專利名稱：肝祖細胞及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種肝祖細胞的技術，尤指一種肝祖細胞的制備方法及其應用。
背景技術：
慢性肝病是一種世界性的嚴重健康問題。B型肝炎、C型肝炎、酒精及某些化學藥物能夠?qū)е赂闻K纖維化及肝硬化，并最終導致肝衰竭，目前肝臟移植仍然是肝衰竭患者的惟一選擇，然而肝臟移植常受阻于缺乏捐贈者，同時，肝臟移植并不適合某些疾病，例如某些感染及某些類型的癌癥，所以需要一些替代性的方法來治療肝病及其相關的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于一個意料之外的發(fā)現(xiàn)，即多功能肝祖細胞能夠用以治療肝病及其相關問題。本發(fā)明包含一種取得肝祖細胞的方法。其方法包括取得培養(yǎng)的多功能動物細胞， 將此多功能動物細胞與肝臟組織在培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間，并收集此共培養(yǎng)的多功能動物細胞及其后代以取得肝祖細胞。其中，此多功能動物細胞對由⑶29、⑶44、⑶49b、⑶49d、 ⑶73、⑶90、⑶105、⑶13和HLA-DR所組成的群組中的一種或多種標記呈陽性反應，并對由 ⑶14、⑶34和⑶45所組成的群組中的一種或多種標記呈陰性反應。此多功能動物細胞可以是取自第一種實驗對象的臍帶的華頓氏膠(Wharton’ s jelly)，此第一種實驗對象可以是人類或是一種非人類的哺乳類動物，比如貓、狗、豬或馬等，此共培養(yǎng)的肝臟組織可以是一種受損傷的肝臟組織，此受損傷的肝臟組織是取自第二種實驗對象，第二種實驗對象可以是一種人類或非人類的哺乳類動物，將取自第二種實驗對象的肝臟組織置于一種具有肝毒性的反應物中，造成此肝臟組織的損傷，第一種實驗對象及第二種實驗對象可以是相同或不同的動物，具肝臟毒性的反應物可以是一種機械的外力或一種生理的事件，比如局部缺血、發(fā)炎反應或是一種化學藥劑，比如硫乙酰胺、四氯甲烷或是酒精，肝臟組織亦可以取自暴露于肝毒性因素的活體組織切片，肝祖細胞可以表達一種或多種選自CK18、白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶(ΤΟ)、α-胎兒蛋白(AFP)、CYP7A1、 nan0g、0ct4、ckit、肝臟生長因子(HGF)和金屬蛋白酶(MMP)群組中的基因表達，在一實施例中，多功能動物細胞對肝臟生長因子或金屬蛋白酶呈陽性反應。本發(fā)明的另一目的在于制備肝祖細胞，制備的方法如上所述。本發(fā)明的另一目的包含制備被培養(yǎng)的多功能動物細胞及肝臟細胞的組合物，該多功能動物細胞是對選自由 CD29、CD44、CD49b、CD49b、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 的群組中的一種或多種標記呈陽性反應，并對選自由⑶14、⑶34和⑶45群組中的一種或多種標記呈陰性反應，肝臟組織可以是在體外培養(yǎng)的組織，在一實施例中肝臟組織是一種受肝毒性試劑損傷的肝臟組織，在一實施例中，多功能動物細胞是取自于第一種實驗對象，比如人類臍帶的華頓氏膠。本發(fā)明包含一種治療肝臟疾病，例如纖維化或肝硬化的方法，此治療方法包含鑒定出具有肝臟疾病或有肝臟疾病風險的實驗對象，并對此實驗對象使用第一制備物或第二制備物，該第一制備物含有上述的被培養(yǎng)的多功能動物細胞，該第二制備物含有上述的肝祖細胞，該多功能動物細胞或該肝祖細胞能夠分化成表達白蛋白的細胞，肝祖細胞的制備方法如上所述。