)，并在室溫孵育1小時(shí)。用PBS清洗所述載玻片3次，每次5分 鐘。通過(guò)與4是供的HRP偶聯(lián)二抗(Dako Envision System Toronto Ontario) 在室溫下30分鐘觀察/顯現(xiàn)一抗的免疫反應(yīng)性。在該步驟之后，用PBS 清洗所述載玻片3次，每次5分鐘，隨后加入DAB(3，3'-二氨基聯(lián)苯胺四 鹽酸鹽，Dako, Toronto, Ontario)生色團(tuán)底物溶液以在室溫免疫過(guò)氧化物 酶染色10分鐘進(jìn)行顏色反應(yīng)。用自來(lái)水清洗所述載玻片以終止生色反應(yīng)。 用Meyer蘇木精(Sigma Diagnostics, Oakville， ON)復(fù)染后，將所述載玻 片用梯度乙醇(75%-100%)脫水并用二曱苯清洗。用固定劑(Dako Faramount, Toronto, Ontario)在所述載Jf皮片上蓋上蓋3皮片。^f吏用Axiovert 200 (Ziess Canada, Toronto, ON)對(duì)載玻片進(jìn)行顯微檢查，使用Northern Eclipse成像軟件(Mississauga， ON)獲取并存儲(chǔ)數(shù)字圖像。由組織病理學(xué) 家對(duì)結(jié)果進(jìn)行讀取、評(píng)分和解釋。
圖11提供人正常和腫瘤前列腺組織陣列的H460-16-2染色結(jié)果的概 要。從表才各來(lái)看，19/53(36。/。)的被測(cè)腫瘤是H460-16-2陽(yáng)性的。H460-16-2 對(duì)胂瘤細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞特異。細(xì)胞定位主要是膜和質(zhì)膜的，伴有 或者不伴有腔定位。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比范圍/人<10°/。->50%，表明抗體與 腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)結(jié)合。因?yàn)椴煌[瘤階段腫瘤數(shù)目的差異(I、 II、 III和IV 期分別是1/1(100%)、 4/12(33%)、 0/2(0%)和11/33 (33%))，不能正確評(píng)價(jià) 抗體結(jié)合與胂瘤階段之間的關(guān)系。與Gleason分?jǐn)?shù)G3-G4(36。/。)的結(jié)合高于與Gl-G2(25。/。)的結(jié)合。 Gleason分?jǐn)?shù)是前列腺癌的分級(jí)系統(tǒng)。Gleason分級(jí)系統(tǒng)給組織樣品中兩 個(gè)最大癌癥區(qū)域的每一個(gè)指定等級(jí)。等級(jí)范圍從1至5， l是侵襲性最弱 的，而5是侵襲性最強(qiáng)的。例如等級(jí)3腫瘤很少轉(zhuǎn)移，而對(duì)等級(jí)4或者 等級(jí)5來(lái)說(shuō)轉(zhuǎn)移^艮常見(jiàn)。然后兩個(gè)等級(jí)相加產(chǎn)生Gleason分?jǐn)?shù)。2至4的 分?jǐn)?shù)被認(rèn)為是低等級(jí)的；5至7，中間等級(jí)；和8至10,高等級(jí)。具有低 Gleason分?jǐn)?shù)的肺瘤通常生長(zhǎng)足夠緩慢，以致在患者的一生中可能都不會(huì) 對(duì)其構(gòu)成顯著威脅。
所有3個(gè)正常前列腺組織切片對(duì)該抗體是陽(yáng)性的。但是，組織特異 性針對(duì)肌上皮和基質(zhì)成纖維細(xì)胞，而不是腺上皮。圖12證明H460-16-2 與被測(cè)前列腺肺瘤結(jié)合的異質(zhì)性10/53、 6/53、 3/53陽(yáng)性肺瘤分別屬于 <10-10%、 <50-50%和>50%的類別。作為H460-16-2結(jié)合前列腺癌細(xì)胞的 結(jié)果，H460-16-2的治療益處有可能被延伸至前列腺癌的治療。
實(shí)施例7
人肝肺瘤組織染色
為了進(jìn)一步鑒定H460-16-2與人肝肺瘤組織的結(jié)合，在肝腫瘤組織 陣列(Imgenex, San Diego， CA)中檢測(cè)該抗體。為每位患者提供下列信息 年齡，性別，器官和診斷。使用的染色步驟與實(shí)施例6中公開(kāi)的相同。 如上所述使用相同的陰性對(duì)照抗體。使用的陽(yáng)性對(duì)照抗體是抗AFP (a 1 胎球蛋白；克隆AFP-ll，Abeam， Cambridge, MA)。所有抗體在5微克/mL 的工作濃度使用，除了抗AFP在10微克/mL的工作濃度使用。
如13所示，H460-16-2抗體顯示與21/49 (43%)的被測(cè)肝癌結(jié)合，包 括11/37 (30°/。)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌，7/8 (88%)的轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌，1/2 (50%) 原發(fā)性肝膽管型肝癌和2/2 (100%)的轉(zhuǎn)移性肝膽管型肝癌。與較早的I和 II期相比，該抗體與晚期肺瘤III和IV期的結(jié)合顯著更高(p = 0.03) [I期， 0/2 (0%); II期，2/17 (12%); III期，8/16 (50%)和IV期，6/8 (75%)]。 H460-16-2對(duì)肺瘤細(xì)胞和侵潤(rùn)性炎性細(xì)胞特異。細(xì)胞定位主要是膜的。一 些肺瘤還顯示彌散性的細(xì)胞質(zhì)染色模式。該抗體與9/9的非胂瘤肝組織結(jié) 合(圖14)。但是，所述結(jié)合限于竇內(nèi)皮細(xì)胞和侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞。H460-16-2抗原看起來(lái)在晚期肝肺瘤組織中特異表達(dá)。因此H460-16-2具有作為肝 癌治療的治療性藥物的潛能。
實(shí)施例8
H460-16-2治療的來(lái)源于SCID小鼠的MDA-MB-231異種移植肺瘤組織 的凋亡研究
在預(yù)防性和成熟的MDA-MB-231異種移植4莫型中，H460-16-2顯示 在體內(nèi)引起胂瘤生長(zhǎng)抑制的能力(如S.N. 10/603,000所公開(kāi))。利用FACS， H460-16-2還顯示對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的作用，這種作用導(dǎo)致凋亡 細(xì)胞數(shù)量的劑量依賴性增加(如S.N. 10/810,165所公開(kāi))。為了進(jìn)一步闡明 H460-i6-2的作用機(jī)制，在乳腺癌異種移植模型的體內(nèi)增殖MDA-MB-231 腫瘤中，研究H460-16-2治療對(duì)凋亡的作用。
在人乳腺癌的MDA-MB-231成熟模型中，治療周期結(jié)束時(shí)， H460-16-2組中小鼠的平均腫瘤體積是緩沖液對(duì)照治療組體積的 68.8%(如實(shí)施例IO所公開(kāi)的相似步驟)。治療結(jié)束后兩天，每組隨機(jī)選擇 4只小鼠，收集腫瘤。收集的腫瘤被一分為二，并用10%緩沖的福爾馬林 固定。固定后，該組織被進(jìn)一步修整以獲得大約2mm的腫瘤切片用于石 蠟包埋。做出適當(dāng)努力使整個(gè)橫切面具有腫瘤代表性。所述組織被包埋 入石蠟、切片并在載玻片上固定以便在Toronto General Hospital (Toronto, ON)的臨床研究實(shí)驗(yàn)室染色。
利用來(lái)自Chemicon Intcrnational(Temecula， CA)的ApopTag 力"±氧 化物酶原位凋亡檢測(cè)試劑盒(S7101)評(píng)價(jià)組織切片中的凋亡。ApopTag試 劑盒基于TUNEL分析，并通過(guò)評(píng)價(jià)DNA斷裂來(lái)檢測(cè)凋亡。使用末端脫 氧核苦酰轉(zhuǎn)移酶(TdT)對(duì)所述片段進(jìn)行地高辛-dNTP的末端標(biāo)記。利用抗 地高辛過(guò)氧化物酶試劑檢測(cè)摻入的地高辛-dNTP。按照該試劑盒提供的手 刑上的概要進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)步驟。利用光學(xué)顯微鏡檢查觀察ApopTag染 色和細(xì)胞形態(tài)學(xué)。對(duì)于每個(gè)切片，在來(lái)自腫瘤活性區(qū)的4個(gè)獨(dú)立區(qū)域計(jì) 數(shù)被染色的細(xì)胞。注意不要集中于肺瘤的壞死區(qū)。將4個(gè)獨(dú)立區(qū)域的計(jì) 數(shù)加在一起得到代表該切片的總計(jì)數(shù)。對(duì)于每個(gè)切片，計(jì)數(shù)重復(fù)3次(每 次集中于4個(gè)區(qū))。利用3次計(jì)數(shù)獲得的總數(shù)獲得所述切片的平均值。隨后，計(jì)算不同治療組的平均計(jì)數(shù)。如圖15所示，緩沖液對(duì)照組的平均總
分為3L5(士14.62)個(gè)細(xì)胞，而H460-16-2治療組的平均總分為42.5(±3.70) 個(gè)細(xì)胞。因此，利用TUNEL分析確定了 H460-16-2治療具有增加凋亡的 趨勢(shì)。
隨后將ApoTag染色肺瘤的連續(xù)切片進(jìn)行H&E染色，并利用形態(tài)學(xué) 標(biāo)準(zhǔn)4企查這些切片的凋亡細(xì)胞，所述形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)例如單細(xì)胞缺失、細(xì)胞 皺縮和染色質(zhì)凝集成高密度。按照上面關(guān)于切片的描述完成符合這些標(biāo) 準(zhǔn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)，得到治療組的平均計(jì)數(shù)。試劑盒中包含陽(yáng)性對(duì)照載玻片(來(lái) 自泌乳后3-5天的正常嚙齒類動(dòng)物乳腺的組織)，所述陽(yáng)性對(duì)照載玻片隨 測(cè)試載玻片一起染色。如圖15所示，緩沖液對(duì)照組的平均總分為17(±5.29) 個(gè)細(xì)胞，而H460-16-2治療組的平均總分為22.5(士4.20)個(gè)細(xì)胞。因此，利 用細(xì)胞形態(tài)學(xué)確定了 H460-16-2治療具有增加凋亡的趨勢(shì)。
實(shí)施例9
H460-16-2的嵌合
1.0可變區(qū)基因克隆入測(cè)序載體
為了促進(jìn)抗體嵌合體的產(chǎn)生，編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因分別被 克隆入商品化測(cè)序載體pCR2丄
1.1 mRNA的分離
利用QuickPrepTM微量mRNA純化試劑盒(GE Healthcare, Piscataway， NJ)從匯合的Master細(xì)胞庫(kù)H460-16-2雜交瘤細(xì)胞中分離信使核糖核酸 (mRNA)。 mRNA保存在-80。C直到下一步的使用。
1.2可變區(qū)基因的RT-PCR擴(kuò)增
進(jìn)行獨(dú)立的反應(yīng)以擴(kuò)增輕鏈和重鏈可變區(qū)。逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(RT-PCR)從mRNA模板合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，然后特異擴(kuò)增 靶基因。
對(duì)于輕鏈，1微升mRNA在65°C加熱10分鐘，然后在冰上冷卻。 利用Superscript —步法RT-PCR,用Platinum Taq (Invitrogen，Burlington, ON)、 12.5孩i升2xRT陽(yáng)PCR反應(yīng)混合物(Invitrogen, Burlington, ON)、 1微升20 pmol/樣吏升MuIgKVL5'-F引物(Novagen， Mississauga, ON)、 1微升20 pmol/微升MuIgKVL3'-l引物(Novagen, Mississauga, ON)、 0.5微 升RT/Platinum Taq混合物(Invitrogen, Burlington, ON)、 0.4微升50 mM MgS04 (Invitrogen, Burlington, ON)和水補(bǔ)足25微升準(zhǔn)備RT-PCR反應(yīng)。 第二組反應(yīng)也如上進(jìn)行準(zhǔn)備，除了使用的正向引物是MuIgKVL5'-C虧1物 (Novagen， Mississauga, ON)以替代MuIgicVL5'-F。反應(yīng)在熱循環(huán)儀中50。C 加熱40分鐘，繼之以94°C 2分鐘。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)94°C 30秒，55°C 1分鐘和72。C 1分鐘。最后PCR產(chǎn)物在72。C 加熱10分鐘，然后保存在4。C。利用QIAquickPCR純化試劑盒(QIAGEN, Mississauga, ON)純化PCR產(chǎn)物。
