專(zhuān)利名稱(chēng)：抗病毒化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及某些栗籽豆精胺酯(castanospermine esters)在治療由黃病毒引起的疾病，尤其在治療由丙型肝炎病毒(HCV)引起的疾病中的用途。
背景技術(shù)：
黃病毒黃病毒類(lèi)(黃病毒科)包含黃病毒屬，瘟病毒屬和Hepacivirus屬，還包括許多人體疾病及給畜牧業(yè)帶來(lái)重大損失的多種動(dòng)物疾病的誘發(fā)劑。
黃病毒科(這里稱(chēng)它的成員為黃病毒)包括黃病毒屬(例如黃熱病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒和森林腦炎病毒)，瘟病毒屬(例如牛病毒性腹瀉病毒，典型豬霍亂病毒和邊緣(border)病病毒)，Hepacivirus屬(丙型肝炎病毒)和黃病毒科一些仍未分類(lèi)的成員(例如GB病毒A、B和C型)。
國(guó)際病毒分類(lèi)學(xué)委員會(huì)詳細(xì)規(guī)定了黃病毒科成員的完整名單(現(xiàn)在承認(rèn)的病毒分類(lèi)規(guī)則見(jiàn)于《病毒分類(lèi)學(xué)》《病毒分類(lèi)和命名》，《國(guó)際病毒分類(lèi)學(xué)委員會(huì)第七次報(bào)告》(書(shū))。M.H.V.van Regenmortel，C.M.Fauquet，D.H.L.Bishop，E.B.Carstens，M.K.Estes，S.M.Lemon，J.Maniloff，M.A.Mayo，D.J.McGeoch，C.R.Pringle，R.B.Wickner(2000)?！恫《痉诸?lèi)學(xué)》，《國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第七次報(bào)告》.Academic Press，SanDiego)，這里引用相關(guān)內(nèi)容作為參照。
然而，最值得注意的黃病毒可能要數(shù)丙型肝炎病毒(HCV)。1989年首次鑒定出HCV，之后逐漸發(fā)現(xiàn)它與許多輸血后非甲、非乙型肝炎的產(chǎn)生有直接關(guān)系。HCV導(dǎo)致慢性肝病，現(xiàn)在被視為的最常見(jiàn)的傳染病之一，世界衛(wèi)生組織確認(rèn)有170,000,000人受HCV病毒長(zhǎng)期感染。HCV感染導(dǎo)致85％的感染者成為長(zhǎng)期的攜帶者，而大約20-30％的感染者會(huì)發(fā)展為肝硬化和末期肝病，這些病常因?yàn)楦渭?xì)胞癌化而變得復(fù)雜。
關(guān)于HCV的研究經(jīng)常受到阻礙，因?yàn)樵摬《静荒芡ㄟ^(guò)細(xì)胞培養(yǎng)有效繁殖。然而，在缺少合適的細(xì)胞培養(yǎng)體系來(lái)進(jìn)行人體HCV病毒的復(fù)制時(shí)，BVDV成為了可接受的細(xì)胞培養(yǎng)模型。HCV和BVDV有著很高的本地蛋白同源性，共同的復(fù)制策略和可能相同的病毒外殼在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的定位。
HCV是屬于黃病毒科的一種被膜正鏈RNA病毒，但是分類(lèi)上則屬于Hepacivirus屬。HCV基因組有一條單獨(dú)的長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框，該框編碼了一個(gè)含～3000個(gè)氨基酸殘基的聚合蛋白。該聚合蛋白被共轉(zhuǎn)譯與轉(zhuǎn)譯后加工為至少十種不同的產(chǎn)物，其中包括兩個(gè)N-末端糖基化蛋白質(zhì)E1和E2。
HCV基因組在5’和3’末端攜帶有非轉(zhuǎn)譯區(qū)(NTRs)以形成穩(wěn)定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。5’NTR攜帶一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入部位(IRES)，允許在ORF起始密碼子的鄰近部位直接結(jié)合核糖體。這種HCV的RNA轉(zhuǎn)譯受IRES的介導(dǎo)，優(yōu)于細(xì)胞mRNA常用的CAP依賴(lài)型機(jī)制。
在聚合蛋白中，分裂得到的產(chǎn)品排序如下核(C)，被膜蛋白1(E1)，E2，p7，非結(jié)構(gòu)性蛋白2(NS2)，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B。核蛋白是一種高度基礎(chǔ)的RNA，它結(jié)合蛋白形成病毒粒子的主要成分。被膜蛋白E1和E2是高度糖基化的1型膜蛋白，通過(guò)C末端固定。他們嵌入病毒粒子的脂膜，聯(lián)接形成穩(wěn)定的雜二聚體。分裂產(chǎn)品p7是一種功能未知的小的疏水縮氨酸。非結(jié)構(gòu)性蛋白涉及到病毒的復(fù)制和蛋白酶(NS2/NS3)、解旋酶(NS3)、RNA聚合酶活性(NS5B)。
與宿主細(xì)胞的結(jié)合可能需要E2或E1/E2復(fù)合體與細(xì)胞表面接受器交互作用。
由于缺少有效的細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)制體系，對(duì)HCV顆粒裝配過(guò)程的了解非常有限。然而，缺少多糖聚合體，缺少表達(dá)后HCV糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的定位，缺少這些細(xì)胞表面蛋白，這正提示了最初病毒粒子的形態(tài)形成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)囊發(fā)芽開(kāi)始的。需要補(bǔ)充的是，成熟的E1和E2雜二聚體離不開(kāi)ER，且ER保留信號(hào)在E1和E2的C末端被識(shí)別出來(lái)。這種情況下病毒將通過(guò)構(gòu)成的秘密通道輸出。與設(shè)想相符，在部分純化的病毒粒子表面發(fā)現(xiàn)了N末端聯(lián)接多聚糖復(fù)合體，這提示病毒是通過(guò)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的。
到目前為止，僅有α干擾素(IFN-α)被證實(shí)有益于HCV感染的治療。使用IFN-α進(jìn)行治療時(shí)，有近50％的患者顯示出療效，但是療效大部分不能維持，而且還存在相當(dāng)多并發(fā)的副作用。最近聯(lián)用IFN-α與核苷類(lèi)似物病毒唑進(jìn)行治療取得了很大的成功，但是接下來(lái)的研究需要找出新的治療備用藥，它們應(yīng)當(dāng)有更強(qiáng)的抗病毒作用和較少的嚴(yán)重的副作用。
因此，需要總體上改善抗黃病毒藥，尤其是抗HCV藥。
糖蛋白和病毒發(fā)展根據(jù)糖與蛋白質(zhì)中氨基酸的聯(lián)接鍵，糖蛋白被分為兩大類(lèi)。研究最多、最廣泛的是蛋白質(zhì)的天冬酰氨酸和低聚糖的N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基之間的N-糖苷鍵。與N末端聯(lián)接的低聚糖，在聯(lián)接在多肽骨架上之后，就在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中受一系列特殊的酶的催化而起反應(yīng)，該反應(yīng)途徑的特點(diǎn)已被很好地標(biāo)記出來(lái)。