本發(fā)明并包含一種提高在實驗對象肝臟中白蛋白、金屬蛋白酶或肝臟生長因子濃度的方法，本方法包含在實驗對象中使用有效劑量的(一)第一制備物或(二)第二制備物，該第一制備物含有上述被培養(yǎng)的多功能動物細胞，該第二制備物含有上述的肝祖細胞， 肝祖細胞的制備方法已如上述。在本發(fā)明中，肝祖細胞具有下列第一特征及第二特征，第一特征是能夠表達一種或多種肝臟特異性(專一性)的基因，該基因由CK18、白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶、α-胎兒蛋白和CYP7A1所組成，第二種特征是具有發(fā)展成為干細胞的潛力，相較于取自于臍帶的華頓氏膠的多功能動物細胞以及華頓氏膠干細胞，肝祖細胞具有較低的nanog、oct4、和 ckit的干細胞基因表達量。以下，本發(fā)明的實施例將結(jié)合附圖詳細描述，從本發(fā)明的描述、附圖及權(quán)利要求書，本發(fā)明的技術內(nèi)容、特征及優(yōu)點將顯而易見。


圖 1-1 至圖 1-13 是針對 CD13 (IA)、CD14(1B)、CD29(1C)、CD 34 (ID)、CD44(1E)、 CD45(1F)、CD49b(lG)、CD49d(lH)、CD73(1I)、CD90(1J)、CD105(1K)、HLA-DR(IL)禾口 IgGh-FITC (1M，作為陽性對照)以抗體進行免疫組織化學染色的結(jié)果；圖1-14是華頓氏膠干細胞的代表性形態(tài)照片，左為低密度培養(yǎng)，右為高密度培養(yǎng)，比例線(Bar) = 500 μ m。圖2-1及圖2-2分別為照片顯示以RT-PCR及凝膠電泳測量肝臟特異性(特異性) 基因表達(圖2-1)及表格顯示半定量RT-PCR試驗結(jié)果(圖2- ，其以肝臟特異性基因表達作為華頓氏膠干細胞在與硫乙酰胺損傷的肝臟組織共同培養(yǎng)0、2、4天后的肝細胞分化程度的測量尺度。圖3-1至圖3-4為以蘇木色素及曙紅染料染色的肝臟切片的照片；圖3-1是正常老鼠肝臟切片；圖3-2是纖維化肝臟切片取自于注射硫乙酰胺200mg/kg的老鼠，每3天注射一次，共60天；圖3-3是華頓氏膠干細胞群組肝臟切片，在華頓氏膠干細胞移殖后21天取得；圖3-3是偽治療群組肝臟切片，在注射食鹽水后21天取得；比例線(Bar)= 50 μ m0圖4-1至圖4-8為以麻省三色(Masson，s trichrome)染色的肝臟切片的照片；圖4-1是正常老鼠肝臟切片；圖4-2是肝臟纖維化老鼠肝臟切片；圖4-3是華頓氏膠干細胞群組肝臟切片，在華頓氏膠干細胞移殖后7天取得；圖4-4是偽治療群組肝臟切片，在7天后取得；圖4-5是華頓氏膠干細胞群組肝臟切片，在華頓氏膠干細胞移殖后7天取得；
圖4-6是偽治療群組肝臟切片，在14天后取得；圖4-7是華頓氏膠干細胞群組肝臟切片，在華頓氏膠干細胞移殖后21天取得；圖4-8是偽治療群組肝臟切片，在21天后取得；比例線(Bar) = 200 μ m。圖5-1至圖5-4為以免疫染色法染色的肝臟切片的照片；圖5-1及圖5_2是華頓氏膠干細胞群組肝臟切片；圖5-1及圖5-2是偽治療群組肝臟切片；均在21天后取得；比例線(Bar)= 50 μ m(圖 5-1 禾口圖 5-3)，比例線(Bar) = 20 μ m(圖 5-2 和圖 5-4)。 