對(duì)于重鏈，1微升mRNA在65°C加熱10分鐘，然后在水上冷卻。 利用 Superscript —步法RT-PCR ，用Platinum Taq (Invitrogen, Burlington, ON)、 12.5孩吏升2xRT-PCR反應(yīng)混合物(Invitrogen, Burlington, ON)、 1微升5 pmol/微升MuIgVH5'-A引物(Novagen, Mississauga, ON)、 1 微升10 pmol/微升MuIgVH5'-B引物(Novagen， Mississauga, ON)、 MuIgVH5'-C引物(Novagen, Mississauga, ON) 、 1微升5 pmol/微升 MuIgVH5'-D引物(Novagen， Mississauga, ON) 、 1農(nóng)i升5 pmol/微升 MuIgVH5'-F引物(Novagen, Mississauga, ON) 、 1微升5 pmol/微升 MuTgGVH3'-2引物(Novagen， Mississauga, ON〉 0.5孩i升RT/Platinum Taq 混合物(Invitrogen, Burlington, ON)、 0.4孩i:升50 mM MgS04 (Invitrogen, Burlington, ON)和水補(bǔ)足25微升準(zhǔn)備RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)在熱循環(huán)儀中 50°C加熱40分鐘，繼之以94°C 2分鐘。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94。C 30秒，55。C 1分鐘和72。C 1分鐘。最后PCR產(chǎn)物在72°C加熱10分鐘， 然后保存在4°C。
圖16顯示RT-PCR反應(yīng)結(jié)果。利用MuIgKVT,5'-F(泳道l)或者 MuIgKVL5'-C(泳道2)正向引物擴(kuò)增輕鏈反應(yīng)(圖A)。重鏈反應(yīng)(圖B)利用 MuIgVH5'-A、 B、 C、 D和F正向引物的混合物進(jìn)4亍擴(kuò)增。兩個(gè)輕《連反應(yīng) (圖A，泳道1和2)均顯示450bp處的強(qiáng)條帶，以及850bp處的弱條帶。 450 bp條帶是包含H460-16-2 Vk基因的靶條帶。重鏈反應(yīng)(圖B，泳道1)顯示500 bp處的強(qiáng)條帶和1000 bp處的弱條帶。500 bp處的條帶是對(duì)應(yīng) 于H460-16-2 Vh基因的靶條帶。利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN: Mississauga, ON)純化所有的PCR產(chǎn)物。
1.3克隆入測(cè)序載體
利用TOPO TA Cloning⑧試劑盒(Invitrogen， Burlington, ON)將純化的 輕鏈和重鏈PCR產(chǎn)物分別克隆入pCR2.1載體。輕鏈和重鏈反應(yīng)均包含2 微升適當(dāng)?shù)募兓疨CR產(chǎn)物。按照制造商的說(shuō)明書(shū)，質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入One Shot MAX Emciency DH5aTM-TlR大腸桿菌(Invitrogen, Burlington, ON)。對(duì)于輕鏈和重鏈轉(zhuǎn)化，均使用2微升的連接反應(yīng)。
來(lái)源于每種反應(yīng)的30微升轉(zhuǎn)化細(xì)胞被涂板于預(yù)溫的Lennox L肉湯 (LB)瓊脂(Sigma， Oakville， ON)平板，所述平板包含50樣i克/mL氨芐青霉 素(Sigma， Oakville， ON)和40微升溶于N，N-二曱基曱酰胺(Caledon Laboratories, Georgetown, ON)的40 mg/mL 5-溴-4-氯-3-口引咮-p匿D-他喃半 享14唐苦(X-gal， Caledon Laboratories, Georgetown, ON)。將所述平一反倒置， 并在37°C孵育過(guò)^R。
分別從H460-16-2 Vk的每塊轉(zhuǎn)化平板挑取5個(gè)白色單克隆，從 H460-16-2 Vh的轉(zhuǎn)化平板挑取10個(gè)白色單克隆，并接種4 mL包含50微 克/mL氨芐青霉素(Sigma， Oakville， ON)的LB肉湯(Sigma, Oakville, ON)。培養(yǎng)物在37。C 200 rpm振搖條件下生長(zhǎng)過(guò)夜。利用QIAprep Spin 小量制備試劑盒(QIAGEN， Mississauga, ON)從各培養(yǎng)物分離質(zhì)粒。
用EcoRI消化回收的質(zhì)粒以確定插入物的大小。H460-16-2 Vk消化 物包含5微升質(zhì)粒、0.02樣i升的50 U/孩i升EcoR I (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC)、 1.5樣i升的10x緩沖液H (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC)、 1.5微升的0.1%牛血清白蛋白(BSA)和6.98微升的水。 H460-16-2 Vh消化物包含5樣i升質(zhì)粒、0.04微升的50 U/微升EcoR I (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC)、 1.5孩i升的10x緩沖液H (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC> 1.5 4效升的0.1% BSA(Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC)和6.96微升的水。質(zhì)粒在37°C消化1小時(shí)。 5微升的各消化質(zhì)粒在1.0°/。瓊脂糖凝膠上電泳。圖17顯示用EcoR I消化的pCR2.1 (H460-16-2 Vk)質(zhì)粒。頂部標(biāo)明 克隆編號(hào)。第一個(gè)數(shù)字表示使用的正向引物(MuIgKVL5'-F是1， MuIgicVL5'-C是2)，而第二個(gè)數(shù)字表示克隆編號(hào)(l-5)。大約S000bp的大 條帶是pCR2.1載體骨架。除了 2-4以外的所有克隆在500bp均有條帶， 這是H460-16-2插入物的預(yù)期大小(箭頭所示)。
圖18顯示用EcoRI消化的pCR2.1(H460-16-2 Vh)質(zhì)粒?？寺?、 2、 3、 4、 5和8顯示對(duì)應(yīng)于H460-16-2Vh基因的期望的500 bp條帶。
一些包含合適大小插入物的質(zhì)粒(Vk 1-1， Vk 1-2， Vk 1-3， Vk 2-1， Vk 2-2， Vk 2-3, Vh 1, Vh 4和Vh 5)在約克大學(xué)的重點(diǎn)分子生物學(xué)實(shí)-險(xiǎn)室 (York University's Core Molecular Biology Facility (Toronto, ON))觀'J序。序 列顯示于圖19。在克隆l-l、 l-2和1-3中發(fā)現(xiàn)了正確的H460-16-2 Vk序 列。剩余的Vk克隆包含異常的免疫球蛋白基因?？寺?-1 (pVkH460-16-2^1-l)被用于嵌合H460-16-2 IgG2質(zhì)粒的構(gòu)建。所有 H460-16-2 Vh克隆包含正確的H460-16-2 Vh序列。具有正確序列的質(zhì)粒 保存在-30。C以便將來(lái)的應(yīng)用。
1.4 H460-16-2 Vh克隆入測(cè)序栽體(用于嵌合IgG2的構(gòu)建)
上述mRNA被用于擴(kuò)增H460-14-2 Vh基因。對(duì)于重鏈，1微升mRNA 在65。C加熱IO分鐘，然后在冰上冷卻2分鐘。利用Superscript —步法 RT隱PCR，用Platinum Taq (Invitrogen, Burlington, ON)、 12.5微升的 2xRT-PCR反應(yīng)混合物(Invitrogen, Burlington, ON)、 1微升的5 pmol/微升 MuIgVH5'-A引物(Novagen, Mississauga, ON)、 1微升的10 pmol/微升 MuIgVH5'-B引物(Novagen, Mississauga, ON)、 1微升的5 pmol/微升 MuIgVH5 '-D引物(Novagen， Mississauga, ON)、 1微升的5 pmol/微升 MilgVH5'-F引物(Novagen， Mississauga, ON)、 1微升的5 pmol/微升 MuIgGVH3'-2引物(Novagen， Mississauga, ON)、 0.5微升RT/Platinum Taq 混合物(Invitrogen， Burlington, ON)、 0.4孩i升的50 mM MgS04 (Invitrogen， Burlington, ON)和水補(bǔ)足25微升準(zhǔn)備RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)在熱循環(huán)儀中 50°C加熱40分鐘，繼之以94。C 2分鐘 PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94°C 30秒，55。C 1分鐘和72。C 1分鐘。最后PCR產(chǎn)物在72。C加熱10分鐘，然后保存在4°C。繪照制造商的說(shuō)明書(shū)，利用QIAquick PCR純化試劑盒 (QIAGEN， Mississauga， ON)純化所有的PCR產(chǎn)物。
利用TOPO TA Cloning 試劑盒(Invitrogen, Burlington, ON)將純化的 重鏈PCR產(chǎn)物克隆入pCR2.1載體該反應(yīng)包含1微升純化的PCR產(chǎn)物。 2微升連接反應(yīng)物-故用于轉(zhuǎn)化One Shot MAX Efficiency DH5a -TlR 大腸桿菌(Invitrogen， Burlington, ON)。 30微升轉(zhuǎn)化細(xì)胞被涂板于預(yù)溫的 Lennox L肉湯(LB)瓊脂(Sigma， Oakville, ON)平板，所述平板包含50微克 /mL氨節(jié)青霉素(Sigma, Oakville， ON)和40微升溶于N，N-二曱基曱酰胺 (Caledon Laboratories, Georgetown, ON)的40 mg/mL 5-溴-4-氯隱3-口引口呆 -卩-D-p比喃半乳糖香(X畫(huà)gal， Caledon Laboratories, Georgetown, ON)>將所述 平板倒置，并在37。C孵育過(guò)夜。
從H460-16-2 VH轉(zhuǎn)化平板挑取10個(gè)單克隆，并接種包含50微克/mL 氨芐青霉素的4 mL LB肉湯。培養(yǎng)物在37°C 200 rpm振搖條件下生長(zhǎng)過(guò) 夜。按照制造商的說(shuō)明書(shū)，利用QIAprepSpin小量制備試劑盒(QIAGEN， Mississauga, ON)從各培養(yǎng)物分離質(zhì)粒。
用EcoRI消化回收的質(zhì)粒以確定插入物的大小。H460-16-2 Vh消化 物包含5微升質(zhì)沖主0.04微升的50 U/微升EcoR I (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC)、 1.5孩i升的lOx緩沖液H (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC> 1.5微升的0.1% BSA(Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC) 和6.96孩i升的水。質(zhì)粒在37。C消化1小時(shí)。5 ^t升的各消化質(zhì)粒在1.0% 瓊脂糖凝膠上電泳。
克隆#3和#1看起來(lái)具有預(yù)期的500 bp插入物。從pCR2.1(H460-16-2 VH)-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌平板再挑取10個(gè)克隆，以便獲得具有正確插入物的 更多克隆。如上所述克隆用于接種LB肉湯。如上所述從培養(yǎng)物分離質(zhì)粒， 然后如上所述用EcoRI消化。
圖20顯示用EcoR I消化的pCR2.1(H460-16-2 Vh)質(zhì)粒。大約5000 bp 的大條帶是pCR2.1載體骨架。克隆#17在500 bp處具有條帶，這是 H460-16-2 VH插入物的預(yù)期大小(箭頭所示)。
包含合適大小插入物的質(zhì)粒(VhW、 Vh#3和VhW7)在約克大學(xué)的重 點(diǎn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(York University's Core Molecular Biology Facility(Toronto, ON))測(cè)序。序列顯示于圖21。在克隆3和17中發(fā)現(xiàn)了正確的 H460-16-2 Vh序列。克隆3(pVhH460-16-2 #3)被用于嵌合H460-16-2 IgG2 質(zhì)粒的構(gòu)建。具有正確序列的質(zhì)粒保存在-30。C以便將來(lái)的應(yīng)用。
2.0鼠H460-16-2基因克隆入包含人恒定區(qū)基因的CMV啟動(dòng)子載體
