基于來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞前期抗原的瘧疾疫苗的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用作瘧疾疫苗的多肽或其片段。其還涉及編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子。其進(jìn)一步涉及包含這些多肽或其片段或核酸分子、特別是這些多肽或其片段的組合的組合物，以及這些組合物作為瘧疾疫苗的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞前期抗原的瘧疾疫苗
[0001]本發(fā)明涉及用作瘧疾疫苗的多肽或其片段。其還涉及編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子。其進(jìn)一步涉及包含這些多肽或其片段或核酸分子、特別是這些多肽或其片段的組合的組合物，以及這些組合物作為瘧疾疫苗的用途。
[0002]發(fā)明背景
瘧疾是感染性疾病，通過(guò)來(lái)自瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)的感染性子孢子經(jīng)由瘧蚊叮咬的接種傳播。全球目前估計(jì)每年有5億瘧疾病例，并且在流行地區(qū)，如撒哈拉以南的非洲每年在1-3百萬(wàn)人中感染是致命的。受影響最嚴(yán)重的是5歲以下的兒童，其中疾病包括幾種綜合癥，例如急性呼吸疾病，嚴(yán)重貧血或腦型瘧疾。導(dǎo)致人類(lèi)瘧疾最嚴(yán)重的形式的寄生蟲(chóng)，惡性瘧原蟲(chóng){Plasmodium falciparum)的生命周期是復(fù)雜的和多方面的，具有宿主組織內(nèi)的局部差異和對(duì)應(yīng)差異的抗原表達(dá)的不同形態(tài)。子孢子接種后，寄生蟲(chóng)轉(zhuǎn)化并在專(zhuān)性、臨床無(wú)癥狀和單向階段中在肝臟中擴(kuò)增(Prudenco等，2006)。膜包裹的裂殖子(merozoite)(稱(chēng)為裂殖體)的包裝的釋放標(biāo)志著瘧疾的發(fā)生(Sturm等，2006)，盡管典型地通過(guò)其發(fā)燒和畏寒的循環(huán)模式被識(shí)別的瘧疾的癥狀和病理學(xué)，專(zhuān)門(mén)是在紅細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)的快速無(wú)性繁殖階段期間導(dǎo)致的(Haidar等，2007)。因此，只有靶向紅細(xì)胞前期的預(yù)防性治療具有預(yù)防疾病并提供有效保護(hù)的潛力。用伽馬輻射的惡性瘧原蟲(chóng)子孢子(RAS)對(duì)人和嚙齒動(dòng)物的接種是僅有的賦予基本上完全保護(hù)的實(shí)驗(yàn)性疫苗，并且是針對(duì)蚊傳播的瘧疾傳播的保護(hù)性免疫的金標(biāo)準(zhǔn)(Nussenzweig等，1967 ;Hoffman等,2002)。福射破壞寄生蟲(chóng)遺傳指令(repertoire)并且寄生蟲(chóng)停滯在肝臟中，在那里它們感染后持續(xù)至多達(dá)6個(gè)月(Silvie等，2002)。但是，這些寄生蟲(chóng)在基因上是不明確的，并且直到今天，僅限于實(shí)驗(yàn)研究中。然而，此模型提供下列原理論證(proof-of-principle):基于通過(guò)福射獲得的隨機(jī)的基因減毒,人類(lèi)中的無(wú)蟲(chóng)免疫(sterile immunity)是可能的。近期工作在嚙齒動(dòng)物模型中通過(guò)基因減毒的寄生蟲(chóng)(GAPs)已引發(fā)了無(wú)蟲(chóng)免疫(Mueller 等,2005 a/b ；van Di jk 等，2005 ;Tarun 等,2007 ;Aly等，2008 ;Silvie等，2008)。這些GAPs停滯在早期肝臟階段并賦予持續(xù)的和階段特異性的免疫(Mueller 等，2007 Jobe `等，2007)。
[0003]基于基因減毒的寄生蟲(chóng)的瘧疾接種的挑戰(zhàn)取決于將在嚙齒動(dòng)物瘧疾模型中獲得的結(jié)果到人瘧疾的轉(zhuǎn)化。這已經(jīng)通過(guò)破壞惡性瘧原蟲(chóng)中的/7公成功進(jìn)行，所述/7公是嚙齒動(dòng)物寄生蟲(chóng)基因A?命的直向同源物，最近已顯示其誘發(fā)針對(duì)子孢子引起的瘧疾的無(wú)蟲(chóng)免疫(sterilising immunity)(van Schaijk 等，2008 ;van Dijk 等，2005 ;VanBuskirk 等，2009)。賦予對(duì)減毒子孢子抗性的免疫機(jī)制被認(rèn)為是依賴(lài)于免疫系統(tǒng)的體液和細(xì)胞武器兩者。細(xì)胞凋亡的RAS感染的肝細(xì)胞導(dǎo)致瘧原蟲(chóng)抗原到樹(shù)突細(xì)胞的遞呈，有可能引發(fā)賦予保護(hù)的免疫應(yīng)答(Leiriao等，2005)?；旧希颜J(rèn)為保護(hù)依賴(lài)于作為細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞的⑶8+ T細(xì)胞(White等，1996 ； Bongfen等，2007)和為抗體和最佳記憶⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性提供幫助的⑶4+ T細(xì)胞(Carvalho等，2002)。