圖6-1至圖6-4為以免疫染色法針對人類金屬蛋白酶及人類線粒體染色在移殖21 天后取得的華頓氏膠干細胞群組及偽治療群組的肝臟切片的照片；圖6-1免疫染色法針對金屬蛋白酶染色的華頓氏膠干細胞群組老鼠肝臟切片；圖6-2免疫染色法針對金屬蛋白酶染色的偽治療群組老鼠肝臟切片；圖6-3免疫染色法針對人類線粒體染色的華頓氏膠干細胞群組老鼠肝臟切片；圖6-4免疫染色法針對人類線粒體染色的偽治療群組老鼠肝臟切片；黑箭號及白箭號為金屬蛋白酶及人類線粒體陽性反應細胞，箭頭為金屬蛋白酶陽性反應的膽管細胞； 比例線(Bar) = 10 μ m。圖7-1及圖7-2為以免疫染色法針對HGF染色在移殖21天后取得的華頓氏膠干細胞群組(圖7-1)及偽治療群組(圖7-2)的肝臟切片的照片；比例線(Bar) = 20 μ m。
具體實施例方式本發(fā)明是關于多功能細胞及使用多功能細胞以治療肝臟疾病的方法。由于具有修復的特質(zhì)及分化的潛能，干細胞被用來治療肝臟疾病已見諸于醫(yī)學文獻之中，然而由于倫理面與邏輯面的考慮，阻礙了胚胎干細胞的使用，自骨髓及臍帶取得的干細胞具有成為各種細胞及肝祖細胞的潛能，同時，活體研究亦證實移植的干細胞能分化成肝祖細胞，同時表達白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶和細胞角質(zhì)蛋白18(CK18)特定的標記， 而研究亦證實移植的老鼠干細胞能夠使動物加速肝臟受到損傷后的復原。本發(fā)明使用華頓氏膠干細胞(Wharton's jelly stem cells)取得肝祖細胞，并用肝祖細胞治療肝臟疾病。胚胎干細胞或華頓氏膠干細胞s具有發(fā)展成各種細胞的潛能，包括肝祖細胞，因此它們能夠使用于再生肝細胞以治療肝臟疾病，如下面例子所顯示，華頓氏膠干細胞能夠用一般的技術手段在試管內(nèi)隔離、維持及發(fā)展，將華頓氏膠干細胞s植入老鼠之后并沒有發(fā)現(xiàn)有絲分裂活化細胞、畸胎瘤、惡性增生的發(fā)生，因此這些細胞可以植入體內(nèi)治療肝臟疾病而沒有上述的顧慮，由于這些優(yōu)點，華頓氏膠干細胞代表另一種取得多功能細胞的方法，在一個較佳的實施例中，本發(fā)明使用華頓氏膠干細胞。在一個較佳的實施例中，本發(fā)明使用人類的華頓氏膠干細胞。華頓氏膠是一種取自于臍帶的凝膠狀結(jié)締組織，華頓氏膠是由肌纖維母細胞狀的基質(zhì)細胞、膠質(zhì)纖維及蛋白多醣(Kobayashi et al.，1998，Early Hum Dev 51,223-33)所組成，華頓氏膠干細胞容易在體外被隔離(提取)及培養(yǎng)，華頓氏膠干細胞具有發(fā)展的潛能，并且在適當?shù)臈l件下，能夠分化成類神經(jīng)元細胞、類軟骨細胞、脂肪細胞、心臟細胞或是骨細胞。取自于豬臍帶的華頓氏膠的細胞，能夠培養(yǎng)至一百倍的數(shù)量，而仍然能夠旺盛活潑的成長(Weiss, et al. 2003, Exp Neurol 182，288-99)，免疫組織化學及超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)取自于華頓氏膠的細胞具有基質(zhì)細胞的特質(zhì)，并且表現(xiàn)出對各種細胞之下及細胞間基質(zhì)蛋白的不同的分布形態(tài)(Nanaev et al. 1997，Placenta 18,53-64) 下列實施例1所描述的方法可用于制備華頓氏膠干細胞(Wharton's jelly Stem Cells)，為了確認所制備的細胞的確是華頓氏膠干細胞，流式細胞儀分析或標準的免疫化學分析用于檢查培養(yǎng)至第四代至第八代的如前所述的細胞，上面所描述的抗體或描述于圖 1-1至1-14的抗體可用來檢查抗原，這些抗體可以跟適當?shù)臉擞浗Y(jié)合，比如熒光異硫氰酸鹽(FITC)、藻紅素(PE)或量子點。