為了產(chǎn)生鼠-人IgGl嵌合抗體構(gòu)建體，鼠H460-16-2可變區(qū)基因被克 隆入包含人恒定區(qū)基因的質(zhì)粒。這些CMV啟動(dòng)子載體獲自G.R. McLean 等。所述載體最初被稱為pHC-huCgl和pLC-huCk。此處，它們被稱為 pCH-huIgl和pCL-huCk。
2.1改變pCH-huIgl的限制性酶位點(diǎn)
圖22是重鏈CMV啟動(dòng)子載體(pCH-huIgl)的質(zhì)粒圖。在Nhe I和Hind 11I限制性位點(diǎn)之間克隆H460-16-2 Vh可變基因。由于H460-16-2 Vh基 因內(nèi)的內(nèi)部Hind III位點(diǎn)，載體上的Hind III位點(diǎn)被改變?yōu)锽siW I。
在實(shí)-瞼室i殳計(jì)PCR引物以促進(jìn)這種克隆，并通過(guò)Gibco BRL (Birlington， ON)合成。引物序列顯示于圖23。 1微升的純化pCH-huIgl 質(zhì)粒(G. R. McLean, Bronx, NY)與1微升的20 pmol/微升pCH-huBsiW I 引物、1微升的20 pmol/微升BGH引物、0.2微升的50 mM MgCl2 (Invitrogen， Burlington, ON)和22孩丈升的Platinum PCR Supermix (Invitrogen， Burlington， ON)混合。所述反應(yīng)物在熱循環(huán)儀中94。C孵育5 分鐘，繼之以30個(gè)循環(huán)94。Cl分鐘，58。C 1分鐘和72°C 1分鐘。最 后，反應(yīng)物在72。C孵育10分鐘，然后保存在4。C。
如圖24所示，4微升PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳。圖A, 泳道1是包含人IgGl重鏈恒定區(qū)的pCH-huIgl質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增區(qū)。在 約llOObp處出現(xiàn)一個(gè)條帶，這是預(yù)期的大小。利用QIAquickPCR純化 試劑盒(QIAGEN， Mississauga， ON)純化剩余的PCR產(chǎn)物。
利用Hind III和Xho I消化純化的PCR產(chǎn)物和純化的pCH-huIgl質(zhì) 粒以促進(jìn)連接。PCR產(chǎn)物消化液包含46微升純化的PCR產(chǎn)物、6微升的 10x緩沖液M (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC)、 6微升的0,1% BSA(Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC)和2微升的15 U/微升HindIII(Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC)。所述質(zhì)li消化液包含4微升 的1.4微克/微升pCH-huIgl， 6微升的10x緩沖液M(AmershamBiosciences, Baie d'Urfe, QC)， 6微升的0.1% BSA(Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC), 42微升的水和2微升的15 U/微升Hind III(Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC)。消化液在37°C下孵育2小時(shí)。取出一小部分(2微升的 PCR產(chǎn)物反應(yīng)物和3微升的質(zhì)粒反應(yīng)物)并保留用于在瓊脂糖凝膠上檢驗(yàn) 消化的進(jìn)展。向剩余的消化液中添加3.2微升的lMNaCL 2.5微升的1M Tris-HCl pH 7.4和3微升的8 U/微升Xho I (New England Biolabs, Ipswich: MA)。反應(yīng)物繼續(xù)在37°C下孵育2小時(shí)。從每種消化液中另取出一小部 分，并保留用于在瓊脂糖凝膠上電泳。
圖25顯示消化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒。不出所^牛，消化后PCR產(chǎn)物的 大小幾乎沒(méi)有變化(圖A和B，泳道l),因?yàn)閺膬蓚€(gè)末端只去除了非常少 的堿基。所述質(zhì)粒的單一Himl III消化(圖A，泳道2)顯示線性化質(zhì)粒的 大小(比分子量標(biāo)記物大)。HindIII和XhoI雙重消化(圖B)顯示大分子量 的質(zhì)粒骨架和大約1000 bp已經(jīng)被切出的片段，其將被消化的PCR產(chǎn)物 替換。剩余的消化PCR產(chǎn)物利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN， Mississauga, ON)純化，剩余的質(zhì)粒骨架利用QIAquick凝月交提取試劑盒 (QIAGEN, Mississauga, ON)從1 %瓊脂糖凝膠純化。
按照4:i的摩爾比例連接消化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒骨架。該反應(yīng)包含 233 ng消化的質(zhì)粒骨架，162ng消化的PCR產(chǎn)物，4微升的5x連接緩沖 液(Gibco BRL, Burlington, ON)， 4微升的1 U/微升T4 DNA連接酶(Gibco BRL, Burlington, ON)和9.33微升的水。所述反應(yīng)物在16。C孵育過(guò)夜，然 后置于70。C 15分鐘以滅活酶。通過(guò)在冰上孵育30分鐘，42°C 2分鐘， 然后再在冰上5分鄰將2微升的連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化入50微升的One Shot MAX Efficiency DH5aTM-TlR大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen, Burlington, ON)。添加250微升S.O.C.培養(yǎng)基(Invitrogen， Burlington, ON),轉(zhuǎn)化細(xì)胞 在37。C孵育1小時(shí)。在預(yù)溫的包含50微克/mL氨千青霉素(Sigma, Oakville， ON)的LB瓊脂平板(Sigma， Oakville， ON)上涂板100樣i升細(xì)胞， 并在37。C孵育過(guò)夜。
從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中挑取10個(gè)單菌落，用于接種4 mL包含50 jig/mL氨芐青霉素(Sigma, Oakville, ON)的LB肉湯(Sigma, Oakville， ON)，并在37°C 200 rpm振搖條件下孵育過(guò)夜。利用QIAprep小量制備試劑盒(QIAGEN, Mississauga， ON)乂人過(guò)夜培養(yǎng)物分離質(zhì)粒。用BsiW I消化分離的質(zhì)粒以鑒 定摻入新的酶切位點(diǎn)的克隆。消化液包含3微升的純化質(zhì)粒，2微升的 10xNEBuffer 2 (New England Biolabs， Ipswich, MA)， 1微升的3 U/微升 BsiW I (New England Biolabs， Ipswich, MA)和水補(bǔ)足20微升。如圖26所 示，消化液在37。C孵育2小時(shí)，然后5微升的消化質(zhì)粒在1%瓊脂糖凝 膠上電泳。除了 4和8外的所有克隆在消化時(shí)被線性化，這表明它們摻 入了新的BsiWI酶切位點(diǎn)。泳道11顯示作為對(duì)照環(huán)狀質(zhì)粒的克隆5的未 消化部分?？寺、 2、 5和7在約克大學(xué)(York University)(Toronto, ON) 測(cè)序。全部6個(gè)克隆都具有期望的序列，保存在-30。C備用。
2.2 ARH460-16-2 Vk和Vh基因插入pCL-huCk和pCH-huIgl
為了促進(jìn)H460-16-2 Vk和Vh基因分別克隆入pCL-huCk和 pCH-huIgl,在基因的任一端需要添加限制性位點(diǎn)。對(duì)于輕鏈，在5'端添 加Bgl II位點(diǎn)，3'端添力卩Hind III位點(diǎn)。對(duì)于重鏈，在5'端添加Nhe I位 點(diǎn)，3'端添加BsiWI位點(diǎn)。圖23顯示這些PCR反應(yīng)中使用的引物序歹'j。 圖27顯示pCL-huCk(還稱為pLC-huCk)的質(zhì)粒圖。盡管在圖中沒(méi)有出現(xiàn)， 但Bgl II位點(diǎn)存在于pCL-huCk載體的前導(dǎo)序列和可變區(qū)之間。
對(duì)于輕鏈，1微升的150 ng/微升從pCR2.1(H460-16-2 Vk) M弁l-1(參 見(jiàn)上文，M denotes Master細(xì)胞庫(kù))純化的質(zhì)粒與1微升的20 pmol/微升 H460-16陽(yáng)2 Vk 5'引物、1微升的20 pmol/微升Vk 3' NoU 0.2微升的50 mM MgCl2(Invitrogen， Burlington, ON)和22樣i升的Platinum PCR Supermix (Invitrogen， Burlington, ON)混合。對(duì)于重鏈，1微升的40 ng/微升從 pCR2.1(H460-16-2 Vh)弁l(參見(jiàn)上文)純化的質(zhì)粒與1微升的25 pmol/微升 H460-16-2 Vh 5' Nhel引物、1微升的25 pmol/微升Vh 3' BsiWI引物和 47孩i升的PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen， Burlington, ON)混合。輕 鏈反應(yīng)在94°C孵育5分鐘，然后是30個(gè)循環(huán)94°C 1分鐘，58°C 1分 鐘和72°C 1分鐘，最后是72°C 7分鐘。類似地進(jìn)行重鏈反應(yīng)，但退火溫 度是55。C(替代58°C)。圖24顯示每個(gè)PCR反應(yīng)的一部分在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳。 H460-16-2 Vk基因(圖A，泳道2)表現(xiàn)為接近400 bp的條帶，這是輕鏈可 變區(qū)的預(yù)期大小。H460-16-l Vh基因(圖B，泳道l)表現(xiàn)為接近450 bp的 條帶，這是重鏈可變區(qū)的預(yù)期大小。利用QIAquick PCR純化試劑盒 (QIAGEN， Mississauga, ON)純化剩余的PCR產(chǎn)物，并用合適的酶消化以 便連接入質(zhì)粒。
對(duì)于輕鏈，pCL-huCk和H460-16-2 Vk PCR產(chǎn)物用Bgl II和Not I消 化以有利于克隆。40微升的H460-16-2 Vk PCR產(chǎn)物與6微升的 10xNEBuffer 3 (New England Biolabs， Ipswich, MA)、 0.6微升的100xBSA (New England Biolabs， Ipswich， MA)、 2微升的10 U/微升Bgl II (New England Biolabs, Ipswich, MA)、 2微升的10 U/微升Not I和補(bǔ)足60微升 的水混合。對(duì)于輕鏈質(zhì)粒，準(zhǔn)備相同的反應(yīng)，所述反應(yīng)包含8微升 pCL-huCk (G. R. McLean, Bronx, NY)，而不是PCR產(chǎn)物。兩種反應(yīng)物均 在37°C下孵育3小時(shí)。如圖28所示， 一部分被消化的載體和插入物在 1.2%瓊脂糖凝膠上電泳。線性化的pCL-huCK載體骨架(泳道l)表現(xiàn)為大 條帶，而從載體切除的輕鏈可變區(qū)表現(xiàn)為400 bp的條帶。消化的 H460-16-2 Vk (泳道2)基因也表現(xiàn)為400 bp。剩余的線性化pCL-huCk質(zhì) 粒在1.0%凝膠上電泳，并利用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN， Mississauga， ON)純化。利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN， Mississauga， ON)純化剩余消化的H460-16-2 Vk PCR產(chǎn)物。