無(wú)蟲(chóng)免疫在不存在⑶8+ T細(xì)胞的情況下可以獲得，其僅僅由⑶4+ T細(xì)胞和II類(lèi)效應(yīng)機(jī)制介導(dǎo)(Oliveira等，2008)。有趣的是，已經(jīng)描述了最近發(fā)表的模型，其中磷酸伯氨喹，一種專(zhuān)門(mén)靶向瘧原蟲(chóng)肝臟階段的藥物，不存在對(duì)這樣的CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答必不可少的持續(xù)的代謝活躍肝臟階段的情況下，已經(jīng)被用于在體內(nèi)引發(fā)針對(duì)隨后的子孢子誘導(dǎo)的嚙齒動(dòng)物瘧疾的疫苗樣保護(hù)性免疫(Putrianti等，2009)。并且，野生型寄生蟲(chóng)連同預(yù)防化學(xué)治療(例如氯喹)的使用導(dǎo)致對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的保護(hù)性免疫(Roestenberg等，2009)。然而，已表明，長(zhǎng)期持續(xù)的RAS的形式經(jīng)由MHC I類(lèi)遞呈寄生蟲(chóng)抗原，其誘導(dǎo)被感染的肝細(xì)胞的基于IFN-Y的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生(Klotz等，1995)。環(huán)子孢子蛋白(CSP)，子孢子主要的表面蛋白，歷來(lái)被認(rèn)為是與瘧原蟲(chóng)肝臟階段相關(guān)的主要抗原和疫苗候選。到目前已鑒定了幾個(gè)CSP衍生的T細(xì)胞表位，一些與非常高水平的保護(hù)相關(guān)，如通過(guò)用正常子孢子攻擊免疫的小鼠后肝臟階段載量的減少所測(cè)量的。RTS，S/AS02A是基于惡性瘧原蟲(chóng)CSP的紅細(xì)胞前期疫苗候選，由葛蘭素史克(GSK)和健康適用技術(shù)組織(PATH)的痕疾疫苗行動(dòng)(malaria vaccine initiative, MVI)項(xiàng)目之間合作開(kāi)發(fā)。但是，其結(jié)果相當(dāng)令人失望，具有40和60%之間的效力(Alonso等，2004 ；Alonso 等,2005 ；Bejon 等,2008, Epstein 等,2011)。這樣的部分保護(hù)表明，CSP 可能不是減毒模型中唯一的保護(hù)性抗原。的確，沒(méi)有在C57B1/6小鼠中描述的CSP表位，雖然在Balb/c中存在眾所周知并表征的T細(xì)胞表位。有趣的是，最近的研究(其采用表達(dá)異源惡性瘧原蟲(chóng)CSP的伯氏瘧原蟲(chóng)iP.berghei)寄生蟲(chóng)系)表明，無(wú)蟲(chóng)免疫可以在不存在CSP特異性免疫應(yīng)答的情況下獲得，并且得出結(jié)論，迄今尚未被表征的抗原，而不是CSP，可能被靶向以誘導(dǎo)無(wú)蟲(chóng)免疫(Griiner等等,2007 ;Mauduit等,2010)。
[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于有效瘧疾疫苗的手段。更具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的是鑒定新的肝臟階段抗原，其是保護(hù)性的(即，對(duì)免疫是關(guān)鍵的)，并從而可以用于接種。
[0005]發(fā)明概述
根據(jù)本發(fā)明，此目的通過(guò)組合物解決，所述組合物包含至少兩種多肽，所述多肽選自包含SEQ ID N0.1-18的氨基酸序列的多肽和與任何上述多肽至少80%相同的多肽，優(yōu)選進(jìn)一步選自包含SEQ ID N0.19-23的氨基酸序列的多肽和與任何上述多肽至少80%相同的多肽，或包含上述多肽的至少兩種片段。
[0006]根據(jù)本發(fā)明，此`目的通過(guò)組合物解決，所述組合物包含至少兩種核酸分子，所述核酸分子每種編碼至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽或其片段，優(yōu)選具有選自SEQ ID N0.41-63，更優(yōu)選SEQ ID N0.41-65的核苷酸序列。
[0007]根據(jù)本發(fā)明，此目的通過(guò)提供本發(fā)明的組合物解決，其用作瘧疾疫苗，優(yōu)選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
[0008]根據(jù)本發(fā)明，此目的進(jìn)一步通過(guò)包含選自SEQ ID N0.1-23的氨基酸序列的多肽，和與任何上述多肽至少80%相同的多肽，或其片段來(lái)解決，其用作瘧疾疫苗，優(yōu)選用作模擬痕疾活的減毒生物體的亞單位痕疾疫苗或多成分痕疾疫苗。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，此目的進(jìn)一步通過(guò)上述多肽的片段解決，所述片段包含或具有選自SEQ ID N0.26-36的氨基酸序列，其用作瘧疾疫苗，優(yōu)選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
