專利名稱：IL-1β結(jié)合抗體及其片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及IL-I β結(jié)合抗體并包括其片段，編碼這些抗體的核酸，以及包含所述 抗體或核酸的載體、細(xì)胞和組合物，以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子的白介素-I (IL-I)家族已經(jīng)涉及疾病狀態(tài)例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨關(guān)節(jié)炎、克羅恩病(Crohn’ s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、敗血性休克、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、移植物抗宿主疾病、動脈粥樣硬化、成人T細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)以及阿爾茨海默病。IL-I家族成員包括IL-Ia、IL-I β和IL_lRa。盡管與它們結(jié)合IL-I受體(IL-1R1和IL-1R2)的能力有關(guān)，但這些細(xì)胞因子的每一種是由不同的基因所表達(dá)的，并且具有不同的一級氨基酸序列。而且，這些細(xì)胞因子的生理學(xué)活性可以被區(qū)分。破壞IL-I受體信號傳導(dǎo)的化合物已經(jīng)被作為治療藥物進(jìn)行研究以治療IL-I介導(dǎo)的疾病。這些化合物包括重組IL-IRa(Amgen Inc.，Thousand Oaks, CA)和IL-1受體“陷講(trap) ”肽(Regeneron Inc. , Tarrytown, NY)。結(jié)合IL-1細(xì)胞因子的動物來源單克隆抗體也已經(jīng)被研究。然而，由于其免疫原性，因此它們的臨床價值是有限的。例如，已知被給藥小鼠單克隆抗體的人類受試者會產(chǎn)生人抗小鼠抗體(HAMA)。已經(jīng)報道HAMA會降低單克隆抗體治療的效率，并產(chǎn)生負(fù)面反應(yīng)包括對腎臟的損傷。其它的IL-I β抗體受到它們的結(jié)合親和力和/或它們效價(potency)的限制。因此，需要其它能夠阻斷IL-I受體信號傳導(dǎo)的化合物。本發(fā)明提供了這類化合物，以及制備和應(yīng)用這些化合物的方法。簡要概述本發(fā)明提供了 IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列。這里還提供了編碼所述抗體或抗體片段的核酸，以及包含所述核酸的載體，包含所述核酸或載體的細(xì)胞，以及包含所述抗體、核酸或載體的組合物。本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防哺乳動物中疾病的方法，其包括為需要治療的哺乳動物給藥有效量的本發(fā)明抗體或抗體片段、核酸或載體，這樣在哺乳動物中疾病得到了治療或者預(yù)防。本發(fā)明提供了一種制備親和力成熟的IL-I β結(jié)合多肽的方法，其包括(a)提供第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸包含編碼IL-I β結(jié)合多肽的核酸序列，所述IL-I β結(jié)合多肽包含SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :26中任一項的氨基酸序列，其中所述第二核酸包括與第一核酸序列至少有一個核苷酸不同的核酸序列；(b)進(jìn)行核酸混編(shuffling)以提供兩種或者多種突變的核酸；(c)選擇編碼突變的核酸，其編碼的多肽α)以比第一核酸所編碼的多肽高的親和力結(jié)合IL-I β，(ii)對于IL-I β具有高于IL-I α的選擇性，所述選擇性高于第一核酸所編碼的多肽對IL-I β的選擇性，(iii)對于IL-I β具有比第一核酸所編碼的多肽低的平衡結(jié)合解離常數(shù)(Kd)，或者(iv)抑制動物中IL-I β誘導(dǎo)的血清IL-6表達(dá)達(dá)到高于第一核酸所編碼的多肽高的程度；以及(d)表達(dá)所選擇的突變核酸，這樣制備了親和力成熟的IL-I β結(jié)合多肽。本發(fā)明提供了新型的IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其以低于3ρΜ的解離常數(shù)結(jié)合到人IL-I β，可選大約2ρΜ或更少，優(yōu)選大約IpM或更少。這些高親和力抗體被設(shè)計能夠用于各種治療或者預(yù)防IL-I相關(guān)的疾病或病癥的方法?？蛇x地，或者另外地，所述IL-I β結(jié)合抗體或者IL-I β結(jié)合片段結(jié)合到IL-I β抗原決定簇上，這樣所結(jié)合的抗體或片段基本上不會防止IL-I β結(jié)合到I型IL-I受體上。可選地，或者另外地，所述IL-I β結(jié)合抗體或者IL-I β結(jié)合片段結(jié)合到與這里所描述的示例性抗體的一種或者多種 基本上相同的抗原決定簇上，例如被指定為ΑΒ7的抗體，其包含重鏈可變區(qū)?？蛇x地，或者另外地，所述IL-I β結(jié)合抗體或者IL-I β結(jié)合片段與具有SEQ ID NO :11輕鏈可變區(qū)以及SEQ ID NO :15重鏈可變區(qū)的抗體競爭結(jié)合。可選地，或者另外地，本發(fā)明包括結(jié)合到包含在序列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID NO :36)中的抗原決定簇的IL-I β結(jié)合抗體或者IL-I β結(jié)合片段。典型的IL-I β結(jié)合抗體包括這里被指定為ΑΒ5和ΑΒ7的抗體。本發(fā)明還提供了 IL-I結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其具有小于3ρΜ的解離常數(shù)，可選大約IpM或者更低，可選這里所公開的其它解離常數(shù)中的任何一種，并且其包含重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含下列氨基酸序列中的一種氨基酸序列SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23 或SEQ ID NO :24，或者可選地氨基酸序列 SEQID NO :12、SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO :21，或者可選地氨基酸序列 SEQ ID NO 13 或 SEQID NO :21，或者可選地氨基酸序列SEQ ID NO :8、SEQ ID N0:14或SEQ ID N0:15，或者可選地氨基酸序列SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 150所述IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段還可以包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10或SEQ ID NO llo作為本發(fā)明的另一個實施方式，提供了新型的IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其以在大約6ρΜ至大約50ρΜ之間的解離常數(shù)結(jié)合IL-I β，可選在大約13ρΜ至大約25ρΜ之間，可選大約19ρΜ，其中所述抗體或片段具有小于O. 5ηΜ(500ρΜ)的IC5tl，可選在大約5ρΜ至大約200ρΜ之間，可選在大約IOpM至大約IOOpM之間，可選大約30ρΜ，以抑制IL-I β刺激的IL-6從人成纖維細(xì)胞中釋放。抑制IL-I β刺激的IL-6從人成纖維細(xì)胞釋放的IC5tl是指抑制IL-I β刺激的IL-6從人成纖維細(xì)胞釋放的50%所需濃度。典型的抗體包括這里指定為ABl的抗體。本發(fā)明還提供了 IL-I結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其具有在大約6ρΜ至大約50ρΜ之間的解離常數(shù)，并包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 或 SEQ ID NO :6 之一，可選地氨基酸序列 SEQ ID NO :4 或 SEQ ID Ν0:5 之一，可選地是SEQ ID NO :4氨基酸序列。設(shè)計在某些情況中，具有相對高解離常數(shù)的IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段可以是期望的，例如，用于治療或者預(yù)防IL-I相關(guān)疾病或者病癥的某些期望相對較低親和力水平的方法。
示例性抗體包括被指定為AB1、AB2、AB3、AB4、AB5、AB6、AB7、AB8和AB9的抗體。
ABl包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列。AB2包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列。AB3包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列。AB4包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列。AB5包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列。AB6包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :10的氨基酸序列。AB7包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重 鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列。AB8包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :25的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :10的氨基酸序列。AB9包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :26的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ IDNO=Il的氨基酸序列。本發(fā)明包括IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段，其具有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含在 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 4-8, SEQ ID NO :12-15, SEQ ID NO 2USEQ ID NO:23-26, SEQ ID NO :28-35 或 SEQ ID NO :42-57 中所列序列的任意一種，可選在 SEQ ID NO:21 中所列序列的任意一種，可選在 SEQ ID NO 4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO :8中所列序列的任意一種，可選在SEQ ID N0:12或SEQ ID N0:13中所列序列的任意一種，可選在 SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID N0:25 或 SEQ ID NO :26 中所列序列的任意一種。本發(fā)明還包括IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段，其具有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含在SEQ ID NO USEQ ID N0:9_ll或SEQ ID NO :27所列序列中的任意一種，可選在SEQ ID NO :1中所列序列的任意一種，可選在SEQ ID NO :9中所列序列的任意一種，可選在SEQ ID NO : 10或SEQ ID NO 11中所列序列的任意一種。本發(fā)明還包括IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段，其具有在SEQ ID NO :2、SEQID NO :4-8,SEQ ID NO :12-15,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23-26,SEQ ID NO :28-35 或 SEQID NO :42-57中所列序列的重鏈可變區(qū)之一，以及在SEQ ID NO USEQ ID N0:9_ll或SEQID NO 27中所列序列的輕鏈可變區(qū)之一。本發(fā)明還包括IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段，其具有不會結(jié)合IL-I β但代替為用于其它功能的部分，例如循環(huán)半衰期、直接細(xì)胞毒性作用、可檢測標(biāo)記或者受體內(nèi)源補體級聯(lián)反應(yīng)或內(nèi)源細(xì)胞毒性的激活。本發(fā)明的抗體可以包括抗體恒定區(qū)的全部或者一部分。所述恒定區(qū)可以選自任何同種型包括IgA(例如IgAl或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。例如，所述抗體可以包含IgG2區(qū)。除了或者代替包含恒定區(qū)外，本發(fā)明的抗體或片段可以包括抗原決定簇標(biāo)簽、補救受體抗原決定簇、用于診斷或純化目的的標(biāo)記部分，或者細(xì)胞毒性部分例如放射性核素或毒素。本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段的任意一種以及藥物上合適的運載體(carrier)、賦形劑或稀釋劑。優(yōu)選本發(fā)明的抗體和化合物能夠以治療有效量為需要這類治療的受試者進(jìn)行給藥，即其量足以改善與目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的病癥或者紊亂的臨床體癥或癥狀。在相關(guān)的實施方式中，所述藥物組合物還包含第二活性藥劑。在另一個相關(guān)的實施方式中，提供了藥物組合物，其中所述第二活性藥劑是生長因子或細(xì)胞因子的抗體或拮抗劑。在另一個實施方式中，所述第二活性藥劑是另一種抗體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，設(shè)計所述IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段用于制備預(yù)防或者減輕與IL-I相關(guān)的病癥或者紊亂的藥物。在上述任何應(yīng)用中，所述藥物可以與使用第二活性藥劑的治療進(jìn)行組合。在本發(fā)明的另一個實施方式中，設(shè)計本發(fā)明抗體的協(xié)同組合在制備治療表現(xiàn)出這里所公開的IL-I相關(guān)病癥或紊亂的癥狀的患者的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與使用第二活性藥劑的治療進(jìn)行組合。在相關(guān)的實施方式中，所述第二活性藥劑是細(xì)胞因子或生長因子的抗體或拮抗劑。設(shè)計任何前述應(yīng)用的實施方式，其中所述IL-I β結(jié)合抗體或片段在所述藥物中的量是以有效降低達(dá)到治療效果所需第二活性
藥劑劑量的劑量。本發(fā)明還設(shè)計了試劑盒。在一個實施方式中，試劑盒包含治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的化合物或組合物(例如抗體、片段、核酸、載體或細(xì)胞)，其被包裝在容器中，例如小瓶(vial)或瓶子，并且還包括貼到或者與容器包裝的標(biāo)簽，該標(biāo)簽描述該容器的內(nèi)含物，并提供關(guān)于該容器的內(nèi)含物用于防止或者減輕與目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的病癥或疾病的指示和/或使用說明。附圖某些觀點的簡要說明圖I是一對氨基酸序列，其對應(yīng)于這里所描述的某些抗體的可變區(qū)的輕鏈和重鏈。氨基酸序列中被下劃線標(biāo)記的部分表示互補性決定區(qū)域(CDR)；圖2是一組氨基酸序列，其對應(yīng)于抗體ΑΒ1、ΑΒ2、ΑΒ3和ΑΒ4的可變區(qū)的輕鏈和重鏈。氨基酸序列中被下劃線標(biāo)記的部分表示互補性決定區(qū)域(CDR)；圖3是一組氨基酸序列，其對應(yīng)于抗體ΑΒ5、ΑΒ5. I和ΑΒ5. 2的可變區(qū)的輕鏈和重鏈。氨基酸序列中被下劃線標(biāo)記的部分表示互補性決定區(qū)域(CDR)；圖4是一組氨基酸序列，其對應(yīng)于抗體ΑΒ5. 3和ΑΒ5. 4的可變區(qū)的輕鏈和重鏈。氨基酸序列中被下劃線標(biāo)記的部分表示互補性決定區(qū)域(CDR)；圖4Α是一組氨基酸序列，其對應(yīng)于抗體ΑΒ6和ΑΒ7的可變區(qū)的輕鏈和重鏈。氨基酸序列中被下劃線標(biāo)記的部分表示互補性決定區(qū)域(CDR)；圖4Β是一組氨基酸序列，其對應(yīng)于抗體ΑΒ8和ΑΒ9的可變區(qū)的輕鏈和重鏈。氨基酸序列中被下劃線標(biāo)記的部分表示互補性決定區(qū)域(CDR)；圖5是表示體外IL-I β刺激實驗結(jié)果的圖；圖6是顯示體內(nèi)IL-I β刺激實驗結(jié)果的柱狀圖；圖7是顯示被指定為ABl的抗體動態(tài)排斥檢驗(kinetic exclusion assay)結(jié)果的圖；圖8是顯示被指定為AB5的抗體動態(tài)排斥檢驗(kinetic exclusion assay)結(jié)果的圖；圖9是顯示被指定為AB7的抗體動態(tài)排斥檢驗(kinetic exclusion assay)結(jié)果的

圖10是顯示被指定為AB1、AB2和AB3的抗體體外IL-I β刺激實驗結(jié)果的圖；圖11是顯示被指定為ABl和ΑΒ7的抗體體外IL-I β刺激實驗結(jié)果的圖；圖12是顯示被指定為ΑΒ5和ΑΒ7的抗體以及fCinefet 體外IL-I β刺激實驗結(jié)果的圖；圖13是顯示被指定為ΑΒ5和ABl的抗體體內(nèi)IL-I β刺激實驗結(jié)果的柱狀圖；圖14是顯示被指定為ΑΒ5和ΑΒ7的抗體體內(nèi)刺激實驗結(jié)果的柱狀圖；圖15是顯示被指定為ΑΒ7的抗體與來自稱猴(cynomolgus monkey)和恒河猴(rhesus macaque)的IL-I β交叉反應(yīng)實驗結(jié)果的蛋白質(zhì)印跡(Western blot)；圖16是顯示被指定為AB7的抗體與來自狗、豚鼠、豬和兔的IL-I β交叉反應(yīng)實驗 結(jié)果的Western印跡；圖17是顯示被指定為AB7的抗體與重組人、小鼠和大鼠的IL-I β交叉反應(yīng)實驗結(jié)果的Western印跡；圖18是顯示被指定為AB7的抗體以及Kineret體外實驗結(jié)果的圖，其包括IL-I誘導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生；圖19是顯示檢測是否本發(fā)明的抗體防止IL-I β結(jié)合到I型IL-I受體的檢驗結(jié)果的圖；圖20是表示檢測是否本發(fā)明的抗體防止IL-I β結(jié)合到I型IL-I受體示意圖。詳細(xì)描述本發(fā)明包括新型的IL-I β抗體和片段，其具有期望的親和力和能力。作為本發(fā)明的一個方面，提供了 IL-Ιβ結(jié)合抗體，與已知IL-Ιβ結(jié)合抗體相比，其具有出乎意料高的親和力和低解離常數(shù)(例如小于3ρΜ，可選大約IpM或更少)。典型的抗體包括這里被指定為ΑΒ5和ΑΒ7的抗體。作為本發(fā)明的另一個方面，提供了 IL-I β結(jié)合抗體，其具有期望的解離常數(shù)(例如在大約6ρΜ至大約50ρΜ之間)以及期望的IC5tl (例如低于500ρΜ)以抑制IL-I β刺激的從人成纖維細(xì)胞釋放IL-6。本發(fā)明還包括IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段，其中它們以比其它抗原高的親和力選擇性地結(jié)合到IL-I β。所述IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段可以選擇性地結(jié)合到人類IL-I β，但也會可檢測地結(jié)合到非人類IL-I β上?？蛇x地或者另外地，所述抗體或片段可以結(jié)合到人類IL-I β或者至少一種其它哺乳動物(第一哺乳動物)的IL-I β，而不結(jié)合到至少一種其它哺乳動物(第二哺乳動物)的IL-I β。例如，所述抗體或者片段可以結(jié)合到嚙齒類IL-I β、靈長類IL-I β、狗IL-I β和兔IL-I β中的一種或者多種,而不結(jié)合到豚鼠IL-Ιβ?？蛇x地或者另外地，所述抗體或片段可以以比大鼠IL-I β高的親和力結(jié)合到小鼠IL-I β?？蛇x地或者另外地，所述IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段可以對人類IL-Ιβ和靈長類IL-Ιβ具有相同或者基本相同的能力?？蛇x地或者另外地，所述IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段可以對重組人類IL-I β和內(nèi)源IL-I β具有相同或者基本相同的能力?？蛇x地或者另外地，所述IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段可以中和小鼠IL-I β。這里所使用的，特異性地與目標(biāo)抗原結(jié)合的抗體或片段，是指以比與類似抗原高的親和力與目標(biāo)抗原結(jié)合的抗體。例如，抗體或片段對于其同源的抗原是特異性的，所述抗體或片段以可檢測的優(yōu)先性識別并結(jié)合所述同源的抗原(從其它已知的相同家族多肽中區(qū)分該抗原，其通過結(jié)合親和力中可檢測的差異，而不管在家族成員之間可能存在的局部序列同一性、同源性或相似性)。能夠理解的是，特異性的抗體和片段也會與其它蛋白質(zhì)相互作用(例如ELISA技術(shù)中的金黃色葡萄球菌(S. aureus)蛋白質(zhì)A或其它抗體)，其通過與抗體可變區(qū)之外的序列的相互作用，特別的，是所述抗體或片段的恒定區(qū)內(nèi)的序列。用于確定抗體結(jié)合特異性的篩選檢驗是本領(lǐng)域中公知的，并且常規(guī)實施的。關(guān)于對這類檢驗的全面討論，參見Harlow等人(Eds)，抗體實驗室手冊冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(Antibodies A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory ；Cold SpringHarbor, NY) (1988),第 6 章。本發(fā)明的一個方面包括IL-I β結(jié)合抗體及其IL-I β結(jié)合片段，其具有意想不到的低解離常數(shù)(Kd)，例如小于3ρΜ，可選2ρΜ或更少，可選IpM或更少，可選O. 8ρΜ或更少，可選O. 74ρΜ或更少，可選O. 72ρΜ或更少，可選O. 7ρΜ或更少，可選O. 6ρΜ或更少，可選O. 56ρΜ或更少，可選O. 5ρΜ或更少，可選O. 3ρΜ或更少，可選O. 26ρΜ或更少，可選O. 24ρΜ或更少，可選O. 2ρΜ或更少。因此，在本發(fā)明的某些實施方式中，可以參考解離常數(shù)范圍的高端值，對IL-I β結(jié)合抗體和片段進(jìn)行描述。此外或者可選地，在本發(fā)明的某些實施方式中，可以參考解離常數(shù)范圍的低端值，對IL-I β結(jié)合抗體和片段進(jìn)行描述，諸如例如解離常數(shù)為O. 07ρΜ或更高的抗體或片段，可選O. IpM或更高，可選O. IlpM或更高，可選O. 15ρΜ或更高，可選 O. 2ρΜ或更高，可選O. 24ρΜ或更高，可選O. 26ρΜ或更高，可選O. 3ρΜ或更高，可選O. 5ρΜ或更高，可選O. 7ρΜ或更高。如上所限定的任何解離較高的常數(shù)和較低的解離常數(shù)可以被組合以限定解離常數(shù)的范圍，只要所選擇較低值等于或者低于所選擇的較高值。本發(fā)明的另一方面提供了新型IL-I β結(jié)合抗體及其IL-I β結(jié)合片段，其以高于6ρΜ并低于或等于50ρΜ的解離常數(shù)結(jié)合IL-I β，可選在大約13ρΜ至大約25ρΜ之間，其中所述抗體或片段具有小于O. 5ηΜ(500ρΜ)的IC5tl，可選在大約5ρΜ至大約200ρΜ之間，可選在大約IOpM至大約IOOpM之間，可選大約30ρΜ，以抑制IL-I β刺激的IL-6從人成纖維細(xì)胞中釋放。設(shè)計，可以期望提供一種IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其具有前面的結(jié)合親和力并具有用于治療或預(yù)防IL-I β介導(dǎo)的病癥或疾病的某些方法的能力。典型的抗體包括這里被指定為ABl的抗體。正如通過這里所列舉的解離常數(shù)所說明的，本發(fā)明的抗體和片段以高親和力結(jié)合到IL-Ιβ。鑒定抗體與抗原親和力的親和力常數(shù)可以是通過抗原-抗體復(fù)合物形成的動力學(xué)所檢測的結(jié)合常數(shù)?？蛇x地，結(jié)合親和力可以由解離常數(shù)鑒定，其中解離常數(shù)是結(jié)合常數(shù)的倒數(shù)。這里所使用的術(shù)語Kd是指抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。本發(fā)明還包括中和抗體或其中和片段，其結(jié)合到IL-I β以中和IL-I β的生物學(xué)活性?？梢酝ㄟ^檢驗IL-I β生物學(xué)活性的一種或者多種指示劑來檢驗IL-I β生物學(xué)活性的中和，例如IL-I β刺激的IL-6從人成纖維細(xì)胞或其它細(xì)胞中釋放，IL-I β誘導(dǎo)的IL-8從血細(xì)胞中釋放，或者IL-I誘導(dǎo)的T輔助細(xì)胞的增殖。優(yōu)選，本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段中和與I型IL-I受體(IL-IRI)的信號傳導(dǎo)功能相關(guān)的IL-I β生物學(xué)活性，其中所述I 型 IL-I 受體(IL-IRI)結(jié)合 I 型 IL-I β。通常，本發(fā)明的中和抗體和片段能夠中和IL-Ιβ的生物學(xué)活性，而不管是否IL-I β結(jié)合到I型IL-I受體被阻斷。更優(yōu)選，所述IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段通過結(jié)合到IL-I β中和IL-I β的生物學(xué)活性，而不會實質(zhì)性地防止IL-I β結(jié)合到I型IL-I受體。這些抗體和片段的潛在優(yōu)點是能夠結(jié)合并中和IL-I β，同時允許IL-I β結(jié)合到IL-1RI。這會導(dǎo)致IL-I α以及IL-I β生物學(xué)活性生物學(xué)活性的有效降低，因為有更少未結(jié)合的IL-IRI位點用于IL-Ia結(jié)合。因此，本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段可以用于期望在體外和體內(nèi)中和IL-I生物學(xué)活性的方法中。本發(fā)明的抗體或片段可以是中和抗體或片段，其特異性地結(jié)合到影響IL-Ιβ生物學(xué)活性的IL-I β抗原決定簇上。本發(fā)明的抗體或片段能夠結(jié)合到IL-I β的中和敏感抗原決定簇上。如果IL-I β的中和敏感抗原決定簇被本發(fā)明的抗體或片段之一結(jié)合，則結(jié)果是含有所述抗原決定簇的IL-I β的功能會喪失。在某些實施方式中，所述IL-I β結(jié)合抗 體或IL-I β結(jié)合片段抑制IL-I β刺激的IL-I β從血細(xì)胞的釋放的IC5tl是低于50ρΜ，可選大約25ρΜ或更低，可選大約IOpM或更低，可選大約2ρΜ或更低。抑制IL-I β刺激的IL-I β從血細(xì)胞的釋放的IC5tl是指抑制50%IL-I β刺激血細(xì)胞所釋放IL-8需要的濃度。典型的抗體包括這里被指定為ΑΒ7的抗體。本發(fā)明還包括含有被改變的氨基酸序列的IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中所述被改變的氨基酸包括針對選自SEQ ID NO :27或28 (或者任何這里所公開的其它序列)的起始氨基酸序列的一個或者至少一個替代、添加或缺失，其中所述被改變的抗體或片段具有與起始氨基酸序列相同或基本相同的抗原決定簇結(jié)合的親和力和特異性。