專利名稱：一種增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤治療載體技 術(shù)領(lǐng)域，涉及一種增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體。
背景技術(shù)：
腫瘤基因治療是目前腫瘤治療的新方向。基因治療載體的表達(dá)、特異性及靶向性都是其療效成敗的關(guān)鍵因素。以往的基因治療載體因缺乏腫瘤特異性或靶向性表達(dá)，而不可避免地對正常組織產(chǎn)生毒副作用，造成機(jī)體損傷，所以提高載體的靶向性是腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。目前已有應(yīng)用針對只在腫瘤組織中特異表達(dá)的survivin啟動(dòng)子聯(lián)合厭氧反應(yīng)元件 HRE 的腫瘤特異性表達(dá)載體(L Yang,, Z Cao,, F Li, et al. Tumor-specific geneexpression using the surviving promoter is further increased by hypoxia. GeneTherapy, 2004,11 :1215_1223),然而在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)單純survivin啟動(dòng)子聯(lián)合厭氧反應(yīng)元件HRE表達(dá)載體的表達(dá)效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，在對腫瘤細(xì)胞特異殺傷的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提聞其表達(dá)效率。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)—種增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，包括厭氧反應(yīng)元件和survivin啟動(dòng)子，在survivin啟動(dòng)子的上游還設(shè)有CMV增強(qiáng)子。所述的CMV增強(qiáng)子為Enhancer，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。所述的厭氧反應(yīng)元件為多個(gè)串聯(lián)的厭氧反應(yīng)元件HRE。所述的多個(gè)串聯(lián)的厭氧反應(yīng)元件HRE為5個(gè)HRE的串聯(lián)，其核苷酸序列如SEQ.ID. NO. 2 所示。所述的survivin啟動(dòng)子的下游設(shè)有包括多克隆位點(diǎn)和PloyA尾的miRNA串聯(lián)表達(dá)框；所述的多克隆位點(diǎn)至少包括EcoRI、PstI、Nhel、kpnl和HindIII酶切位點(diǎn)。所述的survivin啟動(dòng)子與miRNA串聯(lián)表達(dá)框之間還設(shè)有突光標(biāo)記基因,在miRNA串聯(lián)表達(dá)框的下游設(shè)有抗生素篩選基因。所述的多克隆位點(diǎn)之間插入有沉默ERK1/2的腫瘤管家基因ERK。所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體為pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR，該載體是在PMD19-T載體的Amp和ori之間依次連接五個(gè)串聯(lián)的低氧反應(yīng)元件HRE5、CMV增強(qiáng)子Enhancer、survivin啟動(dòng)子、GFP和miRNA表達(dá)框架。所述的pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR 載體的核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 4所示。所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，首先通過腫瘤特異性啟動(dòng)子survivinpromoter和厭氧反應(yīng)元件(HRE)的雙調(diào)控,使得該載體在腫瘤組織特異性表達(dá)，避免其對正常組織的損傷；其次通過CMV增強(qiáng)子的調(diào)控，提高其在腫瘤組織的特異性表達(dá)，提高載體在腫瘤中的表達(dá)能力；細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果表明設(shè)有增強(qiáng)子的載體表達(dá)效率遠(yuǎn)高于無增強(qiáng)子的表達(dá)載體；而且鑒于腫瘤的發(fā)生是多基因共同作用的結(jié)果，單純針對某一靶基因的治療效果往往不是十分理想，本發(fā)明提供的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體的miRNA串聯(lián)表達(dá)框中設(shè)計(jì)了 5個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，這樣就可實(shí)現(xiàn)插入多個(gè)針對腫瘤的管家基因的siRNA或miRNA，使得串聯(lián)的siRNA或miRNA同時(shí)表達(dá)，達(dá)到對腫瘤的多靶點(diǎn)治療。在miRNA串聯(lián)表達(dá)框中插入針對腫瘤管家基因ERK的ERK1/2 shRNA進(jìn)行腫瘤基因治療，結(jié)果表明該載體對肝癌HepG2細(xì)胞，惡性黑色素瘤A375細(xì)胞都有很好的腫瘤抑制效應(yīng)。


