專利名稱：miRNA吸收載體、其制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種新型miRNA吸收載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
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MicroRNA (miRNA)是長約20 24nt、非編碼的微小RNA，通過其種子區(qū)域與靶基因mRNA 3’UTR區(qū)部分互補從而介導(dǎo)30%左右的哺乳動物基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(LewiS，B.P.等，Cell. 2005，120 :15-20)。MiRNA參與了諸多生命過程關(guān)鍵步驟的調(diào)控，包括特定組織或細(xì)胞的分化、凋亡、增殖和維持。此外，miRNA表達(dá)水平失調(diào)與腫瘤等疾病也密切相關(guān)Lu，J.等，Nature. 2005，435 :834-838 ；Li, Q. J.等，Cell. 2007，129 :147-161 ；Cheng, Η. Y.等，Neuron. 2007,54 813-829 ；Chang, T. C.等，Mol Cell. 2007,26 :745-752 ；He, L.等，Nature. 2005，435 :828-833 ；Care, A.等，Nat Med. 2007，13 :613_618。但迄今為止，在培養(yǎng)細(xì)胞和動物模型中，已被實驗證實的miRNA-mRNA相互作用的例子還相對較少，大多數(shù)miRNA的功能也尚未明確。鑒于miRNA行使其功能時，其生理性的濃度至關(guān)重要，故外源性地高表達(dá)某個miRNA時，會導(dǎo)致其濃度過高而容易出現(xiàn)某些實驗假象。因此，確定某個miRNA功能的最好方式是敲減或者敲除這個目的miRNA。但是，由于單個miRNA可能由基因組上多個位置的基因轉(zhuǎn)錄而來，且同一家族的miRNA具有相同的種子序列從而功能上是互補的，所以用傳統(tǒng)基因敲除的方法制備miRNA敲除模型非常困難。找到ー種能在體、內(nèi)外抑制一組功能類似的miRNA的方法受到普遍的關(guān)注。目前，化學(xué)修飾的反義寡核苷酸是沉默內(nèi)源性miRNA功能的主要策略，這些寡核苷酸一般被2’甲氧基修飾(核糖核酸的2位羥基被甲氧基取代)、LNA修飾(核糖核酸五碳環(huán)上的羥基被橋聯(lián)形成鎖核酸)或肽核酸修飾(假肽骨架取代糖骨架)。為增強寡核苷酸進入特定組織或細(xì)胞的能力，也可以在寡核苷酸鏈的3’羥基末端接上嗎啡啉或者膽固醇[Medina,P. P. Slack,F. J. ,Nat Methods2009,6 :37-38。這些寡核苷酸通過與 miRNA 成熟體互補而降解或者扣押之，從而抑制miRNA的功能。通過基因轉(zhuǎn)移手段，轉(zhuǎn)移足夠量的寡核苷酸進入細(xì)胞，可以中和胞漿內(nèi)所有的miRNA，從而可達(dá)到類似于基因敲除類似的效果。前面的研究已經(jīng)證實，通過強啟動子可高表達(dá)miRNA的靶，如果這些人為的靶達(dá)到足夠的濃度，其功能也可以類似于miRNA的抑制劑，甚至強于已有的商業(yè)化的抑制劑[Ebert, M. S.等，Nat Method. 2007,4 :721-726 ；Ebert,M. S.和 Sharp, P. A.，RNA. 2010，16 2043-2050 ；Gentner, B.，G.等，Nat Methods. 2009,6 :63-66 ；Haraguchi, T.等，NucleicAcids Res. 2009, 37 :e43。為了增強這些誘餌靶對目的miRNA的親和力，多個miRNA的結(jié)合位點被插入到靶的3’UTR區(qū)。通過設(shè)計帶有膨起的miRNA結(jié)合祀序列(一般是在Argobaute 2剪切的位點設(shè)計膨起序列)，這些靶序列能夠穩(wěn)定地結(jié)合或吸收帶有目的miRNA的微核糖核蛋白復(fù)合體。這些靶RNA的序列可以瞬時地從轉(zhuǎn)染的質(zhì)?；蛘叻€(wěn)定插入染色體的序列表達(dá)而來。由于誘餌mRNA與miRNA的結(jié)合主要靠miRNA 2 8位的種子序列堿基互補配對，所以ー個誘館mRNA可以與同一種子序列的所有miRNA結(jié)合(一般同一家族的miRNA具有相同的種子序列)。誘餌靶mRNA，也被稱為miRNA吸收序列，相對于商業(yè)化的miRNA寡核苷酸抑制劑，它具有以下優(yōu)點首先，它可以制成miRNA吸收載體，從而具有載體共有的優(yōu)勢，比如，可以制備成病毒載體而轉(zhuǎn)染難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，甚至在體內(nèi)高表達(dá)該載體；可以用于制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系或者轉(zhuǎn)基因動物模型；可以通過更換細(xì)胞特異性的啟動子而使其特異性表達(dá)；其次，由于它可以同時吸收同一家族的miNRA，故比只能吸收完全互補的某ー個miRNA的寡核苷酸抑制劑更加強大，更能避免miRNA的功能冗余現(xiàn)象；并且，吸收載體較化學(xué)修飾的miRNA而言價格相對低廉、且穩(wěn)定性強。同時，相對于傳統(tǒng)的基因敲除技木，miRNA吸收技術(shù)具有以下優(yōu)勢首先，miRNA吸收載體的轉(zhuǎn)基因模型，操作簡單、耗時短、費用低，且有相對較廣的動物模型和細(xì)胞系的適用范圍；其次，很多miRNA的家族成員在基因座上位置不同，考慮到其功能冗余性，如要制 備基因敲除模型，必須對單個miRNA位點敲除后再將動物模型雜交后篩選全家族敲除的模型，這對于某型miRNA家族如let-7家族(有8個成員)幾乎是不可能完成的事情,而miRNA吸收載體的轉(zhuǎn)基因動物模型只要能表達(dá)足夠量的誘餌mRNA，就可以很輕易地吸收全家族的miRNA ;第三,有些miRNA是成簇轉(zhuǎn)錄的,其同一簇內(nèi)的miRNA距離相_很近,故單獨敲除一個miRNA而不影響其余miRNA的加工過程是很困難的,而miRNA吸收序列只針對miRNA成熟體，它們的作用不會影響到同一簇內(nèi)的其余miRNA。MiRNA吸收載體可以實現(xiàn)miRNA在細(xì)胞系或者活體內(nèi)長期的功能抑制。通過骨髓移植和腫瘤細(xì)胞異位移植技術(shù),很多研究小組已成功做到在體內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá)miRNA吸收序列Scherr, M.等，Nucleic Acids Res. 2007,35 el49 ；Bonci, D.等，Nat Med. 2008,14 1271-1277 ；Huang, J.等，Stem Cells. 2010,28 :357-364 ；Valastyan, S.等，Cell. 2009，137 :1032-1046 ；Barbato, C.等，J Neurochem. 2010，113 :591-600 ；Gottwein, E.等，J Virol. 2010,84 :5229-5237 ；Ma, L.等，Nat Biotechnol. 2010,28 :341-347 ；Ma, L.等，Nat Cell Biol. 2010,12 :247-256 ；Papapetrou, E. P.等，Stem Cells.2010，28 :287-296 ;Starczynowski, D. T.等，Nat Med. 2010,16 :49-58 ；Gatt, Μ. E.等，Ebert, M. S.和Sharp, P. A.，RNA. 2010,16 :2043_2050。第一個miRNA吸收載體的轉(zhuǎn)基因生物是擬南芥[Franco-Zorrilla, J. Μ.等,Nat Genet. 2007, 39 :1033_1037,通過插入單個的含 miRNA 吸收序列的載體，可以表現(xiàn)出與對應(yīng)miRNA高表達(dá)植物完全相反的表型。穩(wěn)定的、組織特異性的表達(dá)miRNA吸收載體的動物模型是果蜆Loya, C. M.等,Nat Methods. 2009,6 :897-903],通過GaH-UAS系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了在特定細(xì)胞中達(dá)到與基因敲除類似的表型。然而，表達(dá)miRNA吸收序列的轉(zhuǎn)基因脊椎動物尚未有文獻報道，如果能通過miRNA吸收載體在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)相應(yīng)miRNA的功能敲減，將會為miRNA體內(nèi)研究提供更為便利的工具。本領(lǐng)域迫切需要能有效地吸收內(nèi)源性miRNA的吸收載體，并可以開發(fā)出可高效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的基因轉(zhuǎn)移載體，最好還能實現(xiàn)在哺乳動物體內(nèi)長期穩(wěn)定的高表達(dá)miRNA吸收序列
