專利名稱：Vegf拮抗劑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的物質(zhì)的藥物制劑，并涉及制備和使用該制劑的方法。本發(fā)明包括具有提高了的穩(wěn)定性的藥物制劑。相關(guān)技術(shù)綜述血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)在人癌癥中幾乎普遍存在，與其作為腫瘤新血管生成的關(guān)鍵介體的作用相一致。VEGF功能通過與分子或其VEGFR-2受體結(jié)合的阻斷抑制了多個不同異種移植物模型中植入的腫瘤細(xì)胞的生長(參見，例如，Gerber等人(2000)Cancer Res. 60 :6253-6258)。已經(jīng)描述了可溶性VEGF特異性融合蛋白拮抗劑，被稱為“VEGF 捕集物(trap) ” (Kim 等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :11399-404 ；Holash等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :11393-8)。凍干(在受控條件下冷凍干燥)通常用于蛋白質(zhì)的長期貯藏。凍干的蛋白質(zhì)在凍干狀態(tài)下基本上能抵抗降解、聚集、氧化和其他退化過程(參見，例如，U. S. 6，436，897)。發(fā)明簡述在此提供了 VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩(wěn)定制劑。本發(fā)明的藥物學(xué)上可接受制劑包括VEGF “捕集物”拮抗劑和藥物學(xué)上可接受的載體。具體實(shí)施方案中，提供了液體和冷凍干燥或凍干制劑。第一個方面中，本發(fā)明的特征在于VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩(wěn)定液體制劑，包括含有基本上由第一個VEGF受體的免疫球蛋白樣(Ig)結(jié)構(gòu)域2和第二個VEGF受體的Ig結(jié)構(gòu)域3構(gòu)成的受體成分和多聚化成分的融合蛋白、一種或多種緩沖劑和一種或多種熱穩(wěn)定劑。VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的具體實(shí)施方案中，第一個VEGF受體是Fltl而第二個VEGF受體是Flkl或Flt4。更具體的實(shí)施方案中，融合蛋白具有SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 4的氨基酸序列。一個實(shí)施方案中，緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑和/或檸檬酸鹽。更優(yōu)選，緩沖劑是磷酸鹽和檸檬酸鹽。一個實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定劑是NaCl和/或蔗糖。更優(yōu)選，熱穩(wěn)定劑是NaCl和鹿糖兩者。具體實(shí)施方案中，VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩(wěn)定液體制劑包括I-IOmM磷酸鹽緩沖劑、I-IOmM檸檬酸鹽、25-150mM NaCl、5-30%蔗糖、10_50mg/ml融合蛋白，約6-6. 5的pH。更具體的實(shí)施方案中，穩(wěn)定的液體制劑包括5mM磷酸鹽緩沖劑、5mM檸檬酸鹽緩沖齊[J、IOOmMNaCl、20%蔗糖、25mg/ml融合蛋白，約6. O的pH。此外，可以存在聚山梨酸酯，例如O. 05-0. 15%聚山梨酸酯20。本發(fā)明的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩(wěn)定液體制劑以25mg/ml的VEGF制劑在_80°C貯藏約6個月后幾乎沒有呈現(xiàn)出沉淀并且在5°C貯藏6個月后幾乎沒有沉淀。 第二個方面中，本發(fā)明的特征在于VEGF拮抗劑的高濃度穩(wěn)定液體制劑，該制劑包括 l-50mM 組氨酸、25-150mM NaCl、5-30%蔗糖、50_100mg/ml 融合蛋白，約 6-6. 5 的 pH，和O. l-o. 5%聚山梨酸酯或1-5% PEG。更具體的實(shí)施方案中，高濃度穩(wěn)定液體制劑包括IOmM組氨酸、50mM NaCl、5-20%蔗糖、50-100mg/ml融合蛋白，約6. 0-6. 5的pH，和O. 1%聚山梨酸酯(例如，聚山梨酸酯20)或3% PEG(例如，PEG3350)。