在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，α-葡萄糖苷酶I與末端α-1，2葡萄糖殘基從前體低聚糖上的切除有關(guān)，α-葡萄糖苷酶II切除兩個(gè)保留α-1，3鏈接的葡萄糖殘基，優(yōu)先于在甘露糖苷酶作用下切除甘露糖殘基和涉及各種轉(zhuǎn)移酶的深加工反應(yīng)。這些低聚糖“整理”反應(yīng)能使糖蛋白正確折疊并與鈣網(wǎng)膜蛋白和鈣網(wǎng)蛋白等侶伴蛋白交互反應(yīng)以便通過(guò)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)。
該生物合成途徑的關(guān)鍵酶抑制劑，尤其是那些阻礙α-葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶抑制劑，已經(jīng)顯示出阻止幾種被膜病毒復(fù)制的效果。這一類(lèi)抑制劑通過(guò)干擾病毒被膜糖蛋白的折疊起作用，因此也阻止了最初病毒與宿主細(xì)胞的交互反應(yīng)或隨后的融合。它們也可能通過(guò)阻止構(gòu)建完成病毒外殼所需的合適的糖蛋白來(lái)阻止病毒復(fù)制。
例如，有報(bào)道說(shuō)非特異性糖基化反應(yīng)抑制劑2-去氧-D-葡萄糖和β-羥基-正纈氨酸能抑制HIV糖蛋白的表達(dá)，阻礙多核體的形成(Bloughet al.，Biochemical and Biophysical Research Communications，141(1)，33-38(1986))。受HIV病毒感染的細(xì)胞用這些藥治療后病毒停止繁殖，原因大概是無(wú)法獲得病毒被膜形成所需的糖蛋白。
在另一篇報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)了糖基化反應(yīng)抑制劑2-去氧-2-氟-D-甘露糖能阻止病毒被膜的糖基化反應(yīng)，對(duì)受流感病毒感染的細(xì)胞表現(xiàn)出抗病毒活性(McDowell et al.，Biochemistry，24(27)，8145-52(1985))。該報(bào)道還研究了2-去氧葡萄糖和2-去氧-2-氟葡萄糖的抗病毒活性，還發(fā)現(xiàn)它們各自抑制病毒蛋白糖基化反應(yīng)的機(jī)理不同。
Lu et al.(1995)證實(shí)N末端糖基化對(duì)乙肝病毒的分泌是必需的(Virology 213660-665)同時(shí)Block et al.(1994)顯示人體乙肝病毒分泌物受到亞氨基糖N-丁基脫氧野尻霉素的抑制(PNAS912235-2239)。也可參見(jiàn)WO 99/29321。
Taylor etal.(1988)證明使用栗籽豆精胺或其它植物生物堿治療后細(xì)胞巨化病毒傳染性的損失，并指出這與abberant糖蛋白合成有關(guān)(Antiviral Res.1011-26)。也可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,0004,746。
Taylor等人(1994)表示用6-O-丁?；踝讯咕芬种铺堑鞍准庸っ傅摩?葡萄糖苷酶I對(duì)人免疫缺陷病毒感染的T-細(xì)胞有作用(Antimicrob.Ag.Chemother.381780-1787)，而Sunkara等人(1989)描述栗籽豆精胺類(lèi)似物的抗-HIV活性(Lancet II 1206)。也參見(jiàn)US專(zhuān)利5,0004,746。
美國(guó)專(zhuān)利5,385,911揭示了特定栗籽豆精胺酯的抗皰疹活性。
然而，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多其它已知糖基化反應(yīng)抑制劑沒(méi)有抗病毒活性。這樣總的來(lái)說(shuō)糖蛋白抑制劑對(duì)被膜病毒的抗病毒活性尤其是抗黃病毒活性是不可預(yù)知的。
葡萄糖苷酶抑制劑栗籽豆精胺和特定的亞氨基糖，比如脫氧野尻霉素(DNJ)，是ERα-葡萄糖苷酶抑制劑，均能有效抑制早期的糖蛋白加工。然而，他們的效果依據(jù)所應(yīng)用的系統(tǒng)而完全不同，可能表現(xiàn)出完全不一樣的特異性，相比較而言，栗籽豆精胺對(duì)α-葡萄糖苷酶I更有針對(duì)性。
栗籽豆精胺是一種生物堿，最初從由栗籽豆屬種分離出來(lái)，它具有以下結(jié)構(gòu)式 按系統(tǒng)命名，該化合物可以被命名為[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇，或[1S，(1S，6S，7R，8R，8αR)-1，6，7，8-四羥基-吲嗪或1，2，4，8-四脫氧-1，4，8-氮基-L-甘油基-D-半乳辛八醇。在下面的討論中使用術(shù)語(yǔ)“栗籽豆精胺”或第一個(gè)系統(tǒng)命名。
Branza-Nichita et al.(2001)J.Virol 75(8)3527-3536表明亞氨基糖N-丁基脫氧野尻霉素對(duì)BVDV有抗病毒效果。然而，作者清楚表明使用α-葡萄糖苷酶抑制劑會(huì)影響B(tài)VDV和其它被膜病毒的生命周期，且由于這種影響關(guān)鍵要依賴(lài)病毒蛋白使用的特殊折疊方式，而不能推及其它病毒。
Courageot et al.(2000)J.Virol.74(1)564-572報(bào)道說(shuō)α-葡萄糖苷酶抑制劑栗籽豆精胺和DNJ減少體外小鼠模型的登革熱病毒的產(chǎn)量。然而，沒(méi)有報(bào)道表明亞氨基糖抑制劑DNJ和栗籽豆精胺之間在活性上有大的差異。
WO99/29321揭示了α-葡萄糖苷酶抑制劑一般(尤其是與亞氨基糖一起)用于其它如HCV感染的治療。然而，沒(méi)有明確涉及到栗籽豆精胺(或酯或它的衍生物)在這方面的用途。相反，文章關(guān)注的是各種亞氨基糖的活性。
Choukhi et al.(1998)J.Virol.72(5)3851-3858報(bào)道了栗籽豆精胺對(duì)HCV糖蛋白和它們的侶伴蛋白間交互反應(yīng)的影響。栗籽豆精胺不是終止HCV糖蛋白和它們的侶伴蛋白鈣網(wǎng)膜蛋白與鈣網(wǎng)蛋白間的交互反應(yīng)。相反，栗籽豆精胺實(shí)際上增強(qiáng)了糖蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的聯(lián)接。作者建議HCV糖蛋白化反應(yīng)可能對(duì)糖蛋白整理抑制劑不夠敏感(比如栗籽豆精胺)，包括…HCV糖蛋白在鈣網(wǎng)膜蛋白和鈣網(wǎng)蛋白上的聯(lián)接和釋放可能與N末端多聚糖的整理沒(méi)有關(guān)系。盡管存在相反的教導(dǎo)，本發(fā)明仍令人吃驚地發(fā)現(xiàn)了特定的栗籽豆精胺酯確實(shí)展示出對(duì)黃病毒科某些成員(包括HCV)的抗病毒活性。此外，還發(fā)現(xiàn)它的治療指數(shù)超出預(yù)期，遠(yuǎn)優(yōu)于其它亞氨基糖類(lèi)α-葡萄糖苷酶抑制劑(酯表現(xiàn)出更高的活性和更低的副作用)。不是想和什么理論掛鉤，我們推定栗籽豆精胺酯這些意想不到的特性可能反應(yīng)出它們對(duì)一類(lèi)特殊糖蛋白反應(yīng)酶的相對(duì)特異性(即α葡萄糖苷酶I)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種黃病毒感染者的治療方法，包括在需要的時(shí)候給予患者一定有效量的栗籽豆精胺酯，其結(jié)構(gòu)如下 其中R，R1，R2各自獨(dú)立地是H，C1-14鏈烷?；珻1-14鏈烯?；?，環(huán)己烷羰基，C1-8烷氧乙?；?， 可以被甲基或鹵素任意取代的萘羰基；苯基(C2-6鏈烷?；?其中苯基可被甲基或鹵素任意取代；可以被甲基或鹵素任意取代的吡啶羰基；可以被C1-10烷基任意取代的二氫吡啶羰基；可以被甲基或鹵素任意取代的硫代苯羰基；或者可以被甲基或鹵素任意取代的呋喃羰基；Y是H，C1-4烷基，C1-4烷氧基，鹵素，三氟甲基，C1-4烷磺?；?，C1-4烷巰基，氰基或二甲胺基；Y’是氫，C1-4烷基，C1-4烷氧基，鹵素或聯(lián)合Y形成3，4-亞甲二氧基；Y”是H，C1-4烷基，C1-4烷氧基，或鹵素；所選的R，R1和R2中至少一個(gè)，最多兩個(gè)是H；或藥學(xué)上可接受的鹽或它們的衍生物。