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一正是提供了ー種miRNA吸收載體，其能有效地吸收內(nèi)源性miRNA,其對具有相同種子序列的全家族miRNA均有效,抑制功能可強于商業(yè)化的寡核苷酸抑制劑。本發(fā)明的另一目的是提供一種可高表達(dá)本發(fā)明miRNA吸收載體的慢病毒，從而實現(xiàn)在較難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞中抑制內(nèi)源性miRNA的功能，并可用于骨髄移植前造血干細(xì)胞的基因修飾。本發(fā)明的又一目的是提供miRNA吸收載體的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法和策略，可通過在體內(nèi)抑制目的miRNA的功能而研究特定miRNA的生理病理功能或?qū)iRNA相關(guān)疾病進行治療或預(yù)防。在本發(fā)明的第一方面中，提供了ー種miRNA吸收載體，其攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達(dá)盒(a)II型啟動子；(b)指示蛋白編碼序列；(C)目的miRNA的吸收序列，所述吸收序列是2 10次重復(fù)的、與目的miRNA部分互補或完全互補的序列；(d)任選的增強子序列。在一個優(yōu)選例中，所述II型啟動子是組成型啟動子或誘導(dǎo)性啟動子，優(yōu)選組成型 啟動子。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述II型啟動子優(yōu)選UBC、CAG、PGK、CMV啟動子。在一個優(yōu)選例中，所述UBC啟動子優(yōu)選為Human Ubiquitin C序列(SEQ ID NO 18)或其同源序列。在另ー個優(yōu)選例中，所述啟動子是細(xì)胞特異性啟動子或廣泛表達(dá)的啟動子。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，所述指示蛋白選自熒光蛋白、螢光素酶或者表達(dá)標(biāo)簽。在一個優(yōu)選例中，所述指示蛋白選自綠色熒光蛋白GFP、紅色熒光蛋白RFP、螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶、表達(dá)標(biāo)簽HA或Flag，優(yōu)選綠色熒光蛋白GFP，其激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為509nm。在另ー個優(yōu)選例中，所述的指示蛋白為增強型綠色螢光蛋白eGFP。在另ー個優(yōu)選例中，所述指示蛋白的分子量為8 60kD，優(yōu)選15 30kD。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，所述目的miRNA選自下組:miR_29、miR-21和miR-146。在一個優(yōu)選例中，所述miRNA可為任何miRNA，優(yōu)選對生命過程有重要調(diào)控作用的 miRNA。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，所述吸收序列與目的miRNA的互補比例為78% 84%。在一個優(yōu)選例中，所述吸收序列與目的miRNA的9 12位堿基不互補，而與其它
堿基均互補。在另ー個優(yōu)選例中，所述吸收序列同時與ー組miRNA部分或完全互補。在另ー個優(yōu)選例中，miR-29吸收序列的重復(fù)次數(shù)為4 10次，優(yōu)選7次。在另ー個優(yōu)選例中，所述吸收序列選自下組如SEQ ID NO 3所示的序列；由SEQID NO 3所示序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸、且具有預(yù)防或治療miR-29過表達(dá)相關(guān)疾病和/或征狀的活性的序列；或它們的互補序列。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，所述表達(dá)盒自5’至3’依次包括UBC啟動子、綠色熒光蛋白eGFP序列以及miRNA吸收序列。在一個優(yōu)選例中，所述miRNA吸收載體中還含有選自下組的其它調(diào)控元件增強子、操縱子或定位序列。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，所述吸收載體選自質(zhì)粒、曬菌體或病毒。在一個優(yōu)選例中，所述吸收載體是病毒載體，優(yōu)選慢病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，所述載體是慢病毒載體，其特征在于，該慢病毒載體還包含慢病毒的包裝所必須的序列。在本發(fā)明的第二方面中，提供了ー種制備慢病毒顆粒的方法，其包括以下步驟
(i)制備含本發(fā)明表達(dá)盒的慢病毒穿梭載體；(ii)包裝所述穿梭載體，并獲得慢病毒顆粒；
(iii)任選的通過檢測指示蛋白的表達(dá)確定病毒滴度。
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在一個優(yōu)選例中，所述穿梭載體是通過分子克隆的方法制備的。在另ー個優(yōu)選例中，所述穿梭載體用于在原核生物與真核生物之間穿梭。在另ー個優(yōu)選例中，所述包裝是通過轉(zhuǎn)染載體混合物入包裝細(xì)胞如HEK293T中進行的。在另ー個優(yōu)選例中，提供了ー種慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，其包含慢病毒表達(dá)載體(穿梭載體)，慢病毒包裝載體(骨架載體和被膜載體)，以及慢病毒包裝細(xì)胞系(如293T細(xì)胞、293FT細(xì)胞或293TN細(xì)胞)。在另ー優(yōu)選例中，所述慢病毒表達(dá)系統(tǒng)選自基于人免疫缺陷病毒HIV的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)、基于猴免疫缺陷病毒SIV的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)或基于貓免疫缺陷病毒的FIV的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選基于貓免疫缺陷病毒的FIV的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(SBI公司的新型pCDF載體系統(tǒng)，貨號為⑶11IB-I和LV100A-1)。在本發(fā)明的第三方面中，提供了ー種慢病毒介導(dǎo)目的基因在T細(xì)胞中高表達(dá)的方法，其特征在于，所述方法包括用本發(fā)明的慢病毒感染T細(xì)胞，以使得感染后的T細(xì)胞高表達(dá)目的miRNA吸收序列的步驟。在本發(fā)明的第四方面中，提供了ー種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，所述方法包括(a)提供本發(fā)明的miRNA吸收載體；(b)用該miRNA吸收載體顯微注射小鼠受精卵，并將其分別移植到假孕母鼠輸卵管；(c)待所述母鼠生產(chǎn)小鼠后，檢驗并獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；(d)任選使所述轉(zhuǎn)基因小鼠與其它小鼠配對以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。在本發(fā)明的另一方面中，提供了ー種轉(zhuǎn)基因小鼠，體內(nèi)大部分組織均高表達(dá)目的miRNA吸收序列，內(nèi)源性目的miRNA的功能被顯著抑制，并顯示出與敲除目的miRNA類似的表型。在本發(fā)明的第五方面中，提供了用本發(fā)明的miRNA吸收載體、用本發(fā)明的方法制備的慢病毒載體、用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠在miRNA相關(guān)疾病的預(yù)防或治療中的應(yīng)用。在一個實施方式中，所述miRNA相關(guān)疾病選自腫瘤、血液造血系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、自身免疫病、風(fēng)濕病、糖尿病、系統(tǒng)性硬化病、皮膚病、病毒感染、細(xì)菌感染以及骨分化、肌肉分化和肌肉相關(guān)疾病，優(yōu)選細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀。在本發(fā)明的另ー個方面中，提供了 ー種驗證本發(fā)明吸收載體功能的方法，該方法包括構(gòu)建含有目的miRNA的結(jié)合位點的攜帯報告基因的載體。
在一個優(yōu)選例中，所述報告基因是螢火蟲螢光素酶報告基因。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I :pGS29載體的設(shè)計與制備。圖IA為miR_29a，b，c的同源性比較以及miR-29吸收(miR-29 sponge)序列設(shè)計；圖IB為pGS29載體設(shè)計圖，UBC為啟動子，GFP primer和GS-29 primer為鑒定引物，Tthlll I為線性化酶切位點；圖IC為pGS29載體和其對照載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后RT-PCR鑒定GFP和GS-29序列的表達(dá)情況。圖2 HEK293T細(xì)胞中鑒定pGS29載體的作用。圖2A為對照載體、miR-29抑制劑和pGS29載體轉(zhuǎn)染后，人TTP 3’ UTR報告基因載體的相對螢光素酶活性；圖2B為pGS29載 體轉(zhuǎn)染后，野生型人TTP 3’UTR和突變miR-29結(jié)合位點的人TTP 3’UTR的報告基因載體的相對螢光素酶活性圖；圖2C為對照載體、miR-29抑制劑和pGS29載體轉(zhuǎn)染后，含有7個miR-29a調(diào)控位點的AM1473’UTR報告基因載體的相對螢光素酶活性(“*”，P<0. 05 ;“**”，P < O. 01)。圖3 :HEK293T細(xì)胞中通過含有7個miR-29a調(diào)控位點的AM147報告基因載體的相對螢光素酶活性驗證PGS29載體吸收miR-29的功能(“**”，P < O. 01)。圖4 =IFN- Y 3’UTR含有保守的miR-29結(jié)合位點。圖4A為各哺乳動物IFN- Y 3’UTR中miR-29結(jié)合位點非常保守；圖4B為HEK293T細(xì)胞中通過小鼠IFN-Y 3’ UTR報告基因載體及其突變載體驗證PGS29載體的功能，并證明鼠IFN- Y mRNA是miR-29的靶標(biāo)(“**”，P
<O. 01)。
