專利名稱：一種殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水凝膠由于具有與天然細胞外基質(zhì)相類似的特征而廣泛用作生物醫(yī)用材料。其中，原位凝膠可在原位快速由液體轉(zhuǎn)化為凝膠狀物質(zhì)，具有一般水凝膠不可比擬的優(yōu)點，可避免外科手術(shù)過程中的高度創(chuàng)傷性，減少病人痛苦、降低醫(yī)療費用，特別可用于修復(fù)復(fù)雜、 不規(guī)則形狀的組織。若直接用于人體接觸，可防止體外微生物的感染，抑制體液損失，同時能促進傷口愈合。因此，原位凝膠的親水性三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及獨特的溶液-凝膠轉(zhuǎn)變性質(zhì)使其具有制備簡單、使用方便、保證所包載的細胞和藥物活性、與所需修復(fù)組織特別是黏膜組織親和力強、滯留時間長等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。殼聚糖是一種具有優(yōu)良生物相容性、低毒性、生物可降解性的天然多糖，擁有得天獨厚的物理性質(zhì)(親水性、功能性氨基酸基團和陽離子靜電荷)，可模擬天然細胞外基質(zhì) (ECM)中的糖胺聚糖。它在水凝膠中有巨大的應(yīng)用前景，近年來受到了極大的關(guān)注。e-聚賴氨酸是一種具有抑菌功效的天然多肽，與ECM中的蛋白成分和功能類似，分子鏈上擁有眾多側(cè)氨基，可有效促進細胞粘附生長。此外，其易與聚陰離子發(fā)生強靜電作用，對生物膜有良好穿透力，可用作某些藥物載體，在醫(yī)療和制藥方面擁應(yīng)用前景廣闊。目前殼聚糖基原位水凝膠多采用化學(xué)交聯(lián)法制備，盡管其彌補了物理交聯(lián)凝膠力學(xué)強度低、體內(nèi)穩(wěn)定性差等不足，然而這些方法當(dāng)中常涉及有毒小分子交聯(lián)劑，或紫外光照及光引發(fā)劑、H2O2等試劑的使用，水凝膠對基體的毒性不容忽視，與人體組織的生物相容性有待進一步提高。而邁克爾加成反應(yīng)制備原位水凝膠可以避免使用上述有毒試劑，反應(yīng)條件溫和，可在生理條件下發(fā)生，且反應(yīng)迅速可控?，F(xiàn)有的利用邁克爾加成反應(yīng)制備殼聚糖原位凝膠的體系多采用帶有反應(yīng)端基的聚乙二醇(PEG)作為交聯(lián)劑。PEG的親水性好，但不具備與組織或細胞粘附的活性位點，且分子的可改性位點少，僅限于端基，其主要作用僅為連接聚合物網(wǎng)絡(luò)(Liao Sff, Yu TB, Guan ZB. Journal of the American Chemical Society 2009，131:17638-17646)。為使交聯(lián)劑同時兼?zhèn)浣宦?lián)凝膠網(wǎng)絡(luò)及賦予凝膠新的性能和應(yīng)用的功能，研究人員開發(fā)了一系列功能性聚合物交聯(lián)劑，如鐘志遠制備乙烯砜基葡聚糖作為交聯(lián)劑，與PEG相比，凝膠速度更快、時間更短(Hiemstra C，van der Aa LJ, Zhong ZY, et al. Biomacromolecules 2007, 8: 1548-1556)。Censi 等制備具有溫敏性質(zhì)的三嵌段共聚物交聯(lián)劑。此共聚物可在37°C發(fā)生分子聚集態(tài)結(jié)構(gòu)變化，賦予了凝膠以溫度敏感性， 得到的凝膠網(wǎng)絡(luò)由于三嵌段共聚物在人體溫度下發(fā)生的相結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變而得到加強(Censi R, Fieten PJ, di Martino P, et al. Macromolecules 2010, 43: 5771-5778)。采用多側(cè)基官能度天然多肽作為交聯(lián)劑以模擬細胞外基質(zhì)的蛋白成分及功能特征，通過邁克爾加成原位合成殼聚糖基凝膠，進而增強凝膠的生物相容性和細胞粘附性，這方面的原位凝膠及制備方法尚未見報道。馬來酰亞胺化改性的聚賴氨酸作為新型多肽交聯(lián)劑一方面可連接水凝膠網(wǎng)絡(luò)，同時得到的水凝膠可仿生天然細胞外基質(zhì)的多糖/多肽的成份、結(jié)構(gòu)及功能特征，在組織粘合、止血材料、細胞及藥物載體等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠及其制備方法。