[0010]根據(jù)本發(fā)明，此目的進(jìn)一步通過(guò)編碼至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽或其片段的核酸分子解決，所述核酸分子優(yōu)選具有選自SEQ ID N0.41-63的核苷酸序列，其用作瘧疾疫苗，優(yōu)選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
[0011]本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的描述
在下文更詳細(xì)的描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解此發(fā)明不限于本文所述的特定的方法學(xué)、方案和試劑，因?yàn)檫@些可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)學(xué)是僅用于描述特定的實(shí)施方案的目的，并且不意圖限制本發(fā)明的范圍，其僅被所附的權(quán)利要求所限制。除非另有說(shuō)明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意思。為了本發(fā)明的目的，所有本文引用的參考文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入。
[0012]濃度、量、和其它數(shù)值數(shù)據(jù)可以以范圍格式在本文中表達(dá)或表示。應(yīng)當(dāng)理解僅僅為了方便和簡(jiǎn)潔起見(jiàn)使用這樣的范圍格式，并且從而應(yīng)靈活解釋?zhuān)圆粌H包括作為范圍的限制明確記載的數(shù)值，還包括該范圍內(nèi)包括的所有的單個(gè)數(shù)值或子范圍，好像每個(gè)數(shù)值和子范圍都是明確記載的。作為一個(gè)例子，“至少2到23”的數(shù)值范圍應(yīng)解釋為不僅包括明確記載為2到23的值，還包括所指示的范圍內(nèi)的單獨(dú)的值和子范圍。因此，包括在此數(shù)值范圍內(nèi)的是單獨(dú)的值例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23和子范圍例如2到5，3到10，4到15，2到8，5到15，和6到10等。作為另一個(gè)例子，“5到50個(gè)氨基酸”的數(shù)值范圍應(yīng)解釋為不僅包括明確記載為5到50個(gè)氨基酸的值，還包括所指示的范圍內(nèi)的單獨(dú)的值和子范圍。因此，包括在此數(shù)值范圍內(nèi)的是單獨(dú)的值例如5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、......、49 和 50 和子范圍例如 5 到 50,8
到25，8到15，和28到40等。此同樣的原理適用于記載僅一個(gè)數(shù)值的范圍。并且，無(wú)須考慮該范圍的廣度或所描述的特征，這樣的解釋都應(yīng)當(dāng)適用。
[0013] 具有瘧疾減毒的肝臟階段(MALS)抗原的組合物
此處我們提出用于疫苗開(kāi)發(fā)的新方法，其利用寄生蟲(chóng)在肝臟階段，病理學(xué)血液階段發(fā)病前的臨床無(wú)癥狀的孵育狀態(tài)的免疫潛力。
[0014]除了在自然感染期間獲得對(duì)瘧疾的最終臨床免疫的事實(shí)之外，上文所述現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)果表明針對(duì)瘧疾的有效的疫苗原則上可以是可生產(chǎn)的。然而，盡管針對(duì)瘧疾的自然獲得性免疫被認(rèn)為是針對(duì)感染的紅細(xì)胞期，但是直到今天，只有針對(duì)紅細(xì)胞前期的疫苗已導(dǎo)致針對(duì)瘧疾感染的保護(hù)。由于輻射的子孢子(減毒的寄生蟲(chóng))難以技術(shù)性生產(chǎn)，并且鑒于基于惡性瘧原蟲(chóng)CSP的紅細(xì)胞前期疫苗候選已給出有效性令人失望的結(jié)果，新的候選疫苗抗原仍然是需要的。
[0015]發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的策略用于鑒定這些抗原?，F(xiàn)在本發(fā)明公開(kāi)了靶向肝臟中寄生蟲(chóng)的關(guān)鍵期的保護(hù)性抗原。這些新的有效的抗原分離自誘導(dǎo)保護(hù)的減毒的寄生蟲(chóng)——痕疾疫苗開(kāi)發(fā)中的新穎性一可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成疫苗原型，其通過(guò)在此重要的病理學(xué)前瓶頸處消除寄生蟲(chóng)來(lái)介導(dǎo)免疫。
[0016]最終，我們的技術(shù)可以進(jìn)一步擴(kuò)展，其通過(guò)組合本發(fā)明內(nèi)所述的最有效的紅細(xì)胞前期抗原和紅細(xì)胞抗原用于形成多成分(階段)亞單位疫苗，兩者均模擬活的減毒寄生蟲(chóng)疫苗，并模擬自然獲得性免疫的誘導(dǎo)并從而為下一代疫苗制劑的制備鋪平了道路。
[0017]如上文所述，本發(fā)明提供組合物，包含:
-新鑒定的MALS抗原(蛋白，多肽)
或
-其片段 或