圖I 為 pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP_miR 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)不意圖；圖2為HRE5擴(kuò)增后的電泳鑒定結(jié)果；圖3為survivin啟動(dòng)子擴(kuò)增后的電泳鑒定結(jié)果；圖4為miRNA表達(dá)框擴(kuò)增后的電泳鑒定結(jié)果；圖5為Enhancer擴(kuò)增后的電泳鑒定結(jié)果；圖6為!fepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的熒光照片圖；圖7為小鼠原代培養(yǎng)皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)然后熒光照片圖；圖8-1 8-4為不同載體轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞的熒光檢測結(jié)果圖；圖9-1 9-2為肝癌H印G2、惡性黑色素瘤A375的MTT檢測結(jié)果圖；圖10為肝癌H印G2的細(xì)胞周期檢測結(jié)果圖；圖11為惡性黑色素瘤A375的細(xì)胞周期檢測結(jié)果圖；圖12為肝癌!fepG2的細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果圖；圖13為惡性黑色素瘤A375的細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果圖；圖14為肝癌HepG2的western Blot檢測結(jié)果圖；圖15為惡性黑色素瘤A375的western Blot檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體,該載體在survivin promoter和厭氧反應(yīng)元件(HRE)的雙調(diào)控的基礎(chǔ)上，通過CMV增強(qiáng)子的調(diào)控提高載體在腫瘤中的表達(dá)能力，并進(jìn)一步考慮腫瘤的多靶點(diǎn)治療。下面結(jié)合具體的實(shí)施例PMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFPniR載體的構(gòu)建及抗腫瘤的效果對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定；本發(fā)明所提供的元件組合在其他可表達(dá)的載體中也能夠達(dá)到相應(yīng)的目的或效果。具體的pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR 載體是以 pMD19_T 載體為框架載體，分別連接上 5 個(gè)串聯(lián)的 HRE (5HRE), CMV 增強(qiáng)子 Enhancer, survivin promoter,及 miRNA 表達(dá)框架等主體元件而構(gòu)成，其中在miRNA表達(dá)框架中有EmGFP作為報(bào)告基因，EmGFP下游為插入 miRNA 或 siRNA 的多克隆位點(diǎn)及 PolA 尾。pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP_miR 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖及MCS內(nèi)切酶位點(diǎn)詳細(xì)序列如圖I所示。pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR 載體的構(gòu)建為I、pMD19-T 載體的改造
化學(xué)合成包含SpeI，SphI，F(xiàn)baI，SacI四個(gè)酶切位點(diǎn)的寡核苷酸鏈，其序列為sense oligo actagtatca gcgcatgcca agattgatca gaatcggagc tea ；anti-sense oligo gagctccgat tctgatcaat cttggcatgc gctgatacta gta ；將合成好的sence oligo 和 antisence oligo 在 95°C 4min,常溫 5 IOmin 下退火形成長43bp的雙鏈；并進(jìn)一步取Iul退火液，加99ulH20，稀釋為500nM ;用4%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定退火雙鏈。將退火雙鏈(500nM ds雙鏈)與PMD19-T載體通過T-A連接，得到中間載體pMD-ds，并將pMD-ds轉(zhuǎn)染(請說明宿主)擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒酶切鑒定后，送測序。測序正確的pMD-ds載體作為框架載體，進(jìn)行后續(xù)載體的構(gòu)建。2、低氧反應(yīng)元件的獲得具體的低氧反應(yīng)元件采用5個(gè)HRE串聯(lián)片段，HRE作為厭氧反應(yīng)調(diào)控元件，其主要功能是提高survivin啟動(dòng)子在腫瘤中的表達(dá)。已有報(bào)道單純HRE并不能增強(qiáng)survivin啟動(dòng)子在月中瘤中的表達(dá)(L Yang,, Z Cao,, F Li, et al. Tumor-specific gene expressionusing the surviving promoter is further increased by hypoxia. Gene Therapy,2004,11 :1215-1223)，故本載體構(gòu)建中應(yīng)用5個(gè)串聯(lián)的HRE。