專利名稱：一種絲素蛋白多孔材料及其制備方法和組織工程支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及材料技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種絲素蛋白多孔材料及其制備方法和組織工程支架。
背景技術(shù)：
各種疾病所引起的細胞和組織的缺損或衰竭已經(jīng)成為影響人類健康的主要問題， 通過外來介質(zhì)促進或者引導細胞和組織再生逐漸成為解決上述問題的有效方法。其中，選擇合適的組織工程支架材料作為細胞和組織再生的載體是再生醫(yī)學領(lǐng)域的核心問題，因此，支架材料的性能對于組織缺損的治療具有重要的意義。組織修復所用的支架材料要求具有優(yōu)異的細胞和組織相容性，能夠誘導細胞分化和促進正常組織的再生。目前組織修復中使用的高分子類生物材料包括合成高分子材料和天然高分子材料，合成高分子材料主要是聚乳酸等脂肪族聚酯材料，盡管其在力學性能和降解性等方面都基本上能滿足支架材料的應用，但在生物相容性等方面存在諸多不足，其降解產(chǎn)物對生物體存在不良影響，作為長期使用的體內(nèi)植入材料存在很多需要解決的關(guān)鍵問題。與合成高分子材料相比，天然高分子材料由于具有優(yōu)異的生物相容性逐漸成為組織修復中的研究熱點和重要方向。作為一種天然高分子材料，絲素蛋白材料是從天然蠶絲和蛛絲等原料中提取的高分子纖維蛋白，具有良好的生物相容性、獨特的力學性能和藥物緩釋載體作用等，可作為細胞黏附生長的理想支架材料應用于各種組織工程中。在多年的應用中，相關(guān)研究人員發(fā)現(xiàn)，絲纖維和絲素蛋白由于自身的優(yōu)異的生物相容性、機械性能和可降解性，有更多的潛力應用于臨床修復和組織工程支架及作為改性材料。其中，絲素蛋白的結(jié)晶形態(tài)主要有絲素 I (Silk I)和絲素 II (Silk II)兩種。目前，對于絲素蛋白多孔材料的制備與應用已是材料學家研究的熱點。現(xiàn)有技術(shù)中，采用絲素蛋白制備三維多孔支架的方法包括鹽析法、氣體發(fā)泡法、冷凍干燥法、 靜電紡絲法以及相分離法等。例如，Ung-Jin Kim等發(fā)表在“biomaterial”雜志上的 “Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds，，以及Yun ffang等于2010 年發(fā)表白勺"The synergistic effects of 3-D porous silkfibroin matrix scaffold properties and hydrodynamic environment in cartilagetissue regeneration，，中涉及絲素蛋白多孔支架材料的制備與應用，但均未對絲素蛋白的結(jié)晶結(jié)構(gòu)、納米結(jié)構(gòu)進行調(diào)控， 使之在各個領(lǐng)域上的應用受到限制。公開號為CN1844509A的中國專利文獻報道了一種絲素蛋白多孔結(jié)構(gòu)材料的制備方法，采用靜電紡絲制備多孔支架，但其孔徑較小，同時也難以獲得復雜結(jié)構(gòu)的多孔支架。公開號為CN101703795A的中國專利文獻報道了一種納米磷酸三鈣絲蛋白復合三維多孔材料的制備方法，介紹了鹽析法制備絲素蛋白多孔支架的方法， 由于該技術(shù)方案中需要使用濃鹽溶液，因此所得絲素蛋白多孔支架不利于藥物的載入；同時由于所獲得支架的二級結(jié)構(gòu)為高含量的絲素Π結(jié)構(gòu)，降解性能無法調(diào)控。此外，現(xiàn)有技術(shù)中，公開號為CN101502669A的中國專利文獻報道了絲素蛋白多孔三維支架及其制備方法，采用冷凍干燥法制備三維支架，避免了有機溶劑使用，但其支架孔隙率不高，存在分離片狀結(jié)構(gòu)。