圖5 :HEK293T細(xì)胞和小鼠淋巴瘤細(xì)胞EL4中驗證pGS29載體的功能。圖5A為HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入不同量的GS29載體后小鼠IFN-Y 3’ UTR報告基因載體的相對螢光素酶活性值；圖5B為EL4細(xì)胞中轉(zhuǎn)入不同劑量的GS29載體后，在24h，48h，72h后ELISA檢測EL4 細(xì)胞上清中的 IFN- Y 的分泌水平(“*，，，P く O. 05 ;“**，，，P < O. 01)。圖6 :原代T細(xì)胞中鑒定miR-29吸收序列的功能。圖6A為T細(xì)胞中用慢病毒正常表達(dá)或高表達(dá)miR-29吸收序列后培養(yǎng)72h，提取RNA定量PCR檢測IFN- Y的mRNA水平；圖6B、6C分別為⑶4+T，⑶8+T細(xì)胞中用慢病毒正常表達(dá)或高表達(dá)miR-29吸收序列后培養(yǎng)72h, ELISA 檢測上清中的 IFN- Y 的分泌水平(“*，，，P < O. 05 ;“**，，，P < O. 01)。圖7 miR-29吸收序列(GS29)轉(zhuǎn)基因小鼠的設(shè)計和鑒定。圖7A為GS29轉(zhuǎn)基因小鼠的設(shè)計圖；圖7B為GS29轉(zhuǎn)基因小鼠的首建鼠和Fl代小鼠的RT-PCR的鑒定結(jié)果；圖7C為GS29轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和⑶4+T細(xì)胞的RT-PCR和定量PCR的鑒定結(jié)果；圖7D為野生型或GS29轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染各種報告基因載體后，以相對螢光值ELISA檢測GS29轉(zhuǎn)基因小鼠中內(nèi)源性miR-29的功能敲減情況(“**”，P < O. 01)。圖8 :李斯特菌(LM)感染小鼠模型驗證miR-29吸收載體的功能。圖8A為LM感染野生型小鼠或GS29小鼠指定天數(shù)后的存活率(Wilcoxon test, P < O. 05)。圖8B為LM感染野生型小鼠或GS29小鼠2d后脾臟、肝臟中的細(xì)菌負(fù)荷量。圖9 :結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠模型驗證miR-29吸收載體的功能。圖9A為H37Rv感染野生型小鼠或GS29轉(zhuǎn)基因小鼠指定天數(shù)后，小鼠的存活率(Wilcoxon test, P<O. 05)。圖9B為H37RV感染野生型小鼠或GS29轉(zhuǎn)基因小鼠21天后，肺臟中H37Rv的菌落計數(shù)結(jié)果(“**，，，P < O. 01) ο圖10 :構(gòu)建miRNA吸收載體的啟動子選擇及驗證。圖IOA為II型啟動子與III型啟動子介導(dǎo)miR-29吸收序列在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)，24小時后檢測AM147-3’ UTR報告基因載體的相對螢光值。圖IOB為UBC啟動子介導(dǎo)的miR-29吸收載體在轉(zhuǎn)基因小鼠的各器官和免疫細(xì)胞中GS-29mRNA(即GFP以及miR-29吸收序列，GS-29引物擴增片段見圖I及其

)的表達(dá)水平，RT-PCR檢測結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，成功構(gòu)建了能在體外顯著抑制miR-29功能的新型miRNA吸收載體。發(fā)明人還將miR-29的吸收序列亞克隆至第三代慢病毒載體，包裝成慢病毒，感染難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞(如T細(xì)胞)后成功高表達(dá)miR-29吸收序列。并且，發(fā) 明人還通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將miR-29的吸收載體線性化后插入小鼠基因組中，成功實現(xiàn)體內(nèi)敲減miR-29的功能。因此，新型miRNA吸收載體可以有效地在體內(nèi)、體外抑制內(nèi)源性目的miRNA的功能，既可以作為miRNA的抑制劑而應(yīng)用于科學(xué)研究，又可以治療某些由于miRNA高表達(dá)引起的疾病。為實現(xiàn)有效地吸收內(nèi)源性的miRNA并成功制備小鼠miRNA吸收載體的轉(zhuǎn)基因模型，必須做到以下幾點首先，確定miRNA吸收序列，即設(shè)計好吸收序列中有哪幾個堿基與miRNA成熟體不互補會比較好，因為互補太多或位置不恰當(dāng)，會導(dǎo)致吸收序列降解，而互補太少，會導(dǎo)致不能特異地吸收目的miRNA。關(guān)于miRNA與其靶基因的互補程度與位置對靶基因降解的影響已有多篇文獻報道，例如可參見He，L.等，Nat Rev Genet. 2004,5 :522-531 ；Bartel, D. P.，Cell. 2004，116 :281_297；其次，確定合適的miRNA吸收序列的重復(fù)次數(shù)，重復(fù)次數(shù)太多，不利于轉(zhuǎn)錄，而重復(fù)次數(shù)太少，含有的miRNA的結(jié)合位點少，故吸收內(nèi)源性miRNA的能力差；第三且對本發(fā)明具有重要意義的是，選擇合適的啟動子，既要保證啟動子足夠強，能大量表達(dá)吸收序列，又要確保該啟動子適合制備轉(zhuǎn)基因模型，不會被體內(nèi)的反饋機制沉默而失活。本發(fā)明人通過深入研究，通過長期的實驗對以上因素的選擇和組合，構(gòu)建了穩(wěn)定、高效表達(dá)吸收序列載體，成功制得了轉(zhuǎn)基因脊椎動物(小鼠)，并證實了本發(fā)明miRNA吸收載體的優(yōu)異效果。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。miRNA吸收序列與miRNA吸收載體如本文所用，術(shù)語“種子序列”是指miRNA的第2 8位核苷酸。如本文所用，術(shù)語“miRNA吸收序列”包括所有與已知的miRNA部分互補或完全互補的、四至十次重復(fù)的人工合成序列，可被稱為miRNA sponge序列或者miRNA decoy序列，這些序列的共有特征是能吸收內(nèi)源性的miRNA而減少其與真正靶基因的結(jié)合機會，從而抑制miRNA的功能，即miRNA吸收序列的功能類似于競爭性抑制劑。代表性的例子包括但不限于miR-29吸收序列(如SEQ ID NO 2所示)。適用于本發(fā)明的miRNA吸收序列，可以是與已知的任ー種miRNA部分互補或者完全互補的核酸序列。較佳地，是與已知miRNA部分互補的4 10次重復(fù)序列?；パa性太好或者互補位置不恰當(dāng)，可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)文獻中的互補原則設(shè)計吸收序列并用實驗優(yōu)化之，例如參見Franco-Zorrila, J. M.等，Nat Genet. 2007, 39 :1033-1037,會導(dǎo)致吸收序列編碼的RNA被內(nèi)源性miRNA降解而導(dǎo)致吸收效果不好；重復(fù)序列太短,包含的miRNA結(jié)合位點少，不利于充分吸收內(nèi)源性miRNA;而重復(fù)序列太長，増加吸收載體制備難度，同時影響吸收載體的轉(zhuǎn)錄效率，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本較少同樣不利于吸收內(nèi)源性miRNA。本發(fā)明中以4 10次重復(fù)的吸收序列為佳。miRNA的序列可從www. microRNA. org網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫獲得，miRNA吸收序列根據(jù)miRNA成熟體的序列設(shè)計并需實驗優(yōu)化。設(shè)計原則為人工合成或PCR擴增四至十次重復(fù)的、與目的miRNA部分互補的序列(一般是與miRNA的第9 12位核苷酸不互補，其余部分完全互補)，然后可采用例如含靶基因3’ UTR的螢光素酶報告基因載體對miRNA吸收載體進行優(yōu)化。本發(fā)明所涉及的miRNA吸收序列可以全部人工合成，也可以通過部分合成在PCR擴增后獲得。如本文所用，術(shù)語“miRNA吸收載體”指的是所有能在細(xì)胞內(nèi)或者體內(nèi)有效地表達(dá)·miRNA吸收序列從而抑制內(nèi)源性miRNA功能的載體，其作用一般優(yōu)于商業(yè)化的化學(xué)合成的寡核苷酸序列。在本發(fā)明中，miRNA吸收載體的核心部分從5’至3’依次包括11型啟動子、任選的指示蛋白以及目的miRNA的吸收序列。miRNA吸收載體中的啟動子選擇至關(guān)重要，因為它直接決定了 miRNA吸收序列的表達(dá)量、表達(dá)特異性或者表達(dá)時間，進而對內(nèi)源性miRNA進行時空和效率上進行調(diào)控。某些啟動子在體內(nèi)還會被某些反饋機制修飾而沉默掉，而不利于miRNA吸收序列的長期穩(wěn)定表達(dá)。所以啟動子的優(yōu)化是miRNA吸收載體制備過程中必要的ー環(huán)。適用于本發(fā)明核心序列的啟動子是II型啟動子，其可以是組成型啟動子或誘導(dǎo)性啟動子，既可以要求細(xì)胞特異性也可以是廣泛表達(dá)的啟動子。較佳地，該啟動子是組成型的強啟動子，且制備轉(zhuǎn)基因動物模型時不會被體內(nèi)的反饋機制沉默而失活，如UBC、CAG等啟動子是較佳的選擇。啟動子的強弱直接決定了目的miRNA吸收序列的表達(dá)量，進ー步影響了敲減內(nèi)源性miRNA的效率。當(dāng)然，可以根據(jù)需要，選擇誘導(dǎo)性啟動子或者細(xì)胞特異性啟動子。發(fā)明人的實驗結(jié)果證明，聚合酶II型的啟動子如CMV、CAG、UBC、PGK可介導(dǎo)吸收序列的高表達(dá)，而聚合酶III型的啟動子如Hl和U6介導(dǎo)的吸收序列表達(dá)效果顯著弱于聚合酶II型的啟動子。較佳地，UBC啟動子是較符合在細(xì)胞或者小鼠體內(nèi)穩(wěn)定、高效并廣泛表達(dá)miRNA吸收序列的強啟動子，其效果通常優(yōu)于其它啟動子，這是發(fā)明人比較多種啟動子后得出的結(jié)論。雖然，本發(fā)明實施例中采用的UBC啟動子序列是人泛素C(human ubiquitin C, SEQ IDNO 18)啟動子的部分序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解可采用更長或者更短的序列，也可以改變部分堿基獲得相似或者更適合的UBC啟動子序列。適用于本發(fā)明核心序列的指示蛋白可以是任ー種熒光蛋白、螢光素酶或者表達(dá)標(biāo)簽。較佳地，該指示蛋白分子量不要太大(范圍為15 30kD為佳)，因為插入片段過長，會影響轉(zhuǎn)錄的效率，同時該指示蛋白必須方便檢測，最好能用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或共聚焦顯微鏡清晰地觀察現(xiàn)象。