使用流式細胞儀，將對⑶14、⑶34和⑶45呈陰性并且對 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 呈陽性的華頓氏膠干細胞加以濃縮及純化。這些被濃縮的華頓氏干細胞可以用標準的技術來檢驗其分化潛力。第五代至第十代的細胞可以被用來誘發(fā)生成肝祖細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、骨細胞及脂肪細胞是本領域常用的技術。下面實施例所描述的方法可以用來培養(yǎng)華頓氏膠質(zhì)干細胞，以取得肝祖細胞，在另一實施例中，為確認華頓氏膠質(zhì)干細胞分化成骨細胞或脂肪細胞的潛力，華頓氏膠質(zhì)干細胞被培養(yǎng)之后再轉(zhuǎn)移至骨質(zhì)培養(yǎng)液或脂肪質(zhì)培養(yǎng)液，并培養(yǎng)一段適當?shù)臅r間，例如三周。 分化成骨質(zhì)細胞的潛力，可用鈣質(zhì)累積的程度來加以檢測，鈣質(zhì)累積的程度可用von Kossa 染色法以進行目視觀察。為檢測分化成脂肪細胞的潛力，細胞內(nèi)的脂肪微?？捎肙il Red 0加以染色，并且在顯微鏡之下觀察。華頓氏膠質(zhì)干細胞培養(yǎng)在神經(jīng)培養(yǎng)液一段適當時間， 例如七天，進行血清消耗處理及β-巰基乙醇培養(yǎng)，在分化后，華頓氏膠質(zhì)干細胞呈現(xiàn)折射細胞體(refractile cell body)形態(tài)，具有延伸的軸凸狀構(gòu)造并組成網(wǎng)絡。族系特異性 (特異性)標記的免疫細胞化學染色，可以進一步用來確認神經(jīng)的分化潛力。這些標記包括 III β-微管蛋白(tubulin) (Tuj-I)、神經(jīng)中間絲蛋白(neurofilament)和GFAP神經(jīng)元特異性標記。上述的華頓氏膠質(zhì)干細胞或肝祖細胞可以在非分化性的培養(yǎng)液中培養(yǎng)很多倍，而不產(chǎn)生自發(fā)的分化、老化、形態(tài)的改變、繁殖力的增加或分化成肝細胞的能力上的改變。如下面內(nèi)容所述，這些被確認后的華頓氏膠質(zhì)干細胞或肝祖細胞可以用標準的方法加以儲存或使用于需要的實驗對象。本發(fā)明可以使用各種可以分化成肝祖細胞的多功能干細胞或多功能干細胞實施，換言之，除了華頓氏膠質(zhì)干細胞之外，本發(fā)明的干細胞或前驅(qū)細胞可以來自于各種來源，在本發(fā)明的一個實施例中，干細胞或前驅(qū)細胞是取自于以下群組，該群組包含造血細胞、臍帶血細胞、G-CSF活動外圍血細胞、骨髓細胞、肝臟細胞、胰臟細胞、神經(jīng)細胞、寡樹突細胞、皮膚細胞、胚胎干細胞、肌肉細胞、骨細胞、間質(zhì)細胞、軟骨細胞、基質(zhì)細胞，本發(fā)明自各種來源取出干細胞的方法是本領域的常規(guī)方法，通常是選擇能夠表達一種或多種肝細胞標記的細胞，例如CD34、CD133等，或取自于缺乏某些已分化細胞標記的細胞，干細胞的篩選通常是用FACS或免疫磁性分離法，但是也可以使用核酸法，例如聚合酶鏈式反應(PCR)法，胚胎干細胞取得的方法是本領域的常規(guī)技術(Smith，Annu Rev Cell Dev Biol (2001) 17 435)，成人干細胞，亦即取自于成人組織的干細胞亦是本領域的常規(guī)技術， 分離及濃縮成人干細胞的方法已見諸于文獻中(Miraglia et al. (1997)Blood 90:5013， Uchida