近年來，隨著仿生科學的發(fā)展，支架材料的納米結(jié)構(gòu)的設計逐漸受到研究者的廣泛重視，同普通支架材料相比，同細胞外基質(zhì)相似的納米纖維結(jié)構(gòu)能夠更好的促進組織再生，得到更有效的修復效果。本發(fā)明人考慮，提供一種絲素蛋白多孔材料的制備方法，該方法制備的絲素蛋白多孔材料具有納米纖維結(jié)構(gòu)，孔隙率較高。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種絲素蛋白多孔材料及其制備方法和組織工程支架，該方法制備的絲素蛋白多孔材料具有納米纖維結(jié)構(gòu)，孔隙率較高。為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種絲素蛋白多孔材料的制備方法，包括以下步驟將絲素蛋白水溶液干燥成絲素蛋白膜，將所述絲素蛋白膜溶解于水中；重復干燥-溶解過程，得到絲素蛋白納米線水溶液；將所述絲素蛋白納米線水溶液進行冷凍干燥，得到絲素蛋白材料前驅(qū)體；將所述絲素蛋白材料前驅(qū)體進行醇處理、真空水處理或拉伸處理，干燥后得到絲素蛋白多孔材料。優(yōu)選的，所述絲素蛋白水溶液按照如下方法制備將蠶絲脫膠、溶解、透析，得到絲素蛋白水溶液。優(yōu)選的，所述絲素蛋白水溶液干燥的環(huán)境濕度為1 95%。優(yōu)選的，所述絲素蛋白水溶液干燥成絲素蛋白膜的成膜時間為1 48小時。優(yōu)選的，所述干燥-溶解過程的重復次數(shù)為2 8次。優(yōu)選的，得到絲素蛋白納米線水溶液后還包括將所述絲素蛋白納米線水溶液在0 6°C條件下放置5 96小時。優(yōu)選的，所述醇處理采用的醇為甲醇、乙醇、丁醇、正丁醇和丙醇中的一種或幾種。優(yōu)選的，所述醇處理和真空水處理的時間分別為0. 5 M小時。相應的，本發(fā)明還提供一種上述制備方法制備的絲素蛋白多孔材料。相應的，本發(fā)明還提供一種上述絲素蛋白多孔材料形成的組織工程支架。本發(fā)明提供一種絲素蛋白多孔材料的制備方法，包括以下步驟將絲素蛋白水溶液干燥成絲素蛋白膜，將所述絲素蛋白膜溶解于水中；重復干燥-溶解過程，得到絲素蛋白納米線水溶液；將所述絲素蛋白納米線水溶液進行冷凍干燥，得到絲素蛋白材料前驅(qū)體； 將所述絲素蛋白材料前驅(qū)體進行醇處理或真空水處理，干燥后得到絲素蛋白多孔材料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用絲素蛋白的自組裝行為對納米結(jié)構(gòu)進行調(diào)控，即，由于在多次干燥-溶解過程中，絲素蛋白水溶液內(nèi)部的納米球結(jié)構(gòu)自組裝成納米線結(jié)構(gòu)，從而有效抑制了片狀結(jié)構(gòu)的形成，制備的絲素蛋白多孔材料具有納米纖維結(jié)構(gòu)，孔隙率較高。


圖1為本發(fā)明實施例1制備的絲素蛋白納米線水溶液的原子力顯微鏡圖；圖2為本發(fā)明實施例1制備的絲素蛋白多孔材料的掃描電鏡圖片；
圖3為本發(fā)明實施例1 3制備的絲素蛋白多孔材料的紅外光譜圖；圖4為本發(fā)明實施例6制備的溶膜液的粒徑圖譜。
具體實施例方式下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明公開了一種絲素蛋白多孔材料的制備方法，包括以下步驟將絲素蛋白水溶液干燥成絲素蛋白膜，將所述絲素蛋白膜溶解于水中；重復干燥-溶解過程，得到絲素蛋白納米線水溶液；將所述絲素蛋白納米線水溶液進行冷凍干燥，得到絲素蛋白材料前驅(qū)體；將所述絲素蛋白材料前驅(qū)體進行醇處理、真空水處理或拉伸處理，干燥后得到絲素蛋白多孔材料。在上述制備過程中，本發(fā)明以絲素蛋白水溶液為原料，利用絲素蛋白的自組裝行為對納米結(jié)構(gòu)進行調(diào)控，經(jīng)多次干燥-溶解過程后冷凍干燥，然后經(jīng)醇處理、真空水處理或拉伸處理后得到絲素蛋白多孔材料。