設(shè)計可以對這里所提供的IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段(例如包含SEQ ID Ν0:28和/或SEQ ID NO 27的抗體或片段)進(jìn)行一個或者多個替代、缺失或添加，同時保持與起始抗體或片段相同或基本相同的抗原決定簇結(jié)合的親和力和特異性。例如，本發(fā)明包括含有被改變的氨基酸序列的IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中所述被改變的氨基酸包括針對包含SEQ ID NO :8(或者這里所公開的可以用作起始氨基酸序列的任何其它序列)的起始氨基酸序列的一個或者至少一個替代、添加或缺失，其中所述被改變的抗體或片段具有與包含SEQ ID NO :8(或者用作起始氨基酸序列的特定序列)的起始氨基酸序列相同或基本相同的抗原決定簇結(jié)合的親和力和特異性。措詞“基本相同的”親和力的意思是，在對包含SEQ ID NO 28或27的抗體或片段的檢驗中，通過這里的教導(dǎo)所確定的親和力或解離常數(shù)，不會提高或降低超過固定的偏差，例如進(jìn)行所述檢驗3次或者更多次獨立的檢驗時所觀察到的偏差。措詞“基本相同的”抗原決定簇特異性的意思是，在對包含SEQ ID NO28或27的抗體或片段的檢驗中，通過這里的教導(dǎo)所確定的，與含有所述抗原決定簇的氨基酸序列的結(jié)合在固定的偏差范圍內(nèi)，例如進(jìn)行所述檢驗3次或者更多次獨立的檢驗時所觀察到的偏差。如果與包含SEQ ID NO :28或27的抗體或片段相比，其意思是所述比較需要在被改變的氨基酸序列和進(jìn)行一個或者多個替代、缺失或添加的所述起始氨基酸序列之間進(jìn)行，這些起始序列在其它所有的氨基酸上一致?？贵w、人源化抗體和人工改造(human engineered)的抗體本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體可以被提供為多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、重組抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體、完全人類抗體、單鏈抗體和/或雙特異性抗體以及片段，包括其變體和衍生物，其可以通過已知的技術(shù)包括但不限于酶切、肽合成或重組技術(shù)提供。通?？贵w包含兩條重鏈多肽和兩條輕鏈多肽，盡管也可以設(shè)計具有一條重鏈和一條輕鏈的單結(jié)構(gòu)域抗體以及不含有輕鏈的重鏈抗體。根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，有5種類型的重鏈，被稱作α、δ、ε、Y和μ。這些不同類型的重鏈產(chǎn)生了五類抗體分別是IgA(包括 IgA1 和 IgA2)、IgD、IgE、IgG 和 IgM,包括四種 IgG 的亞類即 IgG1、IgG2、IgG3 和IgG4。根據(jù)恒定區(qū)的氨基酸序列，有兩類輕鏈，被稱作卡帕(K)或拉姆達(dá)U)。全長的抗體包括恒定區(qū)和可變區(qū)。恒定區(qū)不需要出現(xiàn)在抗體的抗原結(jié)合片段上。這里所公開的抗體的抗原結(jié)合片段可以包括Fab、Fab'、F(ab' )2和？(0抗體片段。正如下面更詳細(xì)地討論的，IL-I β結(jié)合片段包括會結(jié)合IL-I β的抗體片段和抗原結(jié)合多肽?？贵w或其抗原結(jié)合片段的每一條重鏈和輕鏈序列都包括可變區(qū)，其具有3個互補性決定區(qū)域(CDR)以及非框架區(qū)域(FR)。除非以其它方式說明，這里所使用的術(shù)語“重鏈”和“輕鏈”的意思分別是重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。這里，重鏈⑶R被稱作⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3。輕鏈⑶R被稱作⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3?？梢?i)根據(jù)本領(lǐng)域中已經(jīng)開發(fā)的通用法則，或者(ii)通過將其序列與已知可變區(qū)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對來鑒定抗體序列中的可變區(qū)和CDR。用于鑒定這些區(qū)域的方法被描述在下列中=Kontermann和Dubel, eds.,抗體工程，施普林格，紐約(Antibody Engineering, Springer, New York, NY,), 2001 ;以及 Dinarello等人，免疫學(xué)現(xiàn)代實驗方案(Current Protocols in Immunology), John Wiley and SonsInc.,霍波肯(Hoboken), NJ, 2000。正如在 Retter 等人,Nucl. Acids Res.，33 (數(shù)據(jù)庫期) D671-D674 (2005)中所描述的,抗體序列的數(shù)據(jù)庫被描述并通過www. bioinf. org. ulc/abs的“The Kabatman^(由A. C. Martin在英格蘭倫敦的倫敦大學(xué)生物化學(xué)和分子生物學(xué)系(inthe Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London,London,England)維持)以及通過 www. vbase2. org 的 VBASE2 獲得?！癒abatman”數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站還包括了用于鑒定⑶R的常規(guī)經(jīng)驗法則。除非特別說明，術(shù)語“⑶R”是如在Kabat等人，免疫學(xué)感興趣序列(Sequences of Immunological Interest,)第5版,健康和人類服務(wù)美國部(U. S. Department of Health and Human Services), 1991 中所描述的。本發(fā)明包括IL-I β結(jié)合抗體，其含有兩條全長的重鏈和兩條全長的輕鏈?？蛇x，所述IL-I β結(jié)合抗體可以為例如具有與IL-I β結(jié)合活性的單鏈抗體或“迷你型”抗體的構(gòu)建體。這些構(gòu)建體可以通過本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行制備,例如PCR介導(dǎo)的單鏈抗體的克隆和組裝以在大腸桿菌(E.coli)中進(jìn)行表達(dá)(例如在抗體工程，實踐途徑系列(AntibodyEngineering, The practical approach series, J. McCafferty), H. R. Hoogenboom, 和D. J. Chiswell,編輯(editors),牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press), 1996 中所描述的)。在這種類型的構(gòu)建體中，從cDNA將抗體分子重鏈和輕鏈的可變部分進(jìn)行PCR擴增。接著，將所得到的擴增子進(jìn)行組裝，例如在另一個PCR步驟中，通過連接體DNA，其中所述連接體DNA編碼由氨基酸Gly和Ser構(gòu)成的柔性蛋白質(zhì)連接體。該連接體能夠使可變的重鏈和輕鏈部分以重新產(chǎn)生抗原結(jié)合槽，并且以通常與起始全長二聚免疫球蛋白分子相當(dāng)?shù)挠H和力結(jié)合抗原的方式進(jìn)行折疊。本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和結(jié)合片段包括這里所公開的典型抗體、片段和序列的變體。變體包括包含一個或者多個氨基酸序列替代、缺失和/或添加的肽和多肽，其與這里所公開的典型抗體、片段和序列具有相同或基本相同的抗原決定簇結(jié)合親和力和特異性。因此，變體包括包含對這里所公開的典型抗體、片段和序列進(jìn)行的一個或者多個氨基酸序列替代、缺失和/或添加，其中這些替代、缺失和/或添加不會對抗原決定簇結(jié)合的親和力和特異性造成實質(zhì)性變化。例如，抗體或片段的變體可以來自對包含SEQ ID NO :1至SEQID NO 35或SEQ ID NO 42至SEQ ID NO 57中一個或者多個氨基酸序列的抗體或片段進(jìn)行一種或者多種改變，其中所改變的抗體或片段與起始序列具有基本相同的抗原決定簇結(jié)合親和力和特異性。變體可以是天然存在的，例如等位基因或拼接變體，或者可以是人工構(gòu)建的。可以從編碼所述變體的相應(yīng)核酸分子制備這些變體。本發(fā)明抗體和IL-I β結(jié)合片段的變體可以在輕鏈和/或重鏈氨基酸序列中具有改變，其可以是天然出現(xiàn)的，或者通過使用重組DNA技術(shù)對原始序列進(jìn)行體外改造而引入的。天然出現(xiàn)的變體包括“體細(xì)胞”變體，其是在應(yīng)答外源抗原產(chǎn)生抗體的過程中，在相應(yīng)的生殖系核苷酸序列中體內(nèi)產(chǎn)生的。IL-I β結(jié)合抗體和IL-I β結(jié)合片段的變體也可以通過誘變技術(shù)進(jìn)行制備。例如，可以在整個抗體編碼區(qū)隨機引入氨基酸改變，并可以對所得到的變體篩選IL-Ιβ的結(jié)合親和力或其它性質(zhì)?？蛇x地，可以在IL-Ιβ抗體的選定區(qū)引入氨基酸改變，例如在輕鏈和/或重鏈CDRjP /或在框架區(qū)內(nèi)，并可以對所得到的抗體篩選與IL-I β的結(jié)合或者某些其它活性。氨基酸改變包括CDR中的一個或者多個氨基酸替代，從對給定CDR如CDR3的單氨基酸差異到引入多個氨基酸置換。在另一種方法中，CDR中每個殘基對IL-I β結(jié)合的貢獻(xiàn)可以通過將⑶R中的至少一個殘基替代為丙氨酸來進(jìn)行檢驗。Lewis等人，(1995)，Mol. Immunol. 32 :1065_72。借著可以改變對于結(jié)合IL-I β不是最佳的殘基，以確定更佳的序列。還包括通過插入氨基酸以提高⑶R如⑶R3的尺寸所產(chǎn)生的變體。例如，大多數(shù)輕鏈CDR3序列長度為9個氨基酸。通過插入適當(dāng)?shù)陌被嵋蕴岣逤DR的長度，可以優(yōu)化短于9 個氨基酸的抗體輕鏈序列結(jié)合IL-I β。還可以通過對輕鏈或重鏈的“鏈混編(chain shuffling) ”制備變體。Marks等人，(1992)，生物技術(shù)(Biotechnology)IO :779_83。一條輕鏈(或重鏈)可以與具有全部重鏈(或輕鏈)的庫進(jìn)行組合，將所得到的群篩選期望的活性例如結(jié)合IL-I β。這可以篩選比使用全部重鏈和輕鏈要多的不同重鏈(或輕鏈)與一條輕鏈(或重鏈)組合的樣品本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段包括這里所公開的典型抗體、片段和序列的衍生物。衍生物包括已經(jīng)被化學(xué)修飾的多肽或肽、或其變體、片段或衍生物。例子包括共價附著一個或者多個聚合物例如水溶性聚合物、N-連接或O-連接的碳水化合物、糖、磷酸和/或其它這類分子。在所附著的分子的類型或位置中，以與天然出現(xiàn)或起始肽或多肽不同的方式對這些衍生物進(jìn)行修飾。這些衍生物還包括去除一個或者多個在所述肽或多肽上天然出現(xiàn)的化學(xué)基團(tuán)。本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段可以是雙特異性的。雙特異性的抗體可以具有多種構(gòu)型的。例如，雙特異性的抗體可以組成單個抗體(或抗體片段)但具有兩個不同的抗原結(jié)合位點(可變區(qū))O可以通過化學(xué)技術(shù)(Kranz等人(1981)，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，78 :5807)、通過”多域(polydoma) “技術(shù)(美國專利No. 4，474，893)或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生雙特異性的抗體。本發(fā)明雙特異性的抗體可以具有對至少兩種不同抗原決定簇的結(jié)合特異性，其中至少一個是IL-I β的抗原決定簇。IL-I β結(jié)合抗體和片段也可以是異種抗體。異種抗體是兩種或者多種被連接在一起的抗體或抗體片段(Fab)，每種抗體或片段都具有不同的特異性。作為生產(chǎn)單克隆抗體的用于制造重組DNA版抗原結(jié)合區(qū)的技術(shù)被設(shè)計用于本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段。將DNA克隆到細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中。適合實施本發(fā)明的技術(shù)的一個例子使用λ噬菌體載體系統(tǒng)，其具有引導(dǎo)序列能夠造成表達(dá)的Fab蛋白質(zhì)遷移到周質(zhì)間隙中(在細(xì)菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間)或被分泌出。人們能夠快速產(chǎn)生和篩選大量有功能的Fab片段得到能夠結(jié)合IL-I β的。這些IL-I β結(jié)合試劑(具有對IL-I β多肽特異性的Fab片段)被特異性地包括在本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段中。本發(fā)明的IL-Ιβ結(jié)合抗體和片段可以是人源化的抗體或人工改造(humanengineered)的抗體。這里所使用的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段是重組多肽，其包含來自非人類抗體的抗原結(jié)合位點部分以及人類抗體的框架和/或恒定區(qū)部分。人工改造的抗體或抗體片段是非人類抗體(例如小鼠)，其已經(jīng)通過在特定位點對氨基酸進(jìn)行修飾(例如缺失、插入或替代)而被改造以降低或除去被修飾的抗體在人種的所有可檢測到的免疫原性。人源化抗體包括嵌合抗體和⑶R移植抗體(Q)R-grafted antibody)。嵌合抗體是包括連接到人恒定區(qū)的非人類抗體可變區(qū)的抗體。因此，在嵌合抗體中，可變區(qū)大部分是非人類的，而恒定區(qū)則是人類的。嵌合抗體及其制備方法被描述在Morrison,等人，Proc.Natl. Acad. Sci USA, 81 :6841-6855 (1984)、Boulianne,等人 Nature，312 :643-646(1984)以及PCT申請公開WO 86/01533中。盡管它們比小鼠單克隆抗體具有較低的免疫原性，但給藥嵌合抗體已經(jīng)與對抗體的非人類部分的免疫應(yīng)答(HAMA)有關(guān)。也已經(jīng)通過將具有適當(dāng)抗原結(jié)合特異性的來自小鼠抗體分子的基因與來自具有適當(dāng)?shù)纳锘钚?如激活人補 體以及介導(dǎo)ADCC的能力)的來自人類抗體分子的基因進(jìn)行拼接而產(chǎn)生嵌合抗體。Morrison等人(1984)，Proc. Natl. Acad. Sci. ,81 :6851 ；Neuberger 等人(1984)，Nature, 312 :604。一個例子是將Fe區(qū)替代位不同同種型的Fe區(qū)。CDR移植抗體是含有來自非人類的“供體”抗體的CDR的抗體，其中所述CDR被連接到來自人類“受體”抗體的框架區(qū)上。通常，CDR移植抗體包括比嵌合抗體多的人類抗體序列，因為它們含有來自人類抗體的恒定區(qū)序列以及可變區(qū)序列(框架)。因此，例如本發(fā)明的CDR移植人源化抗體可以含有重鏈，其中所述重鏈含有來自人類抗體(例如人類抗體的FR-1、FR-2或FR-3)的連續(xù)氨基酸序列(例如大約5個或者更多個、10個或者更多個、甚至15個或者更多個連續(xù)的氨基酸殘基)，或者可以選擇的，包含人類抗體整個框架區(qū)的大部分或者全部。CDR移植抗體及其制備方法被描述載Jones等人Nature,321 :522-525 (1986)，Riechmann 等人 Nature, 332 :323-327 (1988)以及 Verhoeyen 等人Science, 239 :1534-1536 (1988))。可以用于制備人源化抗體的方法也被描述在美國專利4，816，567,5, 721，367,5, 837，243和6，180，377中。CDR移植抗體是認(rèn)為與嵌合抗體相比不太可能誘導(dǎo)針對非人類抗體部分的免疫反應(yīng)。然而，已經(jīng)報道來自供體抗體的框架序列是供體抗體的結(jié)合親和力和/或特異性所必須的，推測因為這些框架序列影響供體抗體的抗原結(jié)合部分的折疊。因此，如果供體非人類CDR序列被移植到未改變的人類框架序列上，則所得到的CDR移植抗體能夠在某些情況下表現(xiàn)出相對于原始的非人類供體抗體損失結(jié)合強度。參見例如 Riechmann 等人Nature, 332 :323-327 (1988)以及 Verhoeyen 等人 Science,239 :1534-1536(1988)。人工改造的抗體包括“鑲飾(veneered) ”抗體，并使用HUMAN ENGINEERING 技術(shù)(XOMA(US) LLC，伯克利(Berkeley)，CA)制備這些抗體。HUMAN ENGINEERING 技術(shù)是商業(yè)上可以獲得的，并且包括改變非人類抗體或抗體片段，例如小鼠或嵌合抗體或抗體片段，其通過對抗體片段的氨基酸序列進(jìn)行特異改變，以產(chǎn)生在人中免疫原性降低的被銹蝕的抗體，但是仍具有原始非人類抗體的期望結(jié)合性能。通常，該技術(shù)包括將非人類抗體(例如小鼠)的氨基酸殘基分類為“低風(fēng)險”、“中等風(fēng)險”或“高風(fēng)險”殘基。使用全面風(fēng)險/回報計算進(jìn)行這種分類，其相對于取代將影響所得到抗體的折疊和/或抗原結(jié)合性能的風(fēng)險，評價進(jìn)行特定替代的預(yù)計益處(例如對于人體中的免疫原性)。因此，預(yù)測為低風(fēng)險位置的替代是有利的，因為其被預(yù)測會降低免疫原性而不會顯著影響抗原結(jié)合性能。中等風(fēng)險位置的替代被預(yù)測為會降低免疫原性，但更可能會影響蛋白質(zhì)折疊和/或抗原結(jié)合。高風(fēng)險位置含有最有可能參與蛋白質(zhì)折疊或抗原結(jié)合的殘基。通常非人類抗體中的低風(fēng)險位置被人類殘基所替代，高風(fēng)險位置幾乎不被替代，有時在中等風(fēng)險的位置進(jìn)行人源化替代，盡管不是無限制的。非人類抗體可變區(qū)中具有脯氨酸的位置通常被分類為至少中等風(fēng)險的位置。
通過將來自非人類抗體可變區(qū)的氨基酸序列與特定或多數(shù)人抗體序列的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行比對，可以選擇在非人類(例如小鼠)抗體序列中給定的低風(fēng)險或中等風(fēng)險位置所被替代的特定人氨基酸殘基。根據(jù)所述的比對，可以將非人類序列中的低風(fēng)險或中等風(fēng)險的氨基酸殘基替代為相應(yīng)的人類抗體序列中的殘基。在Studnicka等人蛋白工程(Protein Engineering)，7 :805-814 (1994)，美國專利 5，766，886,5, 770，196,5, 821，123和5，869，619以及PCT申請公開W093/11794中對制備人工改造的蛋白質(zhì)的技術(shù)進(jìn)行了更詳細(xì)的描述?！拌傦棥笨贵w是非人類抗體或人源化抗體(例如嵌合抗體或CDR移植抗體)，其已經(jīng)被改造為替換某些溶劑暴露的氨基酸殘基以進(jìn)一步降低它們的免疫原性或增強它們的功能。因為嵌合抗體的表面殘基被認(rèn)為不太可能影響正確的抗體折疊并很可能引發(fā)免疫反應(yīng)，因此對嵌合抗體的鑲飾可以包括例如鑒定在嵌合抗體的非人類框架區(qū)中溶劑暴露的殘基，并將它們中的至少一個替換為相應(yīng)的來自人類框架區(qū)的表面殘基?？梢酝ㄟ^適當(dāng)?shù)母脑旒夹g(shù)包括使用上述的人類工程 (HUMAN ENGINEERING )技術(shù)完成所述鑲飾。在不同的方法中，可以通過對CDR移植抗體進(jìn)行“去人源化”恢復(fù)其結(jié)合能力。去人源化可以包括將來自供體抗體框架區(qū)的殘基重建到⑶R移植抗體,這樣恢復(fù)了正確的折疊?？梢酝ㄟ^(i)在“受體”抗體中包含“供體”框架區(qū)部分，或者(ii)將“供體”抗體框架區(qū)部分移植到受體抗體內(nèi)(與移植的供體CDR)獲得相似的“去人源化”。關(guān)于抗體、人源化抗體、人工改造抗體及其制備的進(jìn)一步討論,參見Kontermann和 Dubel,抗體工程(Antibody Engineering), Springer, New York, NY, 2001。示例性的人源化或人工改造的抗體包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD抗體。本發(fā)明可以是任何類型的抗體(IgG、IgM、IgE、IgA和IgD等)或同種型,并且可以看有κ或λ輕鏈。例如，人體抗體可以含有IgG重鏈或指定的片段例如同種型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4種的至少一種。作為進(jìn)一步的例子，本發(fā)明的抗體或片段可以含有IgGl重鏈和IgGl輕鏈。本發(fā)明的抗體和片段可以是人類抗體，例如結(jié)合IL-I β多肽的抗體，并由人生殖系免疫球蛋白核酸序列天然出現(xiàn)的體細(xì)胞變體的核酸序列所編碼的，以及其片段、合成的變體、衍生物和融合。通過本領(lǐng)域中已知的方法生產(chǎn)這類抗體，例如通過使用轉(zhuǎn)基因動物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)，在所述轉(zhuǎn)基因動物中原始的免疫球蛋白的全部能力已經(jīng)被哺乳動物染色體中的人V-基因所替代。這些哺乳動物似乎進(jìn)行正常形式的人生殖系抗體基因VDJ重組和體細(xì)胞超突變,這樣產(chǎn)生了具有全部人類序列的高親和力抗體。也可以通過體外篩選曬菌體展示抗體庫產(chǎn)生人類抗體。參見Hoogenboom等人(1991)，J. Mol. Biol. 227 :381 ;以及 Marks 等人(1991)，J. Mol. Biol. 222 :581。已經(jīng)描述了各種含有抗體的噬菌體展示庫，并可以被容易制備。庫可以含有多種人類抗體序列，例如人Fab、Fv和scFv片段，其針對適當(dāng)?shù)陌羞M(jìn)行篩選。除了被篩選鑒定IL-Ιβ的選擇性結(jié)合試劑外，噬菌體展示庫可以含有肽或蛋白質(zhì)。IL-I β結(jié)合抗體和片段可以含有一個或者多個不會結(jié)合IL-I β的部分，但其對應(yīng)于其它的功能，例如循環(huán)半衰期、引導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)、可檢測的標(biāo)記或受體內(nèi)源補體級聯(lián)反應(yīng)或內(nèi)源性細(xì)胞毒性的激活。所述抗體或片段可以含有恒定區(qū)的全部或一部分，并可以是任何同種型，其包括IgA(例如IgAl或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。除了包含恒定區(qū)外，或替代包含恒定區(qū)外，本發(fā)明的抗原結(jié)合化合物可以包括抗原決定簇標(biāo)簽、補救受體抗原決定簇、用于診斷或純化目的的標(biāo)記部分或者細(xì)胞毒性部分例如放射性核素或毒素。本發(fā)明的抗體和片段的恒定區(qū)可以是Y I、Y 2、Y 3、Y 4、μ、32或6或ε型的，優(yōu)選Y型，更優(yōu)選y型，而人輕鏈的恒定區(qū)可以是κ或λ型的(其包括入1、入2和λ3亞型)，優(yōu)選是κ型。變體可以包括含有被修飾的Fe區(qū)的抗體，其中所述被修飾的Fe區(qū)包含對野生型 Fe區(qū)至少一個氨基酸的修飾?？梢詫⑺鲎凅wFe區(qū)設(shè)計成與含有野生型Fe區(qū)相當(dāng)?shù)姆肿樱员阋烁呋蚋偷挠H和力結(jié)合Fe受體。例如，本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段可以含有被修飾的Fe區(qū)。Fe區(qū)指自然出現(xiàn)的或合成的多肽，其與通過對IgG進(jìn)行木瓜蛋白酶而產(chǎn)生的IgG C-末端同源。IgG Fe具有大約50kD的分子量。在本發(fā)明的抗體和片段中，可以使用整個Fe區(qū)，或者僅僅是其增強半衰期的部分。另外，可以接受氨基酸序列中的許多修飾，因為原始的活性并不是在所有情況中都是必需的或期望的。如果期望的話，可以對Fe區(qū)進(jìn)行突變，以抑制其固定補體并以高親和力結(jié)合Fe受體的能力。對于鼠IgG Fe，將Ala替代為Glu318、Lys320以及Lys322會使得該蛋白質(zhì)不能夠引導(dǎo)ADCC。將Glu替代為Leu235會抑制改蛋白質(zhì)以高親和力結(jié)合Fe受體的能力。已知有各種對人IgG的突變(參見例如Morrison等人1994,免疫學(xué)家(The Immunologist) 2 119124 和 Brekke 等人 1994, The Immunologist 2:125)。在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體或片段被提供了被修飾的Fe區(qū)，其中天然出現(xiàn)的Fe區(qū)被修飾以提高所述抗體或片段在生物環(huán)境中的半衰期，例如血清半衰期或根據(jù)體外檢驗所得到的半衰期。對IgG的原始形式Fe區(qū)進(jìn)行改變的方法也被描述在美國專利No. 6，998，253 中。在某些實施方式中，可以期望對抗體進(jìn)行修飾，以提高其血清半衰期，例如向抗體片段中加入分子例如PEG或其它水溶性聚合物包括多糖聚合物乙提高所述半衰期。這也可以通過例如將補救受體結(jié)合抗原決定簇加入到抗體片段中達(dá)到(例如，通過將抗體片段中適當(dāng)區(qū)域進(jìn)行突變，或者通過將抗原決定簇引入到肽標(biāo)簽中，接著將其與抗體片段在末端或中部進(jìn)行融合，例如通過DNA或肽合成)(參見國際公開NO.W096/32478)。補救受體結(jié)合抗原決定簇指IgG分子的Fe區(qū)的抗原決定簇(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)，其對應(yīng)于提高IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。補救受體結(jié)合抗原決定簇可以含有任何一個或多個氨基酸殘基，其被從Fe區(qū)的一個或兩個環(huán)轉(zhuǎn)移到抗體片段的類似位置。更優(yōu)選，轉(zhuǎn)移來自Fe區(qū)的一個或兩個環(huán)的三個或更多個殘基。更優(yōu)選，所述抗原決定簇被從(例如IgG的)Fe區(qū)的CH2區(qū)取出，并轉(zhuǎn)移到CHI、CH3或VH區(qū)或者該抗體的多個這樣的區(qū)?？蛇x地，所述抗原決定簇被從Fe區(qū)的CH2區(qū)取出，并轉(zhuǎn)移到所述抗體片段的Q區(qū)或'區(qū)或兩者。同樣參見國際申請WO 97/34631和W096/32478，其描述了 Fe變體及它們與補救受體的相互作用。Fe受體結(jié)合位點內(nèi)殘基的突變可能導(dǎo)致改變的效應(yīng)子的功能，例如改變的ADCC或CDC活性，或改變的半衰期?？赡艿耐蛔儼ú迦搿⑷笔Щ蛱娲粋€或多個殘基，其包括使用丙氨酸的替代、保守替代、非保守替代、或使用來自不同IgG亞類的在相同位點的相應(yīng)氨基酸殘基的替換(例如使用在該位點相應(yīng)的IgG2殘基替換IgGl殘基)。例如，已經(jīng)報道將IgG4第241位氨基酸的絲氨酸突變成脯氨酸(在IgGl和IgG2中的該位置所發(fā)現(xiàn)的)，與原始的嵌合IgG4相比，會導(dǎo)致產(chǎn)生同源抗體，并延長血清半衰期和改善組織分布(Angal等人，Mol Immunol. 30 :105-8，1993)。優(yōu)選，本發(fā)明的抗體或抗體片段不會與IL-I β以外的任何目標(biāo)交叉作用。例如，本發(fā)明的抗體和片段優(yōu)選不會可檢測地結(jié)合IL-I α。
