專利名稱：一種利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種介孔二氧化硅材料在特定溶液條件下對(duì)S iRNA的裝載方法。
背景技術(shù)：
隨著細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，RNA干擾技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域(Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4卷，457頁，2003年)。 RNA干擾是指與靶基因同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，其作用機(jī)制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)，這些 siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調(diào)基因表達(dá)。1998年， Fire等(Nature，391卷，806頁，1998年)在線蟲中發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象后，RNA干擾技術(shù)作為特異性抑制基因表達(dá)的方法，逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。自從Elbashir等 (Nature，409卷，363頁，2001年)發(fā)現(xiàn)人工合成的siRNA能誘導(dǎo)特異性靶基因降解，大量的研究集中到將RNA干擾用于基因功能研究和人類疾病治療領(lǐng)域。目前現(xiàn)有的RNA干擾技術(shù)主要是將化學(xué)合成的siRNA引入細(xì)胞，繼而識(shí)別特異的信使RNA實(shí)現(xiàn)干擾功能。但體外合成的siRNA進(jìn)入體內(nèi)后存在易被降解、作用時(shí)間不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，因此，RNA干擾技術(shù)在應(yīng)用方面所存在的最大障礙是缺少能夠穩(wěn)定有效地將siRNA誘導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞的載體，如何開發(fā)低毒高效的載體成為RNAi技術(shù)發(fā)展所面對(duì)重要課題(Mol. Pharm. 6卷，651頁，2009年)。近年來，將介孔二氧化硅納米顆粒用于藥物載體的研究成為了關(guān)注的焦點(diǎn)。由于介孔二氧化硅納米顆粒特殊的孔道結(jié)構(gòu)具有較高的比表面積，較大的孔容積等特點(diǎn)，使其不僅能夠裝載大量的藥物分子，還能夠在生理環(huán)境下實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物分子的可控釋放(Chem. Mater. 13卷，308頁，2001年)。近期研究表明，納米級(jí)的介孔二氧化硅顆粒不僅可以被哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞噬，還具有良好的生物相容性和低細(xì)胞毒性(Adv. Drug. Delivery Rev. 60卷， 1278頁，2008年)。因此，介孔二氧化硅納米顆粒成為了一種非常理想的藥物載體，其在此領(lǐng)域中的突出表現(xiàn)也使人們嘗試將其用于裝載siRNA分子。然而，由于二氧化硅是一種多硅羥基材料，而siRNA表面富含磷酸根基團(tuán)，它們?cè)谒芤涵h(huán)境中均呈負(fù)電性而無法直接實(shí)現(xiàn)裝載。探索合適的方法使介孔二氧化硅材料的孔道能夠裝載siRNA分子，成為了將介孔二氧化硅材料成功應(yīng)用于siRNA裝載的關(guān)鍵所在?