5個(gè)HRE串聯(lián)片段HRE5是以包含5個(gè)HRE串聯(lián)片段的載體pEGFP_5HR(石秦東，張蓬勃，康前雁等，以EGFP為報(bào)告基因的增強(qiáng)子鑒定質(zhì)粒載體的構(gòu)建及鑒定，南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27 (12))為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物5’端加SpeI酶切位點(diǎn)，3’端加SphI酶切位點(diǎn)。引物序列如下HRE5 forward primer actagtccac agtgcatacg tgg ；HRE5 reverse primer gcatgcaatt ccggaagagg acctgtt ；將PCR擴(kuò)增獲得HRE5片段進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果如圖2所示，因有相同的串聯(lián)片段，故擴(kuò)出了大小不等的5條片段，膠回收時(shí)只切取225bp產(chǎn)物片段，即225bp的最大片段為HRE5片段。將HRE5片段與PMD19-T載體分別用SpeI，SphI酶切后連接，轉(zhuǎn)化后，挑菌，提取質(zhì)粒酶切鑒定，送測序；得到T-HRE5載體，其中HRE5片段的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。3、survivin 啟動(dòng)子(survivin promoter)的獲得提取培養(yǎng)的肝癌!fepG2細(xì)胞基因組DNA，以上述DNA為模板PCR擴(kuò)增survivinpromoter,引物序列如下Sp forward primer gcatgcgcgt tctttgaaag cagtc ；Sp reverse primer tgatcagccg ccgccgccac ctctgccaac ggg ；引物5’端加SphI酶切位點(diǎn)，3’端加FbaI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段長279bp ；PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果如圖3所不。
膠回收Survivin promoter片段,與pMD19_T載體連接,轉(zhuǎn)化后,挑菌,提取質(zhì)粒酶切鑒定，送測序；得到載體T-SP，其中Survivin promoter的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所
示。
4、miRNA表達(dá)框架的獲得I)合成含有 EcoR I, Pst I, Nhe I, Kpn I, Hind III 五個(gè)酶切位點(diǎn)的 MCS dsoligo。化學(xué)合成oligo DNA序列:Sense tgctggaatt ctgcagctag cggtaccaag ctt ；Antisense cctgaagctt ggtaccgcta gctgcagaat tcc ；將以上oligo DNA退火形成雙鏈，將ds oligo DNA與商品化的miR載體pcDNA
6.2-GW/EmGFP-miR連接，轉(zhuǎn)化，挑菌，提取質(zhì)粒酶切鑒定，送測序。該載體記為pcDNA
6.2-Gff/EmGFP-dso2)以 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-ds 為模板，擴(kuò)增包含有 EmGFP 及 polA 的 miRNA 表達(dá)框架。引物序列如下miR forward primer tgatcatctg gctaactaga gaacccac ；miR reverse primer gagctcaaca gctatgacca tgtaatac ；擴(kuò)出的片段長1408bp，引物5’端加入FbaI酶切位點(diǎn)，3’端加入SacI酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定如圖4所示。膠回收miRNA表達(dá)框架，與pMD19_T載體連接，轉(zhuǎn)化，挑菌，提取質(zhì)粒酶切鑒定，送測序；該載體記為T-miR。5、Enhancer 片段的獲得以PEGFP-Cl為模板擴(kuò)增Enhancer，弓丨物序列如下Enhancer forward primer gcatgcgttc cgcgttacat aacttacg ；Enhancer reverse primer gcatgctgcc aaaacaaact cccattga ；引物5’端和3’端均加SphI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段長418bp，PCR產(chǎn)物電泳鑒定如圖5所示；所擴(kuò)增的Enhancer的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。膠回收Enhancer PCR產(chǎn)物，通過T-A連接與PMD19-T載體連接，構(gòu)建成pMD—enhancer。6、pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR 表達(dá)載體的連接I)用SpeI和SacI雙酶切pMD-ds，膠回收大片段。2)用 SpeI 和 SphI 雙酶切 T-HRE5,用 SphI 和 FbaI 雙酶切 T-Sp,用 FbaI 和 SacI雙酶切T-miR，分別將每個(gè)酶切產(chǎn)物的小片段膠回收。