還可miRNA吸收載體中加入其它調(diào)控元件(如增強子、操縱子或定位序列)，以使得本發(fā)明的載體可更為有效的表達(dá)吸收序列。例如在miRNA吸收載體核心部分的miRNA吸收序列之后接上一段增強子序列，以使得miRNA吸收序列能在胞內(nèi)或者體內(nèi)更強地表達(dá)。優(yōu)選用于本發(fā)明中的增強子可為SV-40增強子。載體的構(gòu)建、包裝、滴度測定及感染可采用本領(lǐng)域中常用的介導(dǎo)基因表達(dá)的載體，例如慢病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體或質(zhì)粒、噬菌體等非病毒載體，使得所述吸收序列在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。可采用本領(lǐng)域中已知的方法來構(gòu)建本發(fā)明的載體。例如，可參考王培堂等人翻譯的《分子克隆實驗指南》(第三版，科學(xué)出版社，2002)中所記載的方法、或采用市售試劑盒根據(jù)廠商的說明書進行操作。例如，慢病毒是目前介導(dǎo)目的基因高表達(dá)的最有效的方式，幾乎可以感染所有哺 乳動物細(xì)胞，包括非分裂細(xì)胞和大多數(shù)的模式生物。慢病毒載體可以作為普通載體通過ー般的基因轉(zhuǎn)染方式在常規(guī)細(xì)胞系內(nèi)實現(xiàn)低度到中度地表達(dá)目的基因。然而，通過將慢病毒載體包裝成慢病毒，可以實現(xiàn)在難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中高效地轉(zhuǎn)移基因，尤其是在原代細(xì)胞、干細(xì)胞和分化細(xì)胞中特別凸顯其優(yōu)勢。表達(dá)載體與感染后的細(xì)胞基因組整合，從而長期穩(wěn)定地表達(dá)靶基因。慢病毒表達(dá)系統(tǒng)主要有三個成分組成慢病毒表達(dá)載體(穿梭載體)，慢病毒包裝載體(骨架載體和被膜載體)，以及慢病毒包裝細(xì)胞系(如293T細(xì)胞、293FT細(xì)胞或293TN細(xì)胞)。本發(fā)明中所采用的慢病毒系統(tǒng)可選自(但不限干)基于人免疫缺陷病毒HIV的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)、基于猴免疫缺陷病毒SIV的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)或基于貓免疫缺陷病毒的FIV的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選基于貓免疫缺陷病毒的FIV的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如SBI公司的新型P⑶F載體系統(tǒng)，貨號為⑶11IB-I和LV100A-1)。以由貓免疫缺陷病毒改造而來的新型P⑶F載體為例，其3’ LTR的U3區(qū)域缺失，故自體失活；一旦慢病毒整合到基因組后，其5’ LTR的啟動子失活，阻止了病毒顆粒的復(fù)制成分的形成。慢病毒載體在包裝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，CMV/FIV5’ LTR驅(qū)動病毒骨架成分蛋白和必要的功能蛋白轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)(如Psi，RRE和cPPT)，當(dāng)病毒的被膜蛋白在293T細(xì)胞中共表達(dá)時，P⑶F轉(zhuǎn)錄本被有效地包裝入假病毒顆粒中。分離這些病毒顆粒后，P⑶F的表達(dá)盒以RNA的形式可以被有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動物靶細(xì)胞中。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，表達(dá)盒被逆轉(zhuǎn)錄并整合入細(xì)胞的基因組中。本發(fā)明的P⑶F慢病毒載體含有EFla啟動子介導(dǎo)的eGFP基因，便于病毒感染細(xì)胞的篩選。關(guān)于該病毒成分的具體信息和操作見SBI公司的試劑說明書(pCDFl-MCS2-EFl-copGFP，貨號 CD111B-1)。目前的慢病毒載體主要指第二代和第三代慢病毒載體，其主要區(qū)別為是否具有單獨啟動子的5’ LTR0對于人免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)的慢病毒載體，其第二代慢病毒載體為三質(zhì)粒系統(tǒng)，其第三代慢病毒載體為四質(zhì)粒系統(tǒng)。本發(fā)明中優(yōu)選使用的慢病毒載體以貓免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)，是三質(zhì)粒系統(tǒng)的第三代慢病毒載體。無論是哪種免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)的慢病毒載體，均最大限度地考慮了其安全性，即3’ LTR的U3區(qū)缺失及5’ LTR上游的CMV啟動子保證其自體失活和復(fù)制缺陷。本發(fā)明將GFP基因及其下游的miR-29吸收序列克隆至P⑶F的多克隆位點處，經(jīng)測序驗證后的穿梭載體連同骨架載體、被膜載體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，超速離心收集病毒顆粒。溶解病毒顆粒后倍比稀釋在293T細(xì)胞中根據(jù)GFP細(xì)胞的比例測定病毒滴度。已知滴度的病毒顆粒按照MOI約I : I 100 1，優(yōu)選10 I的濃度感染靶細(xì)胞(10個病毒1個細(xì)胞)，感染效率可達(dá)40% 60%。由此，通過采用慢病毒顆粒成功實現(xiàn)在原代的難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高表達(dá)miRNA吸收序列，并可對高表達(dá)細(xì)胞篩選后與其余對照細(xì)胞進行對比，探討該miRNA吸收序列的功能。本發(fā)明優(yōu)選第三代慢病毒載體，并帶上獨立啟動子介導(dǎo)的熒光蛋白，插入目的miRNA吸收序列后而抑制miRNA功能。應(yīng)理解，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明的說明書以及具體的實施例之后，可根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體或系統(tǒng)或者采用本領(lǐng)域中的常識和常規(guī)技術(shù)手段對該表達(dá)載體或系統(tǒng)進行適當(dāng)?shù)母脑?，例如采用各種指示蛋白或啟動子、加入其它調(diào)控序列(如增強子和定位序列)等。
miRNA吸收載體的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備本發(fā)明提供了ー種通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在體內(nèi)廣泛高表達(dá)miRNA吸收序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠是研究miRNA體內(nèi)功能的有效策略，且本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因小鼠實現(xiàn)了內(nèi)源性miRNA的功能抑制，更接近于在生理濃度下研究目的miRNA的功能，實驗結(jié)果明顯優(yōu)于mi RNA體內(nèi)高表達(dá)的模型。本發(fā)明的方法包括提供miRNA吸收載體；用該miRNA吸收載體顯微注射小鼠受精卵，并將其分別移植到假孕母鼠輸卵管；待所述母鼠生產(chǎn)小鼠后，檢驗并獲得轉(zhuǎn)基因陽性小鼠；任選使所述轉(zhuǎn)基因陽性小鼠與其它小鼠配對以產(chǎn)生后代。轉(zhuǎn)基因小鼠制備可通過例如委托專業(yè)公司(如上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司)或根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法進行。
例如，在本發(fā)明的優(yōu)選例中，所用的miRNA吸收載體核心部分依次為UBC啟動子，GFP指示蛋白和miRNA吸收序列，用TthlllI線性化并膠回收后顯微注射小鼠受精卵。轉(zhuǎn)基因小鼠制備委托上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司進行。首建鼠和Fl小鼠可以根據(jù)GFP序列或目的miRNA吸收序列設(shè)計引物，RT-PCR或者定量PCR鑒定之，也可以根據(jù)GFP蛋白的表達(dá)量鑒定之(用Western Blot、FACS或熒光顯微鏡)。藥物組合物本發(fā)明還提供了ー種藥物組合物，所述的組合物含有有效量的本發(fā)明的吸收序列或吸收載體，以及藥學(xué)上可接受的載體。在較佳的實施方案中，所述藥物組合物可用于治療與現(xiàn)有技術(shù)中已知可治療或預(yù)防可通過抑制miRNA而得到預(yù)防、緩解或治療的相關(guān)疾病，例如結(jié)核、感染和腫瘤。例如，本發(fā)明的miRNA吸收載體或序列可用于治療細(xì)菌感染性疾病，例如細(xì)菌感染后導(dǎo)致的敗血癥、腦膜炎、膿毒性流產(chǎn)；過度的炎癥和繼發(fā)的組織損傷；細(xì)菌的過度增殖導(dǎo)致的菌血癥、多器官功能衰竭；肺結(jié)核或者其它器官的結(jié)核征狀。如本文所用，術(shù)語“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣ー些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和こ醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解齊ij、潤滑劑、助流齊 、泡騰齊 、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、PH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發(fā)明的組合物中吸收載體或吸收序列有效成分占組合物總重量的O. 001 99. 