對(duì)于重鏈，利用BsiW I和Nhe I消化具有添加的BsM I位點(diǎn)(參見(jiàn)上 文)的pCH-huIgl質(zhì)粒和H460-16-2 Vh PCR產(chǎn)物以有利于克隆。所述質(zhì) 粒反應(yīng)包含0.7微升的pCH-huIgl(BsiW I)#l DNA 2微升的lOxNEBuffer 2 (New England Biolabs,Ipswich,MA), 0.4微升的10 U/微升BsiW I (New England Biolabs，Ipswich,MA)和水補(bǔ)足20微升。還準(zhǔn)備相同的反應(yīng)，其包 含12.1樣i升純化的H460-16-2 Vh PCR產(chǎn)物而不是質(zhì)粒。反應(yīng)物在55°C 孵育過(guò)夜，然后從質(zhì)粒消化物中取出5微升在凝膠上檢測(cè)。向兩種反應(yīng) 物中添加0.2微升的lOOxBSA (New England Biolabs, Ipswich, MA)和1微 升的5 U/微升Nhe I (New England Biolabs， Ipswich， MA)，然后在37°C孵 育過(guò)夜。再取出5微升，用于在凝膠上電泳以檢測(cè)消化情況。圖29顯示1.2%凝膠電泳的消化結(jié)果。單一BsiWI消化(圖B,泳道 l)顯示線性化的質(zhì)粒。雙重BsiW I和Nhe I消化(圖B,泳道2)顯示表現(xiàn) 為大分子量條帶的質(zhì)粒骨架和450 bp處重鏈可變區(qū)。這條更小的條帶將 被替換為450 bp消化的H460-16-2 Vh PCR產(chǎn)物(圖A，泳道1)。剩余的 消化質(zhì)粒在1.2%凝膠上電泳并利用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN, Mississauga， ON)純化。利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN， Mississauga， ON)純化剩余消化的H460-16-2 Vh PCR產(chǎn)物。
消化的H460-16-2 Vk PCR產(chǎn)物被連接入線性化的pCL-huCK質(zhì)粒。 220 ng消化的pCL-huCK與66 ng消化的H460-16-2 Vk、 4微升的5x連 接緩沖液(Gibco BRL， Burlington, ON> 4微升的1 U/微升T4 DNA連接酶 (Gibco BRL, Burlington, ON)和補(bǔ)足20微升的水混合。所述反應(yīng)物在16°C 孵育過(guò)夜，然后在70。C孵育10分鐘以熱滅活酶。通過(guò)在冰上孵育30分 鐘，42。C2分鐘，再在冰上5分鐘，將2微升的連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化入50微 升的One Shot MAX Efficiency DH5aTM-TlR大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen, Burlington, ON)t添加250微升S.O.C.培養(yǎng)基(Invitrogen, Burlington, ON)， 轉(zhuǎn)化細(xì)胞在37。C孵育1小時(shí)。在預(yù)溫的包含50 ^t克/mL氨千青霉素 (Sigma, Oakville, ON)的LB瓊脂平板(Sigma， Oakville, ON)上涂板30微升 細(xì)胞，并在37。C孵育過(guò)夜。
準(zhǔn)備重鏈連接反應(yīng)，所述反應(yīng)包含250 ng的消化pCH-huIgl， 84 ng 的消化H460-16-2 Vh PCR產(chǎn)物，4微升的5x連接緩沖液(Gibco BRL， Burlington, ON) 1微升的1 U/微升T4 DNA連接酶(Gibco BRL, Burlington, ON)和水補(bǔ)足20微升。所述反應(yīng)物在16°C孵育過(guò)夜，然后在65°C孵育 10分鐘以熱滅活酶。通過(guò)在冰上孵育30分鐘，42。C2分鐘，再在冰上5 分鐘，將1孩i升的連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化入25孩i升的One Shot MAX Efficiency DH5aTM-TlR大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen, Burlington, ON)。添加 250微升S.O,C.培養(yǎng)基(Invitrogen， Burlington, ON)轉(zhuǎn)化細(xì)胞在37°C印孚育 1小時(shí)。在預(yù)溫的包含50微克/mL氨千青霉素(Sigma， Oakville, ON)的 LB瓊脂平板(Sigma， Oakville, ON)上涂板30微升細(xì)胞，并在37°C孵育過(guò) 夜。
從轉(zhuǎn)化的pCL-huCk(H460-16-2 Vk)平板挑取8個(gè)單菌落，從轉(zhuǎn)化的pCH-huIgl(H460-16-2 Vh)平板挑取6個(gè)單菌落用于接種4mL包含50微 克/mL氨卡青霉素(Sigma， Oakville, ON)的2-YT肉湯(Gibco BRL， Burlington, ON)。利用QIAprep小量制備試劑盒(QIAGEN, Mississauga, ON)從過(guò)夜培養(yǎng)物分離質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行消化以確保插入物的大小正 確。準(zhǔn)備輕鏈反應(yīng)，所述反應(yīng)包含3微升質(zhì)粒，1.5微升10xNEBuffer 3 (New England Biolabs, Ipswich， MA)， 0.15 4鼓升100xBSA(New England Biolabs， Ipswich. MA)， 2微升的10 U/微升Bgl II, 2微升的10 U/微升Not I和9.65微升水，并在37。C孵育3小時(shí)。通過(guò)將2微升的質(zhì)粒與2微升 的10xNEBuffer 2 (New England Biolabswith Ipswichwith MA)、 0.4微升的 10 U/微升BsiW I (New England Biolabswith Ipswichwith MA)和補(bǔ)足20微 升的水混合，準(zhǔn)備重鏈反應(yīng)。這些物質(zhì)在55。C孵育2小時(shí)，然后添加2 微升的10xBSA(New England Biolabs， Ipswich, MA)和0.8樣爻升的5 U/微升 Nhe I。反應(yīng)物繼續(xù)在37。C下脬育2小時(shí)。
圖30和31分別顯示pCL-huCk (H460-16-2 Vk)的pCH-huIgl (H460-16-2 Vh)的上述消化結(jié)果。除了#1之外的所有輕鏈克隆(圖30)包含 對(duì)應(yīng)于H460-16-2 Vk基因的目標(biāo)400 bp插入物。所有重鏈克隆(圖31)包 含對(duì)應(yīng)于H460-16-2 Vh基因的目標(biāo)450 bp插入物。才艮據(jù)這些結(jié)果， pCL陽(yáng)huCk(H460-16-2 Vk)克隆l 4 6> 7和&以及pCH-huIgl (H460陽(yáng)16畫(huà)2 Vh)克隆4和6在約克大學(xué)(Toronto， ON)測(cè)序。被測(cè)序的全部克隆都具有 目標(biāo)序列，將質(zhì)粒保存在-80。C備用。
3.0將嵌合的輕鏈和重鏈ARH460-16-2克隆入CHEF1表達(dá)載體
輕鏈(H460-16-2 Vk)的鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)然后被克隆入CHEFl表
達(dá)載體pNEF38，重鏈(H460-16-2 Vh)的鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)被克隆入
CHEF1表達(dá)載體pDEF38。質(zhì)粒圖顯示于圖32和33。
在該報(bào)告的剩余部分，術(shù)語(yǔ)Ch-ARH460-16-2 Vk是指來(lái)源于
pCL-huCk質(zhì)粒的輕鏈可變H460-16-2基因和人輕鏈恒定區(qū)的組合。術(shù)語(yǔ)
Ch-ARH460-16-2 Vh是指來(lái)源于pCH-huIgl質(zhì)粒的重鏈可變H460-16-2
基因和人重鏈IgGl區(qū)的組合。3.1將改變的限制性位點(diǎn)克隆入CHEF 1載體
CMV啟動(dòng)子載體中Ch-ARH460-16-2側(cè)翼的限制性位點(diǎn)需要改變以 促進(jìn)亞克隆入CHEF1表達(dá)載體。利用引入目標(biāo)限制性位點(diǎn)的引物PCR 擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子構(gòu)建體的前導(dǎo)序列、可變區(qū)和恒定區(qū)。引物序列顯示于 圖23。
對(duì)于輕鏈，利用1.4微升的73ng/微升pCL-huCk(ARH460-16-2 Vk) #3 DNA (參見(jiàn)上文)、1.0微升的25 pmol/微升pCL-huCK 5' Mlul引物、 1.7微升的15 pmol/微升BGH引物和20.9微升的PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen， Burlington, ON)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)。對(duì)于重《連，利用0.5 微升的0.27微克/微升pCH-huIgl (ARH460-16-2 Vh) #4 DNA (參見(jiàn)上 文)、1.7微升的15pmol/微升Vh5'Nhel/MluI引物、1.7微升的15 pmo1/ 微升BGH引物和21.1微升的PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen, Burlington, ON)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)。重鏈和輕鏈反應(yīng)物在94。C孵育2分鐘， 分別繼之以25或者30個(gè)循環(huán)94。C30秒，55°C 30秒和68°C 2分鐘。 如圖34所示，每個(gè)反應(yīng)各取 一 部分在瓊脂糖凝膠上電泳。 Ch-ARH460-16-2 VkPCR產(chǎn)物(圖A,泳道l)表現(xiàn)為800 bp的條帶，這是 輕鏈?zhǔn)驢460-16-2 Vk可變區(qū)和人恒定區(qū)的預(yù)期大小。Ch-ARH460-16-2 Vh PCR產(chǎn)物(圖B,泳道l)在1500bp處出現(xiàn)條帶，這是重鏈?zhǔn)驢460-16-2 Vh 可變區(qū)和人恒定區(qū)的預(yù)期大小。
3.2將嵌合H460-16-2基因克隆入CHEF1載體
利用MinElute PCR純化試劑盒(QIAGEN, Mississauga, ON)純化剩余 的PCR產(chǎn)物，然后與CHEF1載體一起用合適的限制性內(nèi)切酶消化以便 克隆。反應(yīng)包含1微克的DNA (純化的Ch-ARH460-16-2 Vk PCR產(chǎn)物， 純化的Ch-ARH460-16-2 Vh PCR產(chǎn)物，pNEF38 (ICOS， Seattle, WA)或者 pDEF38 (ICOS， Seattle, WA》，2微升的lOxNEBuffer 2 (New England Biolabs， Ipswich, MA)， 2孩t升的lOxBSA (New England Biolabs, Ipswich, MA)， 0.2微升的20 U/微升Xba I (New England Biolabs, Ipswich， MA)和 水補(bǔ)足20微升。反應(yīng)物在37°C孵育過(guò)夜，然后添加0.8微升的1 M Tris-HCl pH 7.4 1.0微升的1 M NaCl和0.4微升的10 U/微升Mlu I (NewEngland Biolabs， Ipswich， MA)，并在37°C孵育6小時(shí)。利用MinElute反 應(yīng)提純?cè)噭┖?QIAGEN， Mississauga, ON)純化消化的PCR產(chǎn)物，并利用 QIAEX II反應(yīng)提純?cè)噭┖?QIAGEN， Mississauga, ON)純化消化的載體。
按照5:1的摩爾比例將Ch-ARH460-16-2 Vk連接入pNEF38。 25 ng 消化的pNEF38與69 ng消化的Ch-ARH460-16-2 VkPCR產(chǎn)物、4微升的 5x連接緩沖液(Gibco BRL, Burlington, ON)、 0.5微升的1 U/微升T4 DNA 連接酶(Gibco BRL， Burlington, ON)和補(bǔ)足20微升的水混合。利用25 ng 消化的pDEF38和66 ng消化的Ch-ARH460-16-2 Vh PCR產(chǎn)物準(zhǔn)備相同 的重鏈反應(yīng)。反應(yīng)物在16。C孵育過(guò)夜，然后在65。C孵育10分鐘以滅活 酶。利用QIAEX II反應(yīng)提純?cè)噭┖?QIAGEN, Mississauga, ON)純化所述 重鏈連接反應(yīng)物。
通過(guò)添加3微升的稀釋鹽溶液(Invitrogen, Burlington, ON)和2微升的 連接反應(yīng)物到50微升的One Shot TOP10 ElectrocompTM大腸桿菌 (Invitrogen, Mississauga, ON)，將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。所述細(xì)胞 被轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1 mm比色杯，并在電穿孔儀中充電1700 V 5毫秒。立 即添加1 mL的S.O.C.培養(yǎng)基(Invitrogen， Burlington, ON)，然后細(xì)胞在 37°C 200 rpm振搖條件下孵育1小時(shí)。將200微升的一部分細(xì)胞涂板于 預(yù)溫的包含50微克/mL氨千青霉素的LB瓊脂平^反并在37°C孵育過(guò)夜