本發(fā)明的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的高濃度穩(wěn)定液體制劑在5°C貯藏15個月后(70或100mg/ml VEGF捕集蛋白)呈現(xiàn)出少于約3%降解或在24個月后(50mg/ml)少于約I. 5%降解。第三個方面中，本發(fā)明的特征在于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)特異性融合蛋白拮抗劑凍干前制劑，包括(i)含有基本上由第一個VEGF受體的免疫球蛋白樣(Ig)結(jié)構(gòu)域2和第二個VEGF受體的Ig結(jié)構(gòu)域3構(gòu)成的受體成分和多聚化成分的融合蛋白，(ii)緩沖劑，(iii)有機(jī)助溶劑或增量劑，和Qv) —種或多種凍干保護(hù)劑(Iyoprotectant)。各種不同的實(shí)施方案中，緩沖劑是組氨酸，有機(jī)助溶劑或增量劑是PEG，且凍干保護(hù)劑是甘氨酸和蔗糖中的至少一種。一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干前制劑不含有防腐劑。本發(fā)明的凍干前制劑的一個實(shí)施方案中，該制劑包括5_50mM組氨酸、O. 1-3.0%PEG、0. 25-3. 0%甘氨酸、O. 5-6. 0%蔗糖和5_75mg/ml融合蛋白，約6. 0-6. 5的pH。任何實(shí)施方案中，凍干前制劑都可以進(jìn)一步包括達(dá)O. 05mM的檸檬酸鹽和/或O. 003-0. 005%的聚山梨酸酯。存在的聚山梨酸酯可以是例如聚山梨酸酯20。更具體的實(shí)施方案中，凍干前制劑包括約IOmM組氨酸、約I. 5 % PEG3350、約
O.75%甘氨酸、約2. 5%蔗糖和約12. 5至75mg/mlVEGF特異性融合蛋白，約6. 25的pH。具體實(shí)施方案中，融合蛋白包括SEQ ID NO :4的蛋白質(zhì)序列，作為多聚體存在，例如二聚體。個別的實(shí)施方案中，重建制劑是凍干前制劑濃度的2倍，例如，將20mg融合蛋白/ml凍干前制劑重建成60mg融合蛋白/ml的最終制劑。通常，用適于注射的無菌水來重建凍干制劑。一個實(shí)施方案中，重建液體可以是抑菌水。優(yōu)選的實(shí)施方案中，凍干前制劑基本上由約IOmM組氨酸、約I. 5% PEG 3350、約
O.75%甘氨酸、約2. 5%蔗糖和約50mg/ml具有SEQ ID NO :4的序列作為二聚體的融合蛋白構(gòu)成，約6. 25的pH?？梢源嬖跈幟仕猁}(低于或等于約O. 02mM)和/或聚山梨酸酯(低于或等于約O. 0005% )。任選地，凍干前制劑不含有防腐劑、磷酸鹽緩沖劑和/或超過痕量的NaCl。一個實(shí)施方案中，凍干前制劑由約IOmM組氨酸、約I. 5% PEG3350、約O. 75%甘氨酸、約2. 5%蔗糖和約50mg/ml的VEGF捕集蛋白(SEQ ID NO 4)構(gòu)成，pH6. 3，并且在重建時含有20mM組氨酸、3% PEG、I. 5%甘氨酸、約5%蔗糖和約100mg/ml VEGF捕集蛋白。第四個方面中，本發(fā)明的特征在于生產(chǎn)VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的凍干制劑的方法，該方法包括對本發(fā)明的凍干前制劑進(jìn)行凍干以產(chǎn)生凍干制劑。該凍干制劑可以通過本領(lǐng)域已知的用于將液體凍干的任何方法來凍干。第五個方面中，本發(fā)明的特征在于生產(chǎn)VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的重組凍干制劑的方法，該方法包括將本發(fā)明的凍干制劑重建成重建制劑。一個實(shí)施方案中，重建制劑是凍干前制劑濃度的兩倍，例如，本發(fā)明的方法包括(a)生產(chǎn)VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的凍干前制劑，(b)對步驟(a)的凍干前制劑進(jìn)行凍干；和(C)重建步驟(b)的凍干制劑。
生產(chǎn)重建凍干制劑方法的具體實(shí)施方案中，凍干前溶液以每ml凍干前制劑溶液25mg VEGF特異性融合蛋白拮抗劑存在于小瓶中，將其凍干并重建成50mg/ml溶液。另一實(shí)施方案中，將30mg/ml凍干前溶液凍干并重建成60mg/ml溶液。另一實(shí)施方案中，將40mg/ml凍干前溶液凍干并重建成80mg/ml溶液。另一實(shí)施方案中，將12. 5mg/ml凍干前溶液凍干并重建成25mg/ml溶液。另一實(shí)施方案中，將50mg/ml凍干前溶液凍干并重建成IOOmg/ml溶液。另一實(shí)施方案中，將75mg/ml凍干前溶液凍干并重建成150mg/ml溶液。優(yōu)選，重建的凍干制劑不含有防腐劑。其他目的和優(yōu)勢將從以下的詳述中將變得顯而易見。發(fā)明詳述
