專(zhuān)利名稱：共刺激因子在癌癥治療方面的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及共刺激因子在癌癥治療方面的新用途，特別是B7. I-Fc的新用途。
背景技術(shù)：
肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種，人們?nèi)粘Ｕf(shuō)的肝癌指的多是原發(fā)性肝癌。原發(fā)性肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬(wàn)，居惡性腫瘤的第五位。原發(fā)性肝癌按細(xì)胞分型可分為肝細(xì)胞型肝癌、膽管細(xì)胞型肝癌及混合型肝癌。按腫瘤的形態(tài)可分為結(jié)節(jié)型、巨塊型和彌漫型。原發(fā)性肝癌在我國(guó)屬于高發(fā)病，一般男性多于女性。中國(guó)是乙肝大國(guó)，我國(guó)的肝癌多在乙肝肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，丙肝病人也在逐漸增加，乙肝后也會(huì)發(fā)展為肝癌。目前我國(guó)發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，占全球肝癌病人的55%，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康和生命的一大殺手，其危險(xiǎn)性不容小視。然而，對(duì)于肝癌目前的治療仍與一般腫瘤治療方案一致，均采用化療放療，常規(guī)放化療基本不具備針對(duì)腫瘤的特異性，放化療在破壞癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生殺傷作用，從而對(duì)人體產(chǎn)生很大的毒副作用，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)的破壞，放化療后易引起多種并發(fā)癥而且腫瘤易復(fù)發(fā)，常規(guī)放化療的特點(diǎn)造成腫瘤治療的療效和預(yù)后都不是很理想，目前腫瘤免疫治療成為一種較為安全有效的方式。腫瘤免疫治療是直接或間接利用自身的免疫系統(tǒng)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、清除腫瘤細(xì)胞的方法，腫瘤免疫治療機(jī)理與其它治療手段相比，具有作用特異性高、范圍廣泛、 毒副作用小等特點(diǎn)。B7. I-Fc是免疫刺激因子融合蛋白(Aihong Liu, Peisheng Hu ；Clin Cancer Res 2005 ； 11 (23) December 1，2005，8492-8502)，它是由 CD80 胞外部分融合在人 Ig抗體恒定區(qū)的Fc片段N-端構(gòu)成的融合蛋白，目前已經(jīng)報(bào)道的B7. I-Fc中，F(xiàn)C來(lái)自于免疫球蛋白IgG，特別是IgGl。B7. I-Fc融合蛋白在宿主的APC細(xì)胞將腫瘤抗原信息遞呈給體內(nèi)腫瘤免疫殺傷細(xì)胞的同時(shí)，共刺激因子B7. 1與CD^結(jié)合激活T細(xì)胞，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生系列免疫攻擊，達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。同時(shí)B7. I-Fc融合蛋白不僅能與CD^結(jié)合， 激活T細(xì)胞，也可與CTLA-4結(jié)合，終止T細(xì)胞的激活途徑，從而避免出現(xiàn)T-細(xì)胞的過(guò)度激活。B7. I-Fc融合蛋白的這種雙重作用，大大增強(qiáng)了以B7. I-Fc融合蛋白開(kāi)發(fā)的抗腫瘤藥物的安全可控性。據(jù)有關(guān)研究報(bào)道免疫共刺激因子融合蛋白B7. I-Fc作為一種腫瘤免疫治療藥物，其在結(jié)腸癌、乳腺癌、纖維肉瘤癌具有一定的治療效果(CN200580042109. 0)。目前，還未見(jiàn)將共刺激因子B7. 1及B7. 1融合蛋白用于治療肝癌的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供共刺激因子B7. 1及B7. 1融合蛋白的新用途。本發(fā)明提供了共刺激因子B7. 1及B7. 1融合蛋白在制備治療肝癌、肉瘤或黑色素瘤的藥物中的用途。其中，所述的B7. 1融合蛋白是B7. l_Fc。
進(jìn)一步地，B7. I-Fc是融合到IgG Fc上的B7. 1。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述IgG為IgGl。進(jìn)一步地，所述的藥物是治療肝癌、肉瘤的藥物。進(jìn)一步地，所述的藥物是治療肝癌的藥物。其中，所述的藥物是以共刺激因子B7. 1或B7. 1融合蛋白為有效成分，加上藥學(xué)上常用的輔料制備而成的制劑。進(jìn)一步地，所述的制劑為注射劑。根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)換算可知，所述的制劑中，每日用單位制劑中B7. I-Fc的含量為 192-384ug免疫共刺激因子融合蛋白B7. 1-Fc，特別是B7. 1/IgGl Fe，能夠有效抑制肝癌或肉瘤的生長(zhǎng)，特別是針對(duì)肝癌具有顯著的治療活性，其治療作用與陽(yáng)性藥物相當(dāng)，為臨床用藥提供了一種新的選擇。


圖1SDS-PAGE確認(rèn)表達(dá)的B7. I-Fc的分子量譜圖，其中，1為非還原的B7. I-Fc圖譜、2為還原的B7. I-Fc圖譜、3為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記物；圖2B7. I-Fc給藥后H22荷瘤鼠體重變化圖;3B7. I-Fc對(duì)小鼠肝癌(H22)腫瘤抑制作用圖4B7. I-Fc給藥后S180荷瘤鼠體重變化圖5B7. I-Fc對(duì)小鼠肉瘤(S 180)腫瘤抑制作用圖6B7. I-Fc給藥后B16-F10荷瘤鼠體重變化圖7B7. I-Fc對(duì)小鼠黑色素瘤(B16-F10)腫瘤抑制作用