優(yōu)選的是，R，R1和R2各自獨(dú)立地是H，C1-10鏈烷?；?，C1-10鏈烯酰基，C1-8烷氧乙酰基，和其中Y是H，C1-4烷基，C1-4烷氧基，鹵素，三氟甲基，C1-4烷磺?；?，C1-4烷巰基，氰基和二甲胺基；Y’是H，C1-4烷基，C1-4烷氧基，鹵素或聯(lián)合Y形成3，4-亞甲二氧基；Y”是H，C1-4烷氧基或鹵素；所選的R，R1和R2中至少一個(gè)，最多兩個(gè)是H。
R，R1和R2各自獨(dú)立地是H，C1-8鏈烷?；?，C1-8鏈烯酰基，C1-8烷氧乙?；?，或者是可以被一個(gè)烷基或鹵素任意取代的苯甲?；?；所選的R，R1和R2中至少一個(gè)，最多兩個(gè)是H。
R，R1和R2各自獨(dú)立地是H，C1-8鏈烷?；?，C1-8鏈烯?；?，C1-8烷氧乙?；蛘呤强梢员灰粋€(gè)甲基，溴，氯或氟類(lèi)任意取代的苯甲?；凰x的R，R1和R2中至少一個(gè)，最多兩個(gè)是H。
在優(yōu)選的實(shí)例中，栗籽豆精胺酯具有表1所示結(jié)構(gòu)。
在MDL29270中R1是 在全部其它結(jié)構(gòu)中R1是H
母核 更加優(yōu)選的是栗籽豆精胺酯，其中R1是一個(gè)C1-8鏈烷?；?，C1-10鏈烯酰基，C1-8烷氧乙?；?，或者是可以被一個(gè)烷基或鹵素類(lèi)任意取代的苯甲酰基。
R1可以是一個(gè)C1-8鏈烷?；?，C1-8鏈烯?；?，C1-8烷氧乙?；?，或者是可以被一個(gè)甲基，溴，氯或氟類(lèi)任意取代的苯甲酰基。
栗籽豆精胺酯可以選自(a)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-苯甲酸酯(b)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇7-苯甲酸酯(c)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-(4-甲基苯甲酸酯)(d)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇7-(4溴代苯甲酸酯)(e)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6，8-二丁酸酯(f)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-丁酸酯(g)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-(2-呋喃羧酸酯)(h)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇7-(2，4-二氯苯甲酸酯)(i)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-(3-己烯酸酯)(j)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-辛酸酯
(k)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-戊酸酯(l)O-新戊酰酯(m)2-乙基丁酰酯(n)3，3-二甲基丁酰酯(o)環(huán)丙稀酸酯(p)4-甲氧基苯甲酸酯(q)2-氨基苯甲酸酯；和(r)(a)-(q)中任一或全部的混合物例如，黃病毒可以是黃病毒屬或瘟病毒屬中的一種病毒。
優(yōu)選的實(shí)施例中，黃病毒是Hepacivirus屬的一種病毒。更優(yōu)選的實(shí)施例中，hepacivirus是丙型肝炎病毒(HCV)。
其它黃病毒包括黃病毒屬的一些成員(例如黃熱病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒和蜱媒腦炎病毒)，瘟病毒屬的一些成員(例如牛病毒的腹瀉病毒，典型豬霍亂病毒和邊緣病病毒)，和黃病毒科一些仍未分類(lèi)的成員(例如GB病毒A，B和C型)。
本發(fā)明另一方面，黃病毒為動(dòng)物病毒，例如任意選自下列的蟲(chóng)害病毒，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，典型豬熱病毒，邊緣病毒和豬霍亂病毒。
本發(fā)明還提供了一種上述栗籽豆精胺酯在制備用于預(yù)防或治療黃病毒感染的藥物中的用途。
因而，本發(fā)明關(guān)注一種用于治療或預(yù)防黃病毒感染的藥物的制備方法，特別是使用前述栗籽豆精胺酯的制備方法(比如，作為一種活性成分)。
治療或預(yù)防優(yōu)選用于上述病毒的感染，尤其是對(duì)丙型肝炎，登革熱，日本腦炎，河谷腦炎，羅西奧病毒感染，西尼羅熱，圣路易斯腦炎，森林腦炎，羊跳病毒感染，Powassan病毒感染，鄂目斯克出血熱，森林出血熱，牛腹瀉，典型豬霍亂，邊緣病和豬霍亂的治療和預(yù)防。
本發(fā)明的藥物也可包含栗籽豆精胺酯和與之聯(lián)用(如，混合和包合)的附加治療劑的。附加治療劑可包含一種抗病毒化合物，如一種抗HCV藥。更優(yōu)選的是包括α干擾素和/或病毒唑的附加治療劑。
因而，另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，它含有前面任一權(quán)利要求述及的栗籽豆精胺酯和下列化合物(a)抑制HCV結(jié)合和/或感染細(xì)胞的化合物，包括針對(duì)如HCV E1和/或E2蛋白的抗體(如，單克隆抗體)和葡萄糖胺多糖(如肝素的硫酸鹽和蘇拉明)；(b)抑制病毒RNA從病毒外殼中釋放和抑制HCV基因產(chǎn)物功能的化合物，包括IRES抑制劑，蛋白酶(如絲氨酸蛋白酶)抑制劑，解旋酶抑制劑和病毒聚合酶/復(fù)制酶抑制劑；(c)干擾或影響到細(xì)胞復(fù)制功能的化合物，包括次黃苷單磷酸鹽脫氫酶抑制劑(如，病毒唑，霉酚酸和VX497)和糖蛋白化反應(yīng)抑制劑，比如DNJ及其衍生物；(d)起到改變免疫功能的化合物(如胸腺素α和象α或β干擾素這樣的干擾素；和(e)起到改善HCV感染的癥狀或影響的化合物(例如抗氧化劑，例如類(lèi)黃酮)。
本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有前面任一權(quán)利要求述及的栗籽豆精胺酯和用于治療常見(jiàn)并發(fā)感染的化合物(如乙肝病毒，如象人免疫缺陷病毒1型、2型和人T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒1型、2型這樣的人逆轉(zhuǎn)錄病毒)。這類(lèi)化合物的例子包括核苷RT抑制劑(如拉米夫定(3TC)，齊多夫定，去羥肌苷，阿德福韋二匹伏酯和阿巴卡韋)，非核苷RT抑制劑(如奈韋拉平)和蛋白酶抑制劑(如沙奎那韋，茚地那韋，利托那韋)。
上述附加治療劑與本發(fā)明中的栗籽豆精胺酯可以一起使用。也可選擇先后使用。
優(yōu)選使用α干擾素(IFN-α)，盡管也可以使用其它干擾素(例如通過(guò)表達(dá)克隆的人干擾素基因制備出的干擾素)。
上述組合物還可任意含有一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。因而，本發(fā)明還關(guān)注一種含有上述組合物的藥物組合物。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選用于預(yù)防和治療，如在本文描述的任何一種治療和預(yù)防方法中的應(yīng)用。