選為組合物總重量的I 95wt%，較優(yōu)選為5 90wt%，更優(yōu)選10 80wt%?！び嗔繛樗帉W(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“單位劑型”是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發(fā)明的另ー優(yōu)選實施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中吸收載體或吸收序列的含量為O. 01 2000mg/劑，優(yōu)選O. I 1500mg/劑，更優(yōu)選I IOOOmg/齊U。在本發(fā)明的另ー個優(yōu)選例中，每天施用I 6劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用I 3齊IJ ;最優(yōu)選的，每天服用的劑量為I齊U。應(yīng)理解，所用吸收載體或吸收序列的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴(yán)重程度而變化。具體情況根據(jù)對象的個體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的效果)來決定，這在熟練醫(yī)師可以判斷的范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如ロ服液)或其它合適的形狀。給藥途徑可采用(1)直接裸DNA注射法；(2)將吸收載體或吸收序列與轉(zhuǎn)鐵蛋白/多聚L-賴氨酸復(fù)合物連接，以增強其生物效應(yīng)；(3)吸收載體或吸收序列與帶正電荷的脂類形成復(fù)合物，以克服磷酸骨架負(fù)電荷所致的穿越細(xì)胞膜的困難；(4)用脂質(zhì)體包裹吸收載體或吸收序列后介導(dǎo)進入細(xì)胞，既有利于大分子的順利進入又免受細(xì)胞外各種酶的水解作用；(5)吸收載體或吸收序列與膽固醇結(jié)合使其胞漿保持時間增加10倍；(6)用免疫脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運吸收載體或吸收序列可使其特異性轉(zhuǎn)運至靶組織和靶細(xì)胞；(7)將吸收載體或吸收序列體外轉(zhuǎn)染給轉(zhuǎn)載細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)也可較好地將吸收載體或吸收序列相關(guān)藥物載入靶細(xì)胞內(nèi)；(8)電打孔(electiOporation)，即借助于電流將吸收載體或吸收序列導(dǎo)入靶細(xì)胞。本發(fā)明的吸收載體或吸收序列相互間可以聯(lián)合應(yīng)用，還可以與其它藥物和治療手段聯(lián)合。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的優(yōu)點主要在于(a)本發(fā)明的miRNA吸收載體能夠有效地表達(dá)miRNA吸收序列，對內(nèi)源性的miRNA的功能有顯著的抑制作用，miRNA吸收載體的功能強于商業(yè)化的化學(xué)修飾的寡核苷酸的作用，并克服了商業(yè)化寡核苷酸以下的缺點(1)難以同時抑制具有相同種子序列的同家族miRNA,消除這些miRNA的功能冗余現(xiàn)象；(2)難以實現(xiàn)在體內(nèi)或者細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定地抑制目的miRNA的功能；(3)很難轉(zhuǎn)染大部分原代細(xì)胞，也很難應(yīng)用于體內(nèi)實驗；(4)不夠穩(wěn)定，
大量使用費用昂貴。(b)本發(fā)明的miRNA吸收載體可改裝并帶上諸如慢病毒等包裝序列，從而可通過慢病毒體系實現(xiàn)在難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中高表達(dá)miRNA吸收序列，并可通過對造血干細(xì)胞的修飾或者腫瘤細(xì)胞的修飾制備骨髄重建和腫瘤異位移植模型實現(xiàn)體內(nèi)高表達(dá)miRNA吸收序列；(c)本發(fā)明的miRNA吸收載體可以用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠，實現(xiàn)體內(nèi)敲減目的miRNA的功能，并在以下幾個方面優(yōu)于傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)(l)miRNA吸收序列針對的是miRNA成熟體，可抑制具有相同種子序列的所有miRNA的功能，而傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)很難將這些miRNA的所有基因同時敲除棹；(2)miRNA吸收載體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不會影響到內(nèi)源性miRNA的表達(dá),而傳統(tǒng)的miRNA敲除技術(shù)很難做到不影響鄰近的非目的miRNA的表達(dá),尤其 是成簇表達(dá)的miRNA ;(3)miRNA吸收載體的轉(zhuǎn)基因小鼠制備操作簡單、周期短、費用低、成功率高，而傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)技術(shù)難度大、周期長、且耗費大量的人力物力；(4)miRNA吸收序列對內(nèi)源性miRNA的功能敲減更能模擬體內(nèi)生理情況，而非傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)的完全缺失miRNA ； (5)miRNA吸收載體可以通過更換細(xì)胞特異性的啟動子實現(xiàn)在特定組織和細(xì)胞內(nèi)敲減目的miRNA的功能。實施例下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件(如王培堂等人翻譯的《分子克隆實驗指南》第三版，科學(xué)出版社，2002 ;基本細(xì)胞操作均參照王培堂等人翻譯的《細(xì)胞培養(yǎng)實驗指南》第一版，科學(xué)出版社，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I :dGS29載體的設(shè)計和制備本實驗所用的限制性內(nèi)切酶、Taq酶和pMD19_T載體均購自Takara公司。
miR-29吸收載體插入片段合成以及擴増含有7個重復(fù)的miR-29sponge插入片段(圖1A-B)用以下兩個化學(xué)合成的片段經(jīng)過PCR反應(yīng)后獲得片段I (SEQ ID NO : I):5 ’ -TAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTA-3’ ；片段2 (SEQ ID NO :2):5，-TAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCA-3，所得miR_29sponge插入片段共147bp,其序列(SEQ ID NO 3)如下
TAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTA反應(yīng)體系為加入2μ I的100 μ M的片段I和片段2，以及PCR反應(yīng)所需的premixEx Taq(Takara, cat no. D332A)。反應(yīng)條件如下98°C 10s，55°C 30s，72°C 15s，5個循環(huán)后再用72°C延伸lOmin。膠回收PCR產(chǎn)物插入pMD19-T載體成為pMD19T-miR-29sponge載體(TA克隆法，即PCR產(chǎn)物末端帶A，而pMD19-T載體帶有T的粘端，連接PCR產(chǎn)物和pMD19_T片段即可)。
DIRES2-EGFP載體改造 pIRES 2-EGFP 購自 Clontech 公司。I. PUBC-IRES2-EGFP 的制各首先將其CMV啟動子換成UBC啟動子(human ubiquitin-C promoter),用以下引物在 HEK293T 細(xì)胞 cDNA 中用高保真酶 PrimerSTAR(Takara，cat no. DR010S)擴增 UBC 啟動子上游引物(SEQID NO 4)5， -TAGTTATTAATGTCTAACAAAAAAGCC-3，下游引物(SEQID NO : 5)5， -GAAGATCTGGCCTCCGCGCCGGGTT-3，劃下劃線處為酶切位點和保護堿基；反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，其中5 X PrimerSTAR緩沖液5 μ 1，dNTP混合物 2μ1;模板 cDNA 0.2 ug, PrimerSTAR HS DNA 聚合酶 O. 25 μ 1，上、下游引物各 O. 5 μ 1，加入ddH20補齊至25 μ I。反應(yīng)參數(shù)為98°C10s，56°C 10s，72°C 75s，40 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。上、下游引物分別引入PShB I和Bgl II酶切位點。膠回收以上PCR產(chǎn)物、用pShB I和Bgl II雙酶切之并連入經(jīng)過同樣雙酶切的PIRES2-EGFP載體中。至此，該載體改造為pUBC-IRES2-EGFP。2. PUBC-EGFP-IRES2-EGFP 的制各用高保真酶PrimerSTAR (Takara，cat no. DR010S)擴增 pIRES2_EGFP 中的 GFP 片段上游引物(SEQID NO 6)5， -CGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3，下游引物(SEQID NO :7):5’ -CGGGATCCCATGGACGAGCTGTACAAGCC-3’劃下劃線處為酶切位點和保護堿基。反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，其中5XPrimerSTAR緩沖液5 μ 1，dNTP混合物 2μ1;模板 cDNA 0.2 ug, PrimerSTAR HS DNA 聚合酶 O. 25 μ 1，上、下游引物各 O. 5 μ 1，ddH20 補齊至 25 μ I。反應(yīng)參數(shù)為98°C10s，55°C 10s，72°C 45s，40 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。上、下游引物分別引入EcoR I和BamH I酶切位點。膠回收以上PCR產(chǎn)物、用EcoR I和BamH I雙酶切之并連入經(jīng)過同樣雙酶切的PUBC-IRES2-EGFP載體中。至此，該載體改造為pUBC-EGFP-IRES2-EGFP。