3)將pMD-ds膠回收的大片段與回收的HRE5, SP, miRNA表達(dá)框架一起連接，轉(zhuǎn)化，挑菌，提質(zhì)粒酶切鑒定，送測序；構(gòu)建腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控的表達(dá)載體pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR。4)同時(shí)用 sphl 酶切 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR 和 pMD-enhancer，膠回收pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR大片段與pMD-enhancer小片段，并進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)，之后將這兩片段按比例連接，轉(zhuǎn)化，挑單克隆，送測序。構(gòu)建好增強(qiáng)型腫瘤特異性表達(dá)載體pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR ;其核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 4 所示。7、pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR 表達(dá)載體的表達(dá)功能
I)將測序正確的pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR菌液擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，同時(shí)將構(gòu)建的測序正確且無HRE5的載體pMD-SURV/EmGFP-miR菌液擴(kuò)增，提取質(zhì)粒。同時(shí)提取pEGFP-Cl質(zhì)粒，作為陽性對照組。2)培養(yǎng)以下腫瘤細(xì)胞肝癌細(xì)胞SSCM7721，H印G2，H印3B，胃癌細(xì)胞7901，肺癌細(xì)胞A549，宮頸癌細(xì)胞HeLa，乳腺癌MCF-7，胰腺癌BXPC-3，黑色素瘤細(xì)胞HL3)原代培養(yǎng)小鼠腦細(xì)胞，胃細(xì)胞及皮膚細(xì)胞。4)將原代培養(yǎng)的細(xì)胞按5 X IO4/孔接種于24孔板中，每種細(xì)胞接種3孔，分別用于轉(zhuǎn)染 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR，pMD-SURV/EmGFP-miR 及 pEGFP-Cl 三個(gè)不同的質(zhì)粒；重復(fù)種兩塊相同的24孔培養(yǎng)板，待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后一塊置于正常氧濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一塊置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(I. 1% O2) O5)用Iipofectam 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，24h后在熒光顯微鏡下通過觀察GFP的表達(dá)來判斷pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR，pMD-SURV/EmGFP-miR載體在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。檢測結(jié)果表明PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在不同的腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)，且在低氧培養(yǎng)下pMD-HRE5-SURV/EmGFP-mi R的表達(dá)高于正常培養(yǎng)組，亦高于低氧培養(yǎng)下轉(zhuǎn)染的pMD-SURV/EmGFP-miR載體組。其中在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)最高的為H印G2，表達(dá)較高的為Bxpc-3、MCF-7 ；在小鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞中，pMD-SURV/EmGFP-miR和 pMD-HRE5-SURV/EmGFP_miR 無論在正常培養(yǎng)下，還是厭氧培養(yǎng)均無表達(dá)；其中HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的熒光照片如圖6所示，圖7為小鼠原代培養(yǎng)皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)然后熒光照片；其中，A、B、C分別為正常培養(yǎng)條件下pEGFP-Cl、pMD-SURV/EmGFP-miR、PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR轉(zhuǎn)染后熒光照片；D、E、F分別為厭氧(I. I % O2)培養(yǎng)條件下pEGFP-Cl, pMD-SURV/EmGFP-miR, pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR 轉(zhuǎn)染后熒光照片。圖 6、圖 7 所示 pEGFP-Cl，pMD-SURV/EmGFP-miR，pMD-HRE5-SURV/EmGFP_miR 在HepG2細(xì)胞中無論在正常培養(yǎng)還是厭氧培養(yǎng)都有表達(dá)，但是pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在厭氧條件下的表達(dá)高于正常培養(yǎng)條件下。