該凝膠在生理pH下可快速原位形成，特別是其可仿生天然細胞外基質(zhì)的多糖/多肽的成份、結(jié)構(gòu)及功能特征，具有良好的生物相容性和細胞粘附性的優(yōu)點，其制備方法過程簡單。為達到上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn)的，一種殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠，其特征在于該殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠是由濃度為60mg/ml的巰基化殼聚糖溶液與濃度為40mg/ml的馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液按照體積比(O. 2^40) 1均勻混合，通過原位交聯(lián)反應(yīng)得到，原位凝膠中，巰基化殼聚糖占凝膠總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)為1飛.5%， 馬來酰亞胺化聚賴氨酸占凝膠總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)為O. Γ3. 2 %。上述的殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠制備方法，其特征包括以下步驟
1.馬來酰亞胺化的聚賴氨酸溶液的制備
(1)室溫下將琥珀酰亞胺硫酸鹽溶解于PH=7.2 · 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成濃度為f6mg/ml的溶液，并攪拌至形成澄清溶液；
(2)將數(shù)均分子量4000的聚賴氨酸完全溶解于pH=7. 2 · 4的磷酸鹽緩沖液(PBS) 中，配制成濃度為f20mg/ml的溶液，并攪拌至形成澄清溶液；
(3)按步驟(2)制得的聚賴氨酸溶液與步驟(I)制得的琥珀酰亞胺硫酸鹽溶液的體積比為I :(廣10)在中攪拌速率5(Tl00rpm下混合均勻制得混合液；室溫下持續(xù)攪拌，反應(yīng) O. 5^2小時，以去離子水為介質(zhì)透析、凍干制得雙鍵摩爾取代度在5 30%的馬來酰亞胺化聚賴氨酸；
(4)將步驟(3)制備的馬來酰亞胺化聚賴氨酸粉末溶于pH值為7.2 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成濃度為40mg/ml的馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液；
2.巰基化殼聚糖溶液的制備
采用巰基取代度為15(Γ160 μ mol/g的巰基化殼聚糖溶于pH值為7. 2 . 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成濃度為60mg/ml的巰基化殼聚糖溶液；
3.殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠的制備
在25 37°C下，將步驟2配制的巰基化殼聚糖溶液和步驟I配制的改性聚賴氨酸溶液按照體積比(O. 2^40) 1的比例均勻混合，形成殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠。本發(fā)明的優(yōu)點制備條件溫和，反應(yīng)可控，制備過程簡單。發(fā)明制備的殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠仿生天然細胞外基質(zhì)的多糖/多肽的組成成份、結(jié)構(gòu)及功能特征，有助于增加材料的組織相容性，促進細胞粘附增長，是很有應(yīng)用前途的新型生物材料。特別是此原位凝膠未來可望作為可注射材料用作組織粘合劑以及用于包載細胞或作為藥物載體材料。


圖I為實施例I巰基化殼聚糖溶液和馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液的混合液尚未形成凝膠時的照片。圖2為實施例I巰基化殼聚糖溶液和馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液的混合液形成凝膠的照片。
具體實施例方式實施例I :