本發(fā)明不限于所述的特定方法和實(shí)驗(yàn)條件，因此這樣的方法和條件可以改變。還應(yīng)理解在此所用的術(shù)語只是為了描述特定的實(shí)施方案，而不是打算來限制，除非另外指出，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍只受到所附權(quán)利要求的限制。如本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)提及物，除非上下文中另外清楚地規(guī)定。因此，例如，對“一種方法”的提及包括一種或多種方法，和/或在此所述類型的步驟和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)閱讀本公開內(nèi)容將變得清楚。概述含蛋白制劑的安全處理和給藥代表了對藥物制造者的重大挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)具有出現(xiàn)穩(wěn)定性問題的獨(dú)特化學(xué)和物理特征對于蛋白質(zhì)而言存在多種降解途徑，涉及到化學(xué)和物理不穩(wěn)定性?；瘜W(xué)不穩(wěn)定性包括脫氨基、聚集、肽主鏈的截短和甲硫氨酸殘基的氧化。物理不穩(wěn)定性包括許多現(xiàn)象，包括，例如，聚集?？梢酝ㄟ^從蛋白質(zhì)中除去水來提高化學(xué)和物理穩(wěn)定性。凍干(在受控條件下冷凍干燥)通常用于蛋白質(zhì)的長期貯藏。凍干的蛋白質(zhì)在處于凍干狀態(tài)時基本上能夠抵抗降解、聚集、氧化和其他退化過程。通常在給藥之前用任選地含有抑菌防腐劑(例如，苯甲醇)的水重建凍干的蛋白質(zhì)。定義術(shù)語“載體”包括稀釋劑、輔劑、賦形劑或媒介物，組合物將與其一起給藥。載體可以包括無菌液體，如，例如，水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，如，例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。術(shù)語“賦形劑”包括加入藥物組合物中的非治療性物質(zhì)以提供所需的稠度或穩(wěn)定作用。合適的藥物賦形劑包括，例如，淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇
坐寸ο術(shù)語“凍干的”或“冷凍干燥的”包括已經(jīng)經(jīng)過干燥程序處理如凍干的物質(zhì)的狀態(tài)，其中已經(jīng)除去了至少50%的水分。短語“增量劑”包括藥物學(xué)上可接受的并給凍干塊狀物增加體積的化合物。通常，本領(lǐng)域已知的可接受增量劑包括，例如，碳水化合物，包括單糖如葡萄糖、核糖、果糖等，醇糖如甘露醇、肌醇和山梨糖醇，二糖包括海藻糖、蔗糖和乳糖，天然存在的聚合物如淀粉、葡聚糖、殼聚糖、透明質(zhì)酸酯、蛋白質(zhì)(例如，明膠和血清白蛋白)、糖原以及合成單體和聚合物。在本發(fā)明的制劑中，PEG 3350是攪拌、混合或操作時用于穩(wěn)定融合蛋白的有機(jī)助溶劑，并作為增量劑來幫助產(chǎn)生可接受的體積。術(shù)語“凍干保護(hù)劑”包括可以加入冷凍干燥或凍干制劑中來幫助維持冷凍干燥或凍干時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)?！胺栏瘎卑ㄍǔ＜尤胫苿┲衼硌舆t或消除制劑中細(xì)菌或其它污染微生物生長的抑菌、殺菌、抑真菌或殺真菌化合物。防腐劑包括，例如，苯甲醇、苯酚、苯扎氯銨、間甲酚、硫柳汞、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等。可以在USP中找到藥物學(xué)上可接受的防腐劑的其他實(shí)例。VEGF 拮抗劑VEGF拮抗劑是能夠阻斷或抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的生物作用的化合物，并包括能夠捕獲VEGF的融合蛋白。優(yōu)選的實(shí)施方案中，VEGF拮抗劑是SEQ ID N0:2或4的融合蛋白；更優(yōu)選，SEQ ID N0:4。具體實(shí)施方案中，VEGF拮抗劑在哺乳動物細(xì)胞系如CHO細(xì)胞中表達(dá)并可以在翻譯后修飾。一個具體實(shí)施方案中，融合蛋白包括SEQ ID N0:4的氨基酸27-457并在Asn殘基62、94、149,222和308上糖基化?