專利名稱：一種抗森林腦炎病毒馬血清的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，應(yīng)用于森林腦炎病毒抗血清的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
森林腦炎又稱蜱傳腦炎(tick-borne encephalitis, TBE)是由森林腦炎病毒 (tick-borneencephalitis virus, TBEV)引起的一種流行于北溫帶的、以侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的急性病毒性傳染病。世界范圍內(nèi)受森林腦炎病毒侵襲的國家除我國外，主要還包括德國、奧地利、匈牙利、俄羅斯及日本等近30個(gè)國家。在我國，森林腦炎主要存在三大疫區(qū)、六個(gè)自然疫源地，主要分布于我國的大、小興安嶺地區(qū)和長白山地區(qū)，在同緯度的新疆部分地區(qū)亦有分布。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化及分布地域的不同，森林腦炎病毒可以被分為三個(gè)亞型歐洲亞型(European subtype)、遠(yuǎn)東亞型(Far Eastern subtype)及西伯利亞亞型 (Siberiasubtype)。森林腦炎病毒的三個(gè)亞型在傳播媒介、致病性強(qiáng)弱、致死率高低以及預(yù)后等方面表現(xiàn)不盡相同。其中，歐洲亞型致病性相對較低，致死率約0 3. 9%，預(yù)后良好， 幾乎無嚴(yán)重的后遺癥發(fā)生。遠(yuǎn)東亞型及西伯利亞亞型致病性相對較強(qiáng)，致死率也較高，約為 20 30%，且預(yù)后不好，在未死亡病例中約有25 37%的患者會留下麻痹型后遺癥，從而喪失勞動能力，給社會及家庭造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。我國流行株為遠(yuǎn)東亞型。森林腦炎病毒在感染后采用血清療法可以防止發(fā)病或減輕癥狀。血清療法即發(fā)病 3天內(nèi)患者可用恢復(fù)期患者或林區(qū)居住多年者的血清20 40ml肌注，或椎管內(nèi)注射5 IOml。由于現(xiàn)在沒有已經(jīng)上市的抗森林腦炎血清和免疫球蛋白，血清療法使用的是人血清， 這存在感染HIV、HCV、HBV等血源性病毒的巨大風(fēng)險(xiǎn)，而且來源非常有限，不能大范圍使用。 森林腦炎目前尚無有效的治療手段，抗森林腦炎馬血清可作為暴露后預(yù)防和發(fā)病早期治療的特效藥。目前無上市的抗森林腦炎病毒馬血清。馬血清蛋白對人體來說屬異源蛋白，對人體有很強(qiáng)的致敏性。馬血清制品，常引起下列兩類過敏反應(yīng)(1)過敏性休克，在注射過程或注射后數(shù)分鐘到Ih內(nèi)患者突感胸悶、氣急、脈搏加速、血壓下降，發(fā)冷直到昏迷，重者搶救不及時(shí)，可迅速死亡。此系I型過敏反應(yīng)， 即人體曾注射或接觸過馬血清，致敏而產(chǎn)生IgE細(xì)胞抗體，固定在嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面，再注射馬血清制品時(shí)，抗原抗體相互作用，致上述細(xì)胞破裂釋放大量生物活性物質(zhì)如白三烯、組織胺等，作用于機(jī)體引起過敏。(2)血清病(serum sickness)，即注射馬血清制品后1 2周出現(xiàn)蕁麻疹、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、臉部紅腫、偶有蛋白尿、嘔吐及關(guān)節(jié)疼痛等，此系III型過敏反應(yīng)，即一次性接受較大劑量馬血清制品注射，機(jī)體產(chǎn)生的相應(yīng)IgG與體內(nèi)殘留的過敏原馬血清結(jié)合，形成可溶性循環(huán)免疫復(fù)合物。沉積于毛細(xì)血管內(nèi)壁，激活機(jī)體，引起局部炎癥所致。正常未經(jīng)免疫的馬匹體內(nèi)由于自身免疫作用會有針對不同病毒的中和抗體IgG， 但含量均很低，經(jīng)森林腦炎病毒抗原免疫的馬匹，在馬匹的血清內(nèi)會產(chǎn)生大量能夠中和抗森林腦炎病毒的中和抗體IgG，IgG由F(ab)2段和Fc段組成，其中起到中和病毒作用的成份為F(ab)2段，而Fc段會引起過敏反應(yīng)，而如何在制備抗森林腦炎馬血清的過程中、獲得高純度的針對森林腦炎病毒的特異性F(ab)2段又是十分困難的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種抗森林腦炎病毒馬血清的生產(chǎn)方法，以解決馬血清制品常引起過敏反應(yīng)的問題。本發(fā)明應(yīng)用生物反應(yīng)器技術(shù)培養(yǎng)森林腦炎病毒遠(yuǎn)東亞型“森張株”，能夠獲得高滴度的病毒收獲液，經(jīng)滅活純化，添加適合的佐劑制備免疫抗原；選擇最佳的免疫程序和采血程序，獲得高特異性、高效價(jià)的免疫血清；應(yīng)用以柱層析技術(shù)為核心的抗血清純化工藝，提高抗血清純度，增加F (ab' )2含量。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是，包括下列步驟(1)、森林腦炎毒株采用森林腦炎病毒遠(yuǎn)東亞型“森張株”；(2)、采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞，感染病毒，上罐細(xì)胞密度為1 X 106/ml，加入病毒量為1 100 200，制備病毒原液，采用β-丙內(nèi)酯滅活病毒，制備抗原，另外加入弗氏不完全佐劑；(3)、馬匹免疫程序及采血程序一個(gè)免疫采血周期為兩個(gè)月，免疫程序?yàn)?