IL-I β結(jié)合抗體或抗體片段抗體片段是完整全長抗體的一部分，例如完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);多特異性抗體片段如雙特異性、三特異性和多特異性抗體(例如雙抗體、三抗體和四抗體)；微型抗體；螯合重組抗體；三體(tribodies)或雙體(bibodies);內(nèi)抗體；納米抗體(nanobody);小分子免疫藥物(small molecular immunopharmaceutical, SMIP)、結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白；駱馬它化抗體(camelized antibody);含Vhh的抗體；以及由抗體片段形成的其它任何多肽。本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO :2的IL-1 β結(jié)合抗體或其IL-1 β結(jié)合片段。圖I表示SEQ ID NO :2的氨基酸序列。優(yōu)選，所述抗體或抗體片段包含SEQ ID NO :21的氨基酸序列，更優(yōu)選包含 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 8的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體還可以包含SEQ ID Ν0:12或SEQ ID Ν0:13的氨基酸序列，優(yōu)選包含SEQ ID Ν0:14或SEQ ID NO :15。典型的，所述抗體或抗體片段包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO4-8、12-15或21的氨基酸序列)。優(yōu)選，所述抗體的輕鏈包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列，由SEQ ID NO :I的氨基酸序列構(gòu)成，或基本上由SEQ ID NO :I的氨基酸序列構(gòu)成。因此，例如，所述抗體的輕鏈包含SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11的氨基酸序列，由SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10或SEQ ID NO :11的氨基酸序列構(gòu)成，或基本上由SEQ ID NO:
9、SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 11的氨基酸序列構(gòu)成。同樣優(yōu)選的是，抗體或抗體片段的重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:23 或SEQ ID NO :24(例如 SEQ ID N0:25或SEQ ID NO 26)的氨基酸序列，由 SEQ ID N0:23 或 SEQ ID NO :24(例如 SEQ ID N0:25 或 SEQ ID NO 26)的氨基酸序列構(gòu)成，或基本上由SEQ ID N0:23或SEQ ID NO :24(例如SEQ ID NO :25或SEQID NO 26)的氨基酸序列構(gòu)成的抗體或抗體片段。本發(fā)明提供了含有重鏈可變區(qū)的IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :23或SEQ ID NO :24的氨基酸序列之一，可選SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 23 或 SEQ ID NO 24 的氨基酸序列之一，可選SEQ ID NO 12,SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO :21的氨基酸序列之一，或可選SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :21 的氨基酸序列，或可選 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :14 或 SEQID NO : 15的氨基酸序列，或可選SEQ ID NO :8或SEQ ID NO : 15的氨基酸序列。典型的，所述抗體或抗體片段包含輕鏈可變區(qū)，優(yōu)選所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10或SEQ ID NO :11的氨基酸序列。作為例子，優(yōu)選的抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID ΝΟ:11的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列之一的IL-1 β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段。優(yōu)選，所述抗體或片段還包括SEQ ID NO :27的氨基酸序列之一。本發(fā)明還提供了 IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其包含SEQ ID NO :29，由SEQ ID NO :29構(gòu)成，或基本上由SEQ ID NO :29構(gòu)成。優(yōu)選，所述抗體或抗體片段包含SEQID NO 31至SEQ ID NO 35的氨基酸序列之一，由SEQ ID NO 31至SEQ ID NO 35的氨基酸序列之一構(gòu)成，或基本上由SEQ ID Ν0:31至SEQ ID NO :35的氨基酸序列之一構(gòu)成，或者可選所述抗體或抗體片段包含SEQ ID NO 3USEQ ID NO :32或SEQ ID NO :33的氨基酸序 列，由SEQ ID NO 3U SEQ ID NO :32或SEQ ID NO 33的氨基酸序列構(gòu)成，或基本上由SEQID NO 3USEQ ID NO :32或SEQ ID NO :33的氨基酸序列構(gòu)成，或者可選所述抗體或抗體片段包含 SEQ ID NO 32 或 SEQ ID NO 33 的氨基酸序列，由 SEQ ID NO 32 或 SEQ ID NO 33的氨基酸序列構(gòu)成，或基本上由SEQ ID N0:32或SEQ ID NO :33的氨基酸序列構(gòu)成。優(yōu)選所述抗體或抗體片段還包括輕鏈可變區(qū)，其含SEQ ID NO :27的氨基酸序列之一，可選SEQID NO :9、SEQ ID NO :10 或 SEQ ID NO 11 的氨基酸序列之一。圖2、圖3和圖4列出了本發(fā)明典型的重鏈和輕鏈可變區(qū)，其序列對應(yīng)于這里被稱作 ΑΒ1、ΑΒ2、ΑΒ3、ΑΒ4、ΑΒ5、ΑΒ5· 1、ΑΒ5· 2、ΑΒ5· 3 和 ΑΒ5· 4 的抗體。所述 ΑΒ5. 1、ΑΒ5· 2、ΑΒ5· 3
和ΑΒ5. 4序列含有在重鏈⑶R3區(qū)中被指定為X1和X2的可變位點。這些可變位點可以是任何被指定的氨基酸。優(yōu)選X1和X2分別是丙氨酸和精氨酸、纈氨酸和精氨酸、苯丙氨酸和精氨酸、賴氨酸和賴氨酸、或者天冬酰胺和精氨酸。ΑΒ5. I包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 12的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 10的氨基酸序列。ΑΒ5. 2包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :11的氨基酸序列。ΑΒ5. 3包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :23的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列。ΑΒ5. 4包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :24的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列。本發(fā)明包括IL-I β結(jié)合抗體片段，其包含前述任何一種重鏈或輕鏈序列并結(jié)合IL-I β。這里使用的術(shù)語片段指抗體中任何3個或更多個連續(xù)氨基酸(例如4個或更多、5個或更多、6個或更多、8個或更多、或者甚至10個或更多個連續(xù)氨基酸)，并且包括Fab、Fab'、F(ab' )2和F(V)片段或其單獨的輕鏈或重鏈可變區(qū)或其部分。IL_1 β結(jié)合片段包括例如Fab、Fab'、F (ab' ) 2、Fv和scFv。這些缺少完整抗體的Fe片段，會快速地從循環(huán)中被清除，并且可以具有比起按整的抗體低的非特異性組織結(jié)合。參見Wahl等人(1983)，J. Nucl. Med. ,24 :316_25。可以使用公知的方法從完整的抗體產(chǎn)生這些片段，例如通過用酶進(jìn)行蛋白質(zhì)水解剪切如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab' )2片段)。
本發(fā)明包括IL-I β結(jié)合抗體和其IL-I β結(jié)合片段，其選擇性地結(jié)合IL-I β配體，但允許或基本上允許被結(jié)合的IL-I β配體結(jié)合到I型IL-I受體(IL-IRI)(參見實施例14和圖19及圖20)。如實施例14所證明的，與包括許多已知IL-I β結(jié)合抗體在內(nèi)的許多抗體相反，被指定為ΑΒ5和ΑΒ7的抗體選擇性地結(jié)合-I β配體，但它們不會阻斷或者基本不阻斷IL-I β結(jié)合IL-IRI。例如，被指定為ΑΒ7的抗體結(jié)合IL-I β抗原決定簇，但仍允許被結(jié)合的IL-I β結(jié)合到IL-1RI。因此，本發(fā)明包括能夠結(jié)合到IL-I β抗原決定簇的IL-I β結(jié)合抗體或片段，這樣所結(jié)合的抗體或片段允許或基本允許IL-I β結(jié)合I型IL-I受體(IL-IRI)，所述抗體或片段以低于3ρΜ的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β。在本領(lǐng)域中被充分描述并用于確定IL-I β結(jié)合I型IL-I受體的體內(nèi)基于細(xì)胞的檢驗包括確定存在結(jié)合IL-I β或IL-IRI的分子(例如抗體、拮抗劑或其它抑制劑)的檢驗(參見例如 Evans 等人(1995)，生物化學(xué)(J. Biol. Chem) · 270 :11477-11483 ;Vigers 等人(2000)，J. Biol. Chem. 275 :36927-36933 ;Yanofsky 等人(1996)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 :7381-7386 !Fredericks等人(2004)，蛋白質(zhì)工程(Protein Eng. Des. Sel. 17 :95-106)；Slack 等人(1993)，J.Biol. Chem. 268:2513-2524 ;Smith 等人(2003), Immunity 18:
87-96 ;Vigers 等人(1997), Nature 386 190-194 ;Ruggiero 等人(1997), J. Tmmunol. 158 3881-3887 ；Guo 等人(1995)，J. Biol. Chem. 270 :27562-27568 ；Svenson 等人(1995)，Eur.J. Immunol. 25 :2842-2850 ；Arend 等人，(1994)，J. Immunol. 153 :4766-4774)。用于這類檢驗的重組I型IL-I受體包括人I型IL-I受體是很容易從各種商業(yè)來源獲得的(參見例如R&D Systems, SIGMA) 0也可以從使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)染技術(shù)被引入到適當(dāng)寄主細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)建體或載體表達(dá)。接著可以分離并純化所表達(dá)的I型IL-I受體用于結(jié)合檢驗中，或者可選直接以細(xì)胞結(jié)合的形式進(jìn)行使用。例如，通過固定IL-I β結(jié)合抗體，將IL-I β與固定的抗體接觸并確定是否IL-I β被結(jié)合到抗體上，并將可溶形式的IL-IRI與被結(jié)合的IL-I β /抗體復(fù)合體進(jìn)行接觸，并確定是否所述可溶的IL-IRI被結(jié)合到復(fù)合體上，可以確定IL-I β與I型IL-I受體的結(jié)合。該方案還可以包括在于IL-I β接觸之前，將可溶的IL-IRI與固定的抗體進(jìn)行接觸，以確認(rèn)可溶的IL-IRI不會結(jié)合到所固定的抗體上?？梢允褂肂iacore 結(jié)合相互作用動力學(xué)分析的設(shè)備進(jìn)行該方案。也可以將該方案用于確定是否抗體或其它分子會允許或阻斷IL-I β結(jié)合到I型IL-I受體。對于其它的IL-I β /IL-IRI結(jié)合檢驗，可以通過將存在或不存在IL-I β抗體或其IL-I β結(jié)合片段時IL-I β與IL-IRI的結(jié)合進(jìn)行比較，而確定對IL-I β與IL-IRI的結(jié)合的允許或阻斷。與對照樣品相對，在存在抗IL-I β抗體或其IL-I β結(jié)合片段時IL-I β與I型IL-I受體結(jié)合的降低被認(rèn)為是檢驗中所鑒定的阻斷結(jié)果，其中所述對照樣品含有相應(yīng)的緩沖液或稀釋劑而不含有IL-I β抗體或其IL-I β結(jié)合片段。該檢驗結(jié)果可以被定量地顯示為表示存在或不存在阻斷，或者可以被定量地顯示為說明由于存在所述抗體或片段而導(dǎo)致的結(jié)合的降低百分率或倍數(shù)?？蛇x地或額外地，如果IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段基本上阻斷IL-I β結(jié)合IL1RI，則與不存在所述抗體或片段時，相同濃度的IL-I β與ILlRI的結(jié)合相比，IL-I β結(jié)合ILlRI會被降低至少10倍，可選至少大約10倍，可選至少大約20倍，可選至少大約50倍，可選至少大約100倍，可選至少大約1000倍，可選至少大約10000倍或更多。作為另一個實施例，如果IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段基本上允許IL-I β結(jié)合到IL1RI，則所述IL-I β結(jié)合到ILlRI是在不存在所述抗體或片段時，相同濃度IL-I β和ILlRI的結(jié)合的至少大約90%，可選至少大約，可選至少大約95%，可選至少大約99%，可選至少大約99. 9%，可選至少大約99. 99%，可選至少大約99. 999%，可選至少大約99. 9999%，可選基本相同。本發(fā)明包括IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段，其與這里所公開的典型抗體結(jié)合到相同的抗原決定簇或相同的抗原決定簇?？蛇x或額外，IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段與具有SEQ ID NO :11的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :15的重鏈可變區(qū)的抗體競爭結(jié)合?？蛇x或額外，本發(fā)明包括IL-I β結(jié)合抗體和片段，其結(jié)合到包含在氨基酸序列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID NO :36)中的抗原決定簇，該抗原決定簇是被指定為AB5和AB7結(jié)合的抗原決定簇。正如這里所設(shè)計的，通過使用任何本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，人們可以容易確定是否IL-I β結(jié)合抗體或片段結(jié)合到與典型的抗體(諸如例如被標(biāo)記為ΑΒ7)的一種或者多種相同的抗原決定簇或基本相同的抗原決定簇。例如，使用與實施例11中所描述的方法類似的肽陣列可以確定IL-I β結(jié)合抗體 或片段所結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基(抗原決定簇)。肽陣列例如PepSpot 肽陣列(PT多肽技術(shù)(Peptide Technologies,)柏林,德國)可以直接在膜上被合成，其中長度為十二個氨基酸的肽跨越整個IL-I β氨基酸序列，每條肽與之前的一個有11個氨基酸的重疊。接著使用抗原決定簇結(jié)合信息所尋找的抗體對攜帶所述肽的膜進(jìn)行探針標(biāo)記，如在室溫下以2ug/ml的濃度進(jìn)行2小時。使用偶聯(lián)HRP的羊抗人(或者在適當(dāng)?shù)臅r候為小鼠)二抗，接著進(jìn)行增強的化學(xué)發(fā)光(ECL)，可以對抗體與結(jié)合肽的膜的結(jié)合進(jìn)行檢測。對應(yīng)于成熟IL-I β的特定氨基酸殘基或序列以及抗體結(jié)合評分為陽性的肽點是所述抗原決定簇被特定抗體結(jié)合的指示?？蛇x或另外，可以進(jìn)行抗體競爭實驗，并且這些檢驗是本領(lǐng)域中公知的。例如，為了確定是否抗體或片短結(jié)合到包含在含有氨基酸ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE的肽序列中的抗原決定簇，其中氨基酸ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE對應(yīng)于成熟的IL-I β蛋白質(zhì)的殘基83至105，該未知特異性的抗體可以與本發(fā)明中已知會結(jié)合包含在該序列中的抗原決定簇結(jié)合的任何典型抗體(例如ΑΒ7)進(jìn)行比較?？梢岳缤ㄟ^使用結(jié)合相互作用動力學(xué)分析
設(shè)備或者通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)進(jìn)行結(jié)合競爭檢驗。在這類檢驗中，對抗原決定簇特異性未知的抗體進(jìn)行評定其對已知比較抗體(例如ΑΒ7)競爭結(jié)合的能力。通過與IL-I β抗原決定簇的結(jié)合與已知比較抗體(例如ΑΒ7)降低至少大約50%，或者至少大約70 %，或者至少大約80 %，或者至少大約90 %，或者至少大約95 %，或者至少大約99 %或者100%，并且是結(jié)合到基本相同抗原決定簇的指示?？紤]到本文中對示例性抗體和/或被所公開的抗體識別的抗原決定簇中的IL-I β結(jié)合區(qū)域的公開，設(shè)計與本發(fā)明公開的實施方式類似，可以產(chǎn)生具有類似結(jié)合特征和治療或診斷實用性的其它抗體。而且，本發(fā)明的IL-I β抗體和片段包括前述具有一個或者多個保守替代(例如I、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守替代)的輕鏈或重鏈氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，人們可以確定作為保守替代候選的氨基酸序列的位置，人們可以選擇影響保守替代的合成或天然氨基酸替代任何特定的氨基酸。對選擇保守替代的考慮包括進(jìn)行特定氨基酸替代的環(huán)境，側(cè)鏈的疏水性或極性，側(cè)鏈的整體大小，具有酸性或堿性特征的側(cè)鏈在生理條件下的PK值。例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸通常適合相互替代。正如本領(lǐng)域中已知的，這是因為所有這三種氨基酸都具有堿性側(cè)鏈，而且賴氨酸和精氨酸側(cè)鏈的pK值與組氨酸(大約6)相比相互接近得多(大約10和12)。類似的，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸通常適合相互替代，限制是甘氨酸通常不適合替代該組中的其它成員。這是因為這些氨基酸中的每一個在被引入到多肽中時，都是相對疏水的，但甘氨酸缺少允許phi和psi轉(zhuǎn)動角(在α碳周圍)的α碳，因此構(gòu)型自由使得甘氨酸殘基能夠在構(gòu)型或二級結(jié)構(gòu)中造成改變，這通常在其它氨基酸互相替代時不會出現(xiàn)。通常適合相互替代的其它氨基酸組包括但不限于由谷氨酸和天冬氨酸所構(gòu)成的組；有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸構(gòu)成的組；以及由絲氨酸、蘇氨酸以及可以選擇的酪氨酸構(gòu)成的組。
通過對氨基酸序列進(jìn)行保守性修飾或?qū)幋a的核苷酸進(jìn)行相應(yīng)的修飾，人們可以產(chǎn)生具有有這里所公開的典型抗體或片段相似的功能和化學(xué)特征的IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段。相反，在IL-I β結(jié)合抗體或IL-I β結(jié)合片段的功能和/或化學(xué)特征實質(zhì)性改變的替代，可以通過選擇在保持(a)替代區(qū)域的分子骨架結(jié)構(gòu)例如片層或螺旋構(gòu)型，(b)目標(biāo)位置分子的電荷或疏水性或(c)側(cè)鏈的體積方面顯著不同的替代而完成。抗體的抗原結(jié)合片段包括保持特異性地與抗原結(jié)合的能力，通常是由所述抗體的抗原結(jié)合區(qū)保持的。已經(jīng)充分建立抗體的抗原結(jié)合功能可以通過全長抗體的片段完成。抗原結(jié)合區(qū)的例子包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，其是包含兩個由在鉸鏈區(qū)的二硫橋所連接的Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其是和CHl結(jié)構(gòu)域；(iv)Fv片段，其是抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域；(v) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341 :544-546)，其是VH結(jié)構(gòu)域；以及(vi)分離的互補性決定區(qū)域(CDR)。單鏈抗體也被包含在術(shù)語抗體的抗原決定區(qū)的范圍內(nèi)。本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段還包括單價或多價活單體或多聚體(例如四聚體)CDR產(chǎn)生的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其具有或沒有支架(例如蛋白質(zhì)或糖類支架)。本發(fā)明的IL-Ιβ結(jié)合抗體或片段可以是較大的免疫黏附分子的一部分，其是通過抗體或抗體部分與一種或者多種其它蛋白質(zhì)或肽的共價或非共價結(jié)合所形成的。這類免疫黏附分子的例子包括使用鏈霉親和素核心區(qū)來制備四聚scFv分子(Kipriyanov, S. Μ.,等人(1995)人類抗體和雜交瘤(Human antibody and Hybridomas) 6 :93-101),以及使用半胱氨酸、標(biāo)記物肽和C-末端多聚組氨酸標(biāo)簽制備二價和生物素化scFv分子(Kipriyanov，
S.M.，等人(1994)Mol. Immunol. 31 :1047-1058)。如這里所述的，通過使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)可以獲得包含免疫黏附分子的抗體。優(yōu)選的抗原結(jié)合區(qū)是完整的結(jié)構(gòu)域，或者幾對完整的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段還包括結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)片段(Ward等人Nature 341 :544_546，1989)，其由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段還包括二價抗體的雙抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域被表達(dá)在一條多肽鏈上，但使用的連接體非常短以允許相通鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間的配對，這樣使得這些結(jié)構(gòu)域與其它鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并得到兩個抗原結(jié)合位點(參見例如EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;Holliger等人Proc.Natl. Acad. Sci. USA90 :6444-6448,1993 ;和 Poljak 等人 Structure 2 :1121-1123，1994)。雙抗體可以是雙特異性或單特異性的。
本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段還包括結(jié)合IL-I β的單鏈抗體片段(scFv)。scFv包含被可操作地連接到抗體輕鏈可變區(qū)(\)的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，其中所述重鏈可變區(qū)和所述輕鏈可變區(qū)共同或單獨形成結(jié)合IL-I β的結(jié)合位點。scFv可以在氨基末端包含Vh區(qū)，在羧基末端包含'區(qū)?？蛇x，scFv可以在氨基末端包含'區(qū)，在羧基末端包含Vh區(qū)。而且，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH是由不同的基因編碼的，但它們可以被使用重組方法通過合成的連接體連接起來，這使得它們能夠被制成單條蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子(被稱作單鏈Fv (scFv);參見例如Bird等人(1988) Science 242 423-426 ;和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :5879-5883)。可選擇的，scFv還可以在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間包含多肽連接體。通常這些多肽連接體包含I至50個之間的氨基酸，可選在3至12個氨基酸之間，可選2個氨基酸。用于連接scFv中的重鏈和輕鏈的連接體肽的例子包括5個氨基酸的序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO :37)。其它例子包括一個或者多個該序列的前后重復(fù)(例如，包含2至4個Gly-Gly-Gly-Gly-SeHSEQ ID NO 37)重復(fù)的多肽)以形成連接體。