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適方法來制備本發(fā)明方法和制劑中的VEGF拮抗 齊U，或者該拮抗劑是已知的。VEGF拮抗劑在用于制備藥物學(xué)上可接受的制劑時優(yōu)選基本上無蛋白質(zhì)污染物。優(yōu)選，“基本上無蛋白質(zhì)污染物”意思是至少90%重量的用于制備制劑的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑制劑中的蛋白質(zhì)是VEGF融合蛋白拮抗劑蛋白質(zhì)，更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少99%。融合蛋白優(yōu)選基本上無聚集體。“基本上無聚集體”意思是在融合蛋白用于制備藥物學(xué)上有效的制劑時至少90%重量的融合蛋白不存在聚集體。作為純化處理的結(jié)果，本發(fā)明方法和制劑中的融合蛋白可以含有少量或痕量化合物，例如，少量或痕量檸檬酸鹽和/或聚山梨酸酯。含有約50mg融合蛋白/ml的本發(fā)明凍干前制劑的一個實(shí)施方案中，檸檬酸鹽可以以約O. 02mM的濃度存在和/或聚山梨酸酯可以以約O. 0005%的濃度存在。如果在凍干后將凍干前制劑重建成最初體積的一半(例如，100mg/ml融合蛋白)，那么所得到的濃度可能是O. 04mM檸檬酸鹽和/或O. 001%聚山梨酸酯。凍干和凍干制劑本發(fā)明的一個方面中，提供了包括VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的藥物學(xué)上可接受的制劑，其中該制劑是冷凍干燥或凍干制劑?？梢詫龈芍苿┲亟ǔ扇芤?、懸浮液、乳液或用于給藥或使用的任何其他合適的形式。通常首先將凍干制劑制備成液體，然后冷凍和凍干。凍干之前的總液體體積可以小于、等于或大于凍干制劑的最終重建體積。凍干處理是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且通常包括在受控條件下使水從冷凍制劑中升華。凍干制劑可以貯藏在寬范圍的溫度下。凍干制劑可以貯藏于低于25°C，例如，冷藏于4°C，或貯藏于室溫(例如，大約25V )。優(yōu)選，將凍干制劑貯藏于低于約25°C，更優(yōu)選，約 4-20°C ;低于約 4°C ;低于約-20°C ;約-40°C ;約 _70°C，或約 _80°C。通常通過加入水溶液使凍干制劑溶解來重建凍干制劑供使用。可以使用各種水溶液來重建凍干制劑。優(yōu)選，使用水來重建凍干制劑。優(yōu)選用基本上由水(例如，USP WFI，或注射用水)或抑菌水(例如，含有O. 9%苯甲醇的USP WFI)構(gòu)成的溶液來重建凍干制劑。然而，也可以使用含有緩沖劑和/或賦形劑和/或一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體的溶液。通常從液體，即，從溶液、懸浮液、乳液等制備冷凍干燥或凍干制劑。因此，經(jīng)歷冷凍干燥或凍干的液體優(yōu)選含有最終重建的液體制劑中所需的所有成分。結(jié)果，當(dāng)重建時，冷凍干燥或凍干制劑重建之后將立即成為所需的液體制劑。用于產(chǎn)生冷凍干燥或凍干制劑的優(yōu)選液體制劑包括藥物學(xué)上有效量的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑和增量齊U。冷凍干燥或凍干制劑優(yōu)選包括組氨酸，因?yàn)榻M氨酸與磷酸鹽相比，在將融合蛋白凍干時可更有效地穩(wěn)定融合蛋白。有機(jī)助溶劑，如PEG 3350，用于在攪拌、混合或操作時穩(wěn)定融合蛋白。優(yōu)選在冷凍干燥或凍干制劑中使用凍干保護(hù)劑。凍干保護(hù)劑在冷凍干燥或凍干時有助于維持蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。兩種優(yōu)選實(shí)例凍干保護(hù)劑是甘氨酸和蔗糖，優(yōu)選一起使用。穩(wěn)定的液體制劑一方面，本發(fā)明提供了包括VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩(wěn)定的藥物學(xué)上可接受的制劑，其中該制劑是液體制劑。優(yōu)選，該液體制劑包括藥物學(xué)上有效量的融合蛋白。該制劑還可以包括一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體、緩沖劑、增量劑、穩(wěn)定劑、防腐劑和/或賦形劑。藥物學(xué)上可接受的液體制劑的實(shí)例包括藥物學(xué)上有效量的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑、緩沖劑、助溶劑和一種或多種穩(wěn)定劑優(yōu)選的液體制劑包括磷酸鹽緩沖劑、有機(jī)助溶劑和一種或多種將貯藏時聚集物和低分子量產(chǎn)物的形成減到最少的熱穩(wěn)定劑，和約10mg/ml至約50mg/ml融合蛋白，其中該制劑約為pH 6. 