-編碼它們的核酸分子。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的組合物包含多肽或編碼它們的核酸分子中的至少2種，至少3種，至少4種，至少5種，至少6種，至多達(dá)23種(至少2到23種)，例如2到5種，3到10種，4到15種，2到8種，5到15種，和6到10種。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明多肽中的至少2種，至少3種，至少4種，至少5種，至少6種，至多達(dá)23種(至少2到23)的片段，例如2到5種，3至Ij 10種，4至Ij 15種，2到8種，5到15種，和6到10種的片段。
[0020]將要選擇用于本發(fā)明組合物的蛋白或多肽是包含或具有下列氨基酸序列的蛋白或多肽
MAL13PL13(SEQ ID N0.1), (MALSj)
PFI4_§480(SEQ ID N0.2)， (MALS—B)
MAL13PL258 (SEQ ID N0.3), (MALS_C)
PF14—0435(SEQ ID N0.4), (MALS—F>
ΡΠ4—0390(SEQ ID N0.5),
PF13-0242(SEQ ID N0.6),
PFBJI68(SEQ ID N0.7%
PF11JB42/0421 (SEQ ID N0.8),
PFcOS I Sc(SEQ ID N0.9),
PFcOOSc(SEQ ID N0.10),
PF14J533(SEQ ID N0.11),
ΡΠ3—02.S2(SEQ ID N0.12),
PF10JKJ81(SEQ ID N0.13),
PFF0420c(SEQ 10 NO, 14),
PFI4JB23(SEQ ID N0.15), (MALS_Cal)
PF10J3375(SEQ ID N0.16),
PFIS—0128(SEQ ID N0.1?),
PF14_0548(SEQ ID N0.18), #11
與任何上述多肽至少80%，優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%相同的多肽。
[0021 ] 它們進(jìn)一步選自包含或具有下列氨基酸序列的蛋白或多肽

PF08_005 〗(SEQ ID NO, 19),

PFOg J?36{SEQ.1D N0.20),

PF13_0135(SEQ ID N0.21),

PF13^0343(SEQ ID N0.22),
PFEl 2?c{SEQ ID N0.23),獅
與任何上述多肽至少80%，優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%相同的多肽。[0022]對(duì)于細(xì)節(jié)，參見(jiàn)表1。
[0023]上面的登錄號(hào)是PlasmoDB/GeneDB 登錄號(hào)(www.plasmodb.0rg, version: 8.1,October 11,201 ；www.genedb.0rg, version: November,2010)。
[0024]如上文所述，本發(fā)明還提供與任何上述多肽至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%相同的多肽，或其片段。
[0025]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“百分比(%)相同的”或“百分比(%)序列同一性”指兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性。同一性可以通過(guò)比較兩個(gè)序列中的位置確定，所述位置可以進(jìn)行比對(duì)用于比較目的。當(dāng)在比較的序列中的等同位置被同樣的氨基酸占據(jù)時(shí)，認(rèn)為分子在該位置是相同的。
[0026]通常地，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道下列事實(shí)，蛋白或肽的氨基酸序列中的一些氨基酸交換對(duì)蛋白或肽的(二級(jí)或三級(jí))結(jié)構(gòu)、功能和活性根本不具有任何影響。與本文公開(kāi)的氨基酸序列相比具有該“中性”氨基酸交換的氨基酸序列落入本發(fā)明的范圍。還包括的是在初始氨基酸序列中的突變，其允許或促進(jìn)在不同于惡性瘧原蟲(chóng)的生物體，例如大腸桿菌中多肽或其片段的產(chǎn)生。
[0027]優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包含至少兩種多肽，其選自包含或具有SEQ ID N0.1-23的氨基酸序列的多肽或與SEQ ID N0.1-23中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽或其一種或多種片段。
[0028]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含 -惡性瘧原蟲(chóng)Ferlin，
-惡性痕原蟲(chóng)Ferlin樣蛋白和/或 -另一種惡性瘧原蟲(chóng)包含C2結(jié)構(gòu)域的蛋白，或 -或其片段。
[0029]惡性瘧原蟲(chóng)FerlinO0/ FER ；PF14_0530)具有SEQ ID N0.24的氨基酸序列，惡性瘧原蟲(chóng)Ferlin樣蛋白{Pf FLP ；MAL8P1.134)具有SEQ ID N0.25的氨基酸序列。
[0030]本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種多肽，所述多肽包含或具有選自下列的氨基酸序列
PF14—0530(SEQ ID N0.24), (MALS—E),
MaWPi J34(SEQ ID N0.25), (MALS_G)} ||1