et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :14720, Simmons, P. J. et al. (1991)Blood 78:55，Prockop Cytotherapy(2001)3 393, ；Bohmer Fetal Diagn Ther (2002) 17 83 ；and Rowley et al. BoneMarrow Transplant (1998)21 1253), Stem Cell Biology Daniel R. Marshak(Editor)Richard L. Gardner(Editor),Publisher :Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)and Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Anthony D.Ho (Editor)Richard Champlin(Editor), Publisher :Marcel Dekker(2000))?！案杉毎笔侵改軌蚍只筛鞣N細胞的細胞，干細胞可以是全功能干細胞或多功能干細胞，全功能干細胞可以分化成任何一種細胞，全功能干細胞可以是胚胎干細胞或非胚胎干細胞，多功能干細胞通常可以分化成好幾種不同的細胞，單功能干細胞只可以產(chǎn)生一種細胞的形式，但是單功能干細胞不同于非干細胞是因為其具有自我更新修復的功能，干細胞可以取自于各種組織及器官，這些組織及器官包括但不限于血液、神經(jīng)、肌肉、皮膚、腸道、乳頭、腎臟、肝臟、胰臟與胸腺等，在本發(fā)明中，這些干細胞是可以是取自于成人或新生兒的組織或器官在本發(fā)明中，這些細胞通常是指有相當純度的細胞，在此，相當?shù)募兌仁侵高@些細胞占有一個相當?shù)谋壤?，或大部分的比例，例如超過20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80^^90%或95，一般來說一個有相當純度的細胞占有70%，通常是80%，有的時候是至少 90%，換言之，一種或多種組成的細胞族群都可以在本發(fā)明中使用。“增殖”及“擴展”在本發(fā)明中被交互使用，并且同樣是指相同形態(tài)的細胞經(jīng)由細胞分裂而增加數(shù)目，在此分化是指一個發(fā)展的過程，通過此過程細胞特化成具有一種特定功能的細胞，例如細胞取得一種或多種形態(tài)上的特征或是具有不同于最初細胞的功能，此名詞“分化”包含譜系提交及最終的分化過程，分化過程可以用檢測譜系標記是否存在而加以檢測，分化過程可以用本領域熟知的技術，例如免疫組織化學法，來檢測譜系標記是否存在以評估分化的程度，衍生自前驅(qū)細胞的后代細胞可以是，但未必是屬于干細胞來源組織的同一胚層或同一組織，例如神經(jīng)前驅(qū)細胞及肌肉前驅(qū)細胞可以分化成造血細胞家族。在本發(fā)明中，“譜系提交”及“特化”可以被交互使用，是指干細胞進行的過程，在此過程中，干細胞產(chǎn)生一種前驅(qū)細胞，用以形成一種特定范圍的已分化細胞形態(tài)，被譜系提交或指定的前驅(qū)細胞通常具有自我修復及細胞分裂的功能，在此，“最終分化”是指一種最后分化的過程， 在此過程中，細胞變成一個成熟完全分化的細胞，例如造血前驅(qū)細胞及肌肉前驅(qū)細胞可以分化成神經(jīng)或神經(jīng)膠質(zhì)細胞譜系，然后，其最終的分化過程導致形成成熟的神經(jīng)元細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞，通常最終分化過程伴隨著自細胞分裂周期的退出及細胞增殖的停止，在此， “前驅(qū)細胞”是指被指定或提交于一特定細胞譜系的細胞，這些細胞最終會經(jīng)由一系列的細胞分裂而生成此譜系細胞。