0-6. 5。優(yōu)選的液體制劑包括約5mM磷酸鹽緩沖劑、約5mM檸檬酸鹽、約IOOmMNaCl、約25%蔗糖和約10-50mg/ml融合蛋白，其中該制劑為約6. O的pH ;任選地可以存在聚山梨酸酯(例如，O. I %聚山梨酸酯20)。盡管NaCl或蔗糖可以用作穩(wěn)定劑，已經(jīng)確定NaCl和蔗糖的組合比任一單獨(dú)的穩(wěn)定劑可更有效地穩(wěn)定融合蛋白。在規(guī)定的時間點(diǎn)以多種方式來測定穩(wěn)定性，包括pH的測定、顏色和外觀的目測、通過本領(lǐng)域已知的方法，例如UV光譜法、SDS-PAGE、大小排阻HPLC、活性的生物測定、等電點(diǎn)聚焦和異天冬氨酸定量對總蛋白含量的測定。用于測定VEGF拮抗劑活性的生物測定的一個實(shí)例中，使用BAF/3VEGFR1/EP0R細(xì)胞系來測定通過本發(fā)明的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的VEGF165結(jié)合。制劑，不管是液體還是冷凍干燥和凍干的，都可以貯藏于缺氧環(huán)境中?？梢酝ㄟ^將制劑貯藏在惰性氣體如，例如氬、氮或氦下來產(chǎn)生缺氧環(huán)境。
實(shí)施例在描述本發(fā)明方法之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的特定方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@樣的方法和條件可以改變。還應(yīng)當(dāng)理解在此所用的術(shù)語只是為了描述特定的實(shí)施方案，而不是打算來限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍只限于所附的權(quán)利要求。如本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)提及物，除非上下文中另外清楚地規(guī)定。因此，例如，對“一種方法”的提及包括一種或多種方法，和/或在此所述類型的步驟和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀該公開內(nèi)容之后將變得清楚。除非另外限定，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含意。盡管與在此所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于實(shí)踐或測試本發(fā)明，現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。實(shí)施例I. 50mg/ml VEGF捕集物的液體制劑的穩(wěn)定性將含有IOmM磷酸鹽、50mM NaCl.O. 1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖和50mg/ml VEGF捕集物(SEQ ID N0:4)，pH6. 25的液體制劑貯藏于5°C并在3、6、9、12、18和24個月時測試樣品。通過SE-HPLC測定穩(wěn)定性。表I中所示的結(jié)果表明了分別在12和24個月時98.6%和98. 3%的VEGF捕集蛋白保持完整(未降解)。在0D405nm處測量濁度；和通過大小排阻HPLC測定回收的蛋白質(zhì)百分比。
表I.貯藏于5°C時50mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS065)的穩(wěn)定性
月數(shù)目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VBGF捕集物% 天然構(gòu)象%
O 通過 O. 00 6.210099. O
3 通過 O. 00 6.210298.8
6 通過 O. 00 6. 210398.7
9 通過 O. 00 6. 310298.2
12 通過 O. 00 6. 310698.6
18 通過 O. 00 6. 310398.4
24 通過 O. 00 6. 29398. 3將含有IOmM 磷酸鹽、50mM NaCl,3% PEG 3350、20%蔗糖和50mg/mlVEGF捕集物(SEQ ID NO :4)，ρΗ6· 25的液體制劑貯藏于5°C并在3、6、9、12、18和24個月時測試樣品。穩(wěn)定性結(jié)果顯示于表2中。表2.貯藏于5°C時50mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS065)的穩(wěn)定性