本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段還包括重鏈抗體(HCAb)。在駱駝(駱駝、單峰胳馬它和胳馬(camels, dromedaries and llamas) ;Hamers-Casterman 等人 1993 Nature363 446 ；Nguyen 等人 1998 J. Mol. Biol. 275 :413)、帶紋 S (Greenberg 等人 Nature374 :168-73,1995 ;Roux 等人 1998Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95 :11804)以及在銀鮫(spotted ratfish) (Nguyen,等人"駱§它屬中的重鏈抗體；進(jìn)化變革的實例(Heavy-chainantibody in Camelidae ;a case of evolutionary innovation), " 2002 免疫遺傳學(xué)(Immunogenetics) 54 (I) :39-47)中發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白同種型中還出現(xiàn)了不同于傳統(tǒng)抗體的H2L2的結(jié)構(gòu)。這些抗體能夠明顯地僅使用重鏈可變區(qū)形成抗原結(jié)合區(qū)，這些功能型抗體是僅有重鏈的二聚體(被常作“重鏈抗體”或“HCAb”)。因此，本發(fā)明IL-Ιβ結(jié)合抗體和片段的某些實施方式可以是特異性結(jié)合IL-I β的重鏈抗體(HCAb)。例如術(shù)語IgG類別不含有輕鏈的重鏈抗體，其由包括駱駝、單峰駱駝和無峰駝的駱駝屬(Camelidae)的動物產(chǎn)生(Hamers-Casterman 等人自然(Nature) 363 :446-448(1993))。HCAb 的分子重量為大約95kDa，而通常的IgG抗體的分子量為大約160kDa。它們的結(jié)合結(jié)構(gòu)與僅由重鏈可變區(qū)構(gòu)成，其通常被稱作Vhh以將它們與通常的Vh進(jìn)行區(qū)分。Muyldermans等人J. Mol.Recognit. 12 :131-140 (1999)。有時，重鏈抗體的可變區(qū)被稱作納米抗體(nanobody)(Cortez-Retamozo 等人腫瘤研究(Cancer Research) 64 :2853-57, 2004)。從被免疫的單峰胳馬它可以產(chǎn)生納米抗體(nanobody)庫，如在Conrath等人(Antimicrob Agents Chemother45 =2807-12,2001)中所述的或使用重組方法。由于缺少第一恒定區(qū)(Chi)(由于缺少拼接信號，而在mRNA處理過程中被切除)，可變區(qū)(Vhh)緊接是鉸鏈區(qū)、Ch2 和 Ch3 區(qū)(Nguyen 等人 Mol. Immunol. 36 :515-524(1999)；Woolven 等人 Immunogenetics 50 :98-101 (1999))。據(jù)報道胳馬它 Vhh 與 IgG2 和 IgG3 恒定區(qū)重組，其含有鉸鏈區(qū)、Ch2區(qū)和Ch3區(qū)，并缺少Chi區(qū)(Hamers-Casterman等人見上文)。例如無峰駝IgGl是傳統(tǒng)的(H2L2)抗體同種型，其中Vh與含有鉸鏈區(qū)、Ch2區(qū)和Ch3區(qū)的恒定區(qū)重組，而無峰駝IgG2和IgG3是僅重鏈的同種型，其缺少CHl區(qū)并且不含輕鏈。盡管HCAb不含輕鏈，但它們?nèi)跃哂锌乖Y(jié)合能力。Nguyen等人Adv. Immunol79 =261-296 (2001)和 Nguyen 等人 Immunogenetics 54 39-47 (2002)中對 HCAb 的遺傳產(chǎn)生機制進(jìn)行了綜述。鯊魚包括鉸口鯊表現(xiàn)出含有相似抗原受體的單體V區(qū)。Irving等人 J. Immunol. Methods 248 :31-45(2001) ；Roux 等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 11804(1998)。Vhh含有的小的完整抗原結(jié)合片段(例如大約15kDa，118-136個殘基的片段)。駱馬它Vhh區(qū)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)以高親和力與抗原結(jié)合(Desmyter等人J. Biol. Chem. 276 :26285-90,2001)，其中Vhh親和力通常在納摩范圍內(nèi)，并且與Fab和scFv片段相當(dāng)。Vhh是高度可溶的，并且比ScFjPFab片段的相應(yīng)衍生物更穩(wěn)定。Vh片段已經(jīng)相對難以以可溶形式生成，但溶解度和特異性結(jié)合的改善可以在框架殘基被改編成更類似Vhh而獲得。(參見，例如Reichman等人免疫方法雜志(J Immunol Methods) 1999, 231 :25-38.) Vhh攜帶使它們更加親水并防止與BiP (免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白質(zhì))長時間反應(yīng)的氨基酸替代，其中在折疊和組裝過程中，BiP通常結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的H-鏈，直到其被L鏈所替代。由于Vhh提高的親水性，提高了從ER的分泌?？梢酝ㄟ^對被免疫的駱駝的HCAb進(jìn)行蛋白質(zhì)水解切割，通過直接從被免疫的 駱駝的B細(xì)胞直接克隆Vhh基因得到充足的Vhh,或者從原始庫或合成庫獲得功能性VHH。與Fab或scFv相比，在噬菌體展示中使用Vhhs更簡單且更有效，因為僅需要克隆一個結(jié)構(gòu)域并表達(dá)以獲得功能性抗原結(jié)合片段。Muyldermans,生物技術(shù)(Biotechnol.) 74 277-302(2001) ;Ghahroudi 等人 FEBS Lett. 414 :521-526 (1997);以及 van der Linden 等人 J. Biotechnol. 80 :261-270 (2000)。在美國專利公開 No. 20050136049 和 20050037421 中也描述了產(chǎn)生具有駱駝重鏈的抗體的方法。核糖體展示法可以用于鑒定和分離具有期望的結(jié)合活性和親和力的scFv和/或Vhh分子。Irving等人J. Immunol. Methods 248:31-45(2001)。核糖體展示和選擇具有產(chǎn)生和展示大容量庫(1014)的能力。其它實施方式通過駱騎化(camelisation)處理提供Vhh樣分子,其通過對mm_駱駝％例如人Vhh以提高它們的溶解度并防止非特異性結(jié)合。這是通過使用Vhh樣殘基替換Vh的\側(cè)鏈而叨叨的，進(jìn)而模擬更高溶解度的Vhh片段。駱駝Vh片段，特別是基于人框架的，被認(rèn)為在被體內(nèi)給藥給患者時，表現(xiàn)出大大降低的免疫反應(yīng)，因此，被認(rèn)為具有用于治療應(yīng)用的顯著優(yōu)點。Davies 等人 FEBS Lett. 339 :285-290(1994) ;Davies 等人 Protein Eng. 9 531-537(1996) ；Tanha 等人 J. Biol. Chem. 276 :24774-24780(2001)；以及 Riechmann 等人Tmmunol. Methods 231:25-38(1999)?？梢岳枚喾N表達(dá)體系用于產(chǎn)生包含F(xiàn)ab片段、scFv和Vhh的IL-I β片段。例如，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞來源的表達(dá)體系都可以被用于大規(guī)模生產(chǎn)抗體片段和抗體融合蛋白。特別有利的是允許將大量抗體片段分泌到培養(yǎng)基中的表達(dá)體系。在Schoonjans 等人(J Immunol. 165 :7050-57,2000)和 Willems 等人(Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786 :161-76, 2003)中描述了制備雙特異性Fab-scFv( “二體，，)和三特異性Fab-(scFv) (2)( “三體”)。對于二體或三體，scFv分子被融合到VL-CL(L)和VH-CH1 (Fd)鏈的一條或兩條，例如為制備三體，兩條scFv被融合到Fab的C-末端，而在二體中，一條scFv被融合到Fab的C-末端?！拔⑿涂贵w”是由通過肽連接體(無鉸鏈)或通過IgG鉸鏈融合到CH3的scFv所構(gòu)成的,這已經(jīng)在Olafsen,等人 Protein Eng Des Sel. 2004Apr ；17(4) :315-23 中被描述。
內(nèi)抗體是單鏈抗體，其表示細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并能夠處理細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能(Biocca,等人 EMBO J. 9 :101-108，1990 ;Colby 等人 Proc Natl Acad Sci USA. 101 :17616-21,2004) 可以根據(jù)在 Mhashilkar 等人(EMBO J 14 :1542-51,1995)和 Wheeler 等人(FASEB J. 17 1733-5. 2003)中所描述的來制備包含細(xì)胞信號序列的內(nèi)抗體，其在細(xì)胞內(nèi)區(qū)域中保持抗體結(jié)構(gòu)。穿膜抗體(Transbody)是能透過細(xì)胞的抗體,其中蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)被與單鏈可變片段(scFv)抗體相融合 Heng 等人(Med Hypotheses. 64 :1105-8, 2005)。本發(fā)明的IL-Ιβ結(jié)合抗體和片段還包括抗體，其為對目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性的SMIP或結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白。這些構(gòu)建體是單鏈多肽，其含有與實施抗體效應(yīng)功能必要的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域融合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。參見例如W003/041600，美國專利公開20030133939 和美國專利公開 20030118592。本發(fā)明的IL-Ιβ結(jié)合抗體和片段還包括免疫粘附素。一個或者多個⑶R可以被 共價或非共價加入到分子中，以使其成為免疫粘附素。免疫粘附素可以引入CDR作為較大的多肽鏈的一部分，可以將⑶R共價連接到另一條多肽鏈上，或者可以非共價引入⑶R。這里所公開的⑶R允許免疫粘附素特異性地結(jié)合IL-I β。本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體和片段還包括抗體模擬物，其包含在有機或分子支架(例如蛋白質(zhì)或糖類支架)上建造的一個或者多個IL-I β結(jié)合部分。具有相對確定的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，通常被稱作蛋白質(zhì)支架，可以被用作設(shè)計抗體模擬物的試劑。這些支架通常含有一個或者多個易于進(jìn)行特異或隨機序列改變的區(qū)域，通常進(jìn)行這些區(qū)域的隨機化以獲得蛋白質(zhì)庫，從該庫中可以選擇期望的產(chǎn)品。例如，抗體模擬物可以包含非免疫球蛋白結(jié)合多肽，其具有免疫球帶白楊結(jié)構(gòu)域，含有兩個或多個容積暴露環(huán)，該環(huán)含有與被插入到每個環(huán)的親代抗體不同的CDR并表現(xiàn)出對親代抗體所結(jié)合的配體的選擇性結(jié)合活性。非免疫球蛋白蛋白質(zhì)支架已經(jīng)被用于獲得具有新型結(jié)合特性的蛋白質(zhì)(Tramontano等人J. Mol.Recognit. 7 :9，1994 ；McConnell 和 Hoess, J. Mol. Biol. 250 :460，1995)。其它的蛋白質(zhì)已經(jīng)被作為框架進(jìn)行測試，并已經(jīng)被用于在ct螺旋表面(Nord等人Nat. Biotechnol. 15 :772，1997 ;Nord等人Protein Eng. 8 :601,1995)、α螺旋表面束中α螺旋之間的環(huán)(Ku和 Schultz，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :6552,1995)以及由二硫鍵所限定的環(huán)例如小蛋白酶抑制劑(Markland 等人生物化學(xué)(Biochemistry) 35 :8045,1996 ;Markland 等人 Biochemistry 35 :8058,1996 ；Rottgen 和 Collins, Gene 164:243,1995 ；ffang 等人J. Biol. Chem. 270 :12250,1995)上展示隨機化的殘基。將支架用于抗體模擬物的方法被公開在美國專利 5，770，380 和美國專利公開 2004/0171116,2004/0266993 和 2005/0038229中。因此可以產(chǎn)生多種IL-I β結(jié)合抗體和片段，其包含抗體重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的一個、兩個和/或三個⑶R(優(yōu)選SEQ ID NO 1-26的⑶R中的一個或者多個)。本發(fā)明優(yōu)選的抗體或片段與IL-Ιβ結(jié)合，其以⑴根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附檢驗(ELISA)所確定的大約0. 5nM或更低(例如大約0. 4或更低，大約0. 3或更低，或甚至大約0. 2或更低)的IC5tl, (ii)相對于其結(jié)合IL-I α高至少大約100倍(例如至少大約150倍，至少大約200倍，或甚至至少大約250倍)的親和力(即對IL-I β具有比IL-Ia高至少大約100倍(例如至少大約大約150倍，至少大約200倍，或甚至至少大約250倍)的選擇性)，和/或(iii)對于IL-I β平衡結(jié)合(Kd)大約為20ρΜ或更低(例如大約15ρΜ或更低，大約IOpM或更低，或者甚至大約5pM或更低)。同樣優(yōu)選的本發(fā)明的抗體或片段能夠抑制IL-I β誘導(dǎo)的血清IL-6在動物中的表達(dá)，與未給藥本發(fā)明抗體或片段的IL-I β刺激的動物中血清IL-6的水平相比，抑制至少50% (例如至少60%，至少70%或甚至至少80% )。因此，在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了 IL-I β結(jié)合抗體或IL-Ιβ結(jié)合抗體片段，其具有至少一個前述的特征。盡管本發(fā)明此處已經(jīng)描述了 IL-I β結(jié)合抗體及其片段(例如包含輕鏈和重鏈)，但本發(fā)明還提供了不同于IL-I β結(jié)合抗體或抗體片段的多肽，例如單鏈多肽(包括融合多肽、嵌合多肽、共軛物等)。因此，在這點上，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO :1-26中任一氨基酸序列的多肽，或者其功能上等價的片段或變體。本發(fā)明還提供了包含SEQ ID NO 27-35或42-57中任一氨基酸序列的多肽，或者其功能上等價的片段或變體。 可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽溥@里所描述的抗體和抗體片段。用于制備這類抗體和抗體片段的適當(dāng)方法是本領(lǐng)域中已知的。制備抗體和抗體片段的其它方法在這里被描述作為發(fā)明的一部分。如這里所描述的，本發(fā)明的抗體、抗體片段或多肽可以被分離或純化到任何程度。如這里所使用的，所分離的化合物是已經(jīng)從自然環(huán)境中被去除的化合物。純化的 化合物純度已經(jīng)被提高，這樣該化合物比其存在于(i)自然環(huán)境中，或(ii)在實驗條件下起始合成和/或擴增時更純的形式存在，其中“純度”是相對的術(shù)語并且不必要意味著“絕對純”。如這里所述，前述本發(fā)明的所有抗體、抗體片段或多肽都能夠被人源化或人工改造。制備IL-I β抗體或片段的方法本發(fā)明提供了一種用于制備親和力成熟的IL-Ιβ結(jié)合多肽如抗體或抗體片段(包括抗體區(qū)(例如其輕鏈或重鏈可變區(qū)或任何部分例如CDR))的方法，該方法包括(a)提供第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含編碼IL-I β結(jié)合多肽的核酸序列，其中所述IL-I β結(jié)合多肽包含SEQ ID NO :1-26任一項的氨基酸序列，其中第二核酸序列包含與第一核酸序列至少有一個核苷酸不同的核酸序列；(b)進(jìn)行核酸混編以提供兩種或者更多種突變的核酸；以及(c)選擇突變的核酸，其編碼以下多肽，該多肽能夠(i)以比第一核酸所編碼的多肽高的親和力與IL-I β結(jié)合，(ii)對IL-I β具有高于IL-I α的選擇性，該選擇性大于第一核酸所編碼的多肽的選擇性，(iii)對于IL-I β具有低于第一核酸所編碼的多肽的平衡結(jié)合解離常數(shù)(Kd)，或者(iv)抑制IL-I β誘導(dǎo)的動物中血清IL-6的表達(dá)的程度比第一核酸所編碼的多肽高；以及(d)表達(dá)所選擇的突變核酸以提供親和力成熟的IL-I β多肽。優(yōu)選，所述多肽是抗體或抗體片段，例如這里所描述作為本發(fā)明一部分的任何抗體或抗體片段。制備親和力成熟的IL-I β多肽的方法可選擇地還包括重復(fù)步驟(b)和(C) 一次或多次，其中使用(i)至少一種步驟(c)所選擇的的突變核酸和(ii)至少一種核酸，其具有與所選擇的突變核酸有至少一個核苷酸不同的核酸序列進(jìn)行步驟(b)的核酸混編。優(yōu)選，重復(fù)步驟(b)和(C)直到選擇到最佳的核酸。如果不再可能選擇到一種核酸，其編碼的多肽具有優(yōu)于之前所選擇的核酸所編碼的多肽的對IL-I β的結(jié)合特征(例如步驟(c)的特征(i)-(iv))的多肽，則選到了最佳的核酸。期望地，重復(fù)步驟(b)和(C)直到選擇一種核酸，其編碼具有下列特征中至少一種的多肽(i)根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附檢驗(ELISA)所確定的大約O. 5ηΜ或更低(例如大約O. 4或更低，大約O. 3或更低，或甚至大約O. 2或更低)的IC5tl ;(ii)相對于其結(jié)合IL-Ia高至少大約100倍(例如至少大約150倍，至少大約200倍，或甚至至少大約250倍)的親和力(即對IL-I β具有比IL-I α高至少大約100倍(例如至少大約大約150倍，至少大約200倍，或甚至至少大約250倍)的選擇性);(iii)對于IL-I β平衡結(jié)合(Kd)大約為20ρΜ或更低(例如大約15ρΜ或更低，IOpM或更低,5ρΜ或更低,3ρΜ或更低,2ρΜ或更低，IpM或更低，O. 7ρΜ或更低，O. 5ρΜ或更低，O. 3ρΜ或更低，或O. 2ρΜ或更低)；或(iv)抑制IL-I β誘導(dǎo)的動物中IL-6的表達(dá)，與未給藥本發(fā)明抗體或片段地IL-I β刺激的動物中血清IL-6的水平相比，抑制至少50% (例如至少60%，至少70%或甚至至少80% )。通過適當(dāng)?shù)姆椒梢赃M(jìn)行選擇編碼具有期望性能的多肽的突變核酸。這里公開了表達(dá)所編碼的多肽，檢驗多肽結(jié)合親和力、結(jié)合選擇性、平衡結(jié)合常數(shù)以及抑制IL-I β誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)的方法(參見實施例)。其它的方法是本領(lǐng)域中已知的。如果通過步驟(b)所提供的突變核酸所編碼的多肽不是抗體或全部抗體片段(例如Fab)，則必須提供含有該多肽的抗體以確定是否該多肽滿足選擇標(biāo)準(zhǔn)。因此，本發(fā)明制備親和力成熟的IL-I β多肽 的方法還可以包括提供包含所述突變核酸所編碼的多肽的抗體的步驟，其中選擇編碼具有期望性能的多肽的突變核酸的步驟是通過對所述抗體進(jìn)行檢驗而進(jìn)行的。這里所使用的核酸混編的意思是將兩個或多個核酸序列進(jìn)行分段以提供隨機的核酸片段庫，將所述片段進(jìn)行重新組裝以形成兩個或多個突變的核酸。在這點上，所突變的核酸僅僅是具有已經(jīng)被改變的核酸序列的核酸。可以通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行核酸混編。許多適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域中已知的，例如在美國專利6，489，145 ;6，773, 900 ;6，764, 835 ；6，740，506 ;6，713，282 ;6，713，281 ;6，713，279 ;6，709，841 ;6，696，275 ;6，677，115 ；6，673，552 ;6，656，677 ;6，605，449 ;6，566，050 ;6，562，594 :6，555，315 ;6，537，776 ；6，528，249 ;6，479，258 ;6，455，254 ;6，440，668 ;6，368，798 ;6，361，974 ;6，358，709 ；6，352，842 ;6，344，328 ;6，335，179 ;6，280，926 ;6，238，884 ;6，174，673 ;6，171，820 ；6，168，919 ;6，057，103 ;6，054，267 ;6，030，7796，001，574 ;5，965，408 ;5，958，672 ；5，939，250 ;5，763，239 ;6，395，547 ;6，376，246 ;6，372，497 ;6，368，861 ;6，365，408 ；6，365，377 ;6，358，740 ;6，358，742 ;6，355，484 ;6，344，356 ;6，337，186 ;6，335，160 ；6，323，030 ;6，319，714 ;6，319，713 ;6，303，344 ;6，297，053 ;6，291，242 ;6，287，861 ；6，277，638 ;6，180，406 ;6，165，793 ;6，132，970 ;6，117，679 ;5，834，252 ;5，830，721 ；5，811，238 ;5，605，793 中所描述的。核酸本發(fā)明的抗體、抗體片段和多肽可以由單條核酸(例如包含抗體輕鏈和重鏈多肽鏈的核苷酸序列的單條核酸鏈)所編碼，或者由兩條或更多條單獨的核酸所編碼，其中每一條編碼抗體或抗體片段的不同部分。在這一點上，本發(fā)明提供了一種或者多種核酸，其編碼任何前述的抗體、抗體片段或多肽(例如前述任意一種的輕鏈或重鏈可變區(qū))。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種核酸，其編碼抗體的重鏈可變區(qū)或其一部分。典型的核酸序列是在SEQ ID Ν0:38和SEQ ID NO :39中所提供的，其分別編碼SEQID NO : 15的重鏈可變區(qū)以及SEQ ID NO :11的輕鏈可變區(qū)。在這一點上，本發(fā)明提供了一種編碼多肽(例如抗體的重鏈可變區(qū))的核酸，所述多肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列，可選SEQ ID NO :28的氨基酸序列，期望編碼一種包含SEQ ID NO :21氨基酸序列的多肽(例如包含SEQ ID NO :4-8任一氨基酸序列的多肽)。更優(yōu)選的是編碼一種多肽(如重鏈可變區(qū))，所述多肽包含SEQ ID NO : 12或SEQ ID NO 13的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO 14-15任一氨基酸序列的多肽)，或者包含SEQ ID NO :23或SEQ ID NO :24(例如SEQ IDNO :25或SEQ ID NO 26)的氨基酸序列?？蛇x或另外，本發(fā)明的核酸可以包含一種核酸序列，其編碼抗體的輕鏈可變區(qū)或其一部分。在這一點上，本發(fā)明提供了一種核酸，其編碼包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽(例如輕鏈可變區(qū))。例如，所述核酸序列能夠編碼包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的多肽。更優(yōu)選，所述核酸編碼包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO=Il的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還包括一種核酸，其編碼包含一個或者多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14或15個保守替代)保守替代的任何前述輕鏈或重鏈的氨基酸序列，正如對本發(fā)明的抗體和抗體片段所進(jìn)行的討論，其中包含替代的抗體和片段具有與這里所公開的 示例性抗體的一種或者多種相同或基本相同的抗原決定簇結(jié)合親和力和特異性。通過任何適當(dāng)?shù)姆椒?，可以從這里所描述的抗體、抗體片段和輕鏈或重鏈可變區(qū)的氨基酸序列確定核酸序列，例如通過使用遺傳密碼將該氨基酸序列轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的核酸序列。編碼這些氨基酸序列(例如這里所描述的氨基酸序列)的核酸可以使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行制備(例如分離或合成的核酸序列)，例如在如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning, a Laboratory Manual),第3版,冷泉港出版社,冷泉港，紐約(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), 2001 ;Ausubel 等人，分子生物學(xué)現(xiàn)代實驗方案(Current Protocols in Molecular Biology),格瑞尼出版協(xié)會(Greene Publishing Associates)和 John Wiley & Sons,紐約(New York), NY, 1994;以及Herdewijn等人，寡聚核苷酸合成方法及應(yīng)用(分子生物學(xué)方法)(OligonucleotideSynthesis Methods and Applications(Methods in Molecular Biology)), HumanaPress, Totowa, NJ, 2004中所描述的方法。這里所描述的核酸可以被分離或純化到任何程度。如這里所使用的，所分離的化合物是已經(jīng)從自然環(huán)境中被去除的化合物。純化的化合物純度已經(jīng)被提高，這樣該化合物比其存在于(i)自然環(huán)境中，或(ii)在實驗條件下起始合成和/或擴增時更純的形式存在，其中“純度”是相對的術(shù)語并且不必要意味著“絕對純”?？梢允褂枚喾N技術(shù)對所述核算進(jìn)行純化，其包括但不限于制備型凝膠電泳或等電聚焦、親和、免疫親和或離子交換層析、分子篩層析、聚焦層析或高壓液相層析。載體(vector)這里所描述的核酸可以被插入到載體中，例如核酸表達(dá)和/或靶向載體。可以以各種方式利用這些載體，例如用于在細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)IL-I β結(jié)合抗體或抗體片段。因此，本發(fā)明提供了一種載體，其包含本發(fā)明的任何一種或者多種核酸?！拜d體”是任何具有攜帶核酸進(jìn)入適當(dāng)?shù)募淖〖?xì)胞的能力的分子或組合物，其中在所述適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞處可以發(fā)生所編碼多肽的合成。通常并優(yōu)選，載體是被使用本領(lǐng)域中已知的重組DNA技術(shù)進(jìn)行改造的核酸，以引入期望的核酸序列(例如本發(fā)明的核酸)。期望，所述載體是由DNA構(gòu)成的。適當(dāng)?shù)腄NA基基因轉(zhuǎn)移載體的例子包括質(zhì)粒和病毒載體。例如，適當(dāng)?shù)牟《据d體包括腸炎病毒基載體(例如腺相關(guān)病毒(AAV)基載體)、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)基載體、AAV-腺病毒嵌合載體、HIV病毒基載體以及腺病毒基載體。所有的這些載體都可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備,所述技術(shù)被描述在例如Sambrook等人，supra,和Ausubel等人,supra中。然而,不是基于核酸的載體例如脂質(zhì)體也是本領(lǐng)域中已知的，能夠用于本發(fā)明中。所發(fā)明的載體可以基于單一的核酸類型(例如質(zhì)粒)或非核酸分子(例如脂類或聚合物)?？蛇x，所述載體可以是核酸和非核酸的結(jié)合(即“嵌合”載體)。例如，攜帶所述核酸的質(zhì)?？梢允褂弥蚓酆衔镒鳛閭鬟f媒介被制備。這類載體在這里分別被稱作“質(zhì)粒-脂復(fù)合體”以及“質(zhì)粒-聚合物”復(fù)合體。所發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移載體可以被整合到寄主細(xì)胞基因組中，或者能夠以游離基因的形式出現(xiàn)在寄主細(xì)胞中。本發(fā)明的核酸可以被插入到免疫球蛋白表達(dá)載體中，例如在McLean等人，Mol.Immunol. ,37 :837-45(2000) ；ffalls 等人，Nucleic Acids Res. ,21 :2921-9(1993)；以及Norderhaug 等人，J. Tmmunol. Meth. , 204 :77-87 (1997)中所描述的載體。通常選擇在將使用所述載體的細(xì)胞中有功能的載體(與寄主細(xì)胞機制兼容的載體，這樣可以發(fā)生基因的擴增和/或表達(dá))?？梢栽谠思?xì)胞、酵母、昆蟲(桿狀病毒系統(tǒng))和/或真核寄主細(xì)胞中擴增/表達(dá)編碼IL-I β結(jié)合抗體或的核酸。對所述寄主細(xì)胞的選擇 將部分依賴于是否所述IL-I β結(jié)合抗體或片段會被進(jìn)行轉(zhuǎn)換后修飾(例如糖基化和/或磷酸化)。如果有，則優(yōu)選酵母、昆蟲或哺乳寄主細(xì)胞。在Meth. Enz. V. 185(1990 ；Goeddel,ed. )，Academic Press Inc.，San Diego, Calif可以得到關(guān)于表達(dá)載體的進(jìn)一步信息。通常表達(dá)載體含有下列組分中的一個或多個啟動子、一個或者多個增強子序列、復(fù)制起點、翻譯終止序列、含有供體和受體切割位點的完整內(nèi)含子序列、分泌的弓I導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點、多聚腺苷酸序列、多聚連接體區(qū)以插入要表達(dá)的多肽、以及可選擇的標(biāo)記物元件。載體組分可以是同源的(來自與寄主細(xì)胞相同的種和/或株)、異源的(來自與寄主細(xì)胞種或株不同的種)、雜交的(來自多種來源的不同序列的組合)、合成的或者原是序列，其通常的功能是調(diào)節(jié)免疫球蛋白的表達(dá)。載體組分的來源可以是任何原核或真核生物，任何脊椎生物或無脊椎生物，或者任何植物，只要這些組分能夠在寄主細(xì)胞機制中發(fā)揮功能，并被寄主細(xì)胞機制所激活。根據(jù)用于表達(dá)的寄主細(xì)胞的類型選擇復(fù)制的起點。作為例子，來自質(zhì)粒pBR322 (Product No. 303_3s,新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs),伯克利(Beverly), Mass.)的復(fù)制起點可以用于大部分革蘭氏陰性菌中，而來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、泡狀口腔炎病毒(VSV)或乳頭狀瘤病毒(如HPV或BPV)的各種起點可以用于哺乳細(xì)胞中的克隆載體。通常，哺乳細(xì)胞表達(dá)載體(例如通常使用SV40起點，因為期含有早期的啟動子)不需要復(fù)制起點組分。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于多肽編碼區(qū)的3’末端。原核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄終止序列通常包括富含G-C的片段，接著是多聚T序列?？梢詮淖鳛檩d體一部分的商業(yè)購買或使用核酸合成方法(如上所述)的庫克隆轉(zhuǎn)錄終止序列?？蛇x擇的標(biāo)記物基因編碼對于寄主細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上存活或生長所必須的蛋白質(zhì)。典型的選擇標(biāo)記物基因編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)(a)提供對抗生素或其它毒素的抗性例如對于原核寄主細(xì)胞的青霉素、四環(huán)素或卡那霉素；(b)補充細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷型；或