與SEQ ID N0.24和25的任何氨基 酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
[0031]優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包含至少兩種多肽，所述多肽選自包含或具有SEQ IDN0.1-25的氨基酸序列的多肽或與SEQ ID N0.1_25中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽或其一種或多種片段。
[0032]-優(yōu)選的組合物
本發(fā)明的優(yōu)選的組合物包含下列中的至少兩種:MAL13P1.13(SEQ ID N0.1),(MALSmA),
PF14 JMM(SEQ ID N0.2),(MALS_B)s
MALI 3P1,258(SEQ ID N0.3),(MALS^C)i
PF14^0435(SEQ ID Nd 4%(MALS—F),
和與SEQ ID N0.1到4中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
[0033]本發(fā)明的優(yōu)選的組合物包含下列中的至少兩種:
MAL13P1.13(SEQ ID NO, I),(MALS_A)f
PF14^0480(SEQ ID N0.2),(MALS_B),
MALI3P1258 (SEQ ID N0.3),(MALS^C)1
ΡΠ.4—0435(SEQ ID N0.4),(MALS_F),
PF14 JJ530(SEQ ID NO, 24),(MALS—E),
Pf 14 JB23(SEQ ID N0.15),(MALS—CM)
和與SEQ ID N0.1到4、15或24中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
[0034]-片段
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含本發(fā)明的多肽的片段。
[0035]優(yōu)選地，本發(fā)明的一種或多種多肽、即包含或具有SEQ ID N0.1_23(或SEQ IDN0.1-25)的氨基酸序列的多肽的片段，包含多肽的至少一個(gè)抗原決定簇或表位。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原決定簇或表位的氨基酸序列具有至少8個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，片段具有至少8個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段或肽具有在5到50個(gè)氨基酸、優(yōu)選地8到25個(gè)氨基酸、更優(yōu)選地8到15個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段或肽具有在28到40個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的長(zhǎng)度。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原決定簇或表位是⑶8+ T細(xì)胞表位，⑶4+ T細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位，優(yōu)選地⑶8+ T細(xì)胞表位。優(yōu)選地，⑶8+ T細(xì)胞表位是惡性瘧原蟲(chóng)特異性的⑶8+T細(xì)胞表位，例如HLA-A 0201-限制的CD8+ T細(xì)胞表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在給定的氨基酸序列中如何鑒定/預(yù)測(cè)CD8+ T細(xì)胞表位，例如通過(guò)表位預(yù)測(cè)程序，例如SYFPEITHI(http://www.syfpeith1.de)。
[0038]在優(yōu)選的(至少兩種片段的)組合物中，片段選自包含或具有下列氨基酸序列的片段SLICGLYLL(SEQ ID NO, 26),|MALS—A 的片段h
ILYSLMINSL(SEQ ID NO, 27},(MALS_A _片段)，
LICGLYLLTL(SEQ ID N0.28), ‘4 的片段
VLLEKI_ I《SEQID N0.29),(MALS^B _ IV段)，
YLSPNFINKI(SEQ ID N0.30),<MALS_B f 段),
ILHGGVYRL(SEQ I:D N0.3-1).(MA LSJ:的 J j.段
ILFLFILSI(SEQ FDN0.32),(MALSJ:的打段)，
LLFINEINKL(SEQ ID N0.33),(>1 ALS^C lWilll),
SLISLYIYYV(SEQ ID N0.34).<MALS^F 的iV 段
FLLLML￥SI(SEQ ID N0.35),(MALS—F ft幻 V段
樹(shù)或
FLTLMARKL(SEQ ID NO‘ 36)iMALS^CiI fj J Vlt)。
[0039]它們可以進(jìn)一步選自包含或具有下列氨基酸序列的片段
NLLDPLVW(SEQ ID N0.37),<MALS—E 的J丨―段},
LLLEGH FYL(SEQ ID NO, 38),《MALS—E 的 f1.段)，
KLIPVNYEL(SEQ ID N0.39), Ml|MALS_E 的.片段卜
推域
1LIPSLPLI(SEQ ID N0.40)(MALSj:的)V段>。