月數(shù)目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VEGF捕集物% 天然構(gòu)象％
O通過 O. 00 6.210099. O
3 通過 O. 00 6.210098.8
6 通過 O. 01 6. 310398. 5
9 通過 O. 00 6. 310398. 3
12 通過 O. 01 6. 311098. 3
18 通過 O. 00 6. 311398. O
24 通過 O. 01 6. 29097.8實(shí)施例2. 75mg/ml VEGF捕集物的液體制劑的穩(wěn)定性將含有10禮磷酸鹽、501111 NaCl、0.1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖和75mg/mlVEGF捕集物(SEQ ID NO 4), pH6. 25的液體制劑貯藏于5°C并在0、1、2. 3、3、9、12和15個月時測
試樣品。穩(wěn)定性結(jié)果顯不于表3中。表3.貯藏于5°C時75mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS101)的穩(wěn)定性
月數(shù)目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VEGF捕集物% 天然構(gòu)象%
0通過 O. 00 6.210097. I
1通過 O. 00 6.29697. O 2. 3 通過 O. 00 6.2 98 96.7
3 通過 O. 00 6.29796. I
9 通過 -O. 01 6. O10196. O
12 通過 O. 00 6. 311094.5
15 通過 O. 00 6. 39295 .6
將含有IOmM 磷酸鹽、50mM NaCl,3% PEG 3350、20%蔗糖和75mg/mlVEGF捕集物(SEQ ID NO 4), 冊.25的液體制劑貯藏于51并在0、1、2.3、3、9、12和15個月時測試樣
品。穩(wěn)定性結(jié)果顯示于表4中。表4.貯藏于5°C時75mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS101)的穩(wěn)定性
月數(shù)目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VBGF捕集物天然構(gòu)象％
0通過 O. 00 6.210096.8
1通過 O. 00 6.29996.7
1.3 通過 O. 00 6. 29796. 3 3 通過 O. 00 6. 2 89 95.6 9 通過 -0.01 6. 2 98 95. 4 12 通過 -(LOl 6.3 112 94. I 15 通過 O. 00 6. 3 98 94.8實(shí)施例3. 100mg/ml VEGF捕集物的液體制劑的穩(wěn)定性將含有IOmM磷酸鹽、50mM NaCUO. 1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖和100mg/ml VEGF捕集物(SEQ ID NO 4), pH6. 25的液體制劑貯藏于5°C并在0、1、2. 3、3、9、12和15個月時
測試樣品。穩(wěn)定性結(jié)果顯示于表5中。表5.貯藏于5°C時100mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS101)的穩(wěn)定性
月數(shù)目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VEGF捕集物% 天然構(gòu)象%
0通過 O. 00 6. 310096.7
1通過 O. 00 6.29296.6
2.3 通過 O. 00 6.29296.2 3 通過 O. 00 6. 2 99 95. 5 9 通過 -O. 01 6. 2 92 95. 5 12 通過 -O. 01 6. 2 110 93.9 15 通過 O. 00 6. 3 108 94.8將含有IOmM 磷酸鹽、50mM NaCl,3% PEG 3350、20%蔗糖和 lOOmg/mlVEGF 捕集物(SEQ ID NO 4), pH6. 25的液體制劑貯藏于5°C并在O、1、2· 3、3、9、12和15個月時測試樣品。穩(wěn)定性結(jié)果顯不于表6中。表6.貯藏于5°C時100mg/ml VEGF捕集蛋白(VEF T-SS101)的穩(wěn)定性月數(shù)目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VEGF捕集物% 天然構(gòu)象％