稱取14mg的琥珀酰亞胺硫酸鹽，溶解于8ml的pH =7. 2^7. 4的PBS中，攪拌至形成澄清溶液；稱取30mg的e-聚賴氨酸，完全溶解于2ml pH =7. 2^7. 4的PBS中，攪拌至形成澄清溶液；室溫下將上述聚賴氨酸溶液加入到琥珀酰亞胺硫酸鹽溶液中，在攪拌速率50rpm 下混合均勻，反應(yīng)O. 5小時，以去離子水為介質(zhì)室溫下透析24小時，透析產(chǎn)物經(jīng)凍干制得雙鍵摩爾取代度為5%的馬來酰亞胺化聚賴氨酸。將該馬來酰亞胺化聚賴氨酸粉末溶于pH 值為7. 2 . 4的PBS中，配制成濃度為40mg/ml的馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液；
稱取Ig殼聚糖(I , =1
零.5 X IO5,脫乙酰度為92%)溶于90ml去離子水中形成懸濁液，加入O. 8g I-羥基苯并三唑到上述懸濁液中，攪拌，獲得澄清溶液；在上述澄清溶液中加入3. 4g N-乙?；?L-半胱氨酸，再稱取Sg I-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶于約少量去離子水中，待I- (3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺溶解均勻后，加入至溶液中，然后用lmol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物pH至:Γ5。之后將反應(yīng)體系置于避光環(huán)境，在室溫下以200rpm的速率攪拌 3小時；用去離子水配制含2ymol/L乙二酸四乙胺、5mmol/L鹽酸的溶液；將反應(yīng)后的混合物置于該溶液中透析，透析環(huán)境黑暗避光，溫度控制在4° C;而后再于l%(w/v) NaCl, lmmol/L鹽酸的溶液中透析,透析環(huán)境不變。最后于lmmol/L鹽酸溶液中透析,透析結(jié)束后，將產(chǎn)物取出，凍干。制備的巰基化殼聚糖的巰基取代度為150 μ mol/g。將該巰基化殼聚糖溶于PH值為7. 2 . 4的PBS中，配制成濃度為60mg/ml的巰基化殼聚糖溶液；
在37°C下，將IOml制得的巰基化殼聚糖溶液和IOml制得的改性聚賴氨酸溶液均勻混合，形成2Ig殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠。實施例2:
稱取30mg的琥珀酰亞胺硫酸鹽，溶解于16ml的pH =7. 2^7. 4的PBS中，攪拌至形成澄清溶液；稱取3 Img的聚賴氨酸，完全溶解于4ml pH =7. 2^7. 4的PBS中，攪拌至形成澄清溶液；室溫下將上述聚賴氨酸溶液加入到琥珀酰亞胺硫酸鹽溶液中，在攪拌速率IOOrpm 下混合均勻，反應(yīng)2小時，以去離子水為介質(zhì)室溫下透析24小時，透析產(chǎn)物經(jīng)凍干制得雙鍵摩爾取代度為30%的馬來酰亞胺化聚賴氨酸。將該馬來酰亞胺化聚賴氨酸粉末溶于pH 值為7. 2 . 4的PBS中，配制成濃度為40mg/ml的馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液；
采用巰基取代度為150 μ mol/g的巰基化殼聚糖(J7.. =1. 5 X 105，脫乙酰度為92%)的殼聚糖溶于PH值為7. 2 I. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成濃度為60mg/ml的巰基化殼聚糖溶液；
在37°C下，將IOOml制得的巰基化殼聚糖溶液和IOml制得的改性聚賴氨酸溶液均勻混合，形成116. 4g殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠。實施例3
稱取20mg的琥珀酰亞胺硫酸鹽，溶解于Ilml的pH =7. 2^7. 4的PBS中，攪拌至形成澄清溶液；稱取30mg的e-聚賴氨酸，完全溶解于3ml pH =7. 2 7. 4的PBS中，攪拌至形成澄清溶液；室溫下將上述聚賴氨酸溶液加入到琥珀酰亞胺硫酸鹽溶液中，在攪拌速率SOrpm下混合均勻，反應(yīng)I小時，以去離子水為介質(zhì)室溫下透析24小時，透析產(chǎn)物經(jīng)凍干制得雙鍵摩爾取代度為15%的馬來酰亞胺化聚賴氨酸。將該馬來酰亞胺化聚賴氨酸粉末溶于pH值為7. 2 . 4的PBS中，配制成濃度為40mg/ml的馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液；
采用巰基取代度為160 μ mol/g的巰基化殼聚糖(U.. =1. 2 X 105，脫乙酰度為85%)的殼聚糖溶于PH值為7. 2 I. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成濃度為60mg/ml的巰基化殼聚糖溶液；