[0040]在優(yōu)選的(至少兩種片段的)組合物中，片段選自MALS_A (SEQ ID N0.1)、MALS_B (SEQ ID N0.2)、MALS_C (SEQ ID N0.3)、MALS_F (SEQ ID N0.4)和任選地 MALS_Cal(SEQ ID N0.15)和 MALS_E (SEQ ID N0.24)的片段。
[0041]下列片段的混合物/合并物(抗原的肽合并物)是優(yōu)選的:
MALS_A 的片段SEQ ID N0.26 到 28，
MALS_B 的片段SEQ ID N0.29 和 30，
MALS_C 的片段SEQ ID N0.31 至Ij 33，
MALS_F 的片段SEQ ID N0.34 和 35，
MALS_Cal 的片段SEQ ID N0.36，
MALS_E 的片段SEQ ID N0.37 到 40。
[0042]優(yōu)選的組合物包含含有或具有下列氨基酸序列的片段 SEQ ID N0.26 到28，和 / 或
SEQ ID N0.29 和 30，和 / 或 SEQ ID N0.31 到 33，和 / 或 SEQ ID N0.34 和 35，和 / 或 優(yōu)選地進(jìn)一步 SEQ ID N0.36，和 / 或SEQ ID N0.37 到 40。
[0043]在TO 2011/066995中還公開(kāi)了 FerliruFerlin樣蛋白和其它包含C2結(jié)構(gòu)域蛋白的抗原片段用于瘧疾疫苗的用途。
[0044]-修飾
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種多肽或其一種或多種片段包含一種或多種進(jìn)一步的成分，例如一種或多種標(biāo)記，一種或多種N-和/或C-末端修飾，一種或多種進(jìn)一步藥物或試劑。技術(shù)人員將能夠選擇合適的進(jìn)一步的成分。
[0045]-編碼本發(fā)明的一種或多種多肽的核酸分子
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子。
[0046]優(yōu)選的核酸分子具有選自SEQ ID N0.41-63或SEQ ID N0.41-65的核苷酸序列。
[0047]優(yōu)選的本發(fā)明的組合物包含至少兩種核酸分子，所述核酸分子每個(gè)編碼至少一種本發(fā)明的多肽或其片段，其優(yōu)選具有選自SEQ ID N0.41-63，更優(yōu)選SEQ ID N0.41-65的核苷酸序列。
[0048]核酸分子可以是分離的核酸分子、包含它們的質(zhì)粒、包含它們的表達(dá)構(gòu)建體，例如用于DNA疫苗的表達(dá)系統(tǒng)。
[0049]-組合物的進(jìn)一步成分
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含 -載體 和/或 -佐劑。
[0050]在一個(gè)實(shí)施方案中，載體融合到一種或多種多肽或其一種或多種片段或編碼它們的一種或多種核酸分子(即，如上文所述組合物的成分)上。
[0051]在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是病毒顆?；蚱洳糠?，病毒載體或病毒顆粒的包膜蛋白，納米載體。
[0052]在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒顆粒是乙型肝炎病毒顆?；蚱洳糠帧?br> [0053]在這樣的實(shí)施方案中，載體，例如乙型肝炎病毒顆?；蚱洳糠?，適合用于多肽或其片段的肝臟靶向。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方案中，納米載體是細(xì)胞靶向的納米載體，例如可以從RodosBioTarget GmbH, Hannover (www.biotargeting.0rg)獲得的細(xì)胞祀向的納米載體，例如TargoSphere?遞送系統(tǒng)。這些納米載體可以與所希望的多肽或其片段組合并且特異性地導(dǎo)向至抗原遞呈免疫細(xì) 胞(像APCs，DCs,巨噬細(xì)胞等)。
[0055]在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑通常引發(fā)⑶8 T細(xì)胞應(yīng)答。優(yōu)選地，佐劑是可商購(gòu)獲得的佐劑系統(tǒng)，例如IC31 (Intercell company, Vienna)，因?yàn)樽魟┫到y(tǒng)引發(fā)CD8 T細(xì)胞應(yīng)答而非抗體介導(dǎo)的免疫。
[0056]組合物作為瘧疾疫苗的用途
如上文所述，本發(fā)明提供用作瘧疾疫苗的組合物。
[0057]組合物優(yōu)選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
[0058]相比于基于減毒的全生物體的疫苗(活的減毒疫苗)，“亞單位疫苗”由分別的病原體的至少一種成分(蛋白，蛋白片段)組成。[0059]“多成分疫苗”指包含分別的病原體的超過(guò)一種成分(蛋白，蛋白片段)的疫苗，其優(yōu)選地來(lái)自不同的發(fā)育和疾病誘導(dǎo)的生命周期階段(多成分(_階段)疫苗)。
[0060]“模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位疫苗”指衍生自誘導(dǎo)保護(hù)的減毒的瘧疾肝臟階段寄生蟲(chóng)的免疫原性蛋白成分的最小組合。
[0061]如上文所討論，本發(fā)明提出用于疫苗開(kāi)發(fā)的新方法，其利用寄生蟲(chóng)在肝臟階段，病理學(xué)血液階段發(fā)病前的臨床無(wú)癥狀的孵育狀態(tài)的免疫潛力。