，F(xiàn)有的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法如2009年，ACSNano雜志公開報(bào)道了 T. Xia等人的研究工作(ACS Nano, 3卷，3273頁，2009年)，他們?cè)诮榭锥趸桀w粒表面修飾PEI，實(shí)現(xiàn)了對(duì)siRNA的裝載；2009年Small雜志報(bào)道了 A. M. Chen等人的研究工作(Small，5卷，2673頁，2009年)，他們通過相似的表面修飾正電性高分子的方法， 成功實(shí)現(xiàn)了藥物和siRNA的裝載。但是，上述工作均只采用了修飾后的介孔二氧化硅納米顆粒外表面來裝載siRNA，沒能發(fā)揮介孔納米顆?？椎澜Y(jié)構(gòu)、高比表面積、大孔容積的優(yōu)點(diǎn)； 而且由于顆粒外表面上大量的氨基被用來吸附siRNA分子，使得顆粒表面無法被進(jìn)一步功能化如聚乙二醇等修飾，從而限制了顆粒在生物體內(nèi)的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可以利用介孔二氧化硅納米顆粒的孔道裝載siRNA分子的方法，所述方法通過將siRNA誘導(dǎo)進(jìn)入介孔二氧化硅納米顆粒的孔道，不僅實(shí)現(xiàn)siRNA的裝載還能調(diào)節(jié)siRNA在顆粒中的裝載量；另外此方法還具有在生理環(huán)境條件下siRNA分子不會(huì)從孔道中脫離，裝載后的納米顆粒表面可進(jìn)一步修飾的特點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載SiRNA的方法，包括以下步驟1、取0. 05 Img介孔二氧化硅納米顆粒于2mL離心管中，加入0. 02 4mL的弱極性溶劑，通過超聲振蕩(60 200W)處理使顆粒在弱極性溶劑中均勻分散，所采用的介孔二氧化硅納米顆粒的顆粒粒徑為30 1000納米，優(yōu)選粒徑為30 100納米；顆粒的介孔孔徑為2 10納米，優(yōu)選孔徑為2 6納米；所述的介孔二氧化硅納米顆?？梢允菃我坏慕榭锥趸璩煞?，也可以是內(nèi)核為無機(jī)非金屬氧化物成分或金屬成分外殼為介孔二氧化硅成分，具有核殼結(jié)構(gòu)的顆粒材料，其中所述的無機(jī)非金屬氧化物成分包括四氧化三鐵、氧化錳和氧化鋅中的一種或多種，所述的金屬成分包括金、銀、銅和鎳中的一種或多種；所述的弱極性溶劑為純的有機(jī)溶劑，包括甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮中的一種或多種；2、向步驟1最終所得的混合溶液中加入0. 005 0. 75mL的高鹽溶液，再通過外加超聲震蕩(60 200W)使加入高鹽溶液后的混合溶液均勻分散，高鹽溶液的成分含量為最終濃度為1 6摩爾每升的鹽酸胍、異硫氰酸胍和高氯酸鈉中的一種或多種；最終體積分?jǐn)?shù)為10 50%的甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮等有機(jī)溶劑中的一種或多種；最終體積分?jǐn)?shù)為 50 90%的去離子水、雙蒸水或滅菌水；高鹽溶液的pH范圍為4 6 ；3、將siRNA溶解到去離子水、雙蒸水或滅菌水中配置成為0. 25 2. 5mg/mL的溶液，向步驟2最終所得的溶液中加入配置好的siRNA溶液0. 01 0. 5mL ；將最終所得溶液放入0 40°C條件下恒溫條件吸附1 24h，通過協(xié)調(diào)弱極性溶劑、高鹽溶液、siRNA水溶液三者之間的體積分?jǐn)?shù)配比，即弱極性溶劑高鹽溶液siRNA水溶液為2 8 0.5 1.5 1，我們可以很容易的調(diào)控介孔二氧化硅材料對(duì)siRNA的吸附量；4、將步驟3中最終所得的溶液進(jìn)行高速離心(8000 12000rpm)處理，取出上清溶液并測(cè)量siRNA濃度，通過吸附前后上清溶液中siRNA濃度的差異確定最終的siRNA裝載量；離心分離后的顆粒用0. 05 ImL純乙醇潤洗一次除去多余的高鹽溶液殘留物質(zhì)，然后加入0. 05 0. 