從每個(gè)平板挑取6個(gè)單菌落，用于接種4 mL包含50微克/mL的氨 芐青霉素(Sigma Oakville, ON)的2YT肉湯(Invitrogen， Burlington, ON)并 在37。C 200 rpm寺展才吝條4牛下將育過(guò)夜。利用QIAprep小量制備"i式劑盒 (QIAGEN， Mississauga， ON)從獲得的過(guò)夜培養(yǎng)物分離質(zhì)粒。用Xba I和 Mlu I消化輕鏈質(zhì)粒來(lái)鑒定包含正確大小插入物的克隆。消化液包含1微 克的質(zhì)粒DNA， 2微升的10xNEBuffer 2 (New England Biolabs， Ipswich, MA)， 2微升的10xBSA (New England Biulabs, Ipswich, MA)， 0.2微升的 20 U/微升Xba I (New England Biolabs, Ipswich， MA)和補(bǔ)足20微升的 水。反應(yīng)物在37。C孵育過(guò)夜，然后添加0.8微升的1 M Tris-HCl pH 7.4、 1.0微升的1 M NaCl和0.4微升的10 U/微升Mlu I (New England Biolabs, Ipswich，MA),并在37。C孵育6小時(shí)。重鏈質(zhì)粒用XbaI、 MluI和Hind III消化。100 ng的質(zhì)粒DNA與2微升的10xNEBuffer 2 (New EnglandBiolabs， Ipswich, MA)、 2孩i升的10xBSA (New England Biolabs， Ipswich， MA)、 0.2微升的20 U/|iL Xba I (New England Biolabs, Ipswich, MA)和補(bǔ) 足20微升的水混合。反應(yīng)物在37°C消化過(guò)夜，然后添加0.8 pl的l M Tris-HCl pH 7.4、 1 }il的1 M NaCl和0.4 |il的10 U/pl Mlu I，并在37°C 消化6小時(shí)。取出一'J、部分消化液到凝膠上電泳，并添加2 4效升的 10xNEBuffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA)、 0.3微升的15 U/微 升Hind III和7.7微升的水。反應(yīng)物在37。C下孵育6小時(shí)。
如圖35所示，在1.2。/。瓊脂糖凝膠上電泳消化的質(zhì)粒。對(duì)于輕鏈質(zhì)粒 (圖A),除#3外的所有克隆都具有目標(biāo)750 bp插入物，其對(duì)應(yīng)于輕鏈可 變區(qū)和恒定區(qū)。對(duì)于重鏈質(zhì)粒，Xba I和Mlu I消化物(圖B，泳道IA、 2A和6A)顯示1500bp的插入物，其對(duì)應(yīng)于重《連可變區(qū)和恒定區(qū)。Xbal、 Mlu I和BsiW I消化的重鏈質(zhì)粒(圖B,泳道1B、 2B和6B)在1000 bp和 500 bp處顯示條帶，其分別對(duì)應(yīng)于重鏈恒定區(qū)和可變區(qū)?？寺? (圖B) 根本不顯示條帶，標(biāo)明反應(yīng)設(shè)置存在問(wèn)題。
根據(jù)這些結(jié)果，輕鏈克隆l、 2和4以及重鏈克隆1、 2和6在約克 大學(xué)(Toronto, ON)測(cè)序。序列顯示于圖36 。輕鏈克隆pNEF38 (Ch-ARH460-1 6-2 Vk)斜和重鏈克隆pDEF38 (Ch-ARH460-16-2 Vh) #2具 有正確的序列，用于構(gòu)建嵌合H460-16-2構(gòu)建體。
4.0產(chǎn)生(ch)ARH460-16-2-IgGl的初始克隆 4.1 pMPGCR5 IgGl-Vk+hH460的構(gòu)建
該質(zhì)粒包含H460-16-2的嵌合IgGl同種型的重鏈和輕鏈 (Ch-ARH460-16-2 Vh和Ch-ARH460-16-2 Vk)，由cumate可誘導(dǎo)啟動(dòng)子 (CR5)調(diào)控。此外，該質(zhì)粒包含潮霉素的抗性基因以便于選擇穩(wěn)定的克隆 (圖37)。如下所述，該質(zhì)粒通過(guò)首先構(gòu)建兩個(gè)中間質(zhì)粒來(lái)產(chǎn)生。 A) pMPGCR5VkH460AscId的構(gòu)建
利用BamH I消化從pMPGCR5B43k (圖38)切除編碼抗體B43輕鏈 的DNA片段。在平端化(blunting)末端并利用小牛腸磷酸酶(CIP)處理后， 載體DNA與編碼輕鏈的DNA片段連接，所述輕鏈通過(guò)用Xba I和BsiW I消化pNEF38 (Ch-ARH460-16-2 VK) # 4繼之以T4 DNA聚合酶處理以平端化末端而獲得。
B) pCR5IgGlVhH460AscI的構(gòu)建
利用Hind III消化從pKCR5B43G3(圖39)切除編碼B43重鏈的DNA 片段。在用T4DNA聚合酶平端化末端并用CIP處理后，載體DNA與編 碼重鏈的DNA片段連接，所述重鏈通過(guò)用Xba I和Pacl消化 pDEF38(Ch-ARH460-16-2 VH) #2來(lái)分離。連接前，所述DNA片段用T4 DNA聚合酶平端化。
C) 最終組裝
利用Asc I消化從pCR5IgGlVhH460AscI切除重鏈表達(dá)盒(啟動(dòng)子， 編碼序列，poly A信號(hào))，并將其插入pMPGCR5VkH460AscId的Asc I 位點(diǎn)，所述pMPGCR5VkH460AscId在連接前經(jīng)CIP處理去磷酸化。所 獲構(gòu)建體(pMPGCR5IgGl-Vk+hH460)的圖譜顯示于圖37。
5.0表達(dá)嵌合H460-16-12的克隆的產(chǎn)生
2000年5月從Gibco BRL (Burlington, ON)購(gòu)得一瓶CHOSF(a),并 在添加4 mM L-谷氨酰胺的CD-CHO培養(yǎng)基(Gibco BRL， Burlington, ON) 中解凍。細(xì)胞在添加4 mM L-谷氨酰胺的CD-CHO培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10天， 并在90。/。胎牛血清(Hyclone， Logan， UT)和10% DMSO中制備冷凍儲(chǔ)存 液。按照制造商的推薦，利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Burlington, ON)通過(guò)線性化的pMPG-BFP/CMV-cTA/tk-neo轉(zhuǎn)染CHO-SF(a)細(xì)胞，產(chǎn) 生穩(wěn)定表達(dá)cumate反式激活因子(cTA)的CHOcTA細(xì)胞。三天后，在 G418(1.2 mg/mL)存在的條件下孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞，4周后，用pAdCR5GFPq 轉(zhuǎn)染G418抗性細(xì)胞庫(kù)。兩天后，在EPICS TM V (Model 752; Beckman-Coulter, Hialeah, FL)多參數(shù)激光流式細(xì)胞儀和細(xì)胞分類器上分 選表達(dá)GFP最高的細(xì)胞，再按照每孔一個(gè)細(xì)胞的密度轉(zhuǎn)移到96孔板，所 述孔包含1.2mg/mL的G418。挑取匯合的克隆并擴(kuò)增，并在腺病毒載體 (AdCR5GFPq)感染后24小時(shí)，利用Coulter EPICS Tm XI流式細(xì)胞儀 (Beckman-Coulter， Hialeah， FL)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量GFP強(qiáng)度來(lái)間接確定 細(xì)胞合成cTA的量，所述腺病毒載體表達(dá)受CR5啟動(dòng)子調(diào)控的GFP。利 用細(xì)胞顯微操作器(Caron等，2000)從用AdCR5GFPq轉(zhuǎn)導(dǎo)后熒光最強(qiáng)的克隆中轉(zhuǎn)移特定細(xì)胞到96孔板，進(jìn)行第二輪克隆。所述細(xì)胞在無(wú)G418的
條件下生長(zhǎng)，挑取匯合的集落并擴(kuò)增。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量用
AdCR5GFPq感染后產(chǎn)生的GFPq的強(qiáng)度來(lái)間接計(jì)算這些細(xì)胞產(chǎn)生cTA的 數(shù)量。擴(kuò)增一個(gè)最高產(chǎn)的亞克隆(CHOcTA-5F-l)。產(chǎn)生一個(gè)小規(guī)模的細(xì)胞 庫(kù)，并在液氮中凍存。
角罕凍CHO-SF(b)細(xì)胞(Invitrogen， Burlington, ON)，并在50 ml添加IX HT添力口劑(Invitrogen， Burlington, ON)、 4 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen， Burlington, ON)的CD CHO培養(yǎng)基(Invitrogen， Burlington, ON)中于37。C 生t傳代3次后，按照下文所述利用10% DMSO(Invitrogen, Burlington, ON)制備包含22個(gè)凍存管的細(xì)胞庫(kù)。在INRS-Institut Armand-Frappier, Montreal, QC 4企-瞼該細(xì)胞庫(kù)中支原體的存在。沒(méi)有#僉測(cè)到支原體。按照制 造商的推薦，利用Lipofectbmine 2000 (Invitrogen， Burlington, ON)通過(guò)線 性化的pMPG-/Lk-neo/e;ymR—VP16-nls轉(zhuǎn)染CHO-SF(b)細(xì)胞，產(chǎn)生穩(wěn)定表 達(dá)cumbte反式激活因子(cTA)的CHOcTA細(xì)胞。第二天，在G418 (1.2 mg/mL)存在的條件下，按照每孔10 000或者5000個(gè)細(xì)胞的濃度將細(xì)胞 分散到96孔板。3至4周后，挑取抗性集落并擴(kuò)增。感染腺病毒載體 (AdCR5GFPq)24小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量GFP的強(qiáng)度來(lái)間接確定細(xì)胞 合成cTA的數(shù)量，所述腺病毒載體表達(dá)受CR5啟動(dòng)子調(diào)控的GFP。初次 轉(zhuǎn)染后一個(gè)月加三周后，利用細(xì)胞顯微操作器(Caron等，2000)從用 AdCR5GFPq(CHOs cTA #10)轉(zhuǎn)導(dǎo)后熒光最強(qiáng)的克隆中轉(zhuǎn)移特定細(xì)胞到 96孔板，進(jìn)行第二輪克隆。所述細(xì)胞在無(wú)G418的條件下生長(zhǎng)，挑取匯 合的集落(3至4周后)并擴(kuò)增。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量感染AdCR5GFPq后 產(chǎn)生的GFPq的強(qiáng)度來(lái)間接計(jì)算這些細(xì)胞產(chǎn)生cTA的數(shù)量。擴(kuò)增最高產(chǎn) 的亞克隆(CHOcTA-10-9)。產(chǎn)生一個(gè)小身見(jiàn)模的細(xì)胞庫(kù)，并在液氮中凍存。 在INRS-Institut Armand-Frappier檢-瞼該細(xì)胞庫(kù)中支原體的存在。沒(méi)有檢 測(cè)到支原體。
通過(guò)Lipofectamine 2000試劑使用線性化的pMPGCR5IgGl-Vk+hH460 (Sspl消化)轉(zhuǎn)染表達(dá)cumate反式激活因子的CHO細(xì)胞 (CHOcTA，克隆10-9和5F-1)。第二天，按照不同濃度(10 000或者5000 個(gè)細(xì)胞/孔)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，向培養(yǎng)基中添加600嗎/mL的潮霉素B。兩至三周后，通過(guò)ELISA分析抗性集落(378個(gè)克隆) 上清中IgGl抗體的存在(通過(guò)ELISA和western印跡確定的量只是產(chǎn)生抗 體的粗略估算，因?yàn)橛糜诙康臉?biāo)準(zhǔn)品(純化的人IgG)不同于細(xì)胞產(chǎn)生的 H460-16-2的嵌合IgGl)。總共104個(gè)克隆產(chǎn)生可^r測(cè)量的抗體。
然后擴(kuò)增十二個(gè)克隆，并利用24小時(shí)產(chǎn)能試驗(yàn)通過(guò)western印跡和 SDS-PAGE檢測(cè)所述抗體的表達(dá)。還鑒定了 30。C6至13天的分批培養(yǎng)物 中的抗體產(chǎn)生(圖40和41)。在30°C進(jìn)行抗體的產(chǎn)生，因?yàn)樵谶@個(gè)溫度 CR5啟動(dòng)子作用更強(qiáng)。
6個(gè)克隆是17、 71、 80、 6'、 47'和147'。利用CHOcTA-10-9產(chǎn)生克 隆17、 71和80，而利用CHOcTA-5Fl產(chǎn)生克隆6'、 47'和147。利用人 IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)考馬斯Fluo-Orange染色估算這6個(gè)克隆在37°C 分泌4至6pg/細(xì)胞/天。
6.0產(chǎn)生(ch)ARH460-16-2-IgG2的初始克隆 6.1 pMPGCR5VK+h460-IgG2的構(gòu)建