[0062]本文公開(kāi)并新鑒定的保護(hù)性抗原靶向肝臟中寄生蟲(chóng)的關(guān)鍵期。這些新的確認(rèn)的抗原分離自誘導(dǎo)保護(hù)的減毒的寄生蟲(chóng)——瘧疾疫苗開(kāi)發(fā)中的新穎性一可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成疫苗原型，其通過(guò)在此重要的病理學(xué)前瓶頸處消除寄生蟲(chóng)來(lái)介導(dǎo)免疫。
[0063]本發(fā)明可以進(jìn)一步擴(kuò)展，其通過(guò)組合本發(fā)明所述的最有效的紅細(xì)胞前期抗原和紅細(xì)胞抗原用于形成多成分(階段)亞單位疫苗，兩者均模擬活的減毒寄生蟲(chóng)疫苗，并模擬自然獲得性免疫的誘導(dǎo)并從而為下一代疫苗制劑的制備鋪平了道路。
[0064]MALS抗原、片段、核酸分子作為用于瘧疾疫苗的目標(biāo)
如上文所述，本發(fā)明進(jìn)一步`提供多肽，所述多肽包含或具有選自下列的氨基酸序列:
【權(quán)利要求】
1.包含至少兩種多肽的組合物，所述多肽選自包含下列氨基酸序列的多肽:
MAL13P1.0(SEQIDN0.1),
PFl4JMTO(SEQ 10 N0.2),
MALI 3P1.258(SEQ ID N0.3),
PF14JM35(SEQ ID NO, 4),
PFMJBW(SEQ ID N0.5),
PF13—0242(SEQ ID N0.6),
PF13_016i(SEQ ID N0.1),

PF11 —0342/0421(SEQ ID NO, 8),
PFc0515c(SEQ [DNa 9), PFcOl 35c(SEQ ID N0.10)T PF 14^0533(SEQ ID NO, 11), PF13—0282(SEQ ID N0.12), PFIOJJCWI(SEQ I—D N0.13)s PFF0420c(SEQ ID N0.14), PFI4 J323(SEQ ID N0.15), PF10JB75(SEQ ID N0.16).PHlJH28(SEQ ID N0.17), PF14_0548(SEQ ID N0.18), Hi 與任何上述多肽至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%相同的多肽， 或包含至少兩種上述多肽的片段的組合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步選自包含下列氨基酸序列的多肽，或其片段: PFOg J)051(SEQ ID N0.19), PFOS J)036(SEQ IB N0.20), PF BJM 35(SEQ ID N0.21), PFl 3—0343(SEQ 10 NCX 22), PFE1260c(SEQ ID N0.23), fli 與任何上述多肽至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%相同的多肽。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，進(jìn)一步包含惡性瘧原蟲(chóng)Ferlin、惡性瘧原蟲(chóng)Ferlin樣蛋白和/或另一種惡性瘧原蟲(chóng)包含C2結(jié)構(gòu)域蛋白，或其片段，如包含選自下列的氨基酸序列的一種或多種多肽: PF 14_0530(SEQ ID N0.24), MaWPLl34(SEQIDN0.25), ill與SEQ ID N0.24和25中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少兩種多肽選自包含SEQIDN0.1-23、優(yōu)選SEQ ID N0.1-25的氨基酸序列的多肽，或與SEQ ID N0.1-23、優(yōu)選SEQ IDN0.1-25中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一丨丨生的多肽,或其一種或多種片段。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的組合物，其包含所述多肽中的至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至多達(dá)23種或包含所述多肽中的至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至多達(dá)23種的片段。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物，其包含下列中的至少兩種:MALI3P1.0 (SEQ IDN0.1),PF14 JMgO(SEQ ID N0.2).MAL13P1.258 (SEQ ID N0.3),PF14JM35(SEQ ID N0.4), 和與SEQ ID N0.1到4中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其包含下列中的至少兩種:MAL13PL13 (SEQ ID N0.1),PFi4JMSO(SEQ ID N0. 2),MALBPL25S (SEQ ID N0.3),PF14—0435(SEQ ID N0.4)TPF14_0530(SEQ ID N0.24),Pfl4_0323(SEQ ID N0.15), 和與SEQ ID N0.1到4、15或24中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其包含所述多肽的片段，其中具有SEQIDN0.1-23的氨基酸序列的多肽的片段包含所述多肽的至少一個(gè)抗原決定簇或表位，并且，優(yōu)選地，具有至少8個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述抗原決定簇或表位是CD8+T細(xì)胞表位、CD4+ T細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位，優(yōu)選CD8+ T細(xì)胞表位。