擴增miR-29 SOonge七重復(fù)片段.及GS29載體的構(gòu)建用高保真酶PrimerSTAR (Takara, cat no. DR010S)、以以下引物在pMD19-miR-29sponge 載體中擴增 miR-29 sponge 七重復(fù)片段上游引物(SEQID NO 8)5’ -CGGGATCCATGACTTGCATGCCTGCAGGTCGACG-3’
·
下游引物(SEQID NO 9)5’ -AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC-3，劃下劃線處為酶切位點和保護堿基。反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，其中5 X PrimerSTAR緩沖液5 μ 1，dNTP混合物 2μ1;模板 cDNA O. 2μ g, PrimerSTAR HS DNA 聚合酶(λ 25 μ 1，上、下游引物各(λ 5 μ 1，ddH20 補齊至 25 μ I。反應(yīng)參數(shù)為98°C10s，58°C 10s，72°C 30s，40 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。上、下游引物分別引入BamH I和Not I酶切點位。膠回收以上PCR產(chǎn)物、用BamH I和Not I雙酶切之并連入經(jīng)過同樣雙酶切的PUBC-EGFP-IRES2-EGFP載體中(此時已將EGFP-IRES2切除，并留出粘端以連接miR-29 sponge重復(fù)序列)。至此pGS29載體改造完畢，其特征為UBC啟動子后帶有GFP表達(dá)序列，并在GFP基因的3’ UTR區(qū)帶有7個miR-29 sponge的重復(fù)片段。將pGS29載體或其對照載體pUBC_IRES2_EGFP轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，24h后用GFP和GS-29引物，qRT-PCR檢測GFP基因和miR-29 sponge序列的表達(dá)情況說明pGS29載體構(gòu)建成功(圖1C)，其中鑒定引物分別為GFP primer 上游引物(SEQ ID NO 10)5’ -GTGACCACCCTGACCTACGG-3’下游引物(SEQID NO 11)5’ -CTGCTTGTCGGCCATGATAT-3’GS-29 primer 上游引物(SEQ ID NO 12)5， -GAGCAAAGACCCCAACGAGAAG-3，GS-29 primer 下游引物(SEQ ID NO 13)5，-TCTACAAATGTGGTATGGCTGAT-3，。實施例2 =HEK293T細(xì)胞中的報告基因?qū)嶒烌炞CpGS29載體的功能本實驗所用的限制性內(nèi)切酶、用高保真酶PrimerSTAR購自Takara公司。PGL3_promoter 載體購自 Promega 公司(Cat no. E1761) ;pMIR-報告突光素酶載體購自 Ambion 公司(Cat no. AM5795)。
hTTP 3’UTR報告基因載體的構(gòu)建擴增人TTP基因的3’ UTR全長序列(Pubmed Gene ID :7538)，Xba I酶切后插入經(jīng)過同樣酶切后的PGL3-pr0m0ter載體中，經(jīng)測序驗證構(gòu)建成功hTTP 3’ UTR報告基因載體。
突變hTTP 3’UTR/mu-hTTP-3’UTR)報告基因載體的構(gòu)建將hTTP 3’ UTR報告基因載體中的miR-29結(jié)合位點“5，-TGGTGCT-3’ ”突變成“5’-TCGAGGT-3’ ”(重組PCR定點誘變法，即設(shè)計含有突變序列的引物擴增上下兩端產(chǎn)物后再退火)，使之不能被miR-29調(diào)控，該載體即為mu-hTTP-3’ UTR報告基因載體。
AM 147 3’UTR報告基因載體構(gòu)建擴增pMD19-miR_29sponge載體中的miR-29 sponge七重復(fù)片段,兩端引入Mlu I和Spe I酶切位點。用Mlu I和Spe I雙酶切PCR產(chǎn)物后插入經(jīng)同樣酶切后的pMIR-報告熒光素酶載體中，經(jīng)測序驗證構(gòu)建成功AM147報告基因載體。
OGS29功能驗證 將PGS29載體(或其對照載體pUBC_IRES2_EGFP)或miR_29a的寡核苷酸抑制劑，購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，其序列為5’UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3’，SEQ ID NO:14)、hTTP 3’ UTR報告基因載體(mu-hTTP 3’ UTR報告基因載體或AM147報告基因載體)、TK載體(購自Promega公司，其功能為內(nèi)參螢光素酶載體，用于消除轉(zhuǎn)染效率帶來的螢光素酶活性差異)轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時后檢測細(xì)胞中螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性(雙螢光報告基因檢測試劑Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司)，圖中數(shù)值以螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性表示。結(jié)果表明pGS29載體轉(zhuǎn)染組能明顯上調(diào)hTTP 3’UTR報告基因和AM1473’UTR報告基因的相對螢光素酶活性，且作用明顯優(yōu)于商業(yè)化地寡核苷酸抑制劑(圖2) ;pGS29轉(zhuǎn)染后的HEK293T細(xì)胞中，內(nèi)源性miR-29對hTTP 3’UTR報告基因的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，達(dá)到miR-29結(jié)合位點突變后的報告基因的相對螢光素酶活性類似的水平(圖2B)。miR-29a已被報道能革巴向 TTP 基因的 3’UTR(Gebeshuber，C.A.等，EMBO Rep. 2009，10 :400-405)，AM147 3，UTR是針對miR-29a設(shè)計的報告基因，所以結(jié)合以上實驗結(jié)果說明pGS29載體能部分吸收內(nèi)源性的miR-29a而抑制miR_29a的功能。實施例3 :AM147-3’ UTR報告某閔載體駘證dGS29載體能吸收糖個miR-29家族在實施例2中已經(jīng)證實pGS29載體能部分吸收內(nèi)源性的miR_29a而下調(diào)miR_29a的功能，由于miR-29a、b、c相互之間只有幾個堿基的差異而第2至7位的“種子區(qū)域”堿基完全一致，故推測PGS29載體除了吸收miR-29a，也能吸收miR_29b和miR_29c。用miRNA模擬物(Ctrl (SEQ ID NO :14) :5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT_3，，miR_29a(SEQ ID NO :15) :5，_UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3’，miR-29b(SEQ ID NO :16) : 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3，或 miR-29c(SEQ ID NO :17 :5’ -UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3’)、AM 1473’ UTR 報告基因載體、TK載體和pGS29載體(或其對照載體pUBC-IRES2-EGFP)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞(轉(zhuǎn)染試劑Jet-Endo購自Polyplus公司)。轉(zhuǎn)染后48小時檢測各組細(xì)胞中螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性(雙螢光報告基因檢測試劑Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司)，圖中數(shù)值以螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性表示。
結(jié)果表明miR-29a、miR-29b、miR-29c均能下調(diào)AM 1473’UTR報告基因的相對螢光素酶活性。而無論在Ctrl轉(zhuǎn)染組還是miR-29a，miR-29b，miR-29c轉(zhuǎn)染組，pGS29載體轉(zhuǎn)染組均能明顯上調(diào)AM147報告基因的相對螢光素酶活性，說明pGS29載體能吸收整個miR-29家族(圖3)。實施例4 pGS29載體能卜.調(diào)IFN- Y 3’ UTR報告某閔活件
IFN-γ 3’UTR及其突變報告基因載體的構(gòu)建PCR 擴增人 IFN-Y 基因的 3’UTR 全長序列(Pubmed Gene ID : 15978)，Xba I 酶切 后插入經(jīng)過同樣酶切后的PGL3-pr0m0ter載體中，經(jīng)測序驗證構(gòu)建成功IFN- Y 3’ UTR報告基因載體。將IFN- Y 3’UTR報告基因載體中的miR-29結(jié)合位點“5’-TGGTGCT-3’ ”突變成“5，-TCGAGGT-3’ ” (同實施例2)，使之不能被miR-29調(diào)控，該載體即為mu_IFN- Y -3’ UTR
報告基因載體。