按照本發(fā)明，所述絲素蛋白水溶液可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備，優(yōu)選按照如下方法制備將蠶絲脫膠、溶解、透析，得到絲素蛋白水溶液。具體的，上述制備的絲素蛋白水溶液的步驟為將蠶絲在Na2CO3溶液中煮20 IOOmin以去除蠶絲外部的絲膠蛋白，利用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲烘干，得到脫膠蠶絲；將所述脫膠蠶絲溶解于LiBr溶液中，透析后得到絲素蛋白水溶液。本發(fā)明采用的絲素蛋白水溶液的濃度與絲素蛋白納米線水溶液中納米線含量有一定的關(guān)系，從而影響最終制備的絲素蛋白多孔材料的自身性能，例如，絲素蛋白溶液濃度越高，干燥-溶解過程次數(shù)越少，從而納米線含量越少；絲素蛋白溶液濃度越低，則導致絲素蛋白多孔材料的整體綜合性能較差。本發(fā)明采用的絲素蛋白水溶液的質(zhì)量分數(shù)優(yōu)選為 0. 1 10%，更優(yōu)選為1 10%，更優(yōu)選為2 8%。本發(fā)明對上述干燥-溶解的過程中的溫度并無特別限制，該溫度優(yōu)選為0 60°C， 更優(yōu)選為10 50°C，更優(yōu)選為20 30°C，即干燥-溶解的過程在室溫下進行即可。為了保證使絲素蛋白水溶液內(nèi)部的納米球結(jié)構(gòu)能夠充分轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米線結(jié)構(gòu)，所述絲素蛋白水溶液干燥成絲素蛋白膜的成膜時間優(yōu)選為1 48小時，更優(yōu)選為10 M小時。所述絲素蛋白水溶液干燥的環(huán)境濕度優(yōu)選為1 95%，更優(yōu)選為10 80%，更優(yōu)選為20 60%。上述絲素蛋白溶液濃度、成膜溫度和成膜時間相互影響，具體為絲素蛋白溶液濃度越高以及成膜溫度過高，絲素蛋白膜的可溶性次數(shù)越少，導致最后絲素蛋白納米線水溶液中的納米線含量越少，產(chǎn)物的成孔性有一定的降低；另一方面，成膜時間過長，導致溶解困難，影響絲素蛋白納米線水溶液中的納米線含量，導致絲素蛋白多孔材料的成孔性較差，孔隙率較低。所述重復干燥-溶解過程具體為，將所述絲素蛋白膜溶解于水中后得到的絲素蛋白水溶液重新干燥成絲素蛋白膜，將所述絲素蛋白膜溶解于水中，即重復上述步驟。上述干燥-溶解過程的重復次數(shù)優(yōu)選為2 8次，更優(yōu)選為3 6次。在干燥-溶解過程中，絲素蛋白水溶液中的納米球自組裝成納米線結(jié)構(gòu)，從而有效抑制了片狀結(jié)構(gòu)的形成，有利于最終制備的絲素蛋白多孔材料具有較高的孔隙率。得到絲素蛋白納米線水溶液后還包括將所述絲素蛋白納米線水溶液在0 6°C 條件下放置5 96小時，目的在于使其內(nèi)部的自組裝行為反應完全，使納米球結(jié)構(gòu)充分轉(zhuǎn)化為納米線結(jié)構(gòu)。在得到絲素蛋白納米線水溶液后，將所述絲素蛋白納米線水溶液進行冷凍干燥， 使絲素蛋白納米線水溶液從液體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w狀態(tài)，并且完整干燥。經(jīng)本步驟的冷凍干燥處理后，得到干態(tài)的含納米纖維結(jié)構(gòu)的多孔絲素蛋白材料，即絲素蛋白材料前驅(qū)體。上述冷凍干燥處理步驟具體為將絲素蛋白納米線水溶液進行冷凍處理，然后真空干燥，其中， 所述冷凍處理的時間優(yōu)選為1 48小時，更優(yōu)選為5 40小時，更優(yōu)選為10 30小時； 所述冷凍處理的溫度優(yōu)選為-10 _80°C，更優(yōu)選為-20 _70°C，更優(yōu)選為-30 _60°C ； 所述真空干燥的時間優(yōu)選為1 96小時，更優(yōu)選為10 90小時，更優(yōu)選為20 80小時。