pEGFP-Cl，pMD-SURV/EmGFP-miR, pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR三個(gè)載體在小鼠正常培養(yǎng)皮膚細(xì)胞中，無論在正常培養(yǎng)還是厭氧培養(yǎng)，只有pEGFP-Cl 表達(dá)，而 pMD-SURV/EmGFP-miR，pMD-HRE5-SURV/EmGFP_miR 兩個(gè)載體均無表達(dá)。以上檢測結(jié)果表明pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR可以在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出很好的缺氧誘導(dǎo)作用和高水平的表達(dá)，且在正常細(xì)胞不表達(dá)。說明pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR中的HRE5-SURV雙調(diào)控元件可以在腫瘤細(xì)胞中能夠有效地進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)和調(diào)控工作，為后期在該載體中插入miRNA或shRNA串聯(lián)序列，進(jìn)行miRNA或shRNA功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。 8、pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR 與 pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP_miR 在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的比較將培養(yǎng)H印G2細(xì)胞按5X IO4/孔接種于24孔板中，分別用Iipofectam 2000轉(zhuǎn)染以下載體 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR、pMD-SURV/EmGFP-miR, pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR 和 pMD-Enhancer-SURV/EmGFP-miR ；24h 后在熒光顯微鏡下通過觀察 GFP。檢測結(jié)果如圖8-1 8-4 所示的 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR, pMD-SURV/EmGFP-miR, pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR, pMD-Enhancer-SURV/EmGFP-miR 的轉(zhuǎn)染結(jié)果。圖8-1與圖8-3比較，圖8-2與圖8-4比較，可以看出在增加Enhancer之后，熒光、強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，也即載體表達(dá)說明明顯增強(qiáng)；這就表明增強(qiáng)型PMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR在!fepG2中的表達(dá)遠(yuǎn)高于非增強(qiáng)型pMD-HRE5-SURV/EmGFP_miR的表達(dá)。9、攜帶ERK1/2 shRNA的增強(qiáng)型表達(dá)載體的構(gòu)建及功能絲裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase, MAPK),又稱細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular-signal regulated kinase,ERK)級聯(lián)途徑是將細(xì)胞外刺激信號傳遞到細(xì)胞核，介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)的最為重要通路。MAPK級聯(lián)途徑參與了細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、死亡以及細(xì)胞間功能同步等多種細(xì)胞生理過程。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已明確了 5條MAPK途徑，即ERK1/2、JNK、p38、ERK3/4和ERK5亞家族。其中，Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞增殖分化最重要的途徑之一。ERK1/2是本途徑中處于將細(xì)胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)入細(xì)胞核而調(diào)控下游基因表達(dá)的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白。ERK1/2蛋白激活后，在細(xì)胞質(zhì)中將影響細(xì)胞骨架蛋白、MNK1/2以及P90RSK等蛋白的活性；轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，將通過磷酸化，激活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在多數(shù)腫瘤組織中，可以檢測到Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的持續(xù)開放。