天、3 天、10天、17天、35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；采血從第15天開始靜脈采血，每隔 7天采一次，每次3000ml ；0)、血漿制備；(5)、消化、滅活；(6)、純化采用鹽析法、疏水層析法和離子交換法聯(lián)合純化。本發(fā)明步驟(6)純化中鹽析法如下第一次沉淀，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用1 2N鹽酸調(diào)節(jié) pH5. 0 5. 4，加溫至56 58°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內(nèi)降溫至40 45°C，過濾，取清液；第二次沉淀上述清液用1 2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 0 7. 4，每IOOml加硫酸銨20g， 攪拌均勻后靜止30分鐘，過濾，取沉淀；明礬沉淀，上述沉淀用水稀釋至蛋白含量為2g/L， 每IOOml加入10%明礬液6 10ml，用1 2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 7 7. 9，用0. 45um 的膜進(jìn)行澄清過濾，取清液。本發(fā)明步驟(6)純化中離子交換劑吸附法如下①用DEAE Sepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0， 0. 15MNaCl, IOmM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；②將用0. 45um的膜進(jìn)行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用PH 值為7.0，0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩沖液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質(zhì)被吸附在層析介質(zhì)上，F(xiàn)(ab' )2流穿；③用2M NaCl清洗柱體后，用20%乙醇洗柱，使介質(zhì)浸泡其中保存。本發(fā)明特點(diǎn)在于一是制備高純度的免疫抗原免疫抗原純度越高，產(chǎn)生的特異性中和抗體水平就越高，雜蛋白就越少；二是免疫原的免疫程序和采血程序免疫程序的設(shè)計(jì)是馬匹體內(nèi)能夠產(chǎn)生高水平中和抗體的關(guān)鍵，本發(fā)明的采血程序能夠獲得高水平的中和抗體；三是馬血清的純化使所采集的馬血清中獲得高純度的F(ab)2段，從而盡量降低過敏反應(yīng)發(fā)生率。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)所用森林腦炎病毒毒株為我國獨(dú)有的遠(yuǎn)東亞型，本發(fā)明所制備的抗森林腦炎病毒(遠(yuǎn)東亞型)馬血清屬國際首創(chuàng)，填補(bǔ)了我國在該領(lǐng)域的空白，處于國際領(lǐng)先水平。應(yīng)用本發(fā)明方法制備的抗森林腦炎病毒馬血清成品所含致敏源極少，經(jīng)豚鼠致敏性試驗(yàn)證明應(yīng)用本發(fā)明方法制備的抗森林腦炎病毒馬血清成品幾乎無過敏反應(yīng)發(fā)生，樣品組與生理鹽水陰性對照組無顯著性差異。表1應(yīng)用本發(fā)明方法制備10批抗森林腦炎馬血清成品的結(jié)果統(tǒng)計(jì)表
批次總蛋白質(zhì) (g/L)IgG %F(ab)2%效價(jià)(IU/ml)201105017.424.3294.54240.3201105028.133.1595.36234.56201105037.943.6494.45247.2201106046.532.5396.32216.96201106058.631.7897.42225.71201106067.364.7693.56237.06201106077.923.5295.37244.2201107088.043.1795.80236.96201107098.974.6594.02245.71201107107.363.1495.6227. 8結(jié)果顯示應(yīng)用本發(fā)明的鹽析法、疏水層析法和離子交換法聯(lián)合純化技術(shù)制備的抗森林腦炎馬血清，F(xiàn) (油)2純度高達(dá)90%以上；效價(jià)大于200IU/ml ；雜蛋白含量低，總蛋白質(zhì)含量小于10g/L，IgG含量小于5% ；會大大降低過敏反應(yīng)的發(fā)生率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1細(xì)胞非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞；森林腦炎毒株森林腦炎病毒遠(yuǎn)東亞型“森張株”；(I)Vero細(xì)胞傳代，罐培養(yǎng)，上罐細(xì)胞密度為1 X 106/ml，細(xì)胞密度達(dá)到lX107ml 時(shí)，按感染比例1 100加入森腦病毒，連續(xù)灌流收獲病毒液，免疫熒光法檢測病毒毒力；(2)抗原制備將病毒收獲液用30萬單位濾膜超濾濃縮20倍，按1 4000加入 β -丙內(nèi)酯，于4°C滅活過夜后，37°C水解2個(gè)小時(shí)，收獲樣品過4FF柱純化，收第一個(gè)吸收峰樣品，按1 1加入弗氏不完全佐劑；(3)免疫和采血一個(gè)免疫采血周期為兩個(gè)月，免疫程序?yàn)?