另外，本發(fā)明還包括將所述多孔絲素蛋白材料進行醇處理、真空水處理或拉伸處理的步驟，其目的在于調(diào)節(jié)該絲素蛋白多孔材料的納米結(jié)晶結(jié)構(gòu)，從而獲得不同的降解性能和力學性能，以滿足不同組織再生或者不同藥物釋放的要求。所述醇處理、真空水處理或拉伸處理可以使制備的絲素蛋白多孔材料具有不溶于水等性質(zhì)。另外，通過調(diào)節(jié)醇處理或真空水處理的條件，例如醇的選擇等，可以調(diào)節(jié)制備的絲素蛋白多孔材料中的二級結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)該絲素蛋白多孔材料的納米結(jié)晶結(jié)構(gòu)，得到Silk I和/或Silk II結(jié)構(gòu)。 所述醇處理采用的醇優(yōu)選為甲醇、乙醇、丁醇、正丁醇和丙醇中的一種或幾種。具體的，上述醇處理、真空水處理或拉伸處理可以采用以下幾種優(yōu)選實施方式(1)將所述絲素蛋白材料前驅(qū)體進行真空水蒸氣處理0. 5 M小時；(2)將所述絲素蛋白材料前驅(qū)體進行真空甲醇蒸氣、乙醇蒸氣或甲醇乙醇水溶液真空蒸氣處理0. 5 M小時，甲醇和乙醇水溶液的濃度為5% -100% ； (3)將絲素蛋白材料前驅(qū)體浸泡于甲醇或者乙醇中10分鐘 M小時； (4)將絲素蛋白材料前驅(qū)體進行力學拉伸處理，拉伸后增加的長度為材料原長度的20% 300%。從上述制備方法可以看出，本發(fā)明提供了一種絲素蛋白多孔材料的制備方法，采用反復溶膜成膜技術(shù)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中絲素蛋白多孔支架材料存在的孔隙率低，微納結(jié)構(gòu)不可控等缺陷，制備得到的絲素蛋白多孔材料生物降解性好、孔隙率高、結(jié)晶結(jié)構(gòu)可調(diào)， 并具有同細胞外基質(zhì)相似的納米纖維結(jié)構(gòu)。同時，本發(fā)明所述制備過程溫和，無需任何交聯(lián)劑、制孔劑和其他毒性有機試劑，條件可控，易于產(chǎn)業(yè)化。就制備得到的絲素蛋白多孔材料而言，能提供與不同功能化組織生長相適應的力學支持，且具備良好的生物相容性，可應用于軟骨、骨、皮膚、神經(jīng)等多種組織修復及藥物緩釋的載體等。相應的，本發(fā)明還提供一種由上述方法制備的絲素蛋白多孔材料形成的組織工程支架。對于所述組織工程支架的制備，本發(fā)明并無特別限制，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行制備。為了進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。實施例1
將50g蠶絲在0. 5%的Na2CO3溶液中100°C煮60min以去除蠶絲外部的絲膠蛋白， 使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干；稱取上述處理后的脫膠蠶絲 15g溶解于IOOmL濃度為9. 3mol/L LiBr溶液中，60°C下溶解處理4小時，然后用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ；取上述溶液15ml放入聚乙烯培養(yǎng)皿中，在濕度為40%的條件下，室溫干燥成膜， 干燥時間為M小時，將獲得的絲素蛋白膜溶解于15ml的去離子水中，得到溶膜液；將所述溶膜液重新注入培養(yǎng)皿中重復上述過程，反復4次后得到絲素蛋白納米線水溶液，所述絲素蛋白納米線水溶液的原子力顯微鏡圖如圖1所示。將所述絲素蛋白納米線水溶液稀釋到2%，然后倒入聚乙烯模具中再放入_20°C 下冷凍M小時，放入凍干機干燥72小時后得到絲素蛋白材料前驅(qū)體，然后真空水處理4小時，得到不溶于水的絲素蛋白多孔材料，此絲素蛋白多孔材料主要為Silk I結(jié)構(gòu)，孔隙率達到99%以上。如圖2所示，為本實施例制備的絲素蛋白多孔材料的掃描電鏡圖片。