另一方面，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明提供了一種藥物試劑盒，它基本成分中含有前面任一權(quán)利要求述及的栗籽豆精胺酯和下列化合物(a)抑制HCV結(jié)合和/或感染細(xì)胞的化合物；(b)抑制病毒RNA從病毒外殼中釋放和抑制HCV基因產(chǎn)物功能的化合物；(c)干擾或影響到細(xì)胞復(fù)制功能的化合物；(d)起到改變免疫功能的化合物和(e)起到改善HCV感染的癥狀或影響的化合物。
該試劑盒還含有用于治療黃病毒病的指令(如在文中描述的黃病毒病)。
栗籽豆精胺酯和附加治療劑可混裝到同一劑型單元內(nèi)。
本發(fā)明的組合物的栗籽豆精胺酯和附加治療劑可以以一種補(bǔ)充劑或增效劑的方式起作用。
更優(yōu)選的組合物和方法中既包含本發(fā)明的栗籽豆精胺酯，也包括治療HCV感染的增效劑干擾素。
在任何一種上述藥物組合物中，本發(fā)明的組合物或栗籽豆精胺酯允許以同一劑型單元的形式出現(xiàn)。
這樣本發(fā)明也關(guān)注一種如上所述的試劑盒，該試劑盒中的栗籽豆精胺酯和附加治療劑構(gòu)成同一劑型單元。
發(fā)明詳述本發(fā)明使用的“黃病毒”一詞意指涵蓋黃病毒屬的所有成員。
“一種藥學(xué)上可接受的鹽”的表述意指涵蓋基礎(chǔ)化合物與任何無(wú)毒的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸形成的鹽。
作為例子的適宜的成鹽無(wú)機(jī)酸包括鹽酸，氫溴酸，硫酸，和磷酸，和耐酸金屬鹽，如磷酸一氫鈉和硫酸氫鉀。作為例子的適宜的成鹽有機(jī)酸包括單羧、二羧和三羧酸，比如，這類(lèi)的酸有乙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、反丁烯二酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、苯乙烯酸、水楊酸，和2-苯氧基苯甲酸。其它適宜成鹽有機(jī)酸還有一些磺酸類(lèi)，如甲烷磺酸和2-羥基乙烷磺酸。
鹽和基礎(chǔ)化合物可以以氫氧化物或完全無(wú)水物的形式存在。通過(guò)一些標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來(lái)制備酸鹽，比如通過(guò)把游離的堿溶于含有適當(dāng)酸的水溶液或乙醇溶液，再通過(guò)蒸發(fā)溶劑分離出鹽，或者通過(guò)把游離的堿加入有機(jī)溶劑反應(yīng)然后直接分離出或濃縮溶液得到鹽。
一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的化合物酸化得到的鹽應(yīng)是溶于水和各種親水有機(jī)溶劑的晶體物質(zhì)，與游離堿的形式相比，具有更高的熔點(diǎn)和提升的溶解度。
“一種藥學(xué)上可接受的衍生物”的表述意指涵蓋具有更強(qiáng)的抗水解能力和提升了親脂性的酯的前體藥物。這些前體藥物可迅速通過(guò)胃腸道，在口服時(shí)提供一種“貯存效應(yīng)”，有助于保持在目標(biāo)部位(例如，肝)的活性藥物濃度。
前述C1-14鏈烷?；梢允菐е辨溁蛑ф湹逆溁颦h(huán)，例如甲?；?、乙?；?、丙酰基、丁?；惗□；h(huán)丙?；?，己?；?、辛酰基、癸?；?br> 前述C1-14鏈烯?；梢允菐е辨溁蛑ф湹逆溁颦h(huán)，但至少有一個(gè)C-C單鍵。比如，丙烯?；⒍∠；?、異丁烯酰基、環(huán)丙?；?，己烯?；⑿料；?、癸烯酰基。
前述C1-6烷氧?；傅氖羌籽跻阴；?，乙氧乙酰基和丁氧乙?；?。
前述鹵素具體指氟、氯、溴或碘。
前述C2-6鏈烷?；傅氖且阴；；⒍□；惗□；图乎；?。
不論單獨(dú)或作為烷氧基，烷基磺酸基或烷基巰的一部分，前述C1-4烷基指的是最多帶有4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基。各種這類(lèi)的基團(tuán)有甲基，乙基，丙基，丁基，甲氧基，乙氧基，丁氧基，甲基磺酸基，乙基磺酸基，甲基巰基和乙基巰基。
前述的苯基(C2-6鏈烷?；?苯乙?；捅奖；?。
前述各種萘羰基，吡啶羰基，硫代苯羰基和呋喃羰基包括各種位置的異構(gòu)體，如萘-1-羰基，萘-2-羰基，煙酰，異煙酰，N-甲基-二氫-吡啶-3-羰基，硫代苯基-2-羰基，硫代-3-羰基，呋喃-2-羰基和呋喃-3-羰基。這里萘基，吡啶基，硫代苯基和呋喃基還可按上述指示被任意取代。
本發(fā)明優(yōu)選的化合物中R，R1和R2為1或2鏈烷酰基，鏈烯?；?，或苯?；渲斜锦；杀磺笆鯵，Y’和Y”取代，尤其是一個(gè)C1-4鏈烷?；虮灰粋€(gè)烷基或鹵素取代的苯?；?br> 更優(yōu)選的是如分子式1所示的化合物，其中R，R1和R2之一是鏈烷酰基或苯?；?，尤其是一個(gè)C1-8鏈烷?；?，C1-18鏈烯?；虮灰粋€(gè)烷基或鹵素取代的苯酰基，其余為H。
更優(yōu)選的是那些如分子式1所示的化合物，其中R，R1和R2之一是一個(gè)C1-8鏈烷?；珻1-8鏈烯?；蛞粋€(gè)可被一個(gè)烷基或鹵素，尤其是被一個(gè)甲基，溴、氯或碘基取代的苯酰基，其余為氫。
最優(yōu)選的是如分子式1所示的化合物，其中R1是一個(gè)C1-8鏈烷酰基，C1-8鏈烯?；虮灰粋€(gè)烷基或鹵素任意取代，尤其是被一個(gè)甲基，溴，氯或氟基任意取代，最好是對(duì)位取代的苯?；琑和R2是H。
本發(fā)明的酯通過(guò)栗籽豆精胺與氯酸和酸酐的惰性溶劑溶液反應(yīng)來(lái)制備。這類(lèi)鹵化物可以是氯化物或溴化物，酸酐包括混合酸酐。控制所使用的鹵酸或酸酐的相對(duì)量，溶劑的相對(duì)量，溫度和反應(yīng)時(shí)間以使得?；牧u基數(shù)量最少。
使用相對(duì)多的溶劑以稀釋反應(yīng)物和抑制所形成的高度?；锏臄?shù)量。溶劑優(yōu)選施可溶解反應(yīng)物但不與之發(fā)生反應(yīng)。
反應(yīng)更優(yōu)選地是在有叔胺的情況下進(jìn)行，這些叔胺參與反應(yīng)并移去反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的一切酸。叔胺可以被加入混合物中使用或大量加入作為溶劑使用。
優(yōu)選的是，反應(yīng)時(shí)用冰浴冷卻，冷卻時(shí)間大約16小時(shí)，使單酯的反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，比如延長(zhǎng)至七天，直至需要的雙酯形成。實(shí)際上，反應(yīng)可在較高溫度下進(jìn)行，在涉及反應(yīng)的各種因素被較好控制的時(shí)候可以加熱。
當(dāng)反應(yīng)如期進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)最終得到的混合物中仍含有相當(dāng)數(shù)量未反應(yīng)的栗籽豆精胺。未反應(yīng)物質(zhì)可以從反應(yīng)混合物中還原，回收并在隨后的反應(yīng)中使用，以提高栗籽豆精胺轉(zhuǎn)化為酯的總量。當(dāng)反應(yīng)在有利于分離出單酯的條件下進(jìn)行時(shí)回收栗籽豆精胺尤其重要。
一般來(lái)說(shuō)上述步驟可以得到6-或7-單酯或6，7-或6，8-雙酯。通過(guò)適當(dāng)阻斷基團(tuán)的作用可以得到其它異構(gòu)體。例如，栗籽豆精胺酯與2-(二溴甲基)苯甲酰氯反應(yīng)得到6，7-雙酯。雙酯與適當(dāng)?shù)乃猁u或酸酐反應(yīng)得到相應(yīng)的8-酯。兩個(gè)保護(hù)基在在使用嗎啉和氫氧離子水解甲酸基苯甲酸酯后，很容易通過(guò)兩個(gè)二溴甲基到甲酸基的轉(zhuǎn)化除去(使用高氯酸鹽和溶于丙酮水溶液的2，4，6-三甲基吡啶)。