故在腫瘤細(xì)胞中用ERK1/2 shRNA或siRNA沉默ERK1/2，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在ERKl 5，端加 EcoRI,ERK2 的 3，加 HindIILERKl 與 ERK2 之間用 NheI 連接，人工合成如SEQ. ID. NO. 5所示的ERKI/2 shRNA序列；然后分別用EcoRI、HindIII 同時(shí)酶切 T-ERK1/2 shRNA,及pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR, pMD-Enhancer-SURV/EmGFP-miR將 ERKl/2shRNA 回收片段與載體回收大片段連接，轉(zhuǎn)化，挑單克隆，測序驗(yàn)證。細(xì)胞培養(yǎng)肝癌H印G2，惡性黑色素瘤A375細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。肝癌IfepG2，惡性黑色素瘤A375細(xì)胞分別接種于96孔板中，每組3孔。接種24 小時(shí)后分別轉(zhuǎn)染構(gòu)建的四種載體 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-ERKl/2shRNA (pMD_5HSurp)，pMD-SURV/EmGFP-ERKl/2 shRNA(pMD-Surp)， pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-ERKl/2shRNA (pMD-E5HSurp)，pMD-Enhancer-SURV/EmGFP-ERKl/2 shRNA (pMD-ESurp);然后進(jìn)行以下檢測(pMD_5HSurp、pMD-Surp、pMD-ESurp 作為對照)MTT實(shí)驗(yàn)肝癌IfepG2、惡性黑色素瘤A375細(xì)胞分別接種于96孔板中，每組3孔。接種24小時(shí)后轉(zhuǎn)染以上四種質(zhì)粒。其中pMD-ESurp，pMD-Surp培養(yǎng)于正常培養(yǎng)箱中，pMD-5HSurp，pMD_E5HSurp培養(yǎng)于含1% O2的厭氧培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)測細(xì)胞活力。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)肝癌H印G2、惡性黑色素瘤A375細(xì)胞分別接種于24孔板中，每組3孔。接種24小時(shí)后轉(zhuǎn)染以上四種質(zhì)粒。其中pMD-ESurp，pMD-Surp培養(yǎng)于正常培養(yǎng)箱中，pMD-5HSurp，pMD-E5HSurp培養(yǎng)于含1% O2的厭氧培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集細(xì)胞，用70 %乙醇4°C固定過夜，PI染色后上流式細(xì)胞儀檢測。
細(xì)胞凋亡檢測肝癌H印G2，惡性黑色素瘤A375細(xì)胞分別接種于24孔板中，每組3孔。接種24小時(shí)后轉(zhuǎn)染以上四種質(zhì)粒。其中pMD-ESurp，pMD-Surp培養(yǎng)于正常培養(yǎng)箱中，pMD-5HSurp，pMD-E5HSurp培養(yǎng)于含1% O2的厭氧培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集細(xì)胞，用Annexin V/PE及7-AAD避光染色30分鐘后上流式細(xì)胞儀檢測。western Blot檢測肝癌IfepG2、惡性黑色素瘤A375細(xì)胞分別接種于6孔板中，每組2孔。接種24小時(shí)后轉(zhuǎn)染以上四種質(zhì)粒。其中pMD-ESurp，pMD-Surp培養(yǎng)于正常培養(yǎng)箱中，pMD-5HSurp，pMD-E5HSurp培養(yǎng)于含1% O2的厭氧培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集細(xì)胞，用RIPA提取總蛋白。將所提蛋白與上樣緩沖液混合后，100°C煮沸5分鐘，取10 μ I點(diǎn)樣于SDS-PAGE膠上，IOOv,90分鐘，用半干法轉(zhuǎn)膜后，PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫震蕩封閉2小時(shí)，PBST洗滌后，用ERK1/2 —抗4°C過夜孵育，PBST洗滌后加二抗，室溫孵育2小時(shí)，PBST洗滌后，加化學(xué)發(fā)光液，曝光，取圖，分析。
MTT實(shí)驗(yàn)的肝癌H印G2、惡性黑色素瘤A375的檢測結(jié)果分別如圖9_1、9_2所示。可以看到在48h后pMD-E5HSurp明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。肝癌H印G2、惡性黑色素瘤A375的細(xì)胞周期檢測結(jié)果分別如圖10、圖11所示?？梢钥吹絧MD-E5HSurp將H印G2、惡性黑色素瘤A375的細(xì)胞周期阻滯在S期。肝癌H印G2、惡性黑色素瘤A375的細(xì)胞凋亡結(jié)果分別如圖12、圖13所示?？梢钥吹絧MD-E5HSurp明顯誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。肝癌!fepG2、惡性黑色素瘤A375的western Blot檢測結(jié)果如圖14、圖15所示?？梢钥吹絧MD-E5HSurp明顯的沉默了 ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)。