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明中B7. I-Fc的制備利用基因重組技術(shù)制備B7. I-Fc融合蛋白，按照生物領(lǐng)域技術(shù)人員熟知方法，通過(guò)PCR技術(shù)獲得構(gòu)建B7. I-Fc表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入小鼠骨髓瘤NSO細(xì)胞篩選獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白B7. I-Fc的工程細(xì)胞，然后通過(guò)流加培養(yǎng)獲得高表達(dá)的B7. I-Fc培養(yǎng)上清，然后再通過(guò)蛋白A親和層析和離子交換層析依次純化獲得高純度融合蛋白，4°C保存。本發(fā)明中B7. I-Fc的制備方法可以參照CN200580042109. 0中的制備方法，所述 B7. I-Fc是指B7. 1/IgGl Fe，即B7. 1和IgGl Fc的融合蛋白，其序列表參見(jiàn)Aihong Liu, Peisheng Hu ；Clin Cancer Res 2005 ； 11 (23)December 1，2005，8492—8502。將制備得到的B7. I-Fc測(cè)定分子量，測(cè)定圖譜見(jiàn)圖1 ；實(shí)施例2免疫共刺激因子融合蛋白B7. I-Fc藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1、受試樣品及劑量設(shè)計(jì)名稱免疫共刺激因子融合蛋白B7. 1/IgGlFc (簡(jiǎn)稱B7. I-Fc)按實(shí)施例1制備提供者軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病學(xué)研究所性狀無(wú)色、澄清液體保存條件4°C保存
給藥途徑尾靜脈注射溶劑生理鹽水2、陽(yáng)性對(duì)照注射用環(huán)磷酰胺；紫杉醇3、腫瘤細(xì)胞株小鼠肝癌H22、小鼠肉瘤S180、小鼠黑色素瘤B16-F10，均可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)市售商品得到4、動(dòng)物BALB/c小鼠，SPF/VAF級(jí)由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號(hào) SCXK (京)2009-00045、飼養(yǎng)設(shè)施條件中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障設(shè)施，許可證號(hào) SYXK (京)2009-00046、實(shí)驗(yàn)方法(1)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及接種小鼠肝癌H22、小鼠肉瘤S180、小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞體外培養(yǎng)至相當(dāng)數(shù)量。 消化、洗滌、離心，計(jì)數(shù)細(xì)胞，配制細(xì)胞密度為5X106/ml細(xì)胞懸液。小鼠局部消毒后側(cè)背部接種，注射體積0. Iml/只。(2)給藥劑量及給藥方式每日觀察腫瘤生長(zhǎng)變化，于接種后4天確認(rèn)腫瘤生長(zhǎng)時(shí)，將荷瘤鼠按瘤體積大小隨機(jī)分組。設(shè)陰性對(duì)照組，腫瘤自然生長(zhǎng)；陽(yáng)性對(duì)照組為注射用環(huán)磷酰胺、紫杉醇給藥組， 按人用劑量折算，小鼠以lOOmg/kg—1劑量，視腫瘤生長(zhǎng)情況間斷腹腔注射給藥；融合蛋白 B7. I-Fc按照SOdOJOug/kg—1三個(gè)劑量尾靜脈給藥，每天1次，連續(xù)5天。每組小鼠15只， 并與當(dāng)日全部給藥。(3)觀察指標(biāo)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每2-3日監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤長(zhǎng)、寬徑，計(jì)算體積。分別參見(jiàn)圖3、5、7。 本發(fā)明中采用相對(duì)腫瘤增殖率T/c(% )作為試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)，用以評(píng)價(jià)藥物的抗腫瘤活性， 計(jì)算方法參見(jiàn)《細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。同時(shí)，還為各種荷瘤小鼠稱重，以便確認(rèn)B7. I-Fc對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)，參見(jiàn)圖2、4、6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)B7. I-FC對(duì)小鼠腫瘤肝癌H22腫瘤生長(zhǎng)抑制作用表1B7. I-Fc對(duì)H22腫瘤生長(zhǎng)抑制作用
權(quán)利要求
1.共刺激因子B7.1及B7. 1融合蛋白在制備治療肝癌、肉瘤或黑色素瘤的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的B7.1融合蛋白是B7. I-Fc0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于B7.I-Fc是融合到IgGFc上的B7. 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述IgG為IgGl。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療肝癌、肉瘤的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療肝癌的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述的藥物是以共刺激因子 B7. 1或B7. 1融合蛋白為有效成分，加上藥學(xué)上常用的輔料制備而成的制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述的制劑為注射劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了B7.1及B7.1融合蛋白在制備治療肝癌、肉瘤或黑色素瘤的藥物中的用途。免疫共刺激因子融合蛋白B7.1-Fc，特別是B7.1/IgG1 Fc，能夠有效抑制肝癌或肉瘤的生長(zhǎng)，特別是針對(duì)肝癌具有顯著的治療活性，其治療作用與陽(yáng)性藥物相當(dāng)，且比陽(yáng)性藥物安全性更好，為臨床用藥提供了一種新的選擇。
文檔編號(hào)A61K38/19GK102526708SQ20121001486
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者彭紅衛(wèi), 徐小萍, 曹路君, 楊偉, 羅天學(xué), 趙斌, 陳春會(huì), 陳知航, 雒蓬軼 申請(qǐng)人:天津博發(fā)生物技術(shù)有限公司, 成都博發(fā)生物技術(shù)有限公司, 西藏天行生物藥業(yè)有限公司