5mL的純乙醇并通過的超聲(60 200W)處理使顆粒分散均勻；5、向步驟4中最終所得的溶液中加入0. 05 ImL含正電性高分子的純乙醇溶液 (所述純乙醇溶液中正電性高分子的含量為0. 5 10mg/mL)，超聲震蕩(60 200W)條件下放置10 60分鐘，而后通過高速離心(8000 12000rpm)將顆粒從溶液中分離，所述正電性高分子包括聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、殼聚糖和超支化聚乙烯氨胺等高分子及其功能化的衍生物中的一種或多種；6、向步驟5中最終所得的顆粒中加入去離子水0.2 lmL，在超聲振蕩(60 200W)條件下放置10 30分鐘，除去顆粒表面游離的正電性高分子；7、最后通過高速離心(8000 12000rpm)將顆粒從溶液中分離，并將顆粒加入到滅菌水中，配置成2 4mg/mL的溶液保存。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.此方法避免了復(fù)雜的化學(xué)修飾，僅僅通過改變?nèi)芤旱挠H疏水性質(zhì)，成功地實(shí)現(xiàn)了介孔二氧化硅材料對(duì)siRNA分子的裝載，簡(jiǎn)單有效，易于操作。2.加入所述高鹽溶液后，其所含的鹽離子有助于減弱介孔二氧化硅顆粒和siRNA 表面的靜電排斥力，有利于siRNA在介孔中的吸附。3.介孔二氧化硅對(duì)siRNA的裝載量可以通過改變吸附溶液環(huán)境中各組分之間的配比進(jìn)行調(diào)控。4.使用正電性高分子裝載siRNA的顆粒進(jìn)行包覆后，在生理溶液環(huán)境條件下， siRNA將穩(wěn)定存在于孔道內(nèi)而不被釋放。5.最終所得的顆粒表面存在大量的伯胺基團(tuán)，可以進(jìn)行進(jìn)一步的功能化修飾，滿足不同的生物醫(yī)用需求。


圖1為利用磁性介孔二氧化硅納米顆粒，構(gòu)建用于siRNA干擾的基因載體，黑色短棒為siRNA，藍(lán)色球狀物為介孔二氧化硅納米顆粒(M-MSNs)，橙色線條表示聚乙烯亞胺分子；圖2為磁性介孔二氧化硅納米顆粒在不同乙醇體積配比條件下對(duì)siRNA的裝載量；圖3為調(diào)節(jié)聚乙烯亞胺的用量，當(dāng)聚乙烯亞胺與顆粒的質(zhì)量比為3. 以上時(shí)，將能夠阻止siRNA從顆粒中釋放。
具體實(shí)施例方式在以下實(shí)施例中我們選取了一種帶有四氧化三鐵內(nèi)核的介孔二氧化硅納米顆粒 (magnetic mesoporous silica nanoparticles,M_MSNs)進(jìn)行siRNA裝載試驗(yàn),其中M-MSNs 的粒徑為50納米左右，介孔孔道的孔徑為3. 4nm，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。實(shí)例1 1.先將0.2mg M-MSNs加入到2mL離心管中，再向其中加入0. 03mL純乙醇，IOOw 條件下超聲振蕩30s后使顆粒在溶液中均勻分散。2.向步驟1最終所得的溶液中加入0. OlmL高鹽溶液(此高鹽溶液成分為 0. 04mmol的鹽酸胍、0. 0025mL的異丙醇，0. 0075mL的滅菌水，pH為5)并混合均勻。3.向步驟2最終所得的溶液中加入濃度為0. 6mg/mL的siRNA水溶液(溶劑為去離子水)0.01mL，并再次混合均勻，在此實(shí)施例中，乙醇高鹽溶液siRNA水溶液三者之間的體積比3 1 1，將混合物靜置于25°C烘箱中4h，通過IOOOOrpm離心將吸附siRNA 的M-MSNs從溶液中分離，此時(shí)M-MSNs對(duì)siRNA的單位裝載量為8. 8mg/g(圖2所示)。4.將步驟3中最終所得的顆粒用0. 06mL純乙醇洗滌一次，再加入0. 06mL純乙醇， 并利用IOOw超聲振蕩使顆粒均勻分散。5.向步驟4最終所得溶液中加入含聚乙烯亞胺的純乙醇溶液0. 06mL(所述聚乙烯亞胺在純乙醇溶液中的濃度為1. 5mg/mL)，IOOw超聲振蕩條件下使混合物反應(yīng)20分鐘。6.通過IOOOOrpm離心將顆粒從溶液中分離，并加入到0. 