實施例2將50g蠶絲在0.5%的Na2CO3溶液中100°C煮60min以去除蠶絲外部的絲膠蛋白， 使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干；稱取上述處理后的脫膠蠶絲 15g溶解于IOOmL濃度為9. 3mol/L LiBr溶液中，60°C下溶解處理4小時，然后用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ；取上述溶液20ml放入聚乙烯培養(yǎng)皿中，通過風機提高干燥速率，使絲素蛋白在濕度為40%條件下12小時成膜，將獲得的絲素蛋白膜溶解于20ml去離子水中，得到溶膜液； 將所述溶膜液放置4°C冰箱使之充分自組裝；48小時后取出溶膜液重新注入培養(yǎng)皿中自然成膜，反復5次后得到絲素蛋白納米線水溶液；將所述絲素蛋白納米線水溶液稀釋到2%，然后倒入聚乙烯模具中再放入_40°C 下冷凍M小時，放入凍干機干燥72小時后得到絲素蛋白材料前驅(qū)體前驅(qū)體，將其用50%的甲醇水蒸汽處理6小時，然后在去離子水中浸泡8小時，將甲醇浸泡出來，再次冷凍干燥即得到純的絲素蛋白多孔材料，孔隙率達99%以上。實施例3將50g蠶絲在0. 5%的Na2CO3溶液中100°C煮60min，以去除蠶絲外部的絲膠蛋白， 使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干；稱取上述處理后的脫膠蠶絲 15g溶解于IOOmL濃度為9. 3mol/L LiBr溶液中，60°C下溶解處理4小時，然后用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ；取上述溶液15ml放入聚乙烯培養(yǎng)皿中，在濕度為90%的條件下，室溫干燥成膜， 干燥時間為36小時，將獲得的絲素膜溶解于15ml的去離子水中，得到溶膜液；將所述溶膜液重新注入培養(yǎng)皿中重復上述過程，反復2次后得到絲素蛋白納米線水溶液；將所述絲素蛋白納米線水溶液稀釋到2%，然后倒入聚乙烯模具中再放入_20°C 下冷凍M小時，放入凍干機干燥72小時后得到絲素蛋白材料前驅(qū)體，然后真空水處理4小時，得到不溶于水的純絲素蛋白多孔材料，主要為Silk I結(jié)構(gòu)，孔隙率達到99%以上。
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分別對實施例1 3制備的絲素蛋白多孔材料進行紅外光譜分析，如圖3所示，為實施例1 3制備的絲素蛋白多孔材料紅外光譜圖，其中，a為實施例1制備的絲素蛋白多孔材料的紅外光譜圖，b為實施例2制備的絲素蛋白多孔材料的紅外光譜圖，c為實施例3 制備的絲素蛋白多孔材料的紅外光譜圖。實施例4將50g蠶絲在0. 5%的Na2CO3溶液中100°C煮60min以去除蠶絲外部的絲膠蛋白， 使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干；稱取上述處理后的脫膠蠶絲 15g溶解于IOOmL濃度為9. 3mol/L LiBr溶液中，60°C下溶解處理4小時，然后用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ； 取上述溶液15ml，放入聚乙烯培養(yǎng)皿中，在濕度為60 %的室溫條件下M小時成膜，隨后將絲素膜溶解于15ml的去離子水中，將溶膜液放置4°C冰箱使之充分自組裝，得到溶膜液；48小時后取出所述溶膜液重新注入培養(yǎng)皿中自然成膜，反復3次后得到絲素蛋白納米線水溶液；將所述絲素蛋白納米線水溶液稀釋到2%，然后倒入聚乙烯模具中再放入_20°C 下冷凍M小時，放入凍干機干燥72小時后得到絲素蛋白材料前驅(qū)體，將其用80%的甲醇處理浸泡處理1小時，然后在去離子水中浸泡20小時，將甲醇浸泡出來，再次冷凍干燥即得到純的絲素蛋白多孔材料，主要為Silk II結(jié)構(gòu)。實施例5將50g蠶絲在0. 