0通過 O. OO 6. 310096. 5
1通過 O. 01 6. 29496. 2
2.3 通過 O. 01 6. 2 93 95.7
3 通過 O. 01 6.210294. 6
9 通過 O. 00 6.29594.6
12 通過 O. 00 6, 39692.8
15 通過 O. 01 6. 310293.9實(shí)施例4.穩(wěn)定的VEGF捕集物制劑的另外的實(shí)施方案
一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了穩(wěn)定的液體VEGF結(jié)合融合蛋白(VEGF捕集物)制齊U，其含有5mM磷酸鹽、5mM檸檬酸鹽、IOOmM NaCUO. 1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖、2511^/1111VEGF捕集蛋白，pH6. O。該制劑可以皮下遞送或通過靜脈內(nèi)輸注來稀釋并遞送。由于該制劑的高摩爾滲透壓濃度，將其稀釋3倍以獲得用于靜脈內(nèi)給藥的等滲溶液。穩(wěn)定性研究顯示了在2-8°C貯藏3年后檢測到少于約I %的降解。一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于凍干制劑，優(yōu)選將凍干前制劑濃縮兩倍成為凍干后制劑，例如，50至100mg/ml ;75至150mg/ml,或100至200mg/ml VEGF捕集蛋白。一個具體的實(shí)施方案中，凍干前制劑包括IOmM組氨酸、I. 5% PEG 3350,0. 75%甘氨酸、2. 5%蔗糖、50mg/ml VEGF捕集蛋白，pH6. 3，將其重建成包括20mM組氨酸、3% PEG3350、I. 5%甘氨酸、5%蔗糖、100mg/ml VEGF捕集蛋白，pH6. 3的制劑。穩(wěn)定性研究顯示出在2_8°C貯藏6個月后未檢測到降解。液體制劑的一個實(shí)施方案中，該制劑包括IOmM組氨酸、50mM NaCl、5_20 %蔗糖、50-100mg/ml VEGF捕集物和O. I %聚山梨酸酯20或3% PEG3350之一。該液體制劑的優(yōu)勢之一在于它提供了較高濃度的VEGF捕集物而不需要制造凍干產(chǎn)品。因此，該制劑易于皮下遞送，例如，通過允許提供預(yù)先填充液體的注射器，其濃度高于經(jīng)IV輸注遞送的濃度。此夕卜，該制劑可有利地用于提供較小的輸注體積和較短的輸注時間。在5°C保溫長達(dá)15或24個月后通過SE-HPLC測定的降解量概括于表7中。表7.含有50-100mg/ml VEGF捕集物的液體制劑(VEGF-SS101)的穩(wěn)定性
保溫 VEGF捕集物聚山梨酸酯20% PEG 3350% 降解％
(月數(shù))(mg/ml)
2450O. I-0.7
2450=3I. 3
1575O. I-I. 5
1575-32. O
15100O. I-1. 9
15100-32. 6實(shí)施例5.凍干的和液體的穩(wěn)定性和活性在6個月期間測定重建的凍干制劑的穩(wěn)定性。凍干前制劑含有IOmM組氨酸、I. 5%PEG 3350、2. 5%蔗糖、0. 75%甘氨酸和50mg/ml VEGF捕集蛋白。凍干后，重建的制劑含有20mM組氨酸、3%PEG 3350、5% 蔗糖、I. 5% 甘氨酸和 100mg/ml VEGF 捕集蛋白(SEQ ID NO:
4)。結(jié)果顯示于表8中。在基于細(xì)胞的生物測定中測定活性，該測定直接測量VEGF捕集物抑制人VEGF對小鼠Baf/3 VEGFRl/EpoR細(xì)胞系的生物活性的能力。因此，該生物測定直接測量蛋白質(zhì)的生物活性。將結(jié)果表示為相對效能百分比(測試樣品IC5tl/參照VEGF IC5tl標(biāo)準(zhǔn)X 100)。使用特異性測量含有VEGF和各種濃度VEGF捕集物的平衡混合物中游離VEGF的靈敏ELISA來測量VEGF與VEGF捕集物的結(jié)合親和力。將結(jié)果表示為相對結(jié)合百分比(測試樣品的IC5tl/參照的IC5tlX 100)。測量的pH在6. 3-6. 5的范圍內(nèi)。所有溶液在視覺上都是澄清的。在A28(lnm處用UV分光光度計(jì)來測定回收的VEGF捕集物濃度，以mg/ml表示。用SE-HPLC測定以天然構(gòu)象回收的VEGF捕集物百分比(主峰純度)。表8.貯藏于5°C的VEGF捕集物凍干制劑(VGT-RS475)的穩(wěn)定性
月數(shù)生物測定結(jié)合測定回收的% 天然構(gòu)象％
012012697.998.7
11177497.998.6 1+24 小時 126 72 99. O 98.5 1+4 小時 94 81 101. 5 98.2