該質(zhì)粒包含H460-16-2的嵌合IgG2同種型的重鏈和輕鏈，受cumate 可誘導(dǎo)啟動(dòng)子(CR5)的調(diào)控。此外，該質(zhì)粒包含潮霉素的抗性基因以便于 穩(wěn)定克隆的選擇(圖42)。該質(zhì)粒通過(guò)如下所述的數(shù)次PCR和亞克隆步驟 產(chǎn)生。
A)輕鏈的嵌合(pMPGCR5VkH460的構(gòu)建)
利用質(zhì)粒pVkH460-16-2#l-l以及引物ARvarlc和jctvar-k弁3(圖43) 通過(guò)PCR分離編碼H460-16-2輕鏈可變區(qū)的DNA片段(PCR B)。利用質(zhì) 粒pMPGB43k以及引物ARkappa和jctk-var#3 (圖43)通過(guò)PCR分離編碼 人IgG k輕鏈恒定區(qū)的DNA片段(PCR A>利用片段PCR B和PCR A作 為模板以及引物Arvarlc和ARkappa,通過(guò)PCR將所述可變區(qū)與所述恒 定區(qū)組裝。所獲DNA片段(PCR C)用BamH I消化并連接入 pMPGCR5B43k(圖38),所述pMPGCR5B43k之前已經(jīng)用BamH I消化以 切除B43輕鏈。連接前，線性化載體通過(guò)小牛腸磷酸酶(CIP)處理去磷酸 化。獲得的載體被稱為pMPGCR5VkH460koz。將完整的輕鏈送去測(cè)序。 除了 Kosak序列內(nèi)有一處突變外，核苷酸序列與預(yù)期一致。經(jīng)過(guò)將pMPGCR5vKH460koz的可變區(qū)與pMPGCR5kH460wrongjct(參見(jiàn)下文)可 變區(qū)交換來(lái)校正該突變，這通過(guò)用Kpn I消化這兩種質(zhì)粒并將正確的DNA 片段連接在一起來(lái)實(shí)現(xiàn)。所獲質(zhì)粒被稱為pMPGCR5VkH460,并通過(guò)測(cè) 序確認(rèn)輕鏈的核香酸序列。
B) pMPGCR5VkH460wrortgjct的構(gòu)建
該質(zhì)粒包含H460-16-2的嵌合輕鏈，在可變區(qū)和恒定區(qū)之間具有不 同的接頭。為了構(gòu)建該質(zhì)粒，利用質(zhì)粒pVkH460-16-2#l-l以及引物 ARvarlc和ARjctvar-k(圖30)通過(guò)PCR分離編碼H460-16-2輕鏈可變區(qū)的 DNA片^爻(PCR Bl)。利用質(zhì)斗立pMPGB43k以及引物ARkappa和 ARjctk-var(圖43)通過(guò)PCR分離編碼人IgG k輕鏈恒定區(qū)的DNA片段 (PCR Al)。利用片段PCR Bl和PCR Al作為模板以及引物Arvarlc和 ARkappa，通過(guò)PCR將所述可變區(qū)與所述恒定區(qū)組裝。所獲DNA片段 (PCR Cl)然后用BamH I消化并連接入pMPGCR5B43k(圖38)，所述 pMPGCR5B43k之前已經(jīng)用BamH I消化以切除B43輕鏈。連接前，所述 載體經(jīng) CIP 處理去磷酸化。獲得的載體被稱為 pMPGCR5VkH460wrongjctkoz。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)輕鏈的核苷酸序列。
C) 重鏈的嵌合(pKCR5IgG2VhH460的構(gòu)建)
利用質(zhì)粒pVhH460-16-2#3以及引物ARigg2varlc和ARhvarswa(圖43) 通過(guò)PCR分離編碼H460-16-2重鏈可變區(qū)的DNA片段(PCRD)所述PCR 產(chǎn)物用Apal消化，并連接到編碼人IgG2恒定區(qū)的4.6kbDNA片段。通 過(guò)用Apa I消化pkHc (BRI， NRC, Montreal Qc)繼之以CIP處理，獲得該 載體。所獲質(zhì)粒;故稱為pKIgG2-VhH460。
通過(guò)Swa I消化釋放pKIgG2-VhH460編碼的完整重鏈，并將其克隆 入pKCR5B43G3 (圖39)，所述pKCR5B43G3先前已經(jīng)用Hind III消化以 切除B43重鏈。連接前，所述質(zhì)粒經(jīng)T4 DNA聚合酶處理被平端化，并 經(jīng)CIP處理去磷酸化。所獲質(zhì)粒被稱為pKCR5IgG2VhH460wrongjct，并 通過(guò)測(cè)序確認(rèn)完整重鏈的核苷酸序列。嵌合IgG2的可變區(qū)和輕鏈之間的 接頭是與眾不同的。因此，決定對(duì)其進(jìn)行修飾。利用引物ApalCR5和 IgG2TVSSASTK (圖43),通過(guò)pKCR5IgG2VhH460wrongjd的PCR擴(kuò)增 包含正確接頭的DNA片段 所述PCR片段用Apa I消化并克隆入先用Apa I消化的pKCR5 IgG2VhH460wrongjct。連接前，所述4.6 kb片段經(jīng) CIP處理去磷酸化。所荻質(zhì)粒被稱為pKCR5IgG2VhH460，并通過(guò)測(cè)序確 認(rèn)嵌合IgG2的核苷酸序列。 D)IgG2表達(dá)載體的最終組裝
利用Asc I消化從pKCR5IgG2VhH460切除重鏈表達(dá)盒(啟動(dòng)子，編 碼序列，polyA信號(hào))，并將其插入pMPGCR5VkH460的Asc I位點(diǎn)，所 述pMPGCR5VkH460AscId在連接前經(jīng)CIP處理去^粦酸化。通過(guò)測(cè)序確 認(rèn)重鏈和輕鏈的完整核苷酸序列。所獲構(gòu)建體(pMPGCR5VK+h460-IgG2) 的圖譜顯示于圖42。
7.0初始克隆的產(chǎn)生
用表達(dá)嵌合IgG2抗體的質(zhì)粒pMPGCR5VK+h460-IgG2 (圖42)轉(zhuǎn)染生 長(zhǎng)在無(wú)血清化學(xué)合成培養(yǎng)基中的CHO-cTA(克隆10-9)細(xì)胞，在潮霉素存 在的條件下產(chǎn)生穩(wěn)定克隆。通過(guò)ELISA分析374個(gè)克隆的IgG2抗體表 達(dá)。80個(gè)克隆是抗體表達(dá)陽(yáng)性的。通過(guò)western印跡或者SDS-PAGE分 析58個(gè)最高產(chǎn)克隆分泌抗體的量(圖44)。最高產(chǎn)的克隆在37°C的產(chǎn)量 為5至10pg/細(xì)胞/天。6個(gè)克隆是克隆40、 50、 51、 52、 54和56。
8.0高產(chǎn)克隆的篩選
在沒(méi)有選擇壓力的條件下，利用顯微操作器對(duì)克隆40, 50. 51、 54 和56進(jìn)行亞克隆(每個(gè)克隆大約50個(gè)細(xì)胞)。通過(guò)Western印跡分析或者 SDS-PAGE,繼之以考馬斯Fuo-Orange染色，檢測(cè)51個(gè)亞克隆的生成水 平(圖45》下面是最高產(chǎn)的亞克隆，括號(hào)內(nèi)表示37。C產(chǎn)生抗體的量40F8 (11), 40B7 (7), 56B9 (7)， 40F7 (7)， 56E9 (5)， 40E11 (5)， 40D9 (6)， 56B8 (6), 5611 (4)和54E10(3)。
9.0上清的4全測(cè)
來(lái)自每個(gè)嵌合IgGl和IgG2克隆的上清4皮用作Western印跡探針， 來(lái)確定是否存在能夠檢測(cè)鼠抗體H460-16-2的靶抗原(CD44)的IgG。將包 含300微克人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的全細(xì)胞膜部分的樣品煮沸，并通過(guò)SDS-PAGE(制備凝膠，10。/。丙烯酰胺)/Western免疫印跡進(jìn)行分析。 按照Western印跡的標(biāo)準(zhǔn)程序，利用1:2稀釋(用溶于TBST的10%脫脂 享L)的細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)Western印跡。
結(jié)果表明所有上清(來(lái)源于嵌合IgGl和嵌合IgG2-分泌克隆)都能檢 測(cè)CD44，其在類似(計(jì)算的)濃度(5微克/mL;圖46和47)具有類似于從 鼠親代MAb獲得的信號(hào)。
10.0挑選的克隆在生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)
根據(jù)SDS-PAGE分析，嵌合IgGl克隆6'看起來(lái)是分泌最高的克隆， 并且在Western印跡中，其與鼠H460-16-2以類似的方式結(jié)合 MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞膜制備物。因此，使用克隆6'在30°C的搖瓶中 分批培養(yǎng)產(chǎn)生抗體。通過(guò)SDS-PAGE繼之以考馬斯Fluo-Orange染色(圖
48) ，鑒定每批的抗體濃度。不同批次的體積和抗體濃度顯示如下批次 super22Nov: 1.6 L， 150mg/L;批次N3: 65 L, 200 mg/L;批次N4: 65 L, 100mg/L以及批次N5和N6: 8 L， 200 mg/L?？寺?'被用于將來(lái)所有的嵌 合IgGl研究，將其稱為(ch)ARH460-16-2-IgGl 。
根據(jù)SDS-PAGE分析，嵌合IgG2克隆40B7看起來(lái)是分泌最高的克 隆，并且在Western印跡中，其與鼠H460-16-2以類似的方式結(jié)合 MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞膜制備物。因此，生產(chǎn)更多量的克隆40B7(圖
49) 。生產(chǎn)了包含大約140mg/升抗體的20升培養(yǎng)基。通過(guò)SDS-PAGE繼 之以考馬斯FluOrange染色，測(cè)定培養(yǎng)基中的抗體濃度?？寺?0b7被用 于將來(lái)所有的嵌合IgG2研究，將其稱為(ch)ARH460-16-2-IgG2。
實(shí)施例10
MDA-MB-231細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)
參考圖50和51， 4至6周大的雌性SCID小鼠經(jīng)頸背皮下注射植入 溶于IOO微升鹽水的5百萬(wàn)人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)。每周用卡鉗測(cè) 量腫瘤生長(zhǎng)。當(dāng)移植后35天大部分群組的平均腫瘤體積達(dá)到91 mm、范 圍55-143 mm"時(shí)，小鼠根據(jù)胂瘤大小被分成幾組。來(lái)自各組的小鼠被隨 機(jī)分配到4個(gè)治療組(每組10只)，這樣的話每個(gè)治療組的平均腫瘤體積與其他組不會(huì)顯著不同。每組腹腔內(nèi)注入稀釋后體積為300微升的15
mg/kg H460-16隱2 、 (ch)ARH460-16-2-IgG 1 、 (ch) ARH460墨16-2-IgG2測(cè)試 抗體或者緩沖液對(duì)照，所述稀釋使用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀釋劑從原液濃度稀釋。然后按照相 同方式每周給藥所述抗體3次，共10次劑量，直到移植后第57天。大 約每7天用卡鉗測(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)，直到移植后第62天或者個(gè)別動(dòng)物達(dá) 到CCAC終點(diǎn)。在整個(gè)研究期間每周一次記錄動(dòng)物的體重。研究結(jié)束時(shí)， 根據(jù)CCAC指南處死所有的動(dòng)物。
如圖50所示，在人乳腺癌的已確立的MDA-MB-231體內(nèi)才莫型中， 鼠H460-16-2和(ch)ARH460-16-2-IgGl均降低腫瘤生長(zhǎng)。在第62天，最 后一次劑量給藥后5天，H460-16-2治療導(dǎo)致39%的腫瘤生長(zhǎng)抑制(平均 T/C=57%)。腫瘤生長(zhǎng)的這種減低顯著不同于對(duì)照&=0.0037)。嵌合抗體 (ch)ARH460-16-2-IgGl導(dǎo)致增強(qiáng)的肺瘤生長(zhǎng)抑制，為64%(平均 T/C=26.9%; p<0.0001)。相反，和緩沖液對(duì)照相比，嵌合抗體的IgG2形 式((ch)ARH460-16-2-IgG2)沒(méi)有抑制肺瘤生長(zhǎng)(TGI=0% ; 平均 T/C=122%; p=0.7264)。
在整個(gè)研究期間沒(méi)有臨床毒性癥狀。每周測(cè)量一次的體重是健康狀 況和發(fā)育停滯的表征。圖51顯示整個(gè)研究期間各治療組的體重結(jié)果。與 緩沖液對(duì)照組相比，來(lái)自H460-16-2或者(ch)ARH460-16-2-IgG2治療組 的小鼠的體重沒(méi)有顯著變化。但是緩沖液對(duì)照治療組和 (ch)ARH460-l6-2-IgGl治療組之間存在顯著的體重降低(p二0.0005)。
總之，在MDA-MB-231乳腺癌模型中，(di) ARH460-16-2-TgGl顯示 與鼠抗體相同或者比鼠抗體更高的效果。相反，在人MDA-MB-231乳腺 癌的這種模型中，(ch)ARH460-16-2-IgG2嵌合抗體沒(méi)有降低腫瘤生長(zhǎng)。
實(shí)施例11
用H460-16-2、 (ch)ARH460-16-2-IgGl和(ch)ARH460-16-2IgG2處理的 MDA-MB-231細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白-V染色