天、3天、10天、17天、 35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；采血從第15天開始靜脈采血，每隔7天采一次，每次 3000ml ；(4)血漿制備離心4000rpm，將紅細(xì)胞和血漿分離，將分離好的血漿置4°C 2天。(5)消化、滅活將免疫血漿用蒸餾水稀釋2倍，用IN鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0，加入胃蛋白酶lmg/ml，及甲苯0.2% (ml/ml)，30°C下消化1. 5小時(shí)，終止后，60°C IOh加溫處理滅活可能污染的外源因子；(6)純化鹽析第一次沉淀，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用IN鹽酸調(diào)節(jié)PH5. 0，加溫至56°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內(nèi)降溫至40°C，過濾，取清液；第二次沉淀 上述清液用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 0，每IOOml加硫酸銨20g，攪拌均勻后靜止30分鐘， 過濾，取沉淀；明礬沉淀，上述沉淀用水稀釋至蛋白含量為2g/L，每IOOml加入10%明礬液 6ml，用1 2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 7，用0. 45um的膜進(jìn)行澄清過濾，取清液；疏水層析用Butyl Sepharose Fast Flow疏水凝膠裝柱，用高鹽PBS平衡上樣， 遞減的鹽濃度對樣品進(jìn)行洗脫；離子交換劑吸附純化①用DEAE Sepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0， 0. 15MNaCl, IOmM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；②將用0. 45um的膜進(jìn)行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用PH 值為7.0，0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩沖液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質(zhì)被吸附在層析介質(zhì)上，F(xiàn)(ab' )2流穿；③用2M NaCl清洗柱體后，用20%乙醇洗柱，使介質(zhì)浸泡其中保存；(9)濃縮、澄清及除菌過濾將穿透液采用Amicoh公司的Centricon-3-30，截留分子量30kDa的蛋白質(zhì)超濾濃縮，調(diào)整蛋白含量至170g/L，調(diào)節(jié)pH至6. 0 7. 0，用0. 22um濾膜除菌過濾。(10)分裝、包裝、成品入庫。實(shí)施例2細(xì)胞非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞；森林腦炎毒株森林腦炎病毒遠(yuǎn)東亞型“森張株”；(I)Vero細(xì)胞傳代，罐培養(yǎng)，上罐細(xì)胞密度為1 X 106/ml，細(xì)胞密度達(dá)到lX107ml 時(shí)，按感染比例1 150加入森腦病毒，連續(xù)灌流收獲病毒液，免疫熒光法檢測病毒毒力；(2)抗原制備將病毒收獲液用30萬單位濾膜超濾濃縮20倍，按1 4000加入 β -丙內(nèi)酯，于4°C滅活過夜后，37°C水解2個(gè)小時(shí)，收獲樣品過4FF柱純化，收第一個(gè)吸收峰樣品，按1 1加入弗氏不完全佐劑；(3)免疫和采血一個(gè)免疫采血周期為兩個(gè)月，免疫程序?yàn)?天、3天、10天、17天、 35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；采血從第15天開始靜脈采血，每隔7天采一次，每次 3000ml ；(4)血漿制備離心4000rpm，將紅細(xì)胞和血漿分離，將分離好的血漿置4°C 2天；(5)消化、滅活將免疫血漿用蒸餾水稀釋2 4倍，用1 2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至3. 3， 加入胃蛋白酶lmg/ml，及甲苯0. 2% (ml/ml)，30°C下消化1. 5小時(shí)，終止后，60°C IOh加溫處理滅活可能污染的外源因子。(6)純化鹽析第一次沉淀，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用1. 5N鹽酸調(diào)節(jié)pH5. 2，加溫至57°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內(nèi)降溫至42°C，過濾，取清液；第二次沉淀上述清液用1. 5N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 4，每IOOml加硫酸銨20g，攪拌均勻后靜止30分鐘，過濾，取沉淀；明礬沉淀，上述沉淀用水稀釋至蛋白含量為2g/L，每IOOml加入10%明礬液8ml，用1. 