所示步驟可通過(guò)類(lèi)似途徑得到酯異構(gòu)體。
在1，8-O-異亞丙基栗籽豆精胺或1，8-環(huán)亞甲基栗籽豆精胺，及標(biāo)準(zhǔn)酯化步驟中的氯酸的參與下，反應(yīng)傾向于幾乎只生成6-酯。在酸，比如4-甲苯磺酸的作用下可除去上述異亞甲基和環(huán)亞甲基。自行獲得的起始縮酮化合物形成栗籽豆精胺6，7-聯(lián)苯甲酸酯。聯(lián)苯甲酸酯與2-甲氧基丙稀或1-甲氧基環(huán)己烯和酸反應(yīng)以引入1，8-O-異亞丙基或1，8-O-環(huán)亞己烯基團(tuán)，通過(guò)堿的水解，如氫氧化鈉水解，或通過(guò)催化條件下與醇鈉或醇鉀的酯交換反應(yīng)除去兩個(gè)苯甲酸酯基團(tuán)。
醫(yī)療應(yīng)用本發(fā)明可應(yīng)用于醫(yī)療方面，比如用于治療或預(yù)防的方法。包括用于獸醫(yī)的方法。
這里用到的“一種治療黃病毒感染的方法”指的是對(duì)感染了黃病毒的患者(人或動(dòng)物)的治療。治療的方法涉及給予所說(shuō)的患者一種本發(fā)明中抗病毒有效量的組合物或藥物。
這里用到的“黃病毒感染”指的是任何一種涉及到黃病毒殘留于患者的細(xì)胞或身體里的狀態(tài)或情況(由其引起，因其惡化，或表征為)。
這里用到的“患者”指的是哺乳類(lèi)動(dòng)物，比如人，羊，馬，牛，豬，狗，貓和老鼠。
制劑方面本發(fā)明使用到的藥物可以通過(guò)口服或非消化道途徑給藥，包括靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，真皮下，空氣途徑(氣霧劑)，直腸和局部(包括口腔和舌下)給藥。
栗籽豆精胺酯的給藥量可以根據(jù)使用的特殊劑量單位，治療的時(shí)期，患者的年齡和性別，無(wú)序治療的特征和程度，和所選用的特殊栗籽豆精胺酯而發(fā)生很大變化。
還有，栗籽豆精胺酯可以和其它已知在黃病毒感染治療中有用的藥劑(參見(jiàn)上文)聯(lián)用，在這樣一些例子中，它的劑量可作相應(yīng)調(diào)整。
在合用本發(fā)明的栗籽豆精胺酯前體藥物衍生物時(shí)，因?yàn)檫@些衍生物表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗水解能力和更高的親脂性，所以可以使用較小的劑量。正如前面解釋的那樣，這些前體藥物可迅速通過(guò)胃腸道，在口服時(shí)提供一種“貯存效應(yīng)”，有助于保持在目標(biāo)部位(例如，肝)的活性藥物濃度。
因而，一般來(lái)說(shuō)，栗籽豆精胺酯的有效給藥量范圍在大約15mg/kg至500mg/kg之間。每單位劑量應(yīng)含有25至500mg的栗籽豆精胺酯，一天服用一次或多次。栗籽豆精胺酯可附加一種藥物載體，以常規(guī)單位劑型的形式給藥，如口服，非消化道或局部給藥，具體描述如下。
優(yōu)選的給藥途徑是口服給藥。一般來(lái)說(shuō)，合適的劑量范圍是服用者每天每公斤體重0.1至300mg，優(yōu)選6至150mg，最優(yōu)選15至100mg。
優(yōu)選的給藥劑量是這樣的，每天以適當(dāng)?shù)拈g隔小劑量給藥二次、三次、四次、五次或六次或更多。在這里，小劑量給藥以單位劑型的形式出現(xiàn)，例如，每單位劑型含有活性成分10-1500mg，更優(yōu)選是20-1000mg，最優(yōu)選50-700mg。
劑型方面本發(fā)明藥物組合物可以含有一種藥學(xué)上可接受的賦型劑。可以使用任意適當(dāng)?shù)馁x型劑，例如惰性稀釋劑，分解劑，粘合劑，潤(rùn)滑劑，甜味劑，香味劑，著色劑，防腐劑。適用的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣，磷酸鈉和磷酸鈣，和乳糖，同時(shí)分解劑可以是玉米淀粉和褐藻酸。粘合劑可包括淀粉和明膠，同時(shí)如果使用潤(rùn)滑劑，一般是硬脂酸鎂，硬脂酸或滑石粉。
該藥物組合物可以以任何合適的形式出現(xiàn)，例如可包括片劑，酏劑，膠囊劑，溶液劑，混懸劑，粉末劑，顆粒劑和氣霧劑。
該藥物組合物可以采用部分試劑盒的形式，試劑盒中含有本發(fā)明的組合物和使用的指令和/或一個(gè)劑型單元中不同成分的復(fù)合。
口服用片劑可包括活性成分和藥學(xué)上可接受的賦型劑，例如惰性稀釋劑，分解劑，粘合劑，潤(rùn)滑劑，甜味劑，香味劑，著色劑，防腐劑。適用的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣，磷酸鈉和磷酸鈣，和乳糖，同時(shí)分解劑可以是玉米淀粉和褐藻酸。粘合劑可包括淀粉和明膠，同時(shí)如果使用潤(rùn)滑劑，一般是硬脂酸鎂，硬脂酸或滑石粉。如果需要，片劑可以用單硬脂酸甘油或雙硬脂酸甘油包衣，以延長(zhǎng)在消化道內(nèi)的分解時(shí)間。
口服用膠囊可包括硬膠囊和軟膠囊，硬膠囊中是活性成分混合固體稀釋劑，軟膠囊中是活性成分混合水或油，油可以是花生油、液體石蠟或橄欖油。
直腸給藥劑型以栓劑的形式出現(xiàn)，栓劑有一個(gè)適當(dāng)?shù)幕|(zhì)，其中含有如可可脂或水楊酸鹽。
適于陰道給藥的制劑可呈陰道環(huán)、陰道塞、軟膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴射劑，它們除了含活性成分外還含有本領(lǐng)域已知合適的載體。
對(duì)于肌內(nèi)注射劑，腹膜內(nèi)注射，皮下注射和靜脈內(nèi)注射用劑型，本發(fā)明的化合物一般表現(xiàn)為無(wú)菌水溶液或混懸液，緩沖調(diào)節(jié)至一個(gè)適當(dāng)?shù)膒H值和等滲壓。
適當(dāng)?shù)乃苄匀苊接蠷inger溶液和等滲的氯化鈉溶液。根據(jù)發(fā)明內(nèi)容，水溶性混懸劑可包括懸浮劑，如纖維素衍生物，藻酸鈉，聚乙烯吡咯烷酮和黃芪膠，和一種潤(rùn)濕劑，如卵磷脂。水溶性混懸液用的適宜的防腐劑包括乙基和n-丙基p-羥基苯甲酸。
本發(fā)明的化合物也可以一種脂質(zhì)體的形式出現(xiàn)。
為了口服，栗籽豆精胺酯可以被制成固體或液體制劑，如膠囊，丸劑，片劑，藥片，錠劑，融合劑，粉末劑，顆粒劑，溶液劑，混懸劑，分散劑或乳劑(這里的溶液劑，混懸劑，分散劑或乳劑可以是水溶性，也可以是非水溶性)。固體單位劑型可以是膠囊劑，具有常見(jiàn)的硬或軟明膠類(lèi)外殼，含有如表面活性劑，潤(rùn)滑劑，和惰性填充劑，如乳糖，蔗糖，磷酸鈣和玉米淀粉。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物可以加入一些常規(guī)的輔料如乳糖、蔗糖和玉米淀粉來(lái)壓片，壓片時(shí)還可加入粘合劑如阿拉伯膠，玉米淀粉，或明膠，還可加入崩解劑以助于片劑服用后的崩解和溶解，這一類(lèi)的崩解劑有馬鈴薯淀粉、褐藻酸、玉米淀粉，和瓜爾膠，還可加入潤(rùn)滑劑以利于提高片劑制粒時(shí)的流動(dòng)性和阻止壓片材料在模具和沖床上的粘著，這類(lèi)的潤(rùn)滑劑有滑石粉、硬脂酸，或硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅，還可加入色素，著色劑，和香味劑以利于提高片劑的外觀(guān)質(zhì)量并使患者易于接受。
對(duì)于口服液體劑型來(lái)說(shuō)，適用的賦型劑包括稀釋劑，如水和醇，醇類(lèi)有乙醇，苯甲醇，和聚乙烯醇，可以包括也可以不包括附加劑如表面活性劑，懸浮劑或乳化劑。
本發(fā)明的栗籽豆精胺酯衍生物還可以通過(guò)非消化道給藥，即皮下注射，靜脈內(nèi)注射，肌內(nèi)注射和腹膜內(nèi)注射給藥。