進(jìn)行膜聯(lián)蛋白-V染色以確定H460-16-2的嵌合形式是否能夠按照鼠 對(duì)應(yīng)物的相同方式誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的凋亡。用0.25、2.5和20微克/mL的H460-16-2 、 (ch)ARH460-16-2-IgGl或者 (ch)ARH460-16-2-IgG2處理MDA-MB-231細(xì)胞24小時(shí)。每種抗體與相 同濃度的相應(yīng)同種型對(duì)照(1B7.11,抗TNP，鼠IgGl， k，實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)；人 骨髓瘤IgGl , k, Sigma, Oakville， ON;人骨髓瘤IgG2， k， Sigma, Oakville， ON)—起重復(fù)一企測(cè)3次。包含未處理的樣品作為陰性對(duì)照，并包含喜樹(shù)堿 (Biovision; Exton， PA)作為陽(yáng)性對(duì)照。利用熒光測(cè)定;朱(BD Bioscience, Oakville， ON)補(bǔ)償FACS裝置的焚光偶聯(lián)物的光溢出。細(xì)胞然后用膜聯(lián)蛋 白-V和7AAD染色，并于1小時(shí)內(nèi)在FACSArray上獲取。
在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)—驗(yàn)中，將鼠和兩種嵌合H460-16-2抗體在彼此之間以 及與它們相應(yīng)的同種型對(duì)照抗體之間比較(圖52)。圖52還顯示2個(gè)實(shí)驗(yàn) 的平均值。發(fā)現(xiàn)用同種型對(duì)照處理的細(xì)胞的自發(fā)凋亡作用與只用賦形劑 處理的細(xì)胞類似。發(fā)現(xiàn)在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，鼠和人嵌合IgGl和IgG2 H460-16-2 抗體均以劑量依賴性方式誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系的凋亡，在((^)八101460-16-2 IgGl和IgG2抗體中觀察到更高的凋亡作用。該結(jié)果表明與嵌合IgGl抗 體相比，在體外(ch)ARH460-16-2-lgG2抗體具有最大的凋亡作用。
所有3種抗體均顯示超過(guò)它們預(yù)期同種型對(duì)照的壞死和壞死/凋亡群 百分比的增加。在(ch)ARH460-16-2-IgG2中觀察到壞死和壞死/凋亡群百 分比的最大增加，然后是(ch)ARH460-l6-2-TgG1，再次是H460-16-2
優(yōu)勢(shì)證據(jù)標(biāo)明，H460-16-2、 (ch)ARH460-16-2-IgG2、 (ch)ARH460-16-2-IgGl和AR37A335.8通過(guò)CD44上存在的表位的連接來(lái)介導(dǎo)抗癌作用。 在實(shí)施例5中已經(jīng)顯示，H460-16-2和AR37A335.8抗體可用于免疫沉淀 來(lái)自表達(dá)細(xì)胞例如MDA-MB-231細(xì)胞的同源抗原。此外還顯示，利用下 列說(shuō)明的技術(shù)，但并不限于FACS、細(xì)胞ELISA或者IHC, H460-16-2、 (ch)ARH460-16-2-IgG2、 (ch)ARH460-16-2-IgGl和AR37A335.8抗體可用 于檢測(cè)表達(dá)CD44抗原部分的細(xì)胞和/或組織，所述CD44抗原部分與上 述抗體特異結(jié)合。
因此，利用FACS、細(xì)胞ELISA或者IHC分析，可以顯示免疫沉淀 的 H460-16陽(yáng)2 、 (ch)ARH460-16-2-lgG2 、 (ch)AKH460陽(yáng)16-2-IgGi 和 AR37A335.8抗原能夠抑制任一抗體對(duì)這類細(xì)胞或者組織的結(jié)合。此外， 就像H460隱16-2、 (ch)ARH460-16-2陽(yáng)IgG2 、 (ch)ARH460-16-2畫(huà)IgGl和AR37A335.8抗體一樣，其他抗CD44抗體可用于免疫沉淀和分離其他開(kāi)
式的CD44抗原，并且利用相同類型的分析，所述抗原也可用于抑制這 些抗體與表達(dá)該抗原的細(xì)胞或者組織的結(jié)合。
引用程度如同每個(gè)出版物被特別單獨(dú)地指明以引用的方式并入本文。
應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明以某種形式被說(shuō)明，但這不是要將本發(fā)明限 定在本文所描述和顯示的特定形式或布局。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易 見(jiàn)的是，在不偏離本發(fā)明的范圍的前提下還可做出多種變化，本發(fā)明并 不局限于本說(shuō)明書(shū)中所顯示和描述的內(nèi)容。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易看 出使本發(fā)明良好地適合實(shí)現(xiàn)所描述的目的并獲得最終結(jié)果和益處，以及 其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相關(guān)化 合物、方法、操作和技術(shù)都是優(yōu)選實(shí)施方案中有代表性的，其目的在于 示例，并不是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠想到包括在本 發(fā)明精神的范疇內(nèi)的變化和其它用途，并由所附權(quán)利要求書(shū)的范圍所限 定。盡管借助特定的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解所要求保 護(hù)的本發(fā)明并不僅僅局限于這些特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，所描述的實(shí) 施本發(fā)明的一些方式的的各種變化，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易 見(jiàn)的，均在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。<formula>formula see original document page 80</formula>為專禾i j禾呈序白勺i散生物寸呆藏耳又f尋國(guó)p示承i人白勺布達(dá)f風(fēng)其斤條纟勺
國(guó)P示表
才-艮J居第7.3條發(fā)布的f散生物4呆藏i正明以及
t'艮手居第io.2條發(fā)布的微生物存、;舌聲明
(譯文)
致(保藏人或代理人名稱及地址)
Arius Research Inc.(阿里烏斯研究公司)
代理人Jean de Sousa-他zler
55 York Street 16th Floor
Toronto, Ontario
Canada M5 J 1R7
(加拿大多倫多)
代表Arius Research Inc.(阿里烏斯研究公司)而保藏 保藏人標(biāo)識(shí)號(hào)
小鼠雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2 小鼠雜交瘤細(xì)胞系H460-22-1 小鼠雜交瘤細(xì)胞系7BDT-60
專利保藏指定 PTA-4621 PTA-4622 PTA-4623
所述保藏附有以下說(shuō)明的_科學(xué)性描述_建議的分類描述。本國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
于2002年9月4 Ef收到所述保藏，并且所述保藏已被接受。
應(yīng)您的要求我們旌向您通知30年內(nèi)對(duì)所述齒種的請(qǐng)求。
如果布達(dá)佩斯條約成員國(guó)專利局證明某人有權(quán)收到該菌種，或者如果已出版引用該菌 種的美國(guó)專利，且關(guān)國(guó)專利與商標(biāo)局或本保藏人指示ATCC釋放該菌種，那么將可獲 得該菌種。
如果該培養(yǎng)物在所述保藏的有效期內(nèi)死亡或被破壞，那么您將負(fù)有用相同的活培養(yǎng)物 代替它的責(zé)任。
在自保藏日起至少30年內(nèi)，或者在最近的樣品請(qǐng)求之后5年內(nèi)，該菌種將被維持， 所述時(shí)間以較長(zhǎng)者為準(zhǔn)。美國(guó)和其他很多國(guó)家都是布達(dá)佩斯條約成員國(guó)。
丁-2002年9月6日檢測(cè)以上所引用培養(yǎng)物的存活。在當(dāng)天，所述培養(yǎng)物是存活的。
國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)American Type Culture Collection(美國(guó)典型微生物保藏中心)， Manassas, VA 20110-2209 USA(美國(guó)弗吉尼亞) ATCC授權(quán)代表簽字
Marie Harris_ 日期2002年10月9日
巻號(hào)2056.009 &美國(guó)序列號(hào)09/727361加拿大國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)
加拿大衛(wèi)生部國(guó)立微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
馬尼托巴省溫尼伯市阿林頓街1015 R3E 3R2
加拿大_
國(guó)P示IDAC/BP/4表
微生物保藏證明(譯文)
(根據(jù)布達(dá)佩其開(kāi)條約第7.1條發(fā)布)
所附文件為原始保藏合同與存活聲明的副本
1、 國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受了以下具體描述的微生物
保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦萊麗),ARIUS Research Inc.(阿里烏斯研究公
地址 55 York Street, 16th floor, Toronto, ON M5J 1R7〖加拿大多倫多) 提交日期2004年1月28日
2、 保藏的標(biāo)識(shí)
保藏人對(duì)培養(yǎng)物指定的名稱和符號(hào)
AR37A335.8
由該國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào):
280104-06
以上標(biāo)識(shí)的保藏附有
□科學(xué)性描述
□建議的分類指定
3、國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IDAC授權(quán)代表^1
口期2004年1月28 口
電話(204)78;207tJ 傳真(204)789-2097微生物保藏存活證明譯文
(根據(jù)布達(dá)佩其開(kāi)條約第10.2條發(fā)布)
姓名Ferris Lander先生
地址2855 PGA Boulevard. Palm Beach Gardens, Florida, USA 33410
(美國(guó)佛羅里達(dá))
1. 保藏人
姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦萊麗),ARIUS Research Inc.(阿単烏斯研究公司) 地址55 York Street, Suite 1600, Toronto, ON M5J 1R7(加拿大多倫多)
2. 保藏標(biāo)識(shí)
由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)280104-06 保藏日期(或最近相關(guān)日期)2004年1月28日
3. 存活檢測(cè)
于2Q04年2月23日對(duì)以上標(biāo)識(shí)的微生物進(jìn)行存活檢測(cè)， 在以上指出的日期，所述微生物
0存活
□不再存活
進(jìn)行存活檢測(cè)的條件(在己請(qǐng)求該信息且檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)填寫(xiě))
4.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)授權(quán)代表簽字:
日期2004年2月23日
權(quán)利要求
1. 分離的單克隆抗體，所述抗體由IDAC保藏的保藏號(hào)為280104-06的克隆編碼。
2. 如權(quán)利要求l所述的抗體，所述抗體是人源化的。
3. 如權(quán)利要求l所述的抗體，所述抗體是嵌合的。
4. 由IDAC保藏的保藏號(hào)為280104-06的分離的克隆。