5%的Na2CO3溶液中100°C煮60min以去除蠶絲外部的絲膠蛋白， 使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干；稱取上述處理后的脫膠蠶絲 15g溶解于IOOmL濃度為9. 3mol/L LiBr溶液中，60°C下溶解處理4小時，然后用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ；取上述溶液20ml，放入聚乙烯培養(yǎng)皿中，在風機轉(zhuǎn)動下自然成膜，然后將得到的絲素膜溶解于IOOml水中，得到溶膜液隨，重復上述成膜過程，按上述操作重復6次后，得到絲素蛋白納米線水溶液，將納米線含量在90%以上的絲素蛋白納米線水溶液放置在4°C冰箱里72小時，然后取該絲素蛋白納米線水溶液稀釋到3%，然后倒入聚乙烯模具中再放入-20°C下冷凍48 小時，放入凍干機干燥72小時后得到干態(tài)絲素蛋白多孔材料即絲素蛋白材料前驅(qū)體，最后其用10%的乙醇水蒸汽處理6小時，然后在去離子水中浸泡2小時，將殘留的少量乙醇浸泡出來，再次冷凍干燥即得到純的絲素蛋白多孔材料。實施例6將50g蠶絲在0. 5%的Na2CO3溶液中100°C煮60min以去除蠶絲外部的絲膠蛋白， 使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干；將IOg的絲素蛋白溶于IOOml 三元溶液中(CaCl2/水/乙醇摩爾比為1 8 2配成)，然后用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6%，然后調(diào)節(jié)濃度至1. 5% ；取上述溶液40ml放入聚乙烯培養(yǎng)皿中，在自然環(huán)境下成膜，48小時后將絲素膜溶解于等體積的去離子水中，然后加熱濃縮至20%后放置4°C冰箱使之充分自組裝，得到溶膜液；48小時后取出所述溶膜液重新注入培養(yǎng)皿中自然成膜，反復5次后得到含量高于 90%的絲素蛋白納米線水溶液；將所述絲素蛋白納米線水溶液稀釋到2%，然后倒入聚乙烯模具中再放入_20°C 下冷凍M小時，放入凍干機干燥72小時后得到絲素蛋白材料前驅(qū)體，真空水處理2小時后，將此支架利用拉伸裝置雙方向進行拉伸100%，即得到Silk I和Silk II結(jié)構(gòu)的納米絲蛋白多孔支架。對本實施例中不同次數(shù)得到的溶膜液的粒徑進行分析，如圖4所示，為本實施例所得溶膜液的粒徑圖譜。實施例7將50g蠶絲在0. 5%的Na2CO3溶液中100°C煮60min以去除蠶絲外部的絲膠蛋白， 使用去離子水沖洗，重復以上操作3次后將蠶絲60°C下烘干；稱取上述處理后的脫膠蠶絲 15g溶解于IOOmL濃度為9. 3mol/L LiBr溶液中，60°C下溶解處理4小時，然后用截留分子量3500的透析袋浸在去離子水中透析3天，期間每兩小時換一次水，去除溶液中的LiBr，從而得到純凈的絲素蛋白溶液，其濃度為6% ；取上述溶液20ml放入聚乙烯培養(yǎng)皿中，自然條件下成膜，M小時后將絲素膜溶解于等體積的去離子水中得到溶膜液；將所述溶膜液重新注入培養(yǎng)皿中自然成膜，反復4次后得到納米線含量不同的絲素蛋白水溶液，將4次溶膜液分別在12000rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心，達到納米結(jié)構(gòu)的分離，最后取貼壁部分溶解在去離子水中至使?jié)舛仍?%左右，然后倒入聚乙烯模具中再放入-20°C下冷凍48小時，放入凍干機干燥72小時后得到納米含量高達 95%以上的絲素蛋白多孔材料前驅(qū)體；將絲素蛋白多孔材料前驅(qū)體用30%的甲醇水蒸汽處理4小時，然后在去離子水中浸泡M小時，將甲醇浸泡出來，再次冷凍干燥即得到純的絲素蛋白多孔材料，孔隙率達 99%以上。從上述實施例可以看出，上述實施例以納米結(jié)構(gòu)高達90%的溶膜液為模版制備納米可控的絲素蛋白多孔材料，通過不同的處理方式改變二級結(jié)構(gòu)的含量，達到仿生的要求。 