本發(fā)明并提供數(shù)種藥物組合物(藥物組成)，該藥物組合物包含上述細胞、活性成分或化合物，該藥物組合物的制備是經(jīng)由混合治療上有效劑量的細胞、活性成分、化合物以及藥物學上可接受的載體，且該藥物成分可以選擇性的加入其它的活性物質(zhì)，此載體具有不同的形式，其形式依使用的途徑來確定。上述的藥物組合物可以使用習知的藥物賦形劑及藥物制備方法，該藥物賦形劑可以與各種藥劑、溶劑、造粒劑、濕潤劑及連結(jié)劑(粘結(jié)劑)混合。在此所指的“有效劑量” 或“治療上的有效量”，是指可以造成一特定病癥的癥狀或參數(shù)有可測量的改善的藥劑量， 上述細胞的治療有效量，是可用本領域中習知的方法來確定，本領域的技術人員可使用以經(jīng)驗為依據(jù)的方法來確定治療一種疾病的有效量。使用于患者的精確藥劑量，應當視疾病嚴重的程度及其患者的身體狀況來確定，一個可以造成癥狀或參數(shù)可測量的改變的量，可由本領域技術人員確定或由病人向醫(yī)生的報告而確定，在此應當了解的是，任何臨床上或統(tǒng)計學上的有意義的改變或改善均屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，所謂臨床上有意義的改變或改善，是指病人或醫(yī)生可以察覺到的改變或改善。此詞組“藥物學上可接受的”是指，它的分子本身及它的成分是生理學上可以忍受而且不會對病人產(chǎn)生不想要的反應，更為理想的是，“藥物學上可接受”是指中央或地方政府的藥物管理當局所批準，或在美國藥典或其它公認的藥典被認為是可以使用于哺乳類， 尤其是人類的藥物，藥物學上可接受的鹽類、酯類、胺類及前驅(qū)(前體)藥物，是指這些有良好醫(yī)學評價并且與病人的組織接觸史，不會造成毒性發(fā)炎或過敏反應的鹽類、酯類、胺基化合物及前驅(qū)藥物，這些鹽類、酯類、胺基及前驅(qū)藥物等等，并須符合一個合理的利益/風險比例，并對使用的目的有效。上面所述使用于藥物組合物的載體，是指一種稀釋劑、賦形劑或載體，這些藥物載體可以是無菌的液體，如水或油。水或水溶液、食鹽溶液、葡萄糖水溶液及甘油溶液是較理想的載體，尤其是對注射用的溶液而言，適合使用的藥物載體記載于下述文獻 (“Remington' s Pharmaceutical Sciences^by Ε.W. Martin,18th Edition)。上述的細胞可通過注射或注入的方式施加于患者，例如靜脈注射、腦脊椎膜注射、肌肉注射、管腔注入、氣管注入、腹膜注入或皮下注射，口服或貼皮吸收，或其它本領域中所習用的方式，藥物的施用可以是兩周一次、一周一次或更高的頻率使用，但是在疾病的穩(wěn)定期通常使用的頻率會減少。異體移植細胞與自體移植細胞都可以被使用。在前一種情形，應該要進行人類白血球抗原配對(HLA-matching)，以避免或減低被移植者的反應，在后面的一種情形中，自體細胞被濃縮和純化并且儲存以待后續(xù)使用，這些細胞可以在體外以被移植者的T細胞共培養(yǎng)然后再被導入被移植者的體內(nèi)，這樣做可以讓被移植者的身體認為這些細胞是他自己的，而進而降低T細胞的反應。