(c)補給不能從復(fù)合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物。優(yōu)選的選擇標(biāo)記物是卡那霉素抗性基因、青霉素抗性基因以及四環(huán)素抗性基因。新霉素抗性基因也可以用于在原核寄主細(xì)胞和真核寄主細(xì)胞中進(jìn)行選擇。其它選擇基因可以用于擴增將要表達(dá)的基因。擴增是一種過程，其中需要大量生長必需的蛋白質(zhì)的基因被在重組細(xì)胞的連續(xù)傳代的染色體內(nèi)被反復(fù)復(fù)制。哺乳動物的選擇標(biāo)記物包括二氫葉酸還原酶(DHFR)和胸苷激酶。所述哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)化體被置于選擇壓力下，僅有唯一通過載體上所出現(xiàn)的標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化體會存活。通過將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在培養(yǎng)基中選擇試劑的濃度連續(xù)變化的條件下進(jìn)行培養(yǎng)而提供選擇壓力，這樣達(dá)到了選擇基因以及編碼IL-I β抗體或片段的DNA的擴增。結(jié)果，從擴增的DNA合成了提高量的抗體。通常存在核糖體結(jié)合位點以起始mRNA翻譯。例如，該位點的特征是Shine-Dalgarno序列(原核細(xì)胞)或Kozak序列(真核細(xì)胞)。該元件通常位于啟動子的3’，或要表達(dá)的多肽的編碼區(qū)的5’。所述Shine-Dalgarno序列是可以變化的，但通常是多聚嘌呤(具有高A-G含量)。許多Shine-Dalgarno已經(jīng)被鑒定，每一種都能夠使用上述的方法容易進(jìn)行合成并用于原核載體中。
引導(dǎo)序列或信號序列可以被用于引導(dǎo)多肽的分泌。信號序列可以被定為在多肽編碼區(qū)的內(nèi)部，或直接定位在多肽編碼區(qū)的5’末端。已經(jīng)鑒定了許多信號序列，并可以基于用于表達(dá)的寄主的進(jìn)行選擇。信號序列與編碼需要表達(dá)的蛋白質(zhì)(例如抗體或抗原結(jié)合片段)的核酸序列可以是同源的(自然出現(xiàn)的)或異源的。所選的異源信號序列需要是能夠被寄主細(xì)胞識別并處理(被信號肽酶所切割)的。對于不會識別并處理原始抗體信號序列的原核細(xì)胞，所述信號序列被所選擇的原核信號序列所替代，例如所述原核信號序列選自堿性磷酸酶、青霉素酶或熱穩(wěn)定腸毒素II引導(dǎo)子的組。對于酵母分泌，原始抗體信號序列可以被酵母轉(zhuǎn)化酶、α因子或酸性磷酸酶引導(dǎo)子所取代。在哺乳細(xì)胞中，表達(dá)原始信號臺通常是令人滿意的，盡管其它哺乳信號序列可以是適合的。在大部分情況中，從寄主細(xì)胞分泌抗體或抗原結(jié)合片段將導(dǎo)致從抗體或片段去除信號肽。因此，成熟的抗體或片段將缺少任何引導(dǎo)或信號序列。在某些情況中，例如真核寄主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中期望糖基化的情況中，人們可以操作各種前導(dǎo)序列(presequence)以提高糖基化或產(chǎn)率。例如，人們可以改變信號肽的肽酶切割位點，或增加前導(dǎo)序列(presequence),這也可以會影響糖基化。最終的抗體或片段在-I位置(相對于成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸)可以具有一個或者多個額外的易于表達(dá)的氨基酸，其可以不用被完全去除。例如，最終抗體或片段可以具有在肽酶切割位點發(fā)現(xiàn)的一個或多個連著N-末端的氨基酸?？蛇x，如果酶在成熟抗體或片段的這些區(qū)域內(nèi)進(jìn)行切害I]，則使用某些酶切位點可以導(dǎo)致稍微截短形式的期望抗體或片段。通常所述表達(dá)載體將含有能夠被寄主生物所識別的啟動子，并被可操作地連接到編碼IL-I β結(jié)合抗體或抗原結(jié)合片段的核酸分子上。原始啟動子或異源啟動子可以被使用，這依賴于用于表達(dá)的寄主細(xì)胞和期望的產(chǎn)率。用于原核寄主細(xì)胞的啟動子包括β -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)；堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)；以及雜交啟動子例如tac啟動子。還適合其它已知的細(xì)菌啟動子。它們的序列已經(jīng)被公開，并且它們能夠被連接到期望的核酸序列，其使用期望補充限制性位點的連接體或接頭。用于酵母寄主的啟動子也是本領(lǐng)域中已知的。酵母增強子被有利地與酵母啟動子進(jìn)行使用。適合用于不如細(xì)胞的啟動子是公知的，并且包括從病毒如多瘤病毒、鳥痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細(xì)胞巨化病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎肝炎病最優(yōu)選猿病毒40 (SV40)的病毒基因組的啟動子。其它適當(dāng)?shù)牟溉閯游飭幼影ó愒床溉閯游飭幼尤鐭嵝菘藛幼雍图拥鞍讍幼?。可以用于表達(dá)本發(fā)明選擇性結(jié)合試劑的附加啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)(Bemoist和Chambon, Nature, 290 :304-310,1981) ;CMV啟動子；包含在魯斯氏肉瘤病毒的3,長末端重復(fù)中的啟動子(Yamamoto等人(1980),Cell 22:787-97);皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner 等人(1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 1444-5);金屬硫蛋白基因的調(diào)解序列(Brinster等人Nature, 296 ;39-42，1982);原核表達(dá)載體例如β_內(nèi)酰胺酶啟動子(ViIIa-Kamaroff，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 75 ；3727-3731,1978);或tac 啟動子(DeBoer,等人(1983)，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，80 :21_5)。同樣感興趣的是下列動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，其表現(xiàn)出組織特異性并已經(jīng)用于轉(zhuǎn)基因動物中彈性蛋白酶I基因控制區(qū)，其在胰腺泡細(xì)胞中是有活性的(Swift等人(1984)，Cell 38 :639-46 ；Ornitz等人(1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 :399-409 ；MacDonald(1987),肝臟病學(xué)Ofepatology) 7 :425-515);胰島素基因控制區(qū)，其在胰腺β細(xì)胞中是有活性的(Hanahan(1985)，Nature 315:115-22);免疫球蛋白基因控制區(qū)，其在淋巴細(xì)胞中是有活 性的(Grosschedl 等人(1984)，Cell 38 ;647_58 ;Adames 等人(1985), Nature 318 ;533_8 ；Alexander等人(1987)，Mol. Cell. Biol. 7 :1436-44);小鼠乳房腫瘤病毒控制區(qū)，其在睪丸、胸部、淋巴和肥大細(xì)胞中是有活性的(Leder等人(1986)，Cell 45:485-95);白蛋白基因控制區(qū)，其在肝中是有活性的(Pinkert等人(1987)，基因及發(fā)育(Genes and Devel. ) I 268-76) ;α-胎甲球蛋白基因控制區(qū)，其在肝中是有活性的(Krumlauf等人(1985)，Mol.Cell. Biol. 5 :1639-48 ；Hammer 等人(1987)，Science, 235 :53-8) ； α I-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)，其在肝中是有活性的(Kelsey等人(1987)，Genes and Devel. I :161-71) ;β-球蛋白基因控制區(qū)，其在骨髓細(xì)胞中是有活性的(Mogram等人，Nature, 315338-340,1985 ；Kollias等人(1986)，Cell 46 :89-94);髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)，其在腦中的少突細(xì)胞中是有活性的(Readhead等人(1987)，Cell，48 :703-12);肌球蛋白輕鏈_2基因控制區(qū)，其在骨骼肌中是有活性的(Sani (1985)，Nature, 314 :283-6);以及刺激生殖腺的釋放激素基因控制區(qū)，其在下丘腦中是有活性的(Mason等人(1986)，Science 234:1372-8)。可以將增強子序列插入到載體中以提高在真核寄主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。已知許多可以從哺乳動物基因(例如球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎甲球蛋白和胰島素)獲得的增強子序列。然而通常將使用來自病毒的增強子。SV40增強子、細(xì)胞巨化病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒增強子和腺病毒增強子是激活真核啟動子的示例性增強元件。盡管增強子可以被切割到多肽編碼區(qū)的5’或3’位置的載體中，但通常位于啟動子的5’位點。表達(dá)核酸的載體包括與細(xì)菌、昆蟲和哺乳寄主細(xì)胞兼容的載體。這些載體除了其它的以外還包括pCRII、pCR3以及pcDNA3. I (印威疇根公司(Invitrogen Company),San Diego, Calif. )、pBSII (斯推塔基因公司(Stratagene Company),拉霍亞(La Jolla),Calif. )、ρΕΤ15 (諾瓦根(Novagen),麥迪遜(Madison),威斯康星州(Wis. ))、pGEX (法瑪西亞生物技術(shù)公司(Pharmacia Biotech)，皮斯卡塔韋(Piscataway)，N. J. )、pEGFP_N2 (克隆技術(shù)(Clontech)，帕洛阿爾托(Palo Alto)，Calif. )、pETL(BlueBacII ；Invitrogen)、pDSR- a (PCT 公開 No. W090/14363)以及 pFastBacDual (吉伯克(Gibco/BRL)，格蘭德島(Grand Island), N. Y.)。其它可能的載體包括但不限于柯斯質(zhì)粒(Cosmid)、質(zhì)?；虮恍揎椀牟《?，但所述載體系統(tǒng)必須要與所選擇的寄主細(xì)胞兼容。這些載體包括但不限于質(zhì)粒如Bluescript 質(zhì)粒衍生物(高拷貝數(shù)ColEl-基噬菌體質(zhì)粒(phagemid)，斯推塔基因克隆系統(tǒng)公司Stratagene Cloning Systems Inc. , La Jolla Calif.)、用于克隆 Taq-擴增 PCR 產(chǎn)物的
PCR克隆質(zhì)粒(例如Τ0Ρ0 . TA Cloning Kit, PCR2. I質(zhì)粒衍生物Invitrogen，卡爾斯巴德(Carlsbad), Calif.)和哺乳動物、酵母或病毒載體如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(pBacPAK質(zhì)粒衍生物，Clontech, Palo Alto, Calif.)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)或其它已知技術(shù)將重組分子引入到寄主細(xì)胞中。寄主細(xì)胞及其應(yīng)用 本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核酸或載體的細(xì)胞(例如分離的或純化的細(xì)胞)。所述細(xì)胞可以是能夠被轉(zhuǎn)化本發(fā)明的核酸或載體以生產(chǎn)其所編碼的多肽的所有細(xì)胞類型。優(yōu)選所述細(xì)胞是哺乳細(xì)胞例如人，更優(yōu)選是雜交瘤細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或受精卵。為了表達(dá)IL-I β結(jié)合或片段，編碼如上述獲得的部分或全長輕鏈和重鏈的DNA被插入到表達(dá)載體中，因此這些基因被可操作地連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列中。在本文中，術(shù)語“可操作地”的意思是抗體基因被連接到載體中，這樣載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列提供了它們期望的調(diào)節(jié)所述抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。所述表達(dá)載體和表達(dá)控制序列被選擇為與所使用的表達(dá)寄主細(xì)胞兼容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可以被插入到不同的載體中，或者更典型的，兩個基因被插入到相同的表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)的方法將這些抗體基因插入到表達(dá)載體中(例如通過連接抗體基因片段和載體上的互補限制性位點，或者如果沒有限制性位點存在則平末端連接)。在插入輕鏈或重鏈序列之前，所述表達(dá)載體可以已經(jīng)攜帶抗體恒定區(qū)序列。例如，一種將所選定的VH和VL序列轉(zhuǎn)化成全長抗體基因的方法是將它們分別插入到已經(jīng)編碼重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，這樣所述VH部分被可操作地連接到載體內(nèi)的CH部分中，VL部分被可操作地連接到載體內(nèi)的CL部分。另外或可選，所述重組表達(dá)載體可以編碼信號肽，其輔助抗體鏈從寄主細(xì)胞分泌。所述抗體鏈基因可以被克隆到載體內(nèi)，這樣信號肽被符合閱讀框地連接到抗體鏈基因的氨基末端。所述信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號肽)。除了抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以攜帶調(diào)節(jié)序列，其控制抗體鏈基因在寄主細(xì)胞中的表達(dá)。術(shù)語調(diào)節(jié)序列是為了包括控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動子、增強子和其它表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸信號)。這些調(diào)控序列被描述在例如 Goeddel ;基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression Technology Methods inEnzymology) 185,學(xué)院出版社(Academic Press),圣地亞哥(San Diego),加利福尼亞(Calif). (1990)中?？梢岳斫獾氖牵瑢Ρ磉_(dá)載體的設(shè)計，包括對調(diào)控序列的選擇將依賴于這些因素例如對進(jìn)行轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，以及其它的考慮。哺乳寄主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括引導(dǎo)哺乳細(xì)胞中高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件。除了所述抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶額外的序列，例如調(diào)節(jié)寄主細(xì)胞中載體復(fù)制的序列(例如復(fù)制的起點)以及可選擇的標(biāo)記物基因。所述可選擇的標(biāo)記物基因輔助選擇已經(jīng)引入載體的寄主細(xì)胞(參見例如美國專利No. 4，399，216，4，634，665和5，179，017，全部是Axel等人的)。例如，通?？蛇x擇標(biāo)記物基因為已經(jīng)引入載體的寄主細(xì)胞提供了對藥物的抗性，例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記物基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于&打_寄主細(xì)胞，使用甲氨蝶呤進(jìn)行選擇/擴增)以及neo基因(用G418進(jìn)行選擇)。將核酸和載體引入到所分離的細(xì)胞和培養(yǎng)中，以及在體內(nèi)外選擇所轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且包括使用氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、偶聯(lián)、三親株雜交、DEAE、葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、感染、與脂質(zhì)體的膜融合、使用覆蓋DNA的基因槍彈進(jìn)行高速轟擊、直接微注射倒但細(xì)胞內(nèi)以及電轉(zhuǎn)(參見例如Sambrook等人,見上文；Davis等人，分子生物學(xué)基本方法(Basic Methods in Molecular Biology),第 2 版，McGraw-HillProfessional, 1995 ；以及 Neumann 等人，EMBO J.，I :841 (1982))。所述包含本發(fā)明的核酸或載體的細(xì)胞能夠被用于生產(chǎn)IL-I β結(jié)合抗體、其片段或其一部分(例如由所述核酸或載體所編碼的重鏈序列或輕鏈序列)。將本發(fā)明的核酸或載體引導(dǎo)到細(xì)胞中后，在適合表達(dá)所編碼序列表達(dá)的條件下對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。接著可以從 細(xì)胞分離所述抗體、抗原結(jié)合片段或抗體的一部分。在某些實施方式中，可以將兩種或者多種共同編碼IL-I β結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段的載體引入到細(xì)胞中。例如編碼重鏈可變區(qū)或完整重鏈序列的第一載體可以被引入到寄主細(xì)胞中，編碼輕鏈可變區(qū)或完整輕鏈序列的第二載體也被引入到寄主細(xì)胞中。接著在適合表達(dá)第一和第二載體所編碼的兩條序列的條件下，對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。如果必要，可以接著將所分離的多肽在促進(jìn)它們聯(lián)合和組合成IL-I β結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段的條件下將所分離的多肽進(jìn)行組合?？蛇x，所述第一和第二載體能夠被引入到不同的細(xì)胞中，并可以從各自細(xì)胞分離產(chǎn)品，并連接以提供IL-I β結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段。用于促進(jìn)抗體鏈和和組合成抗原結(jié)合多肽的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)被描述。類似的，分離抗體、其抗原結(jié)合片段或重鏈和輕鏈片段的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。含有本發(fā)明的核酸或載體的胚胎干細(xì)胞可以被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物。用于制備轉(zhuǎn)基因動物的方法被描述在Hofker等人，轉(zhuǎn)基因小鼠方法和實驗方案(分子生物學(xué)方法)(Transgenic Mouse Methods and Portocols (Methods in Molecular Biology )),Humana Press, Clifton, NJ,2002中。這里所公開的含有核酸或載體的轉(zhuǎn)基因非人動物可以被用與表達(dá)所編碼的抗體、抗原結(jié)合片段或所述抗體的一部分。接著可以從該動物分離抗體、抗原結(jié)合片段或所述抗體的一部分。接著可以對抗體的一部分進(jìn)行重新構(gòu)建(與抗體其它部分進(jìn)行組合)成本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體或抗體片段。所述寄主細(xì)胞可以是原核寄主細(xì)胞(例如大腸桿菌)或真核寄主細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或脊椎動物細(xì)胞)。在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)時，所述寄主細(xì)胞表達(dá)IL-I β結(jié)合抗體或片段，接著可以從培養(yǎng)基中被收集(如果寄主細(xì)胞將其分泌到培養(yǎng)基中)，或者直接從生產(chǎn)它的細(xì)胞中被收集(如果不被分泌)。選擇適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞將依賴于各種因素，例如期望的表達(dá)水平、對于活性是期望或必要的多肽修飾如糖基化或磷酸化、以及容易折疊成生物學(xué)上有活性的分子。在本領(lǐng)域中已知許多適合的寄主細(xì)胞，并可以從美國典型培養(yǎng)物庫(ATCC)Manassas，Va獲得。例子包括哺乳動物細(xì)胞例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO) (ATCCNo. CCL61) CHO DHFR-細(xì)胞(Urlaub 等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA97，4216-4220 (1980))、人胚胎腎(HEK) 293 或 293T 細(xì)胞(ATCC No. CRL1573)、3T3 細(xì)胞(ATCC No. CCL92)或 PER.C6細(xì)胞。對適當(dāng)哺乳動物寄主細(xì)胞的選擇，以及轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴增、篩選和產(chǎn)物生產(chǎn)以及純化的方法是本領(lǐng)域中已知的。其它適當(dāng)?shù)牟溉閯游锛?xì)胞系是猴COS-UATCC No. CRL1650)和C0S-7細(xì)胞系(ATCC No. CRL1651)以及CV-1細(xì)胞系(ATCC No. CCL70)。其它的典型哺乳寄主細(xì)胞包括靈長類細(xì)胞系、鳥類細(xì)胞系和嚙齒類細(xì)胞系，包括被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。正常的二倍體細(xì)胞，來自體內(nèi)原代培養(yǎng)組織的細(xì)胞主以及原代外植體也是適當(dāng)?shù)摹：蜻x的細(xì)胞可以在選擇基因上基因型缺陷，或者可以含有顯性發(fā)揮作用的選擇基因。其它適合的哺乳動物細(xì)胞包括但不限于小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤N2A細(xì)胞、HeLa、小鼠L-929細(xì)胞、來自Swiss Balb_c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK倉鼠細(xì)胞系，其可以從美國典型培養(yǎng)物庫Manassas，Va獲得。這些細(xì)胞系中的每一種都是蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員知道并可以得到的。類似可以用作本發(fā)明的寄主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。例如各種大腸桿菌(E. coli)株(例如 HB101、(ATCC No. 33694)DH5a、DHlO 以及 MC1061(ATCC No. 53338))是在生物技術(shù)領(lǐng)域中公知的寄主細(xì)胞?？莶輻U菌(B. subtilis)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)、其它桿菌(Bacillus spp.)、鏈霉菌(Streptomyces spp.)等的各種株都可以用于本發(fā)明中。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體被通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)染到寄主細(xì) 胞中。轉(zhuǎn)染包括多種通常用于將外源DNA引入到原核或真核寄主細(xì)胞中的多種技術(shù)，例如電轉(zhuǎn)、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管理論上可以在原核或真核寄主細(xì)胞中都能夠表達(dá)IL-I β結(jié)合抗體或片段，但優(yōu)選在真核寄主細(xì)胞中表達(dá)所述抗體或片段，最優(yōu)選在哺乳動物寄主細(xì)胞中，因為真核細(xì)胞特別是哺乳動物細(xì)胞比原核細(xì)胞更可能組裝和分泌被正確折疊并且具有免疫學(xué)活性的抗體。用于表達(dá)本發(fā)明重組抗體的哺乳寄主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)(包括dhfr-CHO細(xì)胞，其在Urlaub和Chasin，(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :42164220中被描述，使用DHFR作為可選擇的標(biāo)記物，例如在R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159 :601-621 中所描述的)，NSO 骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。如果編碼抗體基因的重組表達(dá)載體被引入到哺乳動物寄主細(xì)胞中，則通過將該寄主細(xì)胞培養(yǎng)一段時間來制備所述抗體，其中所述時間足以允許在寄主細(xì)胞中表達(dá)抗體，或者更優(yōu)選將所述抗提分泌到寄主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中。