在這些例子里，藥物以注射劑劑型出現(xiàn)，其中化合物溶于一種生理上可接受的稀釋劑和藥學(xué)上可接受的載體，這些稀釋劑和載體可以是一種無(wú)菌液體或液體混合物。適用的液體可以是水，鹽水，液體葡萄糖和相應(yīng)糖溶液，也可以是一種一元醇(如乙醇，異丙醇，或十六烷醇)，二元醇(如丙二醇或聚乙二醇)，甘油縮酮(如2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇)，醚(聚乙二醇400)，一種油，一種脂肪酸，一種脂肪酸酯或甘油酯，或一種酰化脂肪酸甘油酯，可以包括或不包括一種藥學(xué)上可接受的表面活性劑(如一種皂化劑或一種去污劑)，懸浮劑(如膠質(zhì)，卡波沫，甲基纖維素，羥丙甲基纖維素，或羧甲基纖維素)，或乳化劑和其它藥物佐劑。在本發(fā)明非消化道給藥劑型的制備中使用的油的例子有石油，動(dòng)物，植物，或合成油，例如，花生油，豆油，種子油，棉籽油，玉米油，橄欖油，石蠟和礦物油。
合適的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和異硬脂酸。適用的脂肪酸酯是油酸乙酯和豆蔻酸異丙酯。
合適的皂化劑包括脂肪酸的堿金屬鹽，銨鹽，和三乙醇銨鹽，適用的去污劑包括陽(yáng)離子洗滌劑，如二甲基二烴基鹵化銨，烷基鹵化吡啶，和醋酸烷基銨；陰離子去污劑，如烷基，芳基，和石蠟磺酸鹽，烷基，石蠟，乙醚，和單甘油酯硫酸鹽，和硫代琥珀酸鹽；中性去污劑，如脂肪銨氧化物，脂肪酸鏈烷酰銨，和聚氧乙烯聚丙乙烯共聚物；和兩性去污劑，如烷基-β-氨基丙酸鹽，和2-烷基咪唑季銨鹽，和混合物。
本發(fā)明的非消化道給藥的組合物通常含有大約0.5％至大約25％重量比的如分子式1所示的栗籽豆精胺酯衍生物?？梢苑奖愕厥褂靡恍┓栏瘎┖途彌_劑。為了減少或消除注射時(shí)的刺激，該組合物可包括一種中性表面活性劑，其HLB值應(yīng)在12-17之間。在這類(lèi)劑型中，表面活性劑的重量比占大約5％至大約15％。表面活性劑可以是具有上述HLB值的單一成分，也可以是兩種或兩種以上具有上述HLB值的成分的混合物。非消化道給藥劑型中用的表面活性劑的例子有聚乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，如山梨聚糖單油酯和大分子量的環(huán)氧乙烷的疏水基加成物，是通過(guò)丙稀氧化物和丙稀乙二醇的縮和反應(yīng)制成。
本發(fā)明的栗籽豆精胺酯衍生物也可局部給藥，此時(shí)，載體中應(yīng)含有適當(dāng)?shù)娜軇?、軟膏或膠體的基質(zhì)。該基質(zhì)中可包括一種或多種下述成分，比如石油、羊毛脂、聚乙烯甘油，蜂蠟，礦物油，稀釋劑如水和醇，乳化劑和穩(wěn)定劑。局部給藥劑型中栗籽豆精胺酯或其藥學(xué)上的鹽的濃度在大約0.1％至10％w/v之間(重量體積比)。
下面將結(jié)合實(shí)施例描述本發(fā)明，這些實(shí)施例純作舉例用，而不是用作任何限定。
實(shí)施例細(xì)胞，病毒，抑制劑MDBK細(xì)胞(NBL-1)(ATCC CCL22)取自牛腎，可用的引起細(xì)胞病變的BVDV(NADL病毒株)(ATCC VR-534)取自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)。
MDBK細(xì)胞在DMEM中維持(Sigma，Poole，Dorset)，補(bǔ)充以10％FCS，2mM L-谷氨酸鹽，50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素。
6-O-丁酰栗籽豆精胺酯(Bucast；Celgosivir，VIR-222；MDL28，574A)按已有方法合成(Liu，P.S.Hoekstra，W.J.and King，C.H.R.(1990).Synthesis of potent anti-HIV agentsestersof castanospermine.Tetrahedron Lett.311535-1549)，并由Aventis得到(之前已知的是Marion Merrell Dow)。栗籽豆精胺(1S，6S，7R，8R，8aR-16，7，8吲嗪四醇)按現(xiàn)有技術(shù)從Moreton BayChestnut，Castanospermum australe的種子中分離出，見(jiàn)(Liu，P.S.and Rhinehart，B.L.(1986).栗籽豆精胺酯的分離及其抗糖尿病用途。歐洲專(zhuān)利EP0202661)，也可從Aventis中獲得。N-丁基-脫氧野尻霉素(N-丁基-DNJ)和N-壬基-脫氧野尻霉素(NN-DNJ)從加拿大多倫多化學(xué)研究所(Toronto Research Chemicals，Canada)購(gòu)得。Bucast，栗籽豆精胺酯和N-丁基-DNJ溶于水中制成100mM貯備液。NN-DNJ溶于二甲亞砜中制成100mM貯備液。貯備液在零下20攝氏度下保存。
噬菌斑抑制試驗(yàn)MDBK細(xì)胞接種于6-孔細(xì)胞培養(yǎng)皿(NunclonTM，Nunc，Denmark)允許生長(zhǎng)匯合。細(xì)胞在熱磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗兩次，然后感染BVDV NADL(150pfu/孔)，BVDV NADL(150pfu/孔)溶于含有1％的馬血清和1mM氯化鎂的0.25ml PBS。細(xì)胞培養(yǎng)皿在37℃、5％的CO2條件下培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)，每15-20分鐘搖晃一次。病毒接種移至用DMEM稀釋后的3.0ml 0.5％低膠化溫度的瓊脂糖覆層，所用DMEM中加入了5％馬血清，2mM L-谷氨酸鹽，50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素，其中含有或不含有不同濃度的受試化合物。瓊脂糖允許在室溫下固化15分鐘，然后在37℃、5％的CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)三天后，加1.5ml 10％的甲醛溶液覆蓋于瓊脂覆層上以固定細(xì)胞。輕輕地從小孔移去瓊脂，將細(xì)胞在室溫下用0.3％的甲基藍(lán)PBS溶液染色10分鐘。移去多余的染料，細(xì)胞用PBS沖洗干凈而不是烘干培養(yǎng)皿，然后在顯微鏡下計(jì)算菌斑數(shù)量。根據(jù)菌斑平均數(shù)對(duì)化合物濃度log值的函數(shù)標(biāo)定量效曲線(xiàn)。再用直線(xiàn)回歸計(jì)算半數(shù)抑菌濃度(IC50)。
XTT致細(xì)胞病變法將MDBK細(xì)胞植入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar 3596，CorningIncorp.，USA)，使其長(zhǎng)到鋪滿(mǎn)。用熱堿金屬磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞沖洗兩次，然后在100μl的DMEM中用BVDV NADL(100pfu/孔)進(jìn)行感染，所使用的DMEM中加入了5％馬血清，2mM L-谷氨酸鹽，50U/ml青霉素and 50μg/ml鏈霉素。一些被模擬感染的細(xì)胞作為對(duì)照品。繼續(xù)使用100μl上述組成的DMEM進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但是在每個(gè)孔中都要加入或不加不同濃度的測(cè)試化合物。每三組細(xì)胞使用一個(gè)化合物濃度。經(jīng)化合物平行處理過(guò)的未感染的細(xì)胞用于評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。培養(yǎng)板在37℃用5％CO2孵化。6天后，在每個(gè)孔中加入25μl 1mg/ml的2，3-雙-[2-甲氧基-4-硝基-5-硫代苯基]-2H-四唑-5-羧基苯胺(XTT)/25μm吩嗪甲基硫酸鹽(PMS)溶液(XTT和PMS均購(gòu)自Sigma，Poole，Dorset，UK)，并將培養(yǎng)板在37℃用5％CO2孵化2小時(shí)。在450nm處測(cè)定吸光度。以吸光度的值為O.D與化合物濃度的對(duì)數(shù)作圖，并計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)。