PGS29載體對IFN-γ 3’UTR及其突變報告基因載體的調(diào)控作用根據(jù)數(shù)據(jù)庫預(yù)測得IFN- Y 3’UTR中包含miR-29的調(diào)控位點，且在哺乳動物各物種中高度保守(圖4A)，故推測IFN- Y可能是miR-29的靶標(biāo)。將IFN- Y 3’ UTR報告基因載體(或其突變載體)、TK載體和pGS29載體(或其對照載體)共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞(轉(zhuǎn)染試劑JetPei購自Polyplus公司)，轉(zhuǎn)染后24小時檢測各組細(xì)胞中螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性(雙螢光報告基因檢測試劑Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司)，圖中數(shù)值以螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性表示。結(jié)果表明pGS29載體轉(zhuǎn)染組能明顯上調(diào)IFN-Y 3’UTR報告基因，而對其突變載體mu-IFN- Y 3’UTR報告基因無作用(圖4B)，即說明IFN- Y可能是miR-29的靶標(biāo)，而pGS29載體能吸收內(nèi)源性的miR-29從而促進IFN- Y的表達(dá)。實施例5 HEK293T細(xì)朐和小鼠淋巴瘤細(xì)朐EL4中dGS29載體卜.調(diào)IFN- Y的功能在實施例4中已提示IFN- Y可能是miR-29的靶標(biāo)，為進ー步確認(rèn)此結(jié)論且證明PGS29的功能，我們首先再次用將IFN- Y 3’ UTR報告基因載體和不同劑量的pGS29載體共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h檢測各組細(xì)胞中螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性(雙螢光報告基因檢測試劑Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司)，圖中數(shù)值以螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性表示。結(jié)果表明隨著pGS29載體劑量的増加，IFN- Y 3’ UTR報告基因相對螢光活性逐漸上調(diào)(圖5A)。由于T-bet轉(zhuǎn)染后的EL4細(xì)胞在PMA/伊屋諾霉素(ionomycin)刺激下能分泌大量的IFN-y (Szabo, S. J.等，Cell. 2000，100 :655-669)，故我們利用此模型來證實PGS29載體促進IFN- Y表達(dá)的功能。用電穿孔的方法將T-bet表達(dá)載體(該載體為根據(jù)常規(guī)方法構(gòu)建的小鼠T-bet基因ORF全長的表達(dá)載體，基于pcDNA3. I載體(購自Invitrogen公司)構(gòu)建，T-bet基因ORF的pubmed Gene ID :57765)和不同劑量的pGS29載體共轉(zhuǎn)入小鼠淋巴瘤細(xì)胞系EL4細(xì)胞(核轉(zhuǎn)試劑Kit L購自Lonza公司；EL4細(xì)胞系購自ATCC)。12h后換液并用25ng/ml的PMA和500ng/ml的伊屋諾霉素刺激這些細(xì)胞(PMA和伊屋諾霉素購自Sigma公司)，分別在刺激24h、48h和72h后收集上清，ELISA檢測上清中IFN- Y表達(dá)量(IFN- Y的ELISA檢測試劑盒購自R&D公司)。結(jié)果表明隨著pGS29載體劑量的増加，EL4細(xì)胞分泌上清中IFN- Y分泌量逐漸上調(diào)(圖5B)。該實施例進ー步說明IFN-Y可能是miR-29的靶標(biāo)，且pGS29載體能吸收內(nèi)源性的miR-29而促進IFN- Y的表達(dá)。實施例6 :原代T細(xì)朐中駘證DGS29載體卜.調(diào)IFN- Y的功能
PLV-GS29慢病毒載體的構(gòu)建
用EcoR I和Not I雙酶切pGS29載體，膠回收分子量較小的片段(含有GFP基因及7個miR-29 sponge重復(fù)序列)，連入經(jīng)過同樣酶切的pCDFl-MCS2-EFl_copGFP慢病毒載體(該慢病毒載體購自SBI公司，cat no.⑶111B-1)，經(jīng)測序驗證pLV-GS29載體構(gòu)建成功。
慢病毒包裝、濃縮和原代T細(xì)胞感染簡述之，轉(zhuǎn)染前一天在IOcm培養(yǎng)皿中鋪3 X IO6個的293T細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后用8ml37°C預(yù)熱培養(yǎng)基換液。將10 μ g包裝載體混合物(pFIV-34N pVSV_G摩爾比為I : 1，購自SBI公司，貨號為LV100A-1)及4 μ g帶有目的基因的穿梭載體(LV-Ctrl或LV-29 sponge，前者為P⑶Fl載體，購自SBI公司，貨號為⑶11IB-I ;后者為在P⑶Fl載體的多克隆插入位點(BamH I和Not I)中插入了七次重復(fù)的miR-29吸收序列)加入到Iml OMEM中，混合均勻，加入線性25kDa PEI 50 μ I充分混勻后室溫靜置15min (具體步驟可參見PolyscienceIncorporation 的 Linear PEI 說明書，#23966-2)。將質(zhì)粒和PEI的混合溶液均勻地加入到293T細(xì)胞，8小時后換液，加入IOml新鮮DMEM培養(yǎng)基。再48 72小時后先低速離心3000rpm 5min去除細(xì)胞碎片，O. 45 μ m濾器過濾后25，OOOrpm, 2h，4°C超速速離心收獲病毒沉淀，用100 μ I無血清培養(yǎng)基重懸沉淀，重懸過程為每隔15min，4°C晃動離心管一次，2h左右徹底溶解病毒沉淀。分裝病毒于_80°C保存，并取ー小部分測定滴度。(慢病毒詳細(xì)包裝說明見System Biosciences公司的^Lentivector Expression bystems Guide to Packaging and Transauction oi TargetCells”)。感染靶細(xì)胞時，按病毒顆粒數(shù)與靶細(xì)胞數(shù)(新鮮分離的CD4+T或者CD8+T細(xì)胞)10 I (Μ0Ι = 10 I)比例加入靶細(xì)胞培養(yǎng)皿中并加入polybrene，使其終濃度為6 μ g/ml, 12h后更換培養(yǎng)基去除polybrene及游離的病毒顆粒,再過36 48h后(具體時間視細(xì)胞狀態(tài)而定當(dāng)細(xì)胞密度過大或者有大量細(xì)胞浮起，即可停止病毒產(chǎn)生過程，通常情況為48h左右)，提取靶細(xì)胞RNA并檢測靶細(xì)胞上清中的IFN- Y。結(jié)果表明隨著LV_29sponge在⑶4+T或者⑶8+T細(xì)胞中高表達(dá)后，IFN- YmRNA水平顯著下降(圖6A)。⑶4+T或者⑶8+T細(xì)胞上清中，IFN- Y的量在LV-29sponge感染組較高(圖6B)。該實施例說明miR-29吸收序列能在原代T細(xì)胞中吸收內(nèi)源性的miR-29而促進IFN-Y的表達(dá)。實施例7 =miR-29吸收序列(GS29)轉(zhuǎn)基因小鼠的設(shè)計和鑒定
GS29小鼠的構(gòu)建和表達(dá)鑒定
GS29小鼠作用原理如圖7A所示，內(nèi)切酶Tthlll I線性化并回收DNA后委托上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司進行胚胎顯微注射，簡述之，轉(zhuǎn)基因小鼠是通過外源基因的受精卵雄原核注射獲得，供體受精卵取自C57BL/6J(早)與CBA(J)的雜交一代。在此次轉(zhuǎn)基因小鼠制備過程中，我們共獲得385枚注射卵，這些卵分別移植到15只假孕母鼠的輸卵管中，其中14只母鼠懷孕，移植成功率為93. 33%，小鼠出生總數(shù)119只，經(jīng)基因組DNA的PCR檢測，其中5只小鼠為陽性，陽性率為4. 20%。這些轉(zhuǎn)基因陽性小鼠被稱作Founder，即首建鼠。陽性Founder小鼠和I只野生型小鼠再次剪尾抽提基因組DNA，雙盲法再次進行PCR檢測，確認(rèn)5只為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，編號依次為#26，#34, #56，#68，#85。使所述Founder小鼠與野生型C57BL/6J配對后產(chǎn)出Fl代，部分小鼠經(jīng)PCR鑒定為GS-29primer陽性(圖7B)。取野生型小鼠和GS29小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞提取RNA后進ー步用RT-PCR和定量PCR檢測GFP基因，GS29小鼠細(xì)胞中含大量GFPmRNA (圖 7C)?！?br> GS29小鼠的功能鑒定將如圖示的報告基因載體、TK載體用核轉(zhuǎn)的方式共轉(zhuǎn)入野生型小鼠或者GS29小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞(原代巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染用小鼠巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)試劑盒，程序為Amaxa，Y-001。具體的核轉(zhuǎn)步驟參見Lonza公司相關(guān)試劑盒的說明書)，轉(zhuǎn)染后24h檢測各組細(xì)胞中螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性(雙螢光報告基因檢測試劑Dual-Luciferase ReporterAssay System購自Promega公司),圖中數(shù)值以螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性表不。結(jié)果表明GS29小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中能明顯上調(diào)含miR-29結(jié)合位點的報告基因(AM147-3，UTR, hTTP-3，UTR 和 IFN- Y 3，UTR)，而突變 miR-29 結(jié)合位點后，GS29 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中不能上調(diào)這些報告基因的螢光素酶活性(mu-hTTP-3’UTR和mu_IFN- y 3’UTR)，同時無miR-29結(jié)合位點的IL-103’UTR報告基因在野生型或者GS-29腹腔巨噬細(xì)胞中亦無差異(圖7D)。