使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化方法可以從培養(yǎng)基中回收所述抗體。許多本領(lǐng)域中已知的酵母細(xì)胞株也可以用作表達(dá)抗體和片段的寄主細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞包括例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)。另外，如果期望,可以利用昆蟲細(xì)胞。這些系統(tǒng)可以被描述在例如Kitts等人(Biotechniques, 14,810-817 (1993)),Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol.，4, 564-572 (1993))以及 Lucklow 等人(J. Virol.，67,4566-4579(1993))中。優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞是 Sf-9 和 Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)。可以通過公知的方法包括氯化鈣法、電轉(zhuǎn)法、微注射法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或DEAE-葡聚糖法，將編碼IL-I β結(jié)合抗體或片段轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到選定的寄主細(xì)胞中。所選擇的方法將部分依賴于所使用的細(xì)胞類型。這些方法和其它適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ枪?，并且在Samtoook等人見上文中被列出。轉(zhuǎn)基因動物也可以用于表達(dá)糖基化抗體和片段。例如，人們可以使用轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)奶動物(例如牛和羊)并在動物奶中得到糖基化的結(jié)合試劑?？蛇x地，人們可以使用植物來生產(chǎn)糖基化的選擇結(jié)合試劑?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的培養(yǎng)基培養(yǎng)含有編碼IL-I β結(jié)合抗體或片段的表達(dá)載體的寄主細(xì)胞。所述培養(yǎng)基通常含有細(xì)胞生長和存活所必須的所有營養(yǎng)物。用于培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)基的例子包括Luria Broth (LB)和/或Terrific Broth (TB)。用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基是RPMI1640、MEM、DMEM，其可以被補充血清和/或培養(yǎng)特定細(xì)胞系所期望的生長因子。典型的昆蟲培養(yǎng)基是格雷斯氏培養(yǎng)基，其被補充了酵母粉、乳白蛋白水解產(chǎn)物和/或胎牛血清作為必需品?？梢杂糜诒晦D(zhuǎn)染細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性生長的抗生素或其它化合物可以被加入到培養(yǎng)基中作為補充物。根據(jù)在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的質(zhì)粒上所出現(xiàn)的選擇標(biāo)記物，對該化合物進(jìn)行選擇。例如，如果所述可選擇的標(biāo)記物元件是卡那霉素抗性，則加入到培養(yǎng)基中的化合物將是卡那霉素。用于選擇性培養(yǎng)的其它化合物包括青霉素、四環(huán)素和新霉素。通過使用本領(lǐng)域已知的方法可以確定寄主細(xì)胞所產(chǎn)生的IL-I β結(jié)合抗體或片段的量。這些方法包括但不限于蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、非變性凝膠電泳、HPLC分離、免疫沉淀和/或活性檢驗。對已經(jīng)被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的IL-Ιβ結(jié)合抗體或片段的純化，可以通過使用 許多技術(shù)完成包括親和、免疫親和或離子交換層析、分子篩層析、制備型凝膠電泳或等電聚焦、聚焦層析和高壓氣相色譜。例如，可以通過親和層析使用蛋白質(zhì)A純化含有Fe區(qū)的抗體，其中蛋白質(zhì)A選擇性地結(jié)合Fe區(qū)?？梢灾苽湓谄漪然虬被┒司哂杏H和標(biāo)簽包括六聚組胺酸或其它小妝如 FLAG (Eastman Kodak Co. ,New Haven, Conn.)或 myc (Invitrogen)的被修飾形式的抗體或抗原結(jié)合片段，接著通過一步親和柱進(jìn)行純化。例如多聚組胺酸以高親和力和特異性結(jié)合鎳，因此鎳柱的親和力(例如Qiagene.鎳柱)可以被用于純化具有多聚組胺酸標(biāo)簽的選擇結(jié)合試劑(參見例如Ausubel等人eds. ,Current Protocols inMolecular Biology, Section 10. 11. 8, John Wiley & Sons, New York(1993))。在某些情況中，可以采用多步純化。在原核寄主細(xì)胞中表達(dá)的IL-I β結(jié)合抗體或片段可以以可溶形式出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)的周質(zhì)間隙中，或者以不溶形式作為細(xì)胞內(nèi)含體的一部分。IL-I β結(jié)合抗體或片段可以被從寄主細(xì)胞中提取出來，其使用本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)技術(shù)。例如，所述寄主細(xì)胞可以被裂解以釋放外周胞質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)的成分，其通過弗氏壓碎(French pressure)、勻楽；和/或超
聲接著離心。可以使用本領(lǐng)域已知的方法，對在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)或從細(xì)胞周質(zhì)間隙釋放的可溶形式的IL-I β結(jié)合抗體或片段進(jìn)行進(jìn)一步的純化，例如通過滲透壓休克技術(shù)從細(xì)菌周質(zhì)間隙釋放Fab片段。如果已經(jīng)形成了含有抗體或片段的內(nèi)含體，則它們通常會結(jié)合到細(xì)胞膜的內(nèi)壁和/或外壁上，因此會最初在離心后的沉淀材料中被發(fā)現(xiàn)。接著在PH極限下或使用離液劑如去污劑、胍或胍衍生物、尿素或尿素衍生物在存在還原劑如二硫蘇糖醇在堿性PH下或三羧乙基磷在酸性PH下對沉淀材料進(jìn)行處理，以釋放、分離和溶解內(nèi)含體。接著可以將可溶的抗體或片段使用凝膠電泳、免疫沉淀等進(jìn)行分析。如果希望可溶的抗體或抗原結(jié)合片段，則可以使用標(biāo)準(zhǔn)的方法如在下面和在Marston等人(Meth. Enz.，182 :264-275(1990))中所描述的方法進(jìn)行分離。在某些情況中，在分離后，IL-I β結(jié)合抗體或片段可能不具有生物學(xué)活性?？梢允褂迷S多用于“重新折疊”或?qū)⒍嚯霓D(zhuǎn)化成其四級結(jié)構(gòu)并生成二硫鍵的方法以恢復(fù)其生物學(xué)活性。這些方法包括將溶解的多肽在存在特定濃度的離液劑時暴露到通常高于7的pH下。對離液劑的選擇非常類似于用于內(nèi)含體溶解的選擇，但通常離液劑被以較低的濃度使用，并且不必要與溶解時所使用的離液劑相同。在大多數(shù)情況中，重新折疊/氧化溶液將還含有還原劑或以特定比例的還原劑和其氧化形式，以得到特定的氧化還原勢能，以能夠使二硫鍵混編在所形成的蛋白質(zhì)半胱氨酸橋中出現(xiàn)。某些通常使用的氧化還原對包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH) / 二硫二 GSH、氯化銅、二硫蘇二醇(DTT) / 二噻烷DTT以及2-巰基乙醇(bME) / 二-硫代-b (ME)。在許多情況中，可以使用助溶劑來提高重新折疊的效率，用于該目的通常使用的試劑包括甘油、不同分子量的聚乙二醇、精氨酸等。也可以通過化學(xué)合成方法(例如固相肽合成)制備本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體或片段，其使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，例如在Merrifield等人(1963), J. Am. Chem. Soc,85 :2149, Houghten 等人(1985)，Proc Natl Acad. Sci. USA, 82 :5132,以及 Stewart 和Young(1984),固相妝合成(Solid Phase Peptide Synthesis,)皮爾斯化學(xué)公司(PierceChemical Co.),羅克福德(Rockford) , 111中所列出的。這些抗體或片段可以被合成為在氨基末端具有或者沒有甲硫氨酸?；瘜W(xué)合成的抗體和抗原結(jié)合片段可以使用在這些參考文 獻(xiàn)中所列出的方法被氧化以形成二硫橋。這樣制備的抗體和片段將保持與原始或重組產(chǎn)生的IL-I β結(jié)合抗體或片段相關(guān)的至少一種生物學(xué)功能。藥物組合物可以將本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體配制在組合物中。這類組合物包含治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體，其與適當(dāng)?shù)倪\載體混合例如藥物上可以接受的試劑。通常，在配制到藥物組合物之前，本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體被充分純化用于為動物給藥。用于本發(fā)明藥物組合物的藥物上可以接受的試劑包括運載體、賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑、防腐劑、著色劑、芳香劑和稀釋試劑、乳化劑、溶劑、填充劑、膨脹劑、緩沖液、傳輸載體、張度劑、助溶劑、潤濕劑、絡(luò)合劑、緩沖試劑、抗菌劑和表面活性劑。中性緩沖鹽或與血清蛋白混合的鹽是典型的適當(dāng)運載體。所述藥物組合物可以含有抗氧化劑例如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA ;糖醇如甘露醇或山梨醇；形成鹽的帶相反電荷的離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如Tween、普盧蘭尼克(Pluronic)或聚乙二醇(PEG)。同樣，作為例子，適當(dāng)?shù)膹埩υ鰪妱┌▔A金屬鹵化物(優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇、山梨醇等。適當(dāng)?shù)姆栏瘎┌ū郊淄槁然@、硫汞撒、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。過氧化氫也可以被用作防腐齊U。適當(dāng)?shù)闹軇┌ǜ视?、丙二醇和PEG。適當(dāng)?shù)慕j(luò)合劑包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精或羥基-丙基-環(huán)糊精。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┗驖駶櫥ㄉ嚼婢厶酋?、聚山梨醇酯如聚山梨醇?0、氨丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊等。緩沖液可以是傳統(tǒng)的緩沖液例如醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或Tris-HCl。醋酸鹽緩沖液可以是大約pH 4-5. 5, Tris緩沖液可以是大約pH 7-8.5。在雷明頓氏藥物科學(xué)(Remington' sPharmaceutical Sciences),第 18 版,A. R. Gennaro, ed.,馬克出版公司(Mack PublishingCompany), 1990中列出了其它的藥物試劑。
所述組合物可以是液體形式，或者是凍干或冷凍干燥的形式，并可以含有一種或多種凍干保護(hù)劑、賦形劑、表面活性劑、高分子量結(jié)構(gòu)添加劑和/或膨脹劑(參見例如美國專利6，685，940,6, 566，329和6，372，716)。在一個實施方式中，含有凍干保護(hù)劑，其是非還原糖如蔗糖、乳糖或海藻糖。通常所含的凍干保護(hù)劑的量是，通過重新構(gòu)建，所得到的制劑將是等滲的，盡管高滲或稍微高滲的制劑也可以是適當(dāng)?shù)摹Ａ硗?，凍干保護(hù)劑的量需要足以防止由于凍干出現(xiàn)不能接受的變性和/或聚集的量。在預(yù)先凍干的制劑中典型凍干保護(hù)劑糖(例如蔗糖、乳糖或海藻糖)的濃度是大約IOmM至大約400mM。在另一個實施方式中，含有表面活性劑，例如如非離子表面活性劑和離子表面活性劑如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80);泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188);聚(乙二醇基)苯醚(例如Triton);十_■燒基硫酸納(SDS);月桂燒基硫酸納；羊燒基糖昔納；月桂燒基_、肉 蓮基_、亞油烯基-或硬脂?；?磺基甜菜堿；月桂烷基_、肉豆蘧基_、亞油烯基-或硬脂?；?肌氨酸；亞油烯基_、肉豆蘧基-或鯨蠟基甜菜堿；月桂酰胺丙基_、椰油酰胺丙基_、亞油烯基酰胺丙基_、肉豆蘧基酰胺丙基_、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基-甜菜堿(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蘧基酰胺丙基_、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基-二甲胺；椰油甲基牛橫酸鈉或甲基ofeyl牛橫酸二鈉(methyl ofeyl-taurate);以及M0NAQUAT 系 列(Mona Industries, Inc. , Paterson, N. J.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)。在預(yù)先凍干的制劑中表面活性劑的典型量是大約0.001-0.5%。高分子量結(jié)構(gòu)添加劑(例如填充劑、粘合劑)可以包括例如阿拉伯樹膠、白蛋白、褐藻酸、磷酸鈣(二鹽)、纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、葡聚糖、糊精、葡萄糖結(jié)合劑、蔗糖、甲基纖維素、預(yù)膠凝淀粉、硫酸鈣、直鏈淀粉、甘氨酸、膨潤土、麥芽糖、山梨醇、乙基纖維素、磷酸氫二鈉、磷酸二鈉、焦亞硫酸二鈉、聚乙烯醇、凝膠、葡萄糖、瓜爾樹膠、液狀葡萄糖、可壓縮糖、硅酸鎂鋁、麥芽糊精、聚氧乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚維酮、藻酸鈉、黃芪膠微晶纖維素、淀粉和玉米蛋白。高分子量結(jié)構(gòu)添加劑的典型濃度是0.1重量％至10重量％。在其它實施方式中，可以包含膨脹劑(例如甘露醇、甘氨酸)。組合物可以適合腸胃外給藥。適合通過任何路線注射或灌注進(jìn)入動物的典型組合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到的，例如關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)(實質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)或損傷內(nèi)路線。腸胃外給藥的制劑通常是無菌、無熱原、等滲的水溶液，可選擇地含有藥物上可以接受的防腐劑。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、可注射的有機酯如油酸乙酯。含水運載體包括水、醇/水溶液、乳化劑或懸浮液包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外給藥媒介包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或固定性油。靜脈內(nèi)給藥的媒介包括液體和營養(yǎng)補充物、電解液補充物例如基于林格氏右旋糖的等。也可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。通常，參見Remington' s Pharmaceutical Science,第 16 版,Mack Eds. , 1980,這里將其引入作為參考。這里所描述的藥物組合物可以被配制成可控釋放或持續(xù)釋放，其以提供局部產(chǎn)品濃度(例如團(tuán)塊(bolus)、積存作用)和/或在特定局部環(huán)境中提高半衰期的方式。該組合物可以含有本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的制劑，其具有微粒聚合化合物配制品如聚乳酸等、聚乙醇酸以及諸如生物可降解基質(zhì)、可注射微球、微膠囊顆粒、微膠囊、生物蝕解的顆粒珠、脂質(zhì)體和可植入釋放設(shè)備，其提供對所述活性試劑的可控或持續(xù)釋放，接著其可以作為積存注射被釋放。用于配制這類持續(xù)釋放或可控釋放的方法是已知的，并且許多聚合物已經(jīng)被開發(fā)并用于控制釋放和傳輸藥物。通常這些聚合物是生物可降解的和生物兼容的。聚合物水凝膠包括通過對映體聚合物的或多肽部分的絡(luò)合、具有溫度或PH敏感性能的水凝膠可以期望用于提供藥物積存作用，因為在捕獲生物活性蛋白脂藥物(例如抗體)中有關(guān)的潮濕和含水的條件。參見，例如在PCT專利申請WO 93/15722中關(guān)于釋放多孔聚合物微顆粒用于傳輸藥物組合物。用于此目的的適當(dāng)材料包括聚交酯(參見，例如美國專利3，773，919)、聚(a_羥基羧酸)聚合物，例如聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133，988A)、L-谷氨酸和Y - 乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物(Sidman等人，生物高聚物(Biopolymers)，22 :547-556 (1983))、聚(2-羥乙基-甲基炳烯酸脂)(Langer 等人，J. Biomed. Mater. Res.，15 167-277 (1981)以及 Langer,Chem. Tech.，12 :98-105 (1982))、乙烯-乙酸乙烯酯或聚-D㈠-3羥基丁酸。其它生物可降解聚合物包括聚(內(nèi)酯)、聚(乙縮醛)、聚(原酸酯)以及聚(原碳酸酯)。持續(xù)釋放的組合物還可以包含脂質(zhì)體，其可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法被制備(參見，例如Eppstein等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 :3688-92 (1985))。運載體自身或其降解產(chǎn)物在目標(biāo)組織中應(yīng)該是無毒的，并且不應(yīng)該進(jìn)一步使病癥惡化。這可以通過在目標(biāo)失調(diào)的動物模型中直接篩選而確定，或者如果沒有這類模型，則在正常動物中進(jìn)行。用于持續(xù)釋放的對重組蛋白的微膠囊化已經(jīng)成功地應(yīng)用于人生長激素(rhGH)、干擾素-(rhlFN—)、白介素-2 和 MNrgpl20。Johnson 等人，Nat. Med.，2 :795-799(1996)；Yasuda，Biomed. Ther. ,27 :1221-1223 (1993) ；Hora 等人 Bio/Technologv.8 755-758(1990) ；Cleland,"使用聚交酯聚乙二醇微球體系統(tǒng)的單免疫疫苗的設(shè)計和制備(Design and Production of Single Immunization Vaccines Using PolylactidePolyglycolide Microsphere Systems),"在疫苗設(shè)計中:亞單位和輔劑途徑(in VaccineDesign The Subunit and Adjuvant Approach),Powell and Newman,eds,(Plenum Press New York, 1995)，pp. 439-462 ；W097/03692, WO 96/40072，WO 96/07399 ;和美國專利No. 5，654，010。由于其生物兼容性和生物可降解性能的寬范圍，使用乳酸-乙二醇酸共聚物(PLGA)開發(fā)這些蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放的制劑。PLGA的降解產(chǎn)物，乳酸和乙二醇酸可以在人體內(nèi)被快速清除。而且，該聚合物的降解能力能夠依賴于其分子量和組成。Lewis，"來自交酯/糖脂類聚合物的生物活性試劑的受控釋放(Controlled release of bioactiveagents from lactide/glycolide polymer),"在(in :)M. Chasin 和 R. Langer(Eds.)，生物所能降解的聚合物作為藥物遞呈系統(tǒng)(Biodegradable Polymers as Drug DeliverySystems) (Marcel Dekker New York, 1990), pp. 1-41 其它持續(xù)釋放組合物的例子包括例如 EP 58，481A、美國專利 No. 3，887，699、EP 158，277A、加拿大專利 No. 1176565、U. Sidman等人，Biopolymers 22, 547 [1983]，R. Langer 等人，Chem. Tech. 12,98 [1982]，Sinha 等人，控釋(J. Control. Release) 90，261 [2003]，Zhu 等人，Nat. Biotechnol. 18，24 [2000]，以及Dai 等人,膠體 Surf B 生物界面(Colloids Surf B Biointerfaces)41,117[2005]。生物粘合劑聚合物也被期望用于本發(fā)明的組合物中，或者與本發(fā)明的組合物共同使用。生物粘合劑是合成和天然出現(xiàn)的材料，其能夠長時間附著到生物基質(zhì)上。例如，卡波姆和聚卡波非都是聚(丙烯酸)的合成交聯(lián)衍生物。基于天然物質(zhì)的生物粘合劑傳輸系統(tǒng)包括例如透明質(zhì)酸，也被稱作透明質(zhì)燒(hyaluronan)。透明質(zhì)酸是天然的黏多糖,其由D-葡萄糖醛酸和N-乙?；?D-氨基葡萄糖的殘基構(gòu)成。透明質(zhì)酸是在脊椎動物的細(xì)胞外組織基質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)的包括在結(jié)締組織中以及在滑液中和在眼睛的玻璃質(zhì)和水狀液中。透明質(zhì)酸的酯衍生物已經(jīng)被用于生產(chǎn)用于生物兼容的和生物可降解的傳輸中的微球(參見例如 Cortivo 等人，Biomaterials (1991) 12 :727-730 ;歐洲公開 No. 517，565 ;國際公開 No. WO96/29998 ;Ilium等人，J. Controlled Rel. (1994)29 :133-141)。含有本發(fā)明組合物的典型透明質(zhì)酸含有透明質(zhì)酸酯聚合物，其量為IL-I β結(jié)合抗體或片段相對透明質(zhì)酸聚合物為大約 O. 1% (w/w)至大約 40% (w/w) ο
生物可降解和非生物可降解基質(zhì)都可以被用于傳輸本發(fā)明的組合物，這類聚合物基質(zhì)可以含有天然或合成聚合物。優(yōu)選生物可降解的基質(zhì)。釋放出現(xiàn)的時間基于對該聚合物的選擇。通常在幾個小時到12個月的范圍內(nèi)的釋放經(jīng)歷的時間是最優(yōu)選的?？梢杂糜谛纬缮锟山到鈧鬏斚到y(tǒng)的典型聚合物包括乳酸和乙二醇酸的聚合物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴、聚亞烷基二醇、聚亞烷基氧化物、聚亞烷基對苯二甲酸酯、 聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯鹵化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸、聚硅氧烷、聚酐、聚氨酯及其共聚物、聚(丁酸)、聚(戊酸)、烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥基-丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、纖維素醋酸酯、纖維素丙酸酯、纖維素醋酸丁酸酯、纖維素醋酸鄰苯二甲酸酯、羧乙基纖維素、纖維素三醋酸酯、纖維素硫酸鈉鹽、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚(氧乙烯)、聚(乙烯對苯二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚乙烯醋酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。典型的天然聚合物包括藻酸鹽和其他多糖包括葡聚糖和纖維素、膠原及其化學(xué)衍生物(取代、增加化學(xué)基團(tuán)如烷基、烯基、羥基化、氧化和由本領(lǐng)域技術(shù)人員直接進(jìn)行的其它修飾)、白蛋白和其它親水蛋白質(zhì)、玉米蛋白和其它醇溶谷蛋白以及疏水蛋白質(zhì)、它們的共聚物和混合物。通常，這些材料會通過酶水解或在體內(nèi)暴露到水、通過表面或體(bulk)侵蝕而被降解。可選擇的，所述聚合物是以水凝膠的形式(參見例如 WO 04/009664、WO 05/087201、Sawhney，等人，Macromolecules, 1993，26，581-587，)，其能夠在水中吸收最高達(dá)到其重量的大約90%，可選擇地其進(jìn)一步與多價離子或其它聚合物進(jìn)行交聯(lián)。傳輸系統(tǒng)還包括非聚合物系統(tǒng)，其為脂類包括固醇如膽固醇、膽固醇酯和脂肪酸或其它中性脂肪如甘油單酸酯、甘油二酸酯甘油和三酸酯；水凝膠釋放體系；肽基系統(tǒng)；石蠟涂層、使用傳統(tǒng)的粘結(jié)劑和賦形劑的壓縮片；部分融合的植入物等。具體的例子包括但不限于(a)侵蝕系統(tǒng)，其中包含在基質(zhì)內(nèi)的形式的所述產(chǎn)品，如在美國專利No. 4，452，775、4，675，189和5，736，152中所描述的；和(b)擴散系統(tǒng)，其中產(chǎn)品以可控的速率從聚合物滲透例如在美國專利No. 3，854，480,5, 133，974和5，407，686中所描述的。通過已知的方法可以制備含有所述產(chǎn)品的脂質(zhì)體，諸如例如(DE 3，218，121 ;EpStein等人，Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 82 :3688-3692 (1985) ；Hwang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4030-4034(1980) ；EP 52, 322 ；EP 36, 676 ；EP 88, 046 ；EP 143, 949 ；EP 142，641;日本專利申請 83-118008 ;美國專利 No. 4，485，045 和 4，544，545 ；以及 EP102, 324)?？蛇x或額外，所述組合物可以被局部給藥，其通過將已經(jīng)吸附或封裝本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的膜、海綿或其它適當(dāng)材料植入到受影響的區(qū)域內(nèi)。如果使用植入設(shè)備，則所述設(shè)備可以被植入到任何適當(dāng)?shù)慕M織或器官中，本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的釋放可以直接通過該設(shè)備經(jīng)過推注(bolus)或經(jīng)過連續(xù)給藥，或經(jīng)過使用連續(xù)灌輸?shù)膶?dǎo)管進(jìn)行。含有本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的藥物組合物可以被配制為吸入藥諸如例如作為干粉。吸入藥溶液也可以被配制在液體推進(jìn)藥中進(jìn)行氣霧劑傳輸。在另一種制劑中，溶液可以被制成噴霧狀。用于肺部給藥的其它藥物組合物包括例如在PCT申請公開WO 94/20069中所描述的，其公開了肺部傳輸化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)。為了進(jìn)行肺部