12mL去離子水中，在IOOw超聲振蕩條件下反應(yīng)10分鐘除去顆粒表面游離的聚乙烯亞胺。7.最后通過IOOOOrpm離心將顆粒從溶液中分離，再用0. ImL滅菌水溶解顆粒， 配置成2mg/mL的溶液保存，此時(shí)0. 2mg顆粒上的聚乙烯亞胺(PEI)的包覆量約為0. Olmg (即聚乙烯亞胺與顆粒的質(zhì)量比為5% )，在生理環(huán)境條件下，siRNA將無法從顆粒中釋放出來(如圖3所示)。實(shí)例2 1.保持實(shí)施例1中步驟1 3的其他條件不變，改變乙醇高鹽溶液siRNA水溶液(溶劑為雙蒸水)三者之間的體積比為2 1 1或4 1 1。2.將上述最終所得的顆粒從吸附溶液中分離后，得到M-MSNs對(duì)siRNA的單位裝載量分別是配比為2 1 1時(shí)裝載量為5.3mg/g，配比為4 1 1時(shí)裝載量為14. 5mg/ g (圖2所示)。3.將分離后所得的顆粒用0. 06mL純乙醇洗滌一次，再加入0. 06mL純乙醇，并利用 IOOw超聲振蕩使顆粒均勻分散。4.向步驟3最終所得溶液中加入含聚乙烯亞胺的純乙醇溶液0. 06mL(所述聚乙烯亞胺在純乙醇溶液中的濃度為1. 5mg/mL)，IOOw超聲振蕩條件下使混合物反應(yīng)20分鐘。5.通過IOOOOrpm離心將顆粒從溶液中分離，并加入到0. 12mL去離子水中，在 IOOw超聲振蕩條件下反應(yīng)10分鐘，通過IOOOOrpm離心將顆粒從溶液中分離，再將其加入到 0. ImL滅菌水中，配置成2mg/mL的溶液保存，此時(shí)0. 2mg顆粒上的PEI的包覆量為0. Olmg (即聚乙烯亞胺與顆粒的質(zhì)量比為5% )，在生理環(huán)境條件下，siRNA將無法從顆粒中釋放出來(如圖3所示)。實(shí)例3 1.先將0. 2mg M-MSNs加入到2mL離心管中，再向其中加入0. 04mL純乙醇，IOOw 條件下超聲振蕩30s后使顆粒在溶液中均勻分散。2.向步驟1最終所得的溶液中加入0. OlmL高鹽溶液(此高鹽溶液成分為 0. 04mmol的鹽酸胍、0. 0025mL的異丙醇，0. 0075mL的滅菌水，pH為5)并混合均勻。3.向步驟2最終所得的溶液中加入濃度為0. 5mg/mL或者2. 5mg/mL的siRNA水溶液(溶劑為滅菌水)0. OlmL并使溶液混合均勻，在此實(shí)施例中，乙醇高鹽溶液siRNA水溶液三者之間的體積比為4 1 1，將混合物靜置于25°C烘箱中4h，通過IOOOOrpm離心將吸附siRNA的M-MSNs從溶液中分離，此時(shí)M-MSNs對(duì)siRNA的單位裝載量為加入濃度為 0. 5mg/mL的siRNA水溶液時(shí)單位裝載量為3. 2mg/g，加入濃度為2. 5mg/mL的siRNA水溶液時(shí)單位裝載量為27. 5m/g。4.將步驟3最終所得的顆粒用0. 06mL純乙醇洗滌一次，再加入0. 06mL純乙醇，并利用IOOw超聲振蕩使顆粒均勻分散。5.向步驟4最終所得溶液中加入含聚乙烯亞胺的純乙醇溶液0. 06mL(所述聚乙烯亞胺在純乙醇溶液中的濃度為1. 5mg/mL)，IOOw超聲振蕩條件下使混合物反應(yīng)20分鐘。6.通過IOOOOrpm離心將顆粒從溶液中分離，并加入到0. 12mL去離子水中，在 IOOw超聲振蕩條件下反應(yīng)10分鐘。7.最后再次通過IOOOOrpm離心將顆粒從溶液中分離，再將其加入到0. ImL滅菌水中，配置成2mg/mL的溶液保存，此時(shí)0. 2mg顆粒上的PEI的包覆量約為0. Olmg (即聚乙烯亞胺與顆粒的質(zhì)量比為5% )，在生理環(huán)境條件下，siRNA將無法從顆粒中釋放出來(如圖3 所示)。
權(quán)利要求