實施例8 =GS29小鼠具有較強的抗李斯特菌感染的能力李斯特菌毒力株(LM，ATCC 19111的單核增生性李斯特菌，由上海復(fù)祥生物科技有限公司代購)，在含5 μ g/mL紅霉素的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌處于對數(shù)生長期吋，對培養(yǎng)基中的細(xì)菌原液進行10倍梯度倍比稀釋后，涂于含有紅霉素的BHI瓊脂板，在37°C培養(yǎng)過夜后，通過克隆計數(shù)計算原液中的集落形成単位數(shù)(CFU)。每只小鼠腹腔注射5 X IO4CFU的LM，感染指定天數(shù)后，計數(shù)小鼠死亡率，計算生存曲線。取感染3d后小鼠脾臟在5ml O. 05%的Triton X-100中研磨、裂解，然后進行10倍梯度倍比稀釋后，涂于含有紅霉素的BHI瓊脂板，在37°C培養(yǎng)過夜后，通過克隆計數(shù)計算脾臟和肝臟中LM的CFU。GS29小鼠在李斯特菌感染后，存活率明顯高于野生型小鼠(圖8A)，感染3天的小鼠中，GS29小鼠肝臟和脾臟中的李斯特菌菌落數(shù)量明顯少于野生型小鼠(圖SB)。以上結(jié)果說明，GS29小鼠具有較強的抗李斯特菌感染的能力，提示miR-29吸收序列能上調(diào)IFN- Y的表達(dá)而促進李斯特菌的清除能力，增強機體抗李斯特菌的感染能力。實施例9 =GS29小鼠具有較強的抗結(jié)核分支桿菌H37Rv感染的能力結(jié)核分支桿菌毒力株H37Rv(ATCC (#27294)，購自北京生物制品研究所)，在米德爾7H9培養(yǎng)基(Difco，Detroit，Ml)中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌處于對數(shù)生長期時，對培養(yǎng)基中的細(xì)菌原液進行10倍梯度倍比稀釋后，涂于含有10%過氧化氫酶葡萄糖酸(Difco，Detroit, MI)和O. 05% Tween 80 (上海生エ生物工程有限公司)的米德爾7H9瓊脂板。H37Rv感染時，將5X IO5CFU的H37Rv溶于PBS后尾靜脈注射到小鼠中。感染指定天數(shù)后，小鼠肺臟在O. 05%的Tween 80中研磨、裂解，然后進行10倍梯度倍比稀釋后，涂于米德爾7H9瓊脂板，在37°C培養(yǎng)3周后，通過克隆計數(shù)計算肺臟中H37Rv的CFU。結(jié)果顯示，H37Rv感染指定天數(shù)后，GS29小鼠的存活率較高(圖9A)。H37Rv感染3周后，GS29小鼠肺臟中H37Rv的細(xì)菌殘留量較小(圖8C)。以上結(jié)果表明，miR-29吸收序列在體內(nèi)高表達(dá)后能有效地促進結(jié)核分支桿菌H37Rv的清除能力，對肺結(jié)核這種人類重大疾病可能有治療作用。實施例10.表汰載體中啟動子的詵擇和駘證
為選擇適合于構(gòu)建本發(fā)明miR吸收載體的啟動子序列，發(fā)明人比較了多種聚合酶II型的啟動子(如CMV、CAG、UBC、PGK)和多種聚合酶III型的啟動子(如Hl和U6)介導(dǎo)的miR-29吸收序列表達(dá)。構(gòu)建含CMV、CAG、UBC、PGK、HU U6啟動子的miR-29吸收載體，構(gòu)建方法類似于PGS29 (以UBC為啟動子的miR-29吸收載體)，不同之處即載體的啟動子部分被替換成非UBC啟動子。將AM-1473’ UTR報告基因載體、TK載體以及其中ー種上述miR-29吸收載體共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24h檢測各組細(xì)胞中螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性(雙螢光報告基因檢測試劑Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司)，圖中數(shù)值以螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性表示。實驗結(jié)果顯示，聚合酶II型的啟動子如CMV、CAG、UBC、PGK介導(dǎo)miR-29吸收序列高表達(dá)后的效果類似，表現(xiàn)為含有miR-29結(jié)合位點的AM-1473’UTR報告基因具有相近的相對螢光值。聚合酶III型的啟動子如Hl和U6介導(dǎo)的miR-29吸收序列高表達(dá)的效果顯著弱于聚合酶II型的啟動子(圖10A)。發(fā)明人進ー步檢測了以UBC為啟動子的pGS29載體制備成的轉(zhuǎn)基因小鼠中各組織和免疫細(xì)胞中的miR-29吸收序列(GS-29)的表達(dá)情況。提取用pGS29載體制備的miR-29吸收載體轉(zhuǎn)基因小鼠各臟器和各種免疫細(xì)胞的mRNA，用RT-PCR的方法檢測miR-29吸收序列(GS-29)的表達(dá)情況，鑒定引物為GS-29primer (見實施例I)。實驗結(jié)果證實了，含UBC啟動子的pGS29載體制備成轉(zhuǎn)基因小鼠后，能介導(dǎo)miR-29吸收序列的mRNA在各組織器官及各免疫細(xì)胞中高表達(dá)(圖10B)。以上結(jié)果表明，在本發(fā)明中采用II型啟動子具有優(yōu)勢，其可確保吸收序列在體內(nèi)、外的高表達(dá)。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每ー篇文獻被単獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.ー種miRNA吸收載體，其攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達(dá)盒 (a)II型啟動子； (b)指示蛋白編碼序列；以及 (c)目的miRNA的吸收序列，所述吸收序列是2 10次重復(fù)的、與目的miRNA部分互補或完全互補的序列； (d)任選的增強子序列。
2.如權(quán)利要求I所述的miRNA吸收載體，其特征在于，所述II型啟動子優(yōu)選UBC、CAG、PGK、CMV啟動子。
3.如權(quán)利要求I所述的miRNA吸收載體，其特征在于，所述指示蛋白選自熒光蛋白、螢光素酶或者表達(dá)標(biāo)簽。
4.如權(quán)利要求I所述的miRNA吸收載體，其特征在干，所述目的miRNA選自下組miR-29、miR-21 和 miR-146。
5.如權(quán)利要求I所述的miRNA吸收載體，其特征在于，所述吸收序列與目的miRNA的互補比例為78% 84%。
6.如權(quán)利要求I所述的miRNA吸收載體，其特征在于，所述表達(dá)盒自5’至3’依次包括UBC啟動子、綠色熒光蛋白eGFP序列以及miRNA吸收序列。
7.如權(quán)利要求I所述的miRNA吸收載體，其特征在于，所述吸收載體選自質(zhì)粒、噬菌體或病毒。
8.如權(quán)利要求7所述的miRNA吸收載體，其特征在于，所述載體是慢病毒載體，其特征在于，該慢病毒載體還包含慢病毒的包裝所必須的序列。
9.ー種制備慢病毒顆粒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (i)制備含權(quán)利要求1-6任ー項中所記載的表達(dá)盒的慢病毒穿梭載體； ( )包裝所述穿梭載體，并獲得慢病毒顆粒； (iii)任選的通過檢測指示蛋白的表達(dá)確定病毒滴度。
10.ー種慢病毒介導(dǎo)目的基因在T細(xì)胞中高表達(dá)的方法，其特征在于，所述方法包括用權(quán)利要求9所述的慢病毒感染T細(xì)胞，以使得感染后的T細(xì)胞高表達(dá)目的miRNA吸收序列的步驟。
11.ー種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，所述方法包括 (a)提供如權(quán)利要求I 8中任一項所述的miRNA吸收載體； (b)用該miRNA吸收載體顯微注射小鼠受精卵，并將其分別移植到假孕母鼠輸卵管； (c)待所述母鼠生產(chǎn)小鼠后，檢驗并獲得轉(zhuǎn)基因小鼠； (d)任選使所述轉(zhuǎn)基因小鼠與其它小鼠配對以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。
12.權(quán)利要求I 8中任一項所述的miRNA吸收載體、用權(quán)利要求9所述的方法制備的慢病毒載體、權(quán)利要求11所述的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠在miRNA相關(guān)疾病的預(yù)防或治療中的應(yīng)用。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA相關(guān)疾病選自腫瘤、血液造血系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、自身免疫病、風(fēng)濕病、糖尿病、系統(tǒng)性硬化病、皮膚病、病毒感染、細(xì)菌感染以及骨分化、肌肉分化和肌肉相關(guān)疾病，優(yōu)選細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及miRNA吸收載體、其制備及用途。具體而言，本發(fā)明提供了一種miRNA吸收載體，其攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達(dá)盒(a)II型啟動子；(b)指示蛋白編碼序列；以及(c)目的miRNA的吸收序列；(d)任選的增強子序列。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明吸收載體的慢病毒顆粒、轉(zhuǎn)基因動物及它們的制備方法。本發(fā)明的miRNA吸收載體可有效地下調(diào)相應(yīng)家族miRNA的功能，在細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)起到類似于基因敲減的作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P29/00GK102839192SQ201110173870
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者曹雪濤, 馬烽, 李楠, 徐勝 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)