傳輸，粒度應(yīng)該適合傳輸?shù)椒尾磕┒?distal lung)。例如,所述粒度可以為14!11至54 1]1;然而，可以使用更大的顆粒例如如果每個顆粒都完全是多孔的。某些含有本發(fā)明的IL-Ιβ結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的制劑可以被口服給藥。以這種形式給藥的制劑可以使用或不使用通常用于固體劑型如藥片和膠囊的組合中的那些運載體進(jìn)行給藥。例如，如果生物利用度被最大化，前藥降解(pre-systemicdegradation)被最小化，則膠囊可以被設(shè)計為在腸胃道中的位置釋放該制劑的活性部分。可以包含其它的藥物以促進(jìn)選擇性結(jié)合劑的吸附。稀釋劑、調(diào)味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、藥片崩解劑，還可以采用粘結(jié)劑。另一種制劑可以含有有效量的本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或運載體與適合制備藥片的無毒賦形劑的混合。通過將所述藥片溶解在無菌水中，或者其它適當(dāng)?shù)倪\載體中，可以以單位劑型制備該溶液。適當(dāng)?shù)馁x形劑包括但不限于惰性稀釋劑如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或粘結(jié)劑如淀粉、凝膠或阿拉伯樹膠；或乳化劑如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石?？紤]到這里的公開內(nèi)容以及配制技術(shù)的公知技術(shù)，根據(jù)所期望的給藥路線、傳輸方式以及期望的劑量，可以確定適當(dāng)?shù)暮?或優(yōu)選的藥物制劑。不管給藥方式如何，根據(jù)患者體重、體表面積或器官大小可以計算有效的劑量。對確定采用這里所描述的每一種制劑用于治療的適當(dāng)劑量的計算的進(jìn)一步改進(jìn)是本領(lǐng)域中常規(guī)進(jìn)行的，并且在本領(lǐng)域中常規(guī)完成的任務(wù)范圍內(nèi)。通過使用適當(dāng)?shù)膭┝宽憫?yīng)數(shù)據(jù)可以確定適當(dāng)?shù)膭┝?。根?jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容其它的制劑將是明顯的，其包括含有與一種或者其它治療藥物組和的本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的制劑。例如，在某些制劑中，本發(fā)明的IL-Ιβ結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體被配制為IL-I信號通路的第二抑制劑結(jié)合。代表性的第二抑制劑包括但不限于抗體、抗體片段、肽、多肽、化合物、核酸、載體和藥物組合物例如如在 US6899878、US2003022869、US20060094663, US20050186615、US20030166069、W0/04022718、W0/05084696 和 W0/05019259 中所描述的。例如，該組合物可以含有與IL-I β結(jié)合抗體、片段或編碼這類抗體或片段的載體的核酸或載體結(jié)合的本發(fā)明的IL-Ιβ結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體。所述藥物組合物可以包含與其它活性試劑結(jié)合的IL-I β結(jié)合抗體或片段。這些組合是可以用于它們期望目的的。下面列出的活性試劑是為了說明的目的，并不是為了限制。作為本發(fā)明一部分的組合可以使本發(fā)明的抗體和片段以及至少至少選自下表中的一種額外的試劑的組合。如果該組合被形成能夠進(jìn)行其期望的功能的組合物的話，該組合還可以包含多種額外的試劑例如兩種或三種?；钚栽噭┗蚺c本發(fā)明抗體或片段的組合包括非類固醇抗炎藥物(NSAID)例如阿斯匹林、布洛芬和其它丙酸衍生物(阿明洛芬、苯5洛芬、氯環(huán)己苯酰丙酸、卡洛芬、芬布芬、非諾洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、吲哚布洛 芬、酮基布洛芬、咪洛芬、萘普生、奧沙普嗪、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫噁洛芬)、醋酸衍生物(吲哚美辛、阿西美辛、阿氯芬酸、環(huán)氯茚酸、雙氯芬酸、芬氯酸、芬克洛酸、芬替酸、弗洛芬那(fuirofenac)、異丁芬酸、伊索克酸、奧斯皮納(oxpinac)、舒林酸、硫平酸、托爾米汀、齊多美辛和佐美酸)、滅酸衍生物(氟芬那酸、甲氯滅酸、甲滅酸、尼氟滅酸和托芬那酸)、聯(lián)苯羧酸衍生物(迪夫尼沙(difiunisal)和氟苯柳)、昔康類(伊索昔康、批羅昔康、舒多昔康和替諾昔康)、水楊酸鹽(乙酰水楊酸酯、柳氮磺胺吡啶)和吡唑啉酮類(阿扎丙宗、本扎披派瑞隆(bezpiperylon)、非普拉宗、莫非布宗、輕基保泰松、保泰松)。其它組和包括環(huán)氧合酶-2(C0X-2)抑制劑。其它用于組合的活性試劑包括類固醇例如氫化波尼松、強的松、甲基氫化波尼松、倍它米松、地塞米松或氫化可的松。這類組合可以是特別有利的，因為在使用本發(fā)明的抗體和片段地組合進(jìn)行治療患者時，通過將逐漸所需的膽固醇劑量的量可以減少甚至消除一種或者多種副作用。用于與IL-I β結(jié)合抗體或片段組合治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性試劑的其它例子包括細(xì)胞因子抑制性抗炎藥物(CSAIDs);其它人細(xì)胞因子或生長因子的抗體或拮抗劑，其中所述細(xì)胞因子或生長因子例如 TNF、LT、IL-I β、IL-2、IL_6、IL_7、IL-8, IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II, GM-CSF, FGF或TOGF。所述IL-I β結(jié)合抗體和片段可以與細(xì)胞表面分子的抗體組合，其中所述細(xì)胞表面分子例如⑶2、⑶3、⑶4、⑶8、⑶25、⑶28、⑶30、⑶40、⑶45、CD69、CD80 (Β7. I)、CD86 (Β7. 2)、CD90 或其配體包括 CD 154 (gp39 或 CD40L)。活性試劑的優(yōu)選組合可以在自體免疫及后續(xù)炎癥級聯(lián)反應(yīng)中的不同點干擾；優(yōu)選的例子包括TNF拮抗劑例如嵌合、人源化或人TNF抗體、D2E7、cA2 (Remi cade )、CDP571、抗-TNF抗體片段(例如CDP870)以及可溶p55或p75TNF受體、其衍生物、(p75TNFRIgG(EnbreI )或 p55TNFRIgG(Lenerc印t)、可溶 IL-13 受體(sIL-13)以及 TNFa轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑；類似的，由于相同的理由，IL-I抑制劑(例如白介素-I轉(zhuǎn)化酶抑制劑如Vx740或IL-IRA等)可以是有效的。其它優(yōu)選的組合包括白介素11、抗_P7s和p-選擇素糖蛋白配體(PSGL)。另一種組合是自體免疫反應(yīng)的其它關(guān)鍵參與物，其可以與IL-I β發(fā)揮類似功能、依賴IL-I β或與IL-I β —致發(fā)揮功能。可以與抗體或抗體結(jié)合部分組合以治療克羅恩病的活性試劑包括TNF拮抗劑例如抗 TNF 抗體、D2E7、cA2 (Remicade )、CDP 571、抗-TNF 抗體片段(例如 CDP870) ,TNFR-Ig構(gòu)建體(p75TNFRIgG(Enbrel )和p55TNFRIgG(Lenercept))、抗-P7、p-選擇素糖蛋白配體、可溶IL-13受體(sIL-13)以及TOE4抑制劑。IL-I β結(jié)合抗體或片段可以與皮質(zhì)甾類組合如布地縮松和地塞米松。所述IL-I β結(jié)合抗體或片段也可以與諸如下列的試劑組合柳氮磺胺吡啶、5-氨基水楊酸和奧沙拉嗪以及干擾促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子如IL-I的合成或功能的試劑例如IL-I轉(zhuǎn)化酶抑制劑(例如Vx740)和IL-lra。IL-I β結(jié)合抗體或片段也可以與T細(xì)胞信號傳導(dǎo)抑制劑共同使用，例如酪氨酸激酶抑制劑6-巰基嘌呤。IL-Ιβ結(jié)合抗體或片段可以與IL-Il組合。可以與抗體或抗體結(jié)合部分組合以治療多發(fā)性硬化癥的活性試劑的其它例子包括皮質(zhì)留類；波尼松龍；甲基波尼松龍；咪唑硫嘌呤；環(huán)磷酰胺；環(huán)孢霉素；甲氨蝶呤；4_氨基卩比唳；替扎尼定；干擾素_β la (Avonex ；Biogen);干擾素- β Ib (Betaseron ；Chiron/Berlex);共聚物 I (Copolymer I) (Cop-1 ;可巴松(Copaxone);泰瓦制藥工業(yè)公司(Teva Pharmaceutical Industries, Inc.));高壓氧；靜脈注射免疫球蛋白；克拉比彬(clabribine);其它人細(xì)胞因子或生長因子的抗體或拮抗劑，其中所述人細(xì)胞因子或生長因子如 TNF,LT, IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF 和TOGF。The IL-I β結(jié)合抗體或片段可以與細(xì)胞表面分子的抗體結(jié)合，其中所述細(xì)胞表面分子如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90 或它們的配體。IL-I β結(jié)合抗體或片段可以與試劑組合，例如甲氨蝶呤、環(huán)孢霉素、FK506、雷帕霉素、霉酹酸酯(mycophenolate mofetil)、來氟米特、NSAID例如布洛芬、皮質(zhì)留類例如潑尼松龍、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷拮抗劑、抗血栓形成試劑、補體抑制劑、釋放腎上腺素的藥物、干擾促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子如TNFa或IL-I的信號傳導(dǎo)的試劑(如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-I β轉(zhuǎn)化酶抑制劑(例如Vx740)、抗-P7、p-選擇素糖蛋白配體(PSGL)、 TACE抑制劑、T-細(xì)胞信號傳導(dǎo)抑制劑例如激酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶、咪唑硫嘌呤、6-巰基嘌呤、血管收縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、可溶細(xì)胞因子受體及其衍生物(例如可溶 p55 或 p75TNF 受體、sIL-1 RI、sIL-lRII、sIL_6R、可溶 IL-13 受體(sIL-13))和抗炎細(xì)胞因子(例如 IL-4、IL-10、IL-13 和 TGF β )?？梢耘c抗體或抗體結(jié)合部分組合以治療多發(fā)性硬化癥的活性試劑的優(yōu)選例子能夠包括干擾素- β例如IFN β Ia和IFN β Ib ;Copaxone、皮質(zhì)甾類、IL-1抑制劑、TNF抑制劑和⑶40配體和⑶80的抗體。藥物組合物可以含有治療有效量或預(yù)防有效量的本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體或片段。治療有效量是指以該劑量持續(xù)必要的時間能夠有效達(dá)到期望的治療效果的量?？贵w或抗體部分的治療有效量可以根據(jù)許多因素而變化例如疾病狀態(tài)、年齡、性別、個體重量以及抗體或抗體部分在個體中表現(xiàn)出期望響應(yīng)的能力。治療有效量還是治療有益效果超過所述抗體或抗體部分的所有毒性或有害效果的量。預(yù)防有效量是指以該劑量持續(xù)必要的時間能夠有效達(dá)到期望的預(yù)防效果的量。通常，由于預(yù)防劑量是在受試者中在疾病之前或疾病早期使用的，因此預(yù)防有效量將低于治療有效量?？梢詥为毑捎帽景l(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體，或者與其它活性試劑組合應(yīng)用，其可以是相同的藥物組合物，也可以是不同的藥物組合物。例如，這些其它的活性藥物可以包括⑴IL-I拮抗劑(例如重組IL-IRa或IL-trap) ； (ii)白介素-I受體拮抗劑可溶TNF受體-I ；(iv)可溶TNF受體-2 (例如依那西普)；(iv)TNF抑制劑(例如抗體如D2E7);和/或(V)癌癥治療試劑。因此，這些組分中的一種或多種可以結(jié)合本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體被包含在本發(fā)明的組合物中。在某些情況中，可以期望以離體的方式使用包含本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的藥物組合物。在這種情況中，已經(jīng)從患者中取出的細(xì)胞、組織或器官被暴露到含有本發(fā)明的IL-I β結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的藥物組合物中，之后，接著所述將細(xì)胞、組織和/或器官植入回患者中。
在某些情況中，可以通過植入患者已經(jīng)被基因改造的這里所述的細(xì)胞以表達(dá)和分泌多肽、選擇性結(jié)合試劑、片段、變體或衍生物，而傳輸含有IL-I P結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的組合物。這些細(xì)胞可以是動物或人細(xì)胞，并且可以來自患者自身組織或者從其它來源無論是人還是非人類來源?？蛇x擇的，這些細(xì)胞可以是被固定的細(xì)胞。然而，為了降低免疫反應(yīng)的機會，優(yōu)選這些細(xì)胞被封裝以防止?jié)B透到周圍的組織中。封裝材料通常是生物兼容的、半滲透聚合物包裝或者是能夠允許蛋白質(zhì)產(chǎn)物釋放但防止細(xì)胞被患者免疫系統(tǒng)或其它來自周圍組織的破壞性因子所破壞的膜。用于對細(xì)胞進(jìn)行膜封裝的方法是已知的，制備被封裝的細(xì)胞以及將它們植入患者內(nèi)也已經(jīng)被描述，例如在美國專利4，892，538、5，011，472和5，106,627中。PCT申請公開WO 91/10425中描述了用于封裝或細(xì)胞的系統(tǒng)。用于配制多種其它持續(xù)或可控傳輸方式的技術(shù)例如脂質(zhì)體載體、生物可侵蝕的顆粒或珠也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并被描述。被封裝或未被封裝的細(xì)胞可以被植入到患者適當(dāng)?shù)纳眢w組織或器官中。

含有本發(fā)明的IL-I 0結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體的藥物組合物的治療有效量或預(yù)防有效量將依賴于例如所述組合物被用于的癥狀、給藥路線何受試者的病癥。以治 療或預(yù)防有效的量給藥藥物組合物以治療IL-I相關(guān)病癥。“治療有效量或預(yù)防有效量”的本發(fā)明的IL-I P結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體是能夠治療或防止一種或多種受試者中IL-I相關(guān)疾病的癥狀的量。因此，期望對本發(fā)明的IL-I 0結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體進(jìn)行滴定，并根據(jù)能夠獲得最佳的治療效果修改給藥路線。根據(jù)上面所提到的因素，劑量范圍包括大約0. lng/kg至大約100mg/kg或更多(每單位體重被給藥活性試劑的受試者的活性試劑的量)。在其它實施方式中，劑量范圍是大約0. I u g/kg至大約100mg/kg,大約I y g/kg至大約 100mg/kg,大約 5Mg/kg 至大約 100mg/kg,大約 0. 5mg/kg 至大約 100mg/kg,大約 lmg/kg至大約100mg/kg。其它的劑量也可以是適當(dāng)?shù)?。可以以單次劑量，或?jīng)過一段時間兩次或多次劑量(其可以含有或可以不含有相同量的本發(fā)明的IL-I P結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體)，或者通過例如植入設(shè)備或?qū)Ч苓M(jìn)行連續(xù)灌注。應(yīng)用方法本發(fā)明的抗體、抗體片段、核酸、載體、細(xì)胞和組合物(統(tǒng)稱為“本發(fā)明的化合物和組合物”)可以被用于任何目的。例如，本本發(fā)明的化合物和組合物可以被用于研究IL-I相關(guān)機制以及與IL-I相關(guān)機制有關(guān)的疾病和病癥。然而，本發(fā)明的化合物和組合物對于治療需要治療IL-I相關(guān)病癥如自體免疫或炎癥疾病或失調(diào)的受試者(如哺乳動物或人)是特別有用的。因此，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防哺乳動物中疾病的方法，該方法包括:為需要的哺乳動物給藥有效量的本發(fā)明的抗體或抗體片段、核酸或載體，這樣在哺乳動物中對所述疾病進(jìn)行了治療或預(yù)防。術(shù)語“有效量”指的是建立預(yù)防或治療效果所需的本發(fā)明的抗體或抗體片段、核酸或載體的量。正如這里所使用的，治療疾病或病癥被定義為暫時或永久減少或消除疾病或病癥的癥狀或進(jìn)展。類似的，預(yù)防疾病或病癥的意思是暫時或永久抑制、減慢或防止疾病或病癥(或疾病或病癥的癥狀)的開始。本發(fā)明的方法可以用于治療或防止IL-I相關(guān)的疾病或病癥。例如，本發(fā)明的抗體和片段被設(shè)計為用于預(yù)防和治療IL-I介導(dǎo)的疾病或醫(yī)學(xué)癥狀例如炎癥病癥、過敏或過敏癥狀、癌癥、超敏性反應(yīng)、自體免疫疾病、嚴(yán)重感染和器官或組織移植排斥。IL-I相關(guān)的病癥包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨關(guān)節(jié)炎、克羅恩病(Crohn’ s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、敗血性休克、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、移植物抗宿主疾病、動脈粥樣硬化、成人T細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)以及阿爾茨海默病。本發(fā)明的抗體和片段也可以用于防止新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病(N0MID/CINCA)、全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(systemic onset juvenile idiopathic arthritis)、斯蒂爾病(Stills disease)、CAPS或穆-韋二氏綜合癥(Muckle-Wells syndrome)。通常，如果與體液或組織中提高的IL-I 0水平相關(guān)，或者如果從身體取出的細(xì)胞或組織在培養(yǎng)中產(chǎn)生提高水平的IL-I 3，則該疾病或病癥被認(rèn)為是IL-I 3相關(guān)疾病或病癥。例如，本發(fā)明的方法可以被用于治療或防止新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病(N0MID/CINCA)、全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(systemic onset juvenile idiopathic arthritis)、CIASl相關(guān)周期性綜合癥(CAPS)、斯蒂爾病(Stills disease)或Muckle-Wells綜合癥。
作為另一個實施例，本發(fā)明可以被用于治療或者防止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、敗血性休克、慢性阻塞性肺部疾病、哮喘、移植物抗宿主疾病、動脈粥樣硬化、成人T細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)以及阿爾茨海默病。作為另一個實施例，本發(fā)明的方法可以被用于治療或者防止全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(systemic onset juvenile idiopathic arthritis)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化或重癥肌無力。IL-I ^相關(guān)病癥的其它例子是急性胰炎；ALS ;厭食-惡病質(zhì)綜合癥包括AIDS-誘導(dǎo)的惡病質(zhì)；哮喘和其它肺部疾??；自體免疫脈管炎；CIAS1相關(guān)周期性綜合癥(CAPS);慢性疲乏綜合癥；破傷風(fēng)相關(guān)疾病包括破傷風(fēng)相關(guān)的腹瀉；心臟病癥和征兆包括充血性心力衰竭、冠狀動脈再次狹窄、心肌梗死、心肌機能障礙(例如與敗血癥相關(guān))以及冠狀動脈旁路搭橋；癌癥例如多發(fā)性骨髓瘤和骨髓性(例如AML和CML)和其它白血病以及腫瘤轉(zhuǎn)移；糖尿病(例如胰島素性糖尿病)；子宮內(nèi)膜異位；家族性寒冷型自身炎癥綜合癥(FCAS)；家族性地中海熱(FMF);發(fā)燒；肌纖維瘤；腎小球性腎炎；移植物抗宿主病/抑制物排斥；出血性休克；痛覺過敏；炎癥性腸??；炎癥性關(guān)節(jié)病包括牛皮癬關(guān)節(jié)炎(以及骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)；炎癥性眼?。灰部梢耘c下列相關(guān)如角膜移植；局部缺血包括大腦局部缺血(例如外傷、癲癇、出血或休克所引起的腦部損傷，每一種都可能弓丨起神經(jīng)退行性疾病)；Kawasaki氏疾??；認(rèn)知缺陷；肺病(例如ARDS);肌病(例如肌肉蛋白代謝疾病特別是在敗血癥中)；神經(jīng)毒性(例如HIV所誘導(dǎo)的)；骨質(zhì)疏松癥；疼痛包括癌癥相關(guān)的疼痛；帕金森病；牙周疾??；未足月產(chǎn)；牛皮癬；再灌注損傷；輻射治療的副作用；睡眠障礙；暫時顎關(guān)節(jié)疾??；腫瘤壞死因子受體相關(guān)周期發(fā)熱綜合癥(TRAPS);葡萄膜炎；或者來自過度疲勞、扭傷、軟骨損傷、外傷、整形外科手術(shù)、感染和其它疾病過程的炎癥病癥。本發(fā)明的抗體和片段還被設(shè)計用于治療心臟、肺、聯(lián)合心臟-肺、肝、腎、胰、皮膚或角膜移植的受體，其包括同種異體移植物排斥或異種移植物排斥，或者為了防止移植物抗宿主病例如在骨髓移植之后，或器官移植相關(guān)的動脈硬化。本發(fā)明的抗體和片段被設(shè)計用于治療或防止自體疾病或炎癥疾病，特別是炎癥病癥其病源包括自體免疫組分如關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性進(jìn)育型關(guān)節(jié)炎(arthritis chronica progrediente)和關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕疾病包括炎癥疾病和具有骨損失、炎癥疼痛、超敏(包括氣道超敏和皮膚超敏)的風(fēng)濕疾病或過敏。本發(fā)明的抗體和片段可以被應(yīng)用的聚體自體免疫疾病包括自體免疫血液疾病(包括例如溶血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞性貧血和先天性血小板減少)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多軟骨炎、硬化癥、Wegener肉芽腫病、慢性活動性肝炎、重癥肌無力、牛皮癬、，斯-瓊氏綜合癥(Steven-Johnsonsyndrome)、先天性脂肪瀉、自體免疫發(fā)炎性腸病(包括例如潰瘍性結(jié)膜炎、克羅恩病和過敏性腸綜合癥)、內(nèi)毒素Graves病、肉狀瘤病、多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、葡萄膜炎(前部和后部)、干性角膜結(jié)膜炎和春季角膜結(jié)膜炎和間質(zhì)纖維化、牛皮癬關(guān)節(jié)炎或腎小球性腎炎(具有和不具有腎病綜合癥例如包括先天性腎病綜合癥或微小病變腎病)。本發(fā)明的抗體和片段還被設(shè)計用于治療、防止或改善哮喘、支氣管炎、肺塵病、肺氣腫以及其它氣道的梗阻性或炎癥疾病。用于治療不期望的急性和超急性IL-I a介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抗體或片段包括產(chǎn)生特別是促進(jìn)IL-I的TNF釋放，例如急性感染例如敗血性休克(例如內(nèi)毒性休克和成人呼吸窘迫綜合癥)、腦膜炎、肺炎；和重度燒傷；以及用于治療惡 病質(zhì)或感染、癌癥或器官機能障礙之后與病態(tài)TNF釋放相關(guān)的消耗綜合癥，特別是AIDS-相關(guān)的或由于HIV感染所引起的惡病質(zhì)。本發(fā)明的抗體和片段還被設(shè)計為用于骨代謝疾病中，其包括骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和其它的炎性關(guān)節(jié)炎皮疹和整體的骨損失包括年齡相關(guān)的骨損失，特別是牙周疾病。本發(fā)明的抗體和片段還被設(shè)計為用于治療或防止CIASl相關(guān)周期性綜合癥(CAPS)，包括新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病(NOMID)、Muckle-Wells綜合癥(MWS)以及家族性寒冷型自身炎癥綜合癥(FCAS)?；駽IASl中的圖片目前被識別為對三種罕見的遺傳綜合癥負(fù)責(zé)新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病(NOMID)、Muckle-Wells綜合癥(MWS)以及家族性寒冷型自身炎癥綜合癥(FCAS)。(Hoffman 等人 2001 Naure 29 :301-305 ;Feldmann 等人 2002AmJHum Genet 71 :198-203 ;Aksentijevich 等人 2002 Arthritis Rheum46 :3340-3348)。這三種病癥被統(tǒng)稱為“CAPS”。CIASl編碼一種被稱作NALP3的蛋白質(zhì)，NALP3是“發(fā)炎體(inflammasome) ”的組分，發(fā)炎體是一種酶復(fù)合物,其調(diào)節(jié)半胱天冬酶I (caspasel)的活性。Caspasel是將無活性的促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子IL-I的前體形式切割成其生物活性形式的酶(Agostini等人2004見上文)。CIASl中的突變會導(dǎo)致IL-I生成的提高。通常本發(fā)明的抗體或抗體片段、核酸或載體被作為含有本發(fā)明的抗體或抗體片段、核酸或載體以及藥物上可以接受的運載體的藥物組合物為哺乳動物或人進(jìn)行給藥。適合用于治療或防止疾病的藥物組合物是如前面所描述的。本發(fā)明的抗體或抗體片段、核酸或載體可以作為主要的活性試劑或者與一種或者多種會破壞IL-I受體信號傳導(dǎo)的試劑聯(lián)合為哺乳動物進(jìn)行給藥。破壞IL-I受體信號傳導(dǎo)的試劑可以是任何抑制IL-I P和IL-I受體之間相互作用的化合物或組合物。例如，破壞IL-I受體信號傳導(dǎo)的試劑包括結(jié)合IL-I ^或結(jié)合IL-I受體的抗體、重組IL-IRa (例如來自艾姆根公司(Amgen Inc.), Thousand Oaks, CA)以及IL_1受體“陷講”肽(例如來自再生公司(Regeneron Inc.),塔利頓(Tarrytown), NY)。如果使用兩種或更多種破壞IL-1受體信號傳導(dǎo)的試劑，則它們可以被共同給藥(例如在一種藥物組合物中)，或者可以分別將每一種進(jìn)行給藥(例如在分別的藥物組合物中)。本發(fā)明的抗體、片段、核酸或載體可以被給藥給哺乳動物，其與一種或者多種其它的活性試劑組合或聯(lián)合，以治療或防止IL-I介導(dǎo)的上述病癥或疾病。診斷應(yīng)用除了治療應(yīng)用外，本發(fā)明的抗體和片段還可以用于檢測IL-IP的診斷方法中(例如，在生物樣品如血清或血漿中)，其使用傳統(tǒng)的免疫檢驗例如酶聯(lián)免疫吸附檢驗(ELISA)、放射免疫檢驗(RIA)或組織免疫化學(xué)。用于在生物樣品中檢測IL-I P的方法可以包括步驟將生物樣品與一種或者多種本發(fā)明的抗體或片段進(jìn)行接觸，檢測結(jié)合IL-I ^的抗體或片段，或者未結(jié)合的抗體或片段，進(jìn)而檢測生物樣品中的IL-I P。所述抗體或片段可以被直接或間接使用可檢測的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記以輔助檢測結(jié)合或未結(jié)合的抗體。適當(dāng)?shù)目蓹z測的物質(zhì)包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料和放射性材料。適當(dāng)?shù)拿傅碾x子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適當(dāng)?shù)妮o基復(fù)合物的例子包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適當(dāng)?shù)臒晒獠牧系睦影▊阈位?內(nèi)酯、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三哌嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括魯米諾(Iuminol);適當(dāng)?shù)姆派湫圆牧系碾x子包括125I、131I、35S或3H。除了標(biāo)記抗體外，通過利用被標(biāo)記可檢測物質(zhì)的IL-IP標(biāo)準(zhǔn)和未標(biāo)記的抗IL-I 3抗體進(jìn)行的競爭免疫檢驗也可以在生物液中對IL-I 3進(jìn)行檢驗。在該檢驗中，生物樣品、被標(biāo)記的rIL-l ^標(biāo)準(zhǔn)和抗IL-I ^抗體被組合在一起，并確定結(jié)合到未標(biāo)記的抗體的被標(biāo)記的IL-I P標(biāo)準(zhǔn)的量。生物樣品中IL-I P的量與結(jié)合到抗IL-I P抗體上的被標(biāo)記的IL-I 0的量成反比。