5N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 8，用0. 45um的膜進(jìn)行澄清過濾，取清液；疏水層析用Butyl Sepharose Fast Flow疏水凝膠裝柱，用高鹽PBS平衡上樣， 遞減的鹽濃度對樣品進(jìn)行洗脫；離子交換劑吸附純化①用DEAE Sepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0， 0. 15MNaCl, IOmM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；②將用0. 45um的膜進(jìn)行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用pH 值為7.0，0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩沖液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質(zhì)被吸附在層析介質(zhì)上，F(xiàn)(ab' )2流穿；③用2M NaCl清洗柱體后，用20%乙醇洗柱，使介質(zhì)浸泡其中保存；(9)濃縮、澄清及除菌過濾將穿透液采用Amicoh公司的Centricon-3-30，截留分子量30kDa的蛋白質(zhì)超濾濃縮，調(diào)整蛋白含量至17(^/1，調(diào)節(jié)？!1至6.5，用0. 22um濾膜除菌過濾。(10)分裝、包裝、成品入庫。實(shí)施例3細(xì)胞非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞；森林腦炎毒株森林腦炎病毒遠(yuǎn)東亞型“森張株”；(I)Vero細(xì)胞傳代，罐培養(yǎng)，上罐細(xì)胞密度為1 X 106/ml，細(xì)胞密度達(dá)到lX107ml 時(shí)，按感染比例1 200加入森腦病毒，連續(xù)灌流收獲病毒液，免疫熒光法檢測病毒毒力；(2)抗原制備將病毒收獲液用30萬單位濾膜超濾濃縮20倍，按1 4000加入 β -丙內(nèi)酯，于4°C滅活過夜后，37°C水解2個(gè)小時(shí)，收獲樣品過4FF柱純化，收第一個(gè)吸收峰樣品，按1 1加入弗氏不完全佐劑；(3)免疫和采血一個(gè)免疫采血周期為兩個(gè)月，免疫程序?yàn)?天、3天、10天、17天、 35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；采血從第15天開始靜脈采血，每隔7天采一次，每次 3000ml ；(4)血漿制備離心4000rpm，將紅細(xì)胞和血漿分離，將分離好的血漿置4°C 2天；(5)消化、滅活將免疫血漿用蒸餾水稀釋4倍，用2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至3. 6，加入胃蛋白酶lmg/ml，及甲苯0.2% (ml/ml)，30°C下消化1. 5小時(shí)，終止后，60°C IOh加溫處理滅活可能污染的外源因子；(6)純化鹽析第一次沉淀，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用2N鹽酸調(diào)節(jié)PH5. 4，加溫至58°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內(nèi)降溫至45°C，過濾，取清液；第二次沉淀 上述清液用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 4，每IOOml加硫酸銨20g，攪拌均勻后靜止30分鐘， 過濾，取沉淀；明礬沉淀，上述沉淀用水稀釋至蛋白含量為2g/L，每IOOml加入10%明礬液 10ml，用2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 9，用0. 45um的膜進(jìn)行澄清過濾，取清液；疏水層析用Butyl Sepharose Fast Flow疏水凝膠裝柱，用高鹽PBS平衡上樣， 遞減的鹽濃度對樣品進(jìn)行洗脫；離子交換劑吸附純化
①用DEAE Sepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0， 0. 15MNaCl, IOmM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；②將用0. 45um的膜進(jìn)行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用pH 值為7.0，0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩沖液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質(zhì)被吸附在層析介質(zhì)上，F(xiàn)(ab' )2流穿；③用2M NaCl清洗柱體后，用20%乙醇洗柱，使介質(zhì)浸泡其中保存；(9)濃縮、澄清及除菌過濾將穿透液采用Amicoh公司的Centricon-3-30，截留分子量30kDa的蛋白質(zhì)超濾濃縮，調(diào)整蛋白含量至170g/L，調(diào)節(jié)pH至6. 0 7. 0，用0. 22um濾膜除菌過濾。(10)分裝、包裝、成品入庫。試驗(yàn)例1免疫程序和采血程序的確定(1)目的通過小鼠試驗(yàn)，應(yīng)用免疫熒光法測定抗森林腦炎病毒中和抗體，從而確定免疫程序和采血日期。