抗病毒活性采用噬斑還原法對(duì)MDBK細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，栗籽豆精胺和Bucast均會(huì)抑制BVDV斑的形成，栗籽豆精胺和Bucast的劑量隨不同種類(lèi)的細(xì)胞而定(見(jiàn)

圖1)。依照以前的記錄，Bucast用于抗人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)的有效率大約是栗籽豆精胺的13倍。Bucast的IC50平均值是16.25μM±7.5μM，與之相比，栗籽豆精胺的IC50平均值是216.6μM±55.0μM(表2)。
表2用噬菌斑抑制試驗(yàn)測(cè)定的a-葡萄糖苷酶I抑制劑抗-BVDV活性
通過(guò)對(duì)單層細(xì)胞的微觀(guān)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度達(dá)到1000μM時(shí)沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。在噬斑還原平行實(shí)驗(yàn)中，a-葡萄糖苷酶I抑制劑N-丁基-DNJ和N-壬基-DNJ的濃度分別大于＞100μM和＞300μM時(shí)，僅僅顯示出部分抑制作用。N-壬基-DNJ的濃度為300μM時(shí)會(huì)有明顯的細(xì)胞毒性。
用XTT致細(xì)胞病變法測(cè)定a-葡萄糖苷酶I抑制劑的抗-BVDV作用和細(xì)胞毒性的平行實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了相同的結(jié)果。如圖2所示，Bucast和栗籽豆精胺均可以保護(hù)MDBK細(xì)胞使其不會(huì)受病毒感染而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)對(duì)經(jīng)過(guò)處理的未被感染的細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。在相同的實(shí)驗(yàn)中，N-丁基-DNJ或N-壬基-DNJ均對(duì)BVDV細(xì)胞的病理效應(yīng)沒(méi)有任何保護(hù)作用。同時(shí)通過(guò)以前的噬斑還原實(shí)驗(yàn)觀(guān)測(cè)，N-丁基-DNJ沒(méi)有細(xì)胞毒性，N-壬基-DNJ對(duì)于MDBK細(xì)胞有明顯的毒性。計(jì)算所得的N-壬基-DNJ的50％細(xì)胞毒性濃度為120μM。采用大約0.01的多重感染(MOI)，在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中Bucast和栗籽豆精胺的IC50平均值分別是36μM±22μM和400μM(表3)。
表3通過(guò)XTT致細(xì)胞病變法測(cè)定的a-葡萄糖苷酶I抑制劑的抗-BVDV活性和細(xì)胞毒性
*MOI＝0.01
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，N-壬基-DNJ顯示一定的抗病毒活性，但是選擇性指數(shù)只有2-倍。
病毒的MOI對(duì)Bucast抗-BVDV活性的影響研究顯示，當(dāng)病毒細(xì)胞的比例較低時(shí)，它更有效(見(jiàn)圖3和表4)。
表4通過(guò)XTT致細(xì)胞病變法測(cè)定的經(jīng)不同的多重感染后的Bucast和N-丁基-DNJ的抗-BVDV活性
當(dāng)使用低MOI時(shí)N-丁基-DNJ具有一定的抗病毒作用，但是這種抑制作用的強(qiáng)度比Bucast低10-倍。
XTT致細(xì)胞病變法用于測(cè)定人類(lèi)白細(xì)胞干擾素(α干擾素)抑制MDBK細(xì)胞發(fā)生BVDV病變的能力，并證實(shí)了IC50值是每孔1.3干擾素拮抗單位(IRU)。進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)Bucast和干擾素α聯(lián)合使用時(shí)，干擾素α的IC50值會(huì)減小。同樣，Bucast的IC50值也會(huì)減小。聯(lián)合指數(shù)(CI)通過(guò)Suhnel公式計(jì)算得出(抗病毒研究，13，23-40)。
Cl值小于1表示協(xié)同增效作用，小于0.8被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性結(jié)果。α干擾素和Bucast的聯(lián)用所產(chǎn)生的Cl值的范圍從0.28到0.46。因此這些結(jié)果顯示α干擾素和Bucast聯(lián)用具有協(xié)同增效作用。
這些數(shù)據(jù)在表5中作了總結(jié)。
表5通過(guò)XTT致細(xì)胞病變法測(cè)定Bucast和干擾素α聯(lián)用的抗BVDV活性
等價(jià)方式前面的詳細(xì)描述優(yōu)選體現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)施例中。
在考慮了這些描述后，實(shí)際操作中各種修改和變化對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的，所有這些修改和變化均落在所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種黃病毒感染者的治療方法，包括在需要的時(shí)候給予患者一定有效量的栗籽豆精胺酯，其結(jié)構(gòu)如下 其中R，R1，R2各自獨(dú)立地是H，C1-14鏈烷?；珻1-14鏈烯?；?，環(huán)己烷羰基，C1-8烷氧乙?；?可以被甲基或鹵素任意取代的萘羰基；苯基(C2-6鏈烷酰基)其中苯基可被甲基或鹵素任意取代；肉桂酰；可以被甲基或鹵素任意取代的吡啶羰基；可以被C1-10烷基任意取代的二氫吡啶羰基；可以被甲基或鹵素任意取代的噻吩羰基；或者可以被甲基或鹵素任意取代的呋喃羰基；Y是H，C1-4烷基，C1-4烷氧基，鹵素，三氟甲基，C1-4烷磺?；?，C1-4烷巰基，氰基或二甲胺基；Y’是氫，C1-4烷基，C1-4烷氧基，鹵素或聯(lián)合Y形成3，4-亞甲二氧基；Y”是H，C1-4烷基，C1-4烷氧基，或鹵素；所選的R，R1和R2中至少一個(gè)，最多兩個(gè)是H；或藥學(xué)上可接受的鹽或它們的衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R，R1和R2各自獨(dú)立地是H，C1-10鏈烷?；?，C1-10鏈烯酰基，C1-8烷氧乙酰基，和其中Y是H，C1-4烷基，C1-4烷氧基，鹵素，三氟甲基，C1-4烷磺?；珻1-4烷巰基，氰基和二甲胺基；Y’是H，C1-4烷基，C1-4烷氧基，鹵素或聯(lián)合Y形成3，4-亞甲二氧基；Y”是H，C1-4烷氧基或鹵素；所選的R，R1和R2中至少一個(gè)，最多兩個(gè)是H。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中R，R1和R2各自獨(dú)立地是H，C1-8鏈烷?；?，C1-8鏈烯?；?，C1-8烷氧乙?；?，或者是可以被一個(gè)烷基或鹵素任意取代的苯甲?