10.權(quán)利要求8或9的組合物，其中所述片段選自包含或具有下列氨基酸序列的片段:SLICGLYLL(SEQ ID N0.26),
ILYSLMINSL(SEQ ID N0.27),
LICGLYLLTL(SEQ ID N0.28),
VLLEKINVI(SEQ ID N0.29),
YLSPNFINKI(SEQ ID N0.30),
ILHGGVYRL(SEQ ID N0.31),
ILFLFILSI(SEQ ID N0.32),
LLFIWEINKL(SEQ ID N0.33),
SLISLYIYYV(SEQ ID N0.34),FLLLMLVSI(SEQ ID N0.35),.HI域
FLTLMARKL(SEQ ID N0.36)， 優(yōu)選地進(jìn)一步選自包含或具有下列氨基酸序列的片段
NLLDFLWV(SEQ ID N0.3?)?
LLLEGN FYL(SEQ ID N0.38),KLIPVNYEL(SE`Q ID N0.39), Hi/it ILIFSLPL1<SEQ ID N0.40)。
11.權(quán)利要求10的組合物，其包含含有或具有下列氨基酸序列的片段: SEQ ID N0.26 到 28，和 / 或 SEQ ID N0.29 和 30，和 / 或 SEQ ID N0.31 到 33，和 / 或 SEQ ID N0.34 和 35，和 / 或 優(yōu)選地進(jìn)一步包含含有或具有下列氨基酸序列的片段: SEQ ID N0.36，和 / 或 SEQ ID N0.37 到 40。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述多肽或其片段包含一種或多種進(jìn)一步的成分，如一種或多種標(biāo)記，一種或多種N-和/或C-末端修飾，一種或多種進(jìn)一步藥物或一種或多種試劑。
13.組合物，包含至少兩種核酸分子，所述核酸分子每種編碼至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的多肽或其片段，優(yōu)選具有選自SEQ ID N0.41-63、更優(yōu)選SEQ ID N0.41-65的核苷酸序列。
14.權(quán)利要求13的組合物，其包含所述核酸分子中的至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至多達(dá)23種。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，進(jìn)一步包含載體和/或佐劑。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述載體是病毒顆粒或其部分，病毒載體或病毒顆粒的包膜蛋白，納米載體。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述病毒顆粒是乙型肝炎病毒顆?；蚱洳糠?。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中所述納米載體是細(xì)胞靶向的納米載體。
19.權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的組合物，其中所述佐劑通常引發(fā)⑶8T細(xì)胞應(yīng)答，如IC31。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其用作瘧疾疫苗，優(yōu)選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
21.包含選自SEQID N0.1_23的氨基酸序列的多肽，和與任何上述多肽至少80%、優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90%、甚至更優(yōu)選地至少95%相同的多肽， 或其片段， 其用作瘧疾疫苗，優(yōu)選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
22.權(quán)利要求21的多肽的片段，包含或具有選自SEQID N0.26-36的氨基酸序列，其用作瘧疾疫苗，優(yōu)選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
23.核酸分子，其編碼至少一種根據(jù)權(quán)利要求21或22的多肽或其片段，優(yōu)選具有選自SEQ ID N0.41-63的核苷酸序列， 其用作瘧疾疫苗，優(yōu)選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
【文檔編號(hào)】A61K39/015GK103491979SQ201180066346
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月6日
【發(fā)明者】J.普法伊爾, K.海斯, A-K.米勒 申請(qǐng)人:馬爾瓦有限責(zé)任公司