藥物使用的劑量及使用的頻率將視臨床征兆而定，例如病人在緩解期或急性期， 在緩解期中，至少一種急性期的臨床征兆將會消失或減少，并且藥物的劑量與使用的頻率也將視這種用藥物或用藥物來治療的疾病的病人征兆及臨床或非臨床的征候是否有減少， 藥物劑量及使用的頻率也將視病人或是被治療的哺乳類實驗對象的年紀、性別、健康狀況而定，并且也參考藥物的作用及副作用以及醫(yī)生的判斷，在所有上述的方法中，細胞可以每次以一萬到十萬個數(shù)量使用于試驗對象。本發(fā)明并包含一種治療肝臟疾病或緩解肝臟疾病癥狀的方法，此方法包含診斷 “需要”治療的試驗對象，以及使用或移植上述的細胞，需要診斷的對象例如患有肝臟疾病或具有肝臟疾病風險。施用或移植可通過直接注入目標器官、注入血液或注入腹膜內(nèi)的方式施行，適當?shù)氖┯没蛞浦驳姆椒▽⒂梢韵碌姆绞酱_定，例如監(jiān)測被植入的細胞到目標器官的遷移路徑，所想要的器官特異性基因或標記的表達，以及試驗對象的器官的功能，例如白蛋白或肝臟生長因子。在此，應當被認知的是在活體外被培養(yǎng)的干細胞或前驅(qū)細胞被植入肝臟，以提供細胞一個有利生長的環(huán)境，然后分化成能夠表現(xiàn)出對肝臟細胞特異性的特征，然后這些
9分化完成的細胞可以再被移出、分離、再度的植入肝臟的其它部分或其它的試驗對象。這些試驗對象可以是人類或是非人類的哺乳類動物，諸如貓、狗、豬、馬，肝臟疾病包括肝硬化及肝纖維化，在第21段中提及的“需要”是指試驗對象處于一種狀態(tài)，這種狀態(tài)為肝功能需要被加強，此狀態(tài)包括但不限于這些施用對象患有下列原發(fā)性肝臟疾病，例如原發(fā)性膽汁郁積性肝硬化、肝癌、原發(fā)性硬化性膽管炎、自體免疫慢性肝炎、酒精性肝炎以及感染性疾病，例如C型肝炎，此狀態(tài)亦包含一些次要的狀態(tài)，比如寄生蟲引起的感染， 例如蛔蟲，或是藥物及化學藥品中毒。在本發(fā)明的此部分，干細胞或前驅(qū)細胞的捐贈者及接受者可以是同一個體或是不同個體，比如同種異體或異種異體，當進行同種異體的移植， 降低移植排斥的照護需要被進行，此類的照護常常施行于人類的治療，相關的治療如以下文獻所述(Slavin et al. , e. g. , J Clin Immunol (2002) 22 :64, and J. Hematother Stem Cell Res(2002) 11 :265),Gur et al. (Blood(2002)99 :4174)，and Martelli et al,(Semin Hematol(2002) 39 :48))。標準的技術可用來診斷一個需要被治療的試驗對象是否具有相關的狀況或癥狀， 例如過度的膠原沉積是由慢性病毒、肝炎、酒精濫用以及藥物中毒所引起的肝臟纖維化的主要特征。此治療方法須對需要治療的試驗對象使用有效劑量的上述細胞，而且治療效果可用標準的方法加以評估，例如以下實施例所描述的方法。本發(fā)明并包含一種增加在受測試對象肝臟中白蛋白、肝臟生長因子或金屬蛋白酶的方法，此方法包括在需要治療的試驗對象中，使用含有培養(yǎng)多功能動物細胞的第一制備品，或含有肝祖細胞的第二制備品，該多功能動物細胞是對選自于以下群組中的一種或多種標記呈陽性反應，該群組由 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 所組成，該多功能動物細胞并對取自以下群組的一種或多種標記產(chǎn)生陰性反應，該群組由 CD14、CD34和CD45所組成，該金屬蛋白酶在消化肝硬化膠原中扮演重要的角色，某些研究顯示增加金屬蛋白酶的表達有助于降低肝硬化中的膠原。