綜合以上檢測，結(jié)果表明所構(gòu)建的PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR載體在克隆入針對腫瘤管家基因的siRNA或miRNA后能夠?qū)⒛[瘤細(xì)胞阻滯在S期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而特異的殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤尤其是實(shí)體瘤，由于其增長速度過快，而形成瘤體內(nèi)相對缺氧狀態(tài)。而目前的研究表明大多數(shù)腫瘤都可以特異性表達(dá)survivin啟動(dòng)子，故針對腫瘤組織的這兩個(gè)特性，構(gòu)建了低氧反應(yīng)元件HRE5串聯(lián)survivin啟動(dòng)子的表達(dá)載體,進(jìn)一步在survivin啟動(dòng)子前插入CMV增強(qiáng)子，提高其在腫瘤中的表達(dá)；所以所構(gòu)建的表達(dá)載體中的miRNA或siRNA表達(dá)框架又能提供很好的腫瘤靶向基因治療。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，其特征在于，包括厭氧反應(yīng)元件和survivin啟動(dòng)子,在survivin啟動(dòng)子的上游還設(shè)有CMV增強(qiáng)子。
2.如權(quán)利要求I所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，其特征在于，所述的CMV增強(qiáng)子為Enhancer,其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
3.如權(quán)利要求I所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，其特征在于，所述的厭氧反應(yīng)元件為多個(gè)串聯(lián)的厭氧反應(yīng)元件HRE。
4.如權(quán)利要求3所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，其特征在于，所述的多個(gè)串聯(lián)的厭氧反應(yīng)元件HRE為5個(gè)HRE的串聯(lián)，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
5.如權(quán)利要求I所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，其特征在于，所述的survivin啟動(dòng)子的下游設(shè)有包括多克隆位點(diǎn)和PloyA尾的miRNA串聯(lián)表達(dá)框； 所述的多克隆位點(diǎn)至少包括EcoRI、PstI、Nhel、kpnl和HindIII酶切位點(diǎn)。
6.如權(quán)利要求5所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，其特征在于，所述的多克隆位點(diǎn)之間串聯(lián)有多個(gè)針對腫瘤的管家基因的siRNA或miRNA ;其中至少包括沉默腫瘤管家基因ERKI/2 的 siRNA 或 miRNA。
7.如權(quán)利要求5所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體,其特征在于,所述的survivin啟動(dòng)子與miRNA串聯(lián)表達(dá)框之間還設(shè)有熒光標(biāo)記基因，在miRNA串聯(lián)表達(dá)框的下游設(shè)有抗生素篩選基因。
8.如權(quán)利要求I所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，其特征在于，所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體為pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR，該載體是在pMD19_T載體的Amp和ori之間依次連接五個(gè)串聯(lián)的低氧反應(yīng)元件HRE5、CMV增強(qiáng)子Enhancer、survivin啟動(dòng)子、GFP和miRNA表達(dá)框架。
9.如權(quán)利要求8所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，其特征在于，所述的pMD-HRE5-Enhancer-SURV/EmGFP-miR 載體的核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 4 所示。
10.權(quán)利要求I或8所述的增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增強(qiáng)型腫瘤特異性治療載體，該載體包括厭氧反應(yīng)元件和survivin啟動(dòng)子，在survivin啟動(dòng)子的上游還設(shè)有CMV增強(qiáng)子。該載體在survivin promoter和厭氧反應(yīng)元件(HRE)的雙調(diào)控的基礎(chǔ)上，通過CMV增強(qiáng)子的調(diào)控提高載體在腫瘤中的表達(dá)能力，并進(jìn)一步考慮腫瘤的多靶點(diǎn)治療，提高腫瘤治療的特異性和靶向性。
文檔編號A61P35/00GK102618577SQ20121007257
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者劉利英, 宋土生, 許德暉, 黃辰 申請人:西安交通大學(xué)