(2)原理本試驗(yàn)的試驗(yàn)動物為小白鼠，邊免疫邊采血測定小鼠體內(nèi)抗森林腦炎病毒中和抗體的產(chǎn)生水平，找到恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，摸索最佳免疫程序，以及采血時(shí)間。(3)動物18g 22g小白鼠，30只。(4)儀器設(shè)備熒光顯微鏡、超凈工作臺、離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、4°C冰箱等。(5)材料96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、抗森林腦炎病毒血清參考品、Vero細(xì)胞、抗森林腦炎病毒熒光抗體(自制)、玻璃毛細(xì)管、2ml注射器、森林腦炎抗原液(自制)、一次性乳膠手套等。(6)方法第0天免疫，小鼠頸部皮下免疫0. 2ml/只，第3天加強(qiáng)免疫一針；第二天開始采血用于中和抗體檢測，持續(xù)采血，分離血清測定中和抗體。如下表2
權(quán)利要求
1.一種抗森林腦炎病毒馬血清的生產(chǎn)方法，其特征在于包括下列步驟(1 )、森林腦炎毒株采用森林腦炎病毒遠(yuǎn)東亞型“森張株”；(2)、采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞，感染病毒，上罐細(xì)胞密度為1X 106/ml，加入病毒量為1 :10(Γ200，制備病毒原液，采用β-丙內(nèi)酯滅活病毒，制備抗原，另外加入弗氏不完全佐劑；(3)、馬匹免疫程序及采血程序一個(gè)免疫采血周期為兩個(gè)月，免疫程序?yàn)镺天、3天、10 天、17天、35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；采血從第15天開始靜脈采血，每隔7天采一次，每次3000ml ；(4)、血漿制備；(5)、消化、滅活；(6)、純化采用鹽析法、疏水層析法和離子交換法聯(lián)合純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗森林腦炎病毒馬血清的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(6)純化中鹽析法如下第一次沉淀，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用廣2N鹽酸調(diào)節(jié) ρΗ5· 0 5· 4，加溫至56 58°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內(nèi)降溫至4(T45°C，過濾，取清液；第二次沉淀上述清液用廣2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. (Γ7. 4，每IOOml加硫酸銨20g，攪拌均勻后靜止30分鐘，過濾，取沉淀；明礬沉淀，上述沉淀用水稀釋至蛋白含量為2g/L，每IOOml 加入10%明礬液6 10ml，用廣2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. Π. 9，用0. 45um的膜進(jìn)行澄清過濾，取清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗森林腦炎病毒馬血清的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(6)純化中離子交換劑吸附法如下①用DEAESepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0，0. 15M NaCl, IOmM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡；②將用0.45um的膜進(jìn)行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用PH值為 7. 0,0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩沖液洗柱，流速為;3ml/min，收集穿透液，酸性雜質(zhì)被吸附在層析介質(zhì)上，F(xiàn) (ab’)2流穿；③用2MNaCl清洗柱體后，用20%乙醇洗柱，使介質(zhì)浸泡其中保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗森林腦炎病毒馬血清的制備方法，屬于生物制品領(lǐng)域。應(yīng)用森林腦炎病毒遠(yuǎn)東亞型“森張株”；高純度的免疫抗原的制備，免疫采血周期為兩個(gè)月，免疫程序?yàn)?天、3天、10天、17天、35天，采用鹽析法、疏水層析法和離子交換法聯(lián)合純化技術(shù)，可獲得高純度的F(ab)2段。生產(chǎn)出的抗血清具有高品質(zhì)，成品效價(jià)不低于200IU/ml，總蛋白質(zhì)含量不高于10g/L，F(xiàn)(ab')2含量不低于90%，IgG含量不高于5%，且經(jīng)豚鼠致敏性試驗(yàn)證實(shí)幾乎不引起豚鼠的過敏反應(yīng)。
文檔編號A61K35/16GK102335198SQ20111030944
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者丁麗麗, 井偉東, 劉巖, 姜文波, 崔文廣, 李宇輝, 楊屹, 苑志剛, 苗麗, 蔡月紅, 郭秀俠 申請人:長春生物制品研究所有限責(zé)任公司