1.一種利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載SiRNA的方法，其特征在于向含有介孔二氧化硅納米顆粒的弱極性溶劑中分別加入高鹽溶液與siRNA的水溶液，實(shí)現(xiàn)介孔二氧化硅納米顆粒對(duì)siRNA的吸附；再通過正電性高分子包覆顆粒，阻止siRNA在生理溶液環(huán)境中的釋放，由此實(shí)現(xiàn)介孔二氧化硅納米顆粒對(duì)siRNA的裝載。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法，其特征在于 所述介孔二氧化硅納米顆粒的粒徑為30 1000納米，顆粒的介孔孔徑為2 10納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法，其特征在于所述的介孔二氧化硅納米顆粒為單一的介孔二氧化硅成分或內(nèi)核為無機(jī)非金屬氧化物成分或金屬成分而外殼為介孔二氧化硅成分具有核殼結(jié)構(gòu)的顆粒材料，其中所述的無機(jī)非金屬氧化物成分包括四氧化三鐵、氧化錳和氧化鋅中的一種或多種，所述的金屬成分包括金、銀、銅和鎳中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法，其特征在于所述的弱極性溶劑為純的有機(jī)溶劑，包括甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法，其特征在于所述高鹽溶液包括以下組分鹽酸胍、異硫氰酸胍和高氯酸鈉中的一種或其混合物，其最終濃度為1 6摩爾每升；甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮中的一種或其混合物，其最終溶液體積分?jǐn)?shù)為10 50% ；去離子水、雙蒸水和滅菌水中的一種，其最終溶液體積分?jǐn)?shù)為 50% 90%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法，其特征在于siRNA需要先在去離子水、雙蒸水或滅菌水中溶解成為溶液，其溶液濃度為0. 25 2. 5mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法，其特征在于所述介孔二氧化硅材料對(duì)siRNA的吸附，其條件為溫度范圍為0 40°C ；持續(xù)時(shí)間為Ih 24h ；混合溶液的各組分，包括弱極性溶液、高鹽溶液、siRNA溶液的體積分?jǐn)?shù)可在如下范圍內(nèi)2 8 0.5 1.5 1變化。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法，其特征在于所述的用正電性高分子材料包覆，阻止siRNA在生理溶液環(huán)境中的釋放，其中正電性高分子材料包括聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、殼聚糖和超支化聚乙烯氨胺中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法，其特征在于 所述的正電性高分子的分子量范圍為SOODa 50kDa。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用介孔二氧化硅納米顆粒裝載siRNA的方法，其特征在于正電性高分子包覆后的顆粒需要重新分散到去離子水中，并在超聲下處理，用于除去顆粒表面游離的正電性高分子，減輕顆粒的團(tuán)聚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用介孔二氧化硅納米顆粒的孔道裝載siRNA分子的方法，所述方法通過將siRNA誘導(dǎo)進(jìn)入介孔二氧化硅納米顆粒的孔道，不僅實(shí)現(xiàn)siRNA的裝載還能調(diào)節(jié)siRNA在顆粒中的裝載量；此方法還具有在生理環(huán)境條件下siRNA分子不會(huì)從孔道中脫離，裝載后的納米顆粒表面可進(jìn)一步修飾的特點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102327622SQ20111026619
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者古宏晨, 李旭 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)