在25°C下，將60ml制得的巰基化殼聚糖溶液和3ml制得的改性聚賴氨酸溶液均勻混合，形成66. 7g殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠，其特征在于該殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠是由濃度為60mg/ml的巰基化殼聚糖溶液與濃度為40mg/ml的馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液按照體積比(O. 2^40) 1均勻混合，通過原位交聯(lián)反應(yīng)得到，原位凝膠中，巰基化殼聚糖占凝膠總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)為廣5. 5%,馬來酰亞胺化聚賴氨酸占凝膠總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)為O. Γ3. 2 %。
2.一種按權(quán)利要求I所述的殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠制備方法，其特征包括以下步驟1)馬來酰亞胺化的聚賴氨酸溶液的制備(1)室溫下將琥珀酰亞胺硫酸鹽溶解于PH=7.2 · 4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為 r6mg/ml的溶液，并攪拌至形成澄清溶液；(2)將數(shù)均分子量4000的聚賴氨酸完全溶解于pH=7. 2 · 4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為f20mg/ml的溶液，并攪拌至形成澄清溶液；(3)按步驟(2)制得的聚賴氨酸溶液與步驟(I)制得的琥珀酰亞胺硫酸鹽溶液的體積比為I :(廣10)在中攪拌速率5(Tl00rpm下混合均勻制得混合液；室溫下持續(xù)攪拌，反應(yīng)O.5^2小時，以去離子水為介質(zhì)透析、凍干制得雙鍵摩爾取代度在5 30%的馬來酰亞胺化聚賴氨酸；(4)將步驟(3)制備的馬來酰亞胺化聚賴氨酸粉末溶于pH值為7.2 7. 4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為40mg/ml的馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液；2)巰基化殼聚糖溶液的制備采用巰基取代度為15(Γ160 μ mol/g的巰基化殼聚糖溶于pH值為7. 2 . 4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為60mg/ml的巰基化殼聚糖溶液；3)殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠的制備在25 37°C下，將步驟2)配制的巰基化殼聚糖溶液和步驟I)配制的改性聚賴氨酸溶液按照體積比(O. 2^40) 1的比例均勻混合，形成殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖/聚賴氨酸原位凝膠及其制備方法。該凝膠是由質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1~5.5%的巰基化殼聚糖和質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)為0.1~3.2%馬來酰亞胺化聚賴氨酸所形成的原位凝膠。其制備過程包括合成含馬來酰亞胺雙鍵的聚賴氨酸，以PBS為溶劑配制馬來酰亞胺化聚賴氨酸溶液；以PBS為溶劑配制巰基化殼聚糖溶液；將兩種溶液于生理pH值條件下均勻混合形成原位凝膠。本發(fā)明優(yōu)點在于制備過程簡單，所制得的原位凝膠仿生天然細胞外基質(zhì)的多糖/多肽的成份、結(jié)構(gòu)及功能特征，有助于增加材料的組織相容性，促進細胞粘附增長，在組織工程及藥物釋放領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61L27/54GK102585303SQ20121008347
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月27日
發(fā)明者聶微, 袁曉燕, 趙瑾 申請人:天津大學(xué)