；?；所選的R，R1和R2中至少一個(gè)，最多兩個(gè)是H。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R，R1和R2各自獨(dú)立地是H，C1-8鏈烷?；?，C1-8鏈烯酰基，C1-8烷氧乙?；?，或者是可以被一個(gè)甲基，溴，氯或氟類(lèi)任意取代的苯甲?；凰x的R，R1和R2中至少一個(gè)，最多兩個(gè)是H。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R1是C1-8鏈烷?；?，C1-10鏈烯?；?，C1-8烷氧乙?；?，或者是可以被一個(gè)烷基或鹵素任意取代的苯甲?；?。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R1是C1-8鏈烷?；?，C1-8鏈烯酰基，C1-8烷氧乙?；?，或者是可以被一個(gè)甲基，溴，氯或氟類(lèi)任意取代的苯甲酰基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的栗籽豆精胺酯選自(a)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-苯甲酸酯(b)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇7-苯甲酸酯(c)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-(4-甲基苯甲酸酯)(d)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇7-(4溴代苯甲酸酯)(e)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6，8-二丁酸酯(f)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-丁酸酯(g)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-(2-呋喃羧酸酯)(h)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇7-(2，4-二氯苯甲酸酯)(i)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-(3-己烯酸酯)(j)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-辛酸酯(k)[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-吲嗪四醇6-戊酸酯(l)O-新戊酰酯(m)2-乙基丁酰酯(n)3，3-二甲基丁酰酯(o)環(huán)丙酰酯(p)4-甲氧基苯甲酸酯(q)2-氨基苯甲酸酯；和(r)(a)-(q)中任一或全部的混合物
8.根據(jù)任一在前權(quán)利要求的方法，其中的黃病毒是瘟病毒屬或黃病毒屬的一種病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其中的黃病毒是Hepacivirus屬的一種病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的病毒是HCV。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中黃病毒選自黃熱病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒和森林腦炎病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至7的方法，其中黃病毒是一種動(dòng)物病毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中的動(dòng)物病毒選自牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，典型豬熱病毒和邊緣病病毒。
14.根據(jù)任一在前權(quán)利要求所述的栗籽豆精胺酯在制備用于治療或預(yù)防黃病毒感染的藥物中的用途。
15.一種制備用于治療或預(yù)防黃病毒感染的藥物的方法，其特征在于使用任一在前權(quán)利要求所述的栗籽豆精胺酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其中治療或預(yù)防指的是對(duì)權(quán)利要求8-13中任一病毒引起的感染的治療和預(yù)防。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的用途或權(quán)利要求15的方法，其中治療或預(yù)防是針對(duì)下列疾病a.丙型肝炎；b.黃熱??；c.登革熱；d.日本腦炎；e.河谷腦炎；f.羅西奧病毒感染；g.西尼羅熱；h.圣路易斯腦炎；i.森林腦炎；j.羊跳病毒感染；k.Powassan病毒感染；l.鄂目斯克出血熱；m.森林出血熱；n.牛腹瀉；o.典型豬霍亂(豬霍亂)；和p.邊緣病。
18.一種組合物，它含有前面任一權(quán)利要求述及的栗籽豆精胺酯和一些治療附加劑，該附加劑選自(a)抑制HCV結(jié)合和/或感染細(xì)胞的化合物；和/或(b)抑制病毒RNA從病毒外殼中釋放或抑制HCV基因產(chǎn)物功能的化合物；和/或(c)干擾或影響到細(xì)胞復(fù)制功能的化合物；和/或(d)起到改變免疫功能的化合物；和/或(e)起到改善HCV感染的癥狀或影響的化合物(例如抗氧化劑，例如類(lèi)黃酮)；和/或(d)用于乙肝病毒和/或人逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的化合物(例如，核苷RT抑制劑，非核苷RT抑制劑和蛋白酶抑制劑)。
19.權(quán)利要求18所述的組合物，其中改變免疫功能的化合物(d)是α干擾素(IFN-α)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的組合物，其中還包括一種藥學(xué)上可接受的賦型劑。
21.一種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求18至20中任一所述的組合物。
22.用于治療或預(yù)防的根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一所述的組合物。
23.一種部分試劑盒，它含有前面任一權(quán)利要求述及的栗籽豆精胺酯和任一或全部在權(quán)利要求18(a)-(f)中述及的治療附加劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的試劑盒，其中還含有用于治療黃病毒病的指令。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的試劑盒，其中栗籽豆精胺酯和/或附加治療劑在同一劑型單元中。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，其中的黃病毒病同權(quán)利要求17中所述。
全文摘要
某些栗籽豆精胺酯在治療由黃病毒引起的疾病，尤其在治療由丙型肝炎病毒(HCV)引起的疾病中的用途，和含有所述酯與輔助治療劑組合的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K31/444GK1516582SQ02809904
公開(kāi)日2004年7月28日 申請(qǐng)日期2002年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月3日
發(fā)明者A·S·蒂姆斯, A S 蒂姆斯, D·L·泰勒, 泰勒 申請(qǐng)人:韋羅金有限公司