本實施例制備的絲素蛋白多孔材料具有優(yōu)異的多孔結(jié)構(gòu)，同時使得絲蛋白納米結(jié)構(gòu)具有可控性，實現(xiàn)從納米層次組裝設計適合不同組織再生的生物材料基體，進而切實促進絲蛋白生物材料在再生醫(yī)學中的臨床應用。本發(fā)明制備的絲素蛋白多孔材料可以應用于骨、軟骨、 韌帶、神經(jīng)、皮膚等組織修復以及藥物緩釋的載體等。對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。 對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。
權(quán)利要求
1.一種絲素蛋白多孔材料的制備方法，包括以下步驟將絲素蛋白水溶液干燥成絲素蛋白膜，將所述絲素蛋白膜溶解于水中； 重復干燥-溶解過程，得到絲素蛋白納米線水溶液； 將所述絲素蛋白納米線水溶液進行冷凍干燥，得到絲素蛋白材料前驅(qū)體； 將所述絲素蛋白材料前驅(qū)體進行醇處理、真空水處理或拉伸處理，干燥后得到絲素蛋白多孔材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述絲素蛋白水溶液按照如下方法制備將蠶絲脫膠、溶解、透析，得到絲素蛋白水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述絲素蛋白水溶液干燥的環(huán)境濕度為1 95%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述絲素蛋白水溶液干燥成絲素蛋白膜的成膜時間為1 48小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述干燥-溶解過程的重復次數(shù)為 2 8次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，得到絲素蛋白納米線水溶液后還包括將所述絲素蛋白納米線水溶液在0 6°C條件下放置5 96小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述醇處理采用的醇為甲醇、乙醇、 丁醇、正丁醇和丙醇中的一種或幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述醇處理和真空水處理的時間分別為0. 5 M小時。
9.一種權(quán)利要求1 8任意一項制備方法制備的絲素蛋白多孔材料。
10.一種權(quán)利要求9所述的絲素蛋白多孔材料形成的組織工程支架。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種絲素蛋白多孔材料的制備方法，包括以下步驟將絲素蛋白水溶液干燥成絲素蛋白膜，將所述絲素蛋白膜溶解于水中；重復干燥-溶解過程，得到絲素蛋白納米線水溶液；將所述絲素蛋白納米線水溶液進行冷凍干燥，得到絲素蛋白材料前驅(qū)體；將所述絲素蛋白材料前驅(qū)體進行醇處理或真空水處理，干燥后得到絲素蛋白多孔材料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用絲素蛋白的自組裝行為對納米結(jié)構(gòu)進行調(diào)控，即，由于在多次干燥-溶解過程中，絲素蛋白水溶液內(nèi)部的納米球結(jié)構(gòu)自組裝成納米線結(jié)構(gòu)，從而有效抑制了片狀結(jié)構(gòu)的形成，制備的絲素蛋白多孔材料具有納米纖維結(jié)構(gòu)，孔隙率較高。
文檔編號A61L27/22GK102357264SQ20111036121
公開日2012年2月22日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者呂強, 張岑岑, 林莎莎, 趙薈菁 申請人:蘇州大學