5. 引發(fā)抗體誘導(dǎo)的選自人類肺瘤的組織樣品中癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作 用的方法，其包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣品；提供IDAC保藏的保藏號(hào)為280104-06的克隆編碼的分離的單克隆抗 體或者其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體，所述配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸?制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力；和將所述分離的單克隆抗體或者其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體與所述組 織樣品接觸；其中所述分離的單克隆抗體或者其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體與所述 組織樣品的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
6. 如權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體的配體。
7. 如權(quán)利要求2所述的人源化抗體的配體。
8. 如權(quán)利要求3所述的嵌合抗體的配體。
9. 如權(quán)利要求l、 2、 3、 6、 7或者8中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或 者配體，所述抗體或者配體與選自細(xì)胞毒部分、酶、放射性化合物和造血細(xì)胞的成員偶聯(lián)。
10.治療哺乳動(dòng)物中對(duì)抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用敏感的人類 腫瘤的方法，其中所述人類肺瘤表達(dá)與分離的單克隆抗體或者其細(xì)胞的 細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體特異結(jié)合的抗原，所述分離的單克隆抗體由IDAC保藏的保藏號(hào)為280104-06的克隆編碼，所述配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸?制所述分離的單克隆抗體與其耙抗原結(jié)合的能力，所述方法包括給予所 述哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的有效量的所述單克隆抗體或者所 述其細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)配體，從而減輕所述哺乳動(dòng)物的肺瘤負(fù)荷。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法, 胞毒部分偶聯(lián)。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法,素。
13. 如權(quán)利要求10所述的方法, 補(bǔ)體。
14. 如權(quán)利要求10所述的方法， 抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
15. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述單克隆抗體或者配體與細(xì)其中所述細(xì)胞毒部分是放射性同位其中所述單克隆抗體或者配體活化其中所述單克隆抗體或者配體介導(dǎo)其中所述單克隆抗體是人源化的。
16. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合的。
17. 能夠特異結(jié)合人CD44的單克隆抗體或者配體，其中與所述單克 隆抗體或者其配體反應(yīng)的人CD44的一個(gè)或者多個(gè)表位和與分離的單克 隆抗體反應(yīng)的人CD44的一個(gè)或者多個(gè)表位相同，所述分離的單克隆抗 體獲得自具有ATCC保藏號(hào)PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2;所述單克隆抗體或者配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的單克隆抗體與其人CD44耙抗原結(jié)合的能力。
18. 能夠特異結(jié)合人CD44的單克隆抗體或者配體，其中與所述單克 隆抗體或者其配體反應(yīng)的人CD44的一個(gè)或者多個(gè)表位和與分離的單克 隆抗體反應(yīng)的人CD44的一個(gè)或者多個(gè)表位相同，所述分離的單克隆抗 體獲得自具有IDAC保藏號(hào)280104-06的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R37A335.8;所 述單克隆抗體或者配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的單克隆抗 體與其人CD44把抗原結(jié)合的能力。
19. 能夠特異結(jié)合人CD44的單克隆抗體或者配體，其中與所述單克 隆抗體或者其配體反應(yīng)的人CD44的一個(gè)或者多個(gè)表位和與分離的單克 隆抗體反應(yīng)的人CD44的一個(gè)或者多個(gè)表位相同，所述分離的單克隆抗 體從選自具有ATCC保藏號(hào)PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2和具有 IDAC保藏號(hào)280104-06的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R37A335.8的雜交瘤獲得；所 述單克隆抗體或者配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的舉克隆抗 體與其人CD44耙抗原結(jié)合的能力。
20. 治療表達(dá)人CD44抗原的人類癌性肺瘤的方法，包括對(duì)患有所述人類癌癥的個(gè)體進(jìn)行至少 一種單克隆抗體或者配體的給 藥，所述單克隆抗體或者配體識(shí)別的一個(gè)或者多個(gè)表位與雜交瘤產(chǎn)生的 單克隆抗體識(shí)別的一個(gè)或者多個(gè)表位相同，所述雜交瘤選自具有ATCC 保藏號(hào)PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2和具有IDAC保藏號(hào) 280104-06的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R37A335.8;其中所述一個(gè)或者多個(gè)表位的結(jié)合有效降低腫瘤負(fù)荷。
21. —種治療表達(dá)人CD44抗原的人類癌性肺瘤的方法，包括 給藥于患有所述人類癌癥的個(gè)體與至少 一種化療劑聯(lián)用的、至少一種單克隆抗體或者配體，所述單克隆抗體或者配體識(shí)別的一個(gè)或者多個(gè) 表位與雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體識(shí)別的一個(gè)或者多個(gè)表位相同，所述雜交瘤選自具有ATCC保藏號(hào)PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2和具有 IDAC保藏號(hào)280104-06的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R37A335.8; 其中所述給藥有效降低肺瘤負(fù)荷。
22. 確定選自人類腫瘤的組織樣品中表達(dá)CD44的一個(gè)或者多個(gè)表 位的癌性細(xì)胞存在的結(jié)合分析，包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣品；提供至少一種單克隆抗體或者配體，所述單克隆抗體或者配體識(shí)別 的 一個(gè)或者多個(gè)表位與雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體識(shí)別的一個(gè)或者多個(gè)表 位相同，所述雜交瘤選自具有ATCC保藏號(hào)PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系 H460-16-2和具有IDAC保藏號(hào)280104-06的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R37A335.8;將所述至少一種單克隆抗體或者其配體與所述組織樣品接觸；和確定所述至少一種單克隆抗體或者其配體與所述組織樣品的結(jié)合；從而指示所述癌性細(xì)胞在所述組織樣品中的存在。
23. 單克隆抗CD44嵌合抗體或者其配體，其中所述單克隆抗CD44 嵌合抗體或者其配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种艭D44與分離的單克隆 抗體結(jié)合的能力，所述分離的單克隆抗體由ATCC保藏的保藏號(hào)為 PTA-4621的克隆編碼。
24. 引發(fā)抗體誘導(dǎo)的選自人類腫瘤的組織樣品中癌性細(xì)胞的細(xì)胞毒 性作用的方法，其包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣品；提供單克隆抗CD44嵌合抗體或者其配體，其中所述單克隆抗CD44 嵌合抗體或者其配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种艭D44與分離的單克隆 抗體結(jié)合的能力，所述分離的單克隆抗體由ATCC保藏的保藏號(hào)為 P丁A-4621的克隆編碼；和將所述抗CD44嵌合單克隆抗體或者其配體與所述組織樣品接觸。
25. 治療哺乳動(dòng)物中對(duì)抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用敏感的人類腫瘤的方法，其中所述人類腫瘤表達(dá)CD44，所述方法包括給予誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性的有效量的單克隆抗CD44嵌合抗體或者 其配體從而降低所述哺乳動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷，其中所述單克隆抗CD44嵌 合抗體或者其配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种艭D44與分離的單克隆抗 體結(jié)合的能力，所述分離的單克隆抗體由ATCC保藏的保藏號(hào)為 PTA-4621的克隆編碼。
26. 治療表達(dá)人CD44抗原的人類癌性肺瘤的方法，包括 對(duì)患有所述人類癌癥的個(gè)體進(jìn)行至少一種單克隆抗CD44嵌合抗體或者其配體的給藥，其中所述單克隆抗CD44嵌合抗體或者其配體的特 征在于具有竟?fàn)幮砸种艭D44與分離的單克隆抗體結(jié)合的能力，所述分 離的單克隆抗體由ATCC保藏的保藏號(hào)為PTA-4621的克隆編碼；其中所述抗CD44嵌合抗體或者其配體的結(jié)合有效降低肺瘤負(fù)荷。
27. 治療表達(dá)人CD44抗原的人類癌性肺瘤的方法，包括 對(duì)患有所述人類癌癥的個(gè)體進(jìn)行至少一種單克隆抗CD44嵌合抗體或者其配體的給藥，其中所述單克隆抗CD44嵌合抗體或者其配體的特 征在于具有竟?fàn)幮砸种艭D44與分離的單克隆抗體結(jié)合的能力，所述分 離的單克隆抗體由ATCC保藏的保藏號(hào)為PTA-4621的克隆編碼；其中所述抗CD44嵌合抗體或者其配體的所述給藥有效降低腫瘤負(fù)荷。
28. 確定選自人類肺瘤的組織樣品中表達(dá)人CD44抗原的癌性細(xì)胞 存在的結(jié)合分析，包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣品；提供至少一種單克隆抗CD44嵌合抗體或者其配體，其中所述單克 隆抗CD44嵌合抗體或者其配體的特征在于具有竟?fàn)幮砸种艭D44與分離 的單克隆抗體結(jié)合的能力，所述分離的單克隆抗體由ATCC保藏的保藏 號(hào)為PTA-4621的克隆編碼；將所述至少一種抗CD44嵌合抗體或者其配體與所述組織樣品接觸；和確定所述至少一種抗CD44嵌合抗體或者其配體與所述組織樣品的 結(jié)合；從而指示所述癌性細(xì)胞在所述組織樣品中的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌性疾病的診斷和治療，具體涉及顯示CD44表面表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性介導(dǎo)；最具體涉及癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)作為起始細(xì)胞毒性反應(yīng)的手段的用途，所述CDMAB任選地與一種或者多種化療劑聯(lián)用。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合分析。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101432307SQ200780015423
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2007年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日
發(fā)明者利薩·M·切凱托, 大衛(wèi)·S·F·楊, 海倫·P·芬德利, 福爾圖納塔·麥唐基, 蘇姍·E·哈恩 申請(qǐng)人:阿里烏斯研究公司