實施例下面的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，當(dāng)然其不能被認(rèn)為以任何方式限制發(fā)明的保護(hù)范圍。在下面的實施例中，本發(fā)明參考的各種抗體包括被指定為AB1、AB5和AB7的抗體。如上所提到的，ABl含有重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，所述輕鏈區(qū)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列。AB5含有重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，所述輕鏈區(qū)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列。AB7含有重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中所述重鏈區(qū)包含SEQ ID NO : 15的氨基酸序列，所述輕鏈區(qū)包含SEQID NO 11的氨基酸序列。對于下列實施例中的各種比較，參考被指定為AB-對照的抗體，其是可以商業(yè)獲得的具有對IL-I P相對高親和力的抗體。AB-對照是鼠抗體，其被認(rèn)為具有重鏈和輕鏈，其中所述重鏈區(qū)包含SEQ ID NO 40的氨基酸序列，所述輕鏈區(qū)包含SEQ ID NO 41的氨基酸序列。這些鼠的序列被列在美國專利申請公開No. 2003/0026806在圖6A和圖6B中。在下面的幾個實施例中，AB5和AB7顯示與人IL-IP具有比AB-對照與人IL-I 3意想不到高的親和力。實施例I本實施例I說明本發(fā)明的某些抗體與IL-I P的結(jié)合親和力。使用抗體KTNEXA 設(shè)備(來自薩匹迪恩儀器公司(Sapidyne Instruments Inc.),博伊西(Boise)，ID)對指定為ABl和AB5的抗體進(jìn)行檢驗與IL-I ^的結(jié)合性能。圖2和圖3中提供了抗體ABl和AB5的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。商業(yè)購買的與IL-I ^具有相對高親和力的抗體(這里被稱作AB-對照)被檢驗用于比較。表I中總結(jié)了 IL-I P結(jié)合檢驗結(jié)果。Kd值表示每種抗體-IL-I P復(fù)合物的解離常數(shù)。Kd被計算為“離開速率”(抗體-IL-I ^復(fù)合物解離的速率)與“結(jié)合速率”(抗體-IL-I P復(fù)合物的組合速率)的比例。較低的Kd比例是較高抗體親和力的指示。表1:11-13結(jié)合結(jié)果
抗體Kd (pM)AB-對照 3 06 ABl (發(fā)明) 18. 63 AB5(發(fā)明) 0. 261這些實驗的結(jié)果顯示ABl和AB5以高親和力結(jié)合IL_1 P。本發(fā)明的抗體對IL-I 3的親和力與AB-對照對IL-I P的親和力相當(dāng)，或者更好。實施例2本實施例表示使用本發(fā)明的抗體體外抑制IL-I ^。使用檢測IL-I ^刺激的從人成纖維細(xì)胞釋放的IL-6的生物檢驗，評估ABl和AB5抗體(參見實施例I)抑制IL-I P的能力。如實施例I中的，AB-對照被用作對照樣品。在Dinarello等人，免疫學(xué)現(xiàn)有實驗方案(Current Protocols in Immunology),Ch. 6. 2. 1-6. 2. 7, John Wiley and Sons Inc.，Hoboken, NJ, 2000 中描述了該檢驗的細(xì)節(jié)。簡單的講，在多孔板中將來自美國典型培養(yǎng)物庫(ATCC)馬納薩斯(Manassas)，VA的人MRC5人成纖維細(xì)胞(ATCC#CCL-171)培養(yǎng)至匯合。使用經(jīng)過滴定劑量的AB5抗體對細(xì)胞進(jìn)行處理。接著將細(xì)胞接觸(i) 100pg/ml IL-I P或(ii)100pg/ml IL-I^和ABl或AB5抗體(來自實施例I)。不使用IL-I P對陰性對照細(xì)胞刺激。使用來自BD法米根(BD Pharmingen)(富蘭克林湖(Franklin Lakes)，NJ) IL-6ELISA試劑盒根據(jù)制造商的使用說明檢測每組中被處理的細(xì)胞中所釋放的IL-6。圖5中表示了 ELISA結(jié)果，并總結(jié)在表2中。IC5tl是抑制由IL-I ^刺激所釋放的IL-6的50%所需要的抗體濃度。表2ELISA 結(jié)果
抗體IC50(nM)^
AB-對照 0. 017 ABl (發(fā)明)07T5 AB5(發(fā)明) 0. 014這些結(jié)果證明了本發(fā)明的抗體體外抑制IL-I ^的能力。而且，對MRC5中IL-I 3刺激的細(xì)胞因子釋放的抑制已經(jīng)顯示與該試劑抑制IL-I介導(dǎo)的體內(nèi)活性有關(guān)。因此，這些結(jié)果說明本發(fā)明的抗體將在體內(nèi)具有IL-I P抑制效力。
實施例3本實施例說明使用本發(fā)明的抗體對IL-I P的體內(nèi)抑制。為了確認(rèn)AB5的體內(nèi)效力，在小鼠中對AB5阻斷人IL_1 ^生物學(xué)活性的能力進(jìn)行測試。該檢驗的細(xì)節(jié)被描述在Economides等人,天然醫(yī)藥(Nature Med.), 9 :47-52 (2003)中。簡單的講，將雄性C57/B16小鼠(Jackson實驗室柵海港,緬因州(Jackson LaboratoryBar Harbor,Maine))經(jīng)腹膜注射經(jīng)滴定計量的AB5 (實施例I)、AB_對照(實施例I)或?qū)φ?IgG(Jackson 免疫研究實驗室(Jackson ImmunoResearch Laboratories) ,West Grove,PA)。注射抗體24小時后，給小鼠皮下注射計量為I U g/kg的重組人IL-I P (rhIL-1 P )(來自 PeproTech Inc.，Rocky Hill, NJ)。注射 rhIL-1 P 后 2 小時(IL-6 反應(yīng)峰時間)，將小鼠處死，收集血液并處理得到血清。通過ELISA (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ)根據(jù)制造商的方案檢驗血清IL-6水平。通過實驗動物血清中所檢測到的IL-6與對照中所檢測到的IL-6的比例計算抑制百分比(乘以100)。結(jié)果列在圖6中。抑制體內(nèi)IL-IP活性的能力被評定為IL-IP刺激的血清中IL-6水平的函數(shù)。如圖6所表示的，對于抑制人IL-I ^的活性，即使AB5抗體不比AB-對照更有效，AB5也是有效的。在該檢驗中，3 u gAB5與10 y gAB-對照的效力相同。因此，這些結(jié)果說明所測試的抗體可以用于在體內(nèi)抑制IL-I ^活性。這些結(jié)果還顯示單次注射AB5能夠阻斷IL-I P長時間刺激的系統(tǒng)性作用。實施例4 下面的實施例表示根據(jù)本發(fā)明制備抗體。使用HUMAN ENGINEERING 技術(shù)產(chǎn)生許多人工改造的抗體序列，其如在Studnicka等人，Protein Engineering, 7 :805-814 (1994)和在美國專利 5，766，886,5, 770，196、5，821，123和5，869，619以及PCT申請公開WO 93/11794。所產(chǎn)生的人工改造抗體序列包括AB5. 1、AB5. 2、AB5. 3和AB5. 4。如圖3和圖4所示，這些序列中的每一條都在CDR-3H區(qū)中含有標(biāo)記為X1和X2的兩個可變位點。因此，在這些人工改造的每一個抗體的某些實施例中，CDR3的X1和X2分別對應(yīng)丙氨酸和精氨酸、纈氨酸和精氨酸、苯丙氨酸和精氨酸、賴氨酸和賴氨酸、或者天冬酰胺和精氨酸。實施例5對被指定為AB5和AB7的抗體(人工改造的抗體序列)檢驗其IL_1 ^結(jié)合性能，其使用以類似實施例I中所描述類似的方式，在開奈夏 (KINEXA )設(shè)備上進(jìn)行的動態(tài)排斥檢驗。其它關(guān)于KINEXA 設(shè)備和抗體鑒定的描述可以從制造商獲得，并可以在公開的文獻(xiàn)中得到例如美國專利No. 6，664，114(Sapidyne, Inc.);以及Darling等人"動力排除檢測技術(shù)分子相互作用特征(Kinetic Exclusion Assay Technology Characterizationof Molecular Interactions)."檢測及藥物開發(fā)技術(shù)(ASSAY and Drug DevelopmentTechnologies)，2004, 2，647-657。所述KINEXA 設(shè)備進(jìn)行動態(tài)排斥檢驗，并將數(shù)據(jù)符合各種理論曲線，這樣確定了 Kd以及其它的性能例如Kd的95%置信區(qū)間。對于親和力特征的分析例如解離常數(shù)和“離開速率”，KINEXA 設(shè)備比其它的設(shè)備(如比阿考(BiaCore)設(shè)備)更靈敏。圖3和圖4A分別提供了 AB5和AB7的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。表3中總結(jié)了 IL-IP結(jié)合檢驗。如同實施例1，KD被計算為“離開速率”與“結(jié)合速率”的比值，并且較低的Kd比例是較高抗體親和力的指示。表權(quán)利要求
1.一種IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗體或抗體片段，其中，所述的抗體或片段包含SEQID NO2、SEQ ID NO :23 或 SEQ ID NO 24 的氨基酸序列。
3.—種IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中，所述抗體或片段以大約IpM或更低的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或片段以大約O. 3ρΜ或更低的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或片段以大約O. 24ρΜ的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或片段以大約O. IlpM的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β。
7.—種IL-Ιβ結(jié)合抗體或其IL-Ιβ結(jié)合片段，其中，所述抗體或片段結(jié)合到IL-I β抗原決定簇上，這樣所結(jié)合的抗體或片段基本上允許IL-I β結(jié)合到I型IL-I受體上(IL-IRI)，并且所述抗體或片段以低于IpM的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β。
8.—種IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中，所述抗體或片段以低于IpM的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β，并且所述抗體或片段結(jié)合與具有SEQ ID NO: 11輕鏈可變區(qū)和SEQID NO 15重鏈可變區(qū)的抗體所結(jié)合的基本上相同的抗原決定簇。
9.一種IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中，所述抗體或片段以低于IpM的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β，并且所述抗體或片段與具有SEQ ID NO : 11輕鏈可變區(qū)和SEQ IDNO 15重鏈可變區(qū)的抗體競爭結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體或片段，其中，所述的抗體或抗體片段結(jié)合包含在序列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE(SEQ ID NO 36)中的抗原決定簇。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段是人源化的或人工改造的。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述的抗體或抗體片段是人抗體或人抗體片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段是中和抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段包含λ輕鏈。
15.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段包含IgG2區(qū)。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段是Fab、F(aY )2、Fv、單鏈抗體片段，或者這些抗體或片段中任一種的變體或衍生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段是多特異性抗體、雙抗體、三抗體和四抗體、微型抗體、線性抗體、螯合重組抗體、三體、雙體、內(nèi)抗體、納米抗體、小分子免疫藥物(SMIP)、結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝化抗體、含Vhh的抗體，或者這些抗體或片段中任一種的變體或衍生物。
18.根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段包括含有SEQ ID NO :27氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
19.根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 14或SEQ ID NO : 15的氨基酸序列之一，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10和SEQ ID NO 11的氨基酸序列之一。
20.根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :15的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 10的氨基酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段具有低于3pM的解離常數(shù)。
24.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段具有大約2pM或更低的解離常數(shù)。
25.—種IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中，所述抗體或抗體片段(i)具有用于抑制由IL-I β刺激從人成纖維細(xì)胞釋放IL-6的大約O. 5ηΜ或更低的IC50，(ii)以大約IpM或更低的解離常數(shù)結(jié)合IL-I β，以及(iii)與未給藥抗體或抗體片段的IL-I β刺激的動物中血清IL-6水平相比，在以有效量對動物給藥所述抗體或抗體片段時，抑制動物中IL-I β誘導(dǎo)的血清IL-6表達(dá)的至少50%。
26.—種IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中，所述抗體或抗體片段以大約6ρΜ至大約50ρΜ的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β，并且其中所述抗體具有用于抑制由IL-I β刺激從人成纖維細(xì)胞釋放IL-6的大約5ρΜ至大約200ρΜ的IC5tl。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段以大約13ρΜ至大約25ρΜ的解離常數(shù)結(jié)合人IL-I β。
28.根據(jù)權(quán)利要求26-27所述的抗體或抗體片段，其中，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO 4的氨基酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求26-28所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段不會可檢測地結(jié)合IL-I α。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段不會與IL-I β以外的靶交叉反應(yīng)。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段結(jié)合嚙齒類IL-I β、靈長類IL-I β、狗IL-I β和兔IL-I β中的一種或多種。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或片段以比大鼠IL-I β高的親和力結(jié)合小鼠IL-I β。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-33中任一項所述的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或片段不結(jié)合豚鼠IL-I β。
35.一種IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中，所述抗體或片段包含對SEQ IDNO 28氨基酸序列的一個或多個替代、缺失或添加，并且所述抗體或片段具有與在SEQ IDNO 28中所列氨基酸序列相同或基本相同的抗原決定簇結(jié)合親和力和特異性。
36.一種IL-I β結(jié)合抗體或其IL-I β結(jié)合片段，其中，所述抗體或片段包含對SEQ IDNO 27氨基酸序列的一個或多個替代、缺失或添加，并且所述抗體或片段具有與在SEQ IDNO 27中所列氨基酸序列相同或基本相同的抗原決定簇結(jié)合親和力和特異性。
37.一種核酸，其編碼權(quán)利要求1-35中任一項所述的抗體或抗體片段。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQID Ν0:38的序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQID Ν0:39的序列。
40.一種核酸，其包含編碼抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列，其中，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO 28的氨基酸序列。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的核酸序列，其中，所述核酸編碼包含SEQID NO:2、SEQ IDNO :23或SEQ ID NO 24的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
42.一種核酸，其包含編碼抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ IDNO 27的氨基酸序列。
43.—種載體,其包含權(quán)利要求37-41中任一項所述的核酸。
44.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求37-41中任一項所述的核酸或權(quán)利要求42所述的載體。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞或受精卵。
46.一種轉(zhuǎn)基因動物，其包含權(quán)利要求44或45所述的細(xì)胞。
47.一種雜交瘤，其產(chǎn)生權(quán)利要求1-34中任一項所述的抗體或抗體片段。
48.一種組合物，其包含(a)權(quán)利要求1-34中任一項所述的抗體或抗體片段、權(quán)利要求37-41中任一項所述的核酸或權(quán)利要求42所述的載體；以及(b)適當(dāng)?shù)倪\載體。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的組合物，其中，所述運載體是藥物上可以接受的運載體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的組合物，其中，所述組合物是適合關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)(實質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)、損傷內(nèi)、口服或吸入給藥的形式。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的組合物，其中，所述組合物含有凍干保護(hù)劑、表面活性劑、填充劑、粘合劑和/或膨脹劑。
52.根據(jù)權(quán)利要求49所述的組合物，其中，所述組合物是可控釋放或持續(xù)釋放的藥物組合物。
53.一種治療或預(yù)防哺乳動物中IL-I相關(guān)疾病或病癥的方法，其包括為需要治療的哺乳動物給藥有效量的(a)權(quán)利要求1-34中任一項所述的抗體或抗體片段、(b)權(quán)利要求37-41中任一項所述的核酸、(c)權(quán)利要求42的載體或(d)權(quán)利要求48-54任一項所述的組合物，這樣哺乳動物中的疾病得到治療或預(yù)防。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述IL-I相關(guān)疾病或病癥是炎癥疾病、自體免疫疾病或癌癥。
55.根據(jù)權(quán)利要求53或54所述的方法，其中，所述IL-I相關(guān)疾病或病癥選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、敗血性休克、慢性阻塞性肺部疾病、哮喘、移植物抗宿主疾病、動脈粥樣硬化、成人T細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)或阿爾茨海默病。
56.根據(jù)權(quán)利要求53-55中任一項所述的方法，其中，所述IL-I相關(guān)疾病或病癥是新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病(NOMID/CINCA)、全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、CIASl相關(guān)周期性綜合癥(CAPS)、斯蒂爾病或穆-韋二氏綜合癥。
57.根據(jù)權(quán)利要求53-56中任一項所述的方法，其中，所述IL-I相關(guān)疾病或病癥是全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、動脈硬化或重癥肌無力。
58.根據(jù)權(quán)利要求53-56中任一項所述的方法，其中，所述哺乳動物是人類。
59.根據(jù)權(quán)利要求54-58中任一項所述的方法，其中，與不存在抗體的血清IL-6水平相t匕，所述有效量的所述抗體或抗體片段有效抑制動物中IL-I β誘導(dǎo)的血清IL-6表達(dá)的至少 50%。
60.一種制備親和力成熟的IL-I β結(jié)合多肽的方法，其包括 (a)提供第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含編碼IL-Iβ結(jié)合多肽的核酸序列，其中所述IL-I β結(jié)合多肽包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列，其中第二核酸序列包含與第一核酸序列至少有一個核苷酸不同的核酸序列； (b)進(jìn)行核酸混編以提供兩種或者更多種突變的核酸； (c)選擇突變的核酸，其編碼以下多肽，所述多肽能夠或者(i)以比第一核酸所編碼的多肽高的親和力與IL-I β結(jié)合，(ii)對IL-I β具有高于IL-I α的選擇性，該選擇性大于第一核酸所編碼的多肽的選擇性，(iii)對于IL-I β具有低于第一核酸所編碼的多肽的平衡結(jié)合解離常數(shù)，或者(iv)抑制IL-I β誘導(dǎo)的動物中血清IL-6的表達(dá)的程度比第一核酸所編碼的多肽高；以及 (d)表達(dá)所選擇的突變核酸， 以提供親和力成熟的IL-I β多肽。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其還包括在選擇突變的核酸之前提供以下抗體，所述抗體包含由所述突變的核酸所編碼的多肽，其中通過對所述抗體進(jìn)行檢驗來進(jìn)行對突變的核酸的選擇。
62.根據(jù)權(quán)利要求60或61所述的方法，其中，重復(fù)步驟(b)和(C)，其中使用(i)至少一種步驟(c)所選擇的的突變核酸和(ii)至少一種核酸，其具有與所選擇的突變核酸有至少一個核苷酸不同的核酸序列，來進(jìn)行步驟(b)的核酸混編。
63.根據(jù)權(quán)利要求60-62中任一項所述的方法，其中，重復(fù)步驟(b)和(c)直到選擇到最佳的核酸。
64.根據(jù)權(quán)利要求60-63中任一項所述的方法,其中，所述第一核酸編碼含有SEQIDNO 1-26中任一氨基酸序列的多肽。
65.根據(jù)權(quán)利要求60-64中任一項所述的方法,其中，所述第一核酸編碼含有SEQIDNO 27-35或SEQ ID NO :42-57中任一氨基酸序列的多肽。
66.根據(jù)權(quán)利要求60-65中任一項所述的方法，其中，重復(fù)步驟(b)和(c)直到選擇到編碼以下多肽的核酸，所述多肽(i)具有用于抑制IL-I β刺激從人成纖維細(xì)胞釋放IL-6的大約O. 5nM或更低的IC5tl ； (ii)以低于3pM的解離常數(shù)結(jié)合IL-I β ;以及(iii)與未給藥抗體或片段的IL -I β刺激的動物中血清IL-6水平相比，抑制動物中IL-I β誘導(dǎo)的血清IL-6表達(dá)的至少50%。
全文摘要
IL-1β結(jié)合抗體或其IL-1β結(jié)合片段，其含有SEQ ID NO2氨基酸序列和相關(guān)的核酸、載體、細(xì)胞核組合物及使用它們用于治療疾病的方法，以及制備親和力成熟的IL-1β結(jié)合多肽的方法。提供了IL-1β結(jié)合抗體或其IL-1β結(jié)合片段，其具有期望的親和力和效力。
文檔編號A61K39/395GK102775493SQ20121015744
公開日2012年11月14日 申請日期2006年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者瑪麗·哈克-弗倫茲喬, 琳達(dá)·馬薩特, 阿諾德·霍維茨, 陳剛, 馬里納·勒爾 申請人:佐馬技術(shù)有限公司