31019898. I98.6
3+24 小時659498. I98.2
6+4 小時96.998.7
6+24 小時98.898.6測試含有約5mM磷酸鹽、5mM檸檬酸鹽、IOOmM NaCl、0. 1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖和25mg/ml VEGF捕集蛋白的制劑在5°C貯藏時36個月內(nèi)的穩(wěn)定性和活性。結(jié)果顯示于表9中。如通過目測所確定的，所有樣品是澄清的和無色的。pH范圍為6. 0-6. I。*直接表示兩次測量(I和2個月)的結(jié)合測定結(jié)果而不是以標(biāo)準(zhǔn)的百分比表示。表9.液體制劑(VGT-FS405)的穩(wěn)定性和活性
月數(shù)天然構(gòu)象％ 生物測定結(jié)合測定蛋白質(zhì)含量mg/ml
099. 71067225. O
199. 91194. 4pM*25. 2
299. 61025. 4pM*25. I
399.6978825. I 6 99.6 101 106 25. O 9 99.4 89 126 25.4 12 99. 5 85 95 25. 2 18 99.4 99 81 25.5 24 99. 3 75 95 25. 6 36 98.8 109 79 25. 權(quán)利要求
1.凍干前制劑，包括α)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)特異性融合蛋白拮抗劑，(ii)緩沖齊U，(ill)有機(jī)助溶劑或增量劑，和(iV) —種或多種凍干保護(hù)劑，其中融合蛋白具有SEQ IDNO 4的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I的凍干前制劑，其中緩沖劑是組氨酸。
3.權(quán)利要求I的凍干前制劑，其中有機(jī)助溶劑或增量劑是PEG。
4.權(quán)利要求I的凍干前制劑，其中凍干保護(hù)劑是甘氨酸和蔗糖中的至少一種。
5.權(quán)利要求I的凍干前制劑，包括5-50mM組氨酸、O.1-3. 0% PEG、0. 25-3. O %甘氨酸、O. 5-6. 0%鹿糖和 5-75mg/ml 融合蛋白，約 6. 0-6. 5 的 pH。
6.權(quán)利要求5的凍干前制劑，包括約IOmM組氨酸、約I.5% PEG3350、約O. 75%甘氨酸、約2. 5%蔗糖和約12. 5-75mg/mlVEGF特異性融合蛋白，約6. 25的pH。
7.權(quán)利要求6的凍干前制劑，其中融合蛋白是50mg/ml。
8.由SEQID NO :4編碼的VEGF拮抗劑融合蛋白的液體穩(wěn)定制劑，包括l-50mM組氨酸、25-150mM NaCl、5_30%蔗糖和 50_100mg/ml 融合蛋白，約 6. 0-6. 5 的 pH，包括 O. 01-0. 5%聚山梨酸酯。
9.權(quán)利要求8的液體穩(wěn)定制劑，進(jìn)一步包括O.1-5% PEG。
10.權(quán)利要求8的液體穩(wěn)定制劑，包括約IOmM組氨酸、約50mMNaCl、5-20%蔗糖和50-100mg/ml融合蛋白，約6. 0-6. 5的pH，進(jìn)一步包括O. I %聚山梨酸酯20。
11.權(quán)利要求10的液體穩(wěn)定制劑，進(jìn)一步包括3%PEG 3350。
12.生產(chǎn)VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的凍干制劑的方法，包括使權(quán)利要求7的凍干前制劑受到凍干而產(chǎn)生凍干制劑。
13.生產(chǎn)VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的重建的凍干制劑的方法，包括用液體重建權(quán)利要求12的凍干制劑，其中產(chǎn)生重建的凍干制劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中液體是無菌水或抑菌水。
全文摘要
提供了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)特異性融合蛋白拮抗劑的制劑，包括凍干前制劑、重建的凍干制劑和穩(wěn)定的液體制劑。優(yōu)選，該融合蛋白具有SEQ ID NO4的序列。
文檔編號A61K47/26GK102614134SQ201210090068
公開日2012年8月1日 申請日期2006年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者D·迪克斯, K·弗萊, S·考特茲 申請人:瑞澤恩制藥公司