我們可以通過測量白蛋白、肝臟生長因子或金屬蛋白酶在樣本中的表達量，以確認治療的功效，這些樣本是在本發(fā)明的藥品使用前及使用后取自于試驗對象，這些表達量是由mRNA水平或蛋白質(zhì)水平所確定，在測量組織樣本或體液樣本中的mRNA水平的方法，是本領域中的習知技術，為測量mRNA的水平，細胞被溶解，而在溶解產(chǎn)物中mRNA的水平可由如下方法所確定，例如雜交試驗法或定量或半定量的RT-PCR，無論該溶解產(chǎn)物是否有純化，其中，該雜交試驗法是使用具有基因特異性的DNA或RNA探針，而RT-PCR是使用適當?shù)幕蛱禺愋砸铮硗?，定量或半定量的原位雜交試驗，可用來檢查組織切片或未溶解的細胞懸浮液，該定量或半定量的原位雜交試驗是使用以熒光劑或酶所標記的DNA或RNA探針， 此外，mRNA定量法包含有RNA保護試驗法(RPA)、基因表達序列分析法(SAGE)及數(shù)組技術。在組織樣本或體液中，測量蛋白質(zhì)水平的方法在本領域中是習知的方法，某些測量蛋白質(zhì)水平的方法，使用可以特異性的結(jié)合于目標蛋白質(zhì)的抗體，例如單株抗體或多株抗體，在這些方法中，抗體本身或結(jié)合于該抗體的次級抗體可以被檢測到。或者抗體結(jié)合生物素。而抗生物素又用來標記生物素(抗生物素是一種可與生物素結(jié)合的多勝肽)，抗生物素是可以被檢測，檢測抗生物素的含量就可以確定生物素的含量，上述多種手段的結(jié)合，包括“多層三明治檢測法(multi-layer sandwich assay) ”可以用來加強檢測蛋白質(zhì)的敏感度，某些蛋白質(zhì)測量法，例如酵素連結(jié)免疫吸附法(ELISA)或免疫印跡法(Western blot) 可以使用于體液或細胞的溶解物的蛋白質(zhì)檢測，而一些其它的蛋白質(zhì)檢測法，比如免疫組織學法或熒光流式細胞儀，則可使用于組織切片或未溶解細胞懸浮液的蛋白質(zhì)檢測，可以使用的標記包括放射性核種(同位素)，例如125I、mI、35S、3H或32P酶堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、熒光酵素(熒光酶)或半乳糖苷酶、熒光發(fā)光劑例如熒光、藻紅蛋白、GFP、BFP和由 Quantum Dot Corporation供應的Qdot ，其它可使用的方法包括定量免疫沉淀反應法及互補結(jié)合反應法。上述試驗方法的結(jié)果可用以確定藥物使用的劑量范圍及藥物施用的途徑，藥物的劑量確定于藥物施用的途徑、藥物的配方、患者的疾病，以及患者本身的體重、表面積、年紀或性別，以及是否有其它的藥物也在同時施用以及醫(yī)生的判斷，由于不同的藥物適用途徑有不同的藥物效率，因此藥物劑量的變化是必須的，習知的根據(jù)經(jīng)驗的標準方法可用于調(diào)整藥物劑量以達到最佳的效果。一般而言，細胞的施用量是在IxlO4到IxlO7之間，比如 IxlO5到切106而較理想的是切105到hio5，依據(jù)治療的特質(zhì)，藥物可以同時施用于多個不同部位，如上所述，自體移植或異體移植的華頓氏膠干細胞或肝祖細胞都可以被使用，在異體移植的情形，人類白血球抗原配對要被進行以避免或減低被移植者的反應，在自體移植的情形，自體細胞將被濃縮及純化并且被儲存?zhèn)溆?。“治療”是指對試驗對象施用藥物組合物，例如細胞組成，而該試驗對象是患有肝臟疾病或有肝臟疾病的風險，治療的目的是改善肝臟的疾病并且減輕肝臟疾病的癥狀或是減少發(fā)生肝臟疾病的風險，肝臟疾病包括原發(fā)性的肝臟疾病，例如原發(fā)性膽汁肝硬化、肝癌、原發(fā)性硬化性膽管炎、自體免疫性肝炎、酒精性肝炎以及感染性肝炎，例如A型、B型或C 型肝炎、肝臟疾病包括一些次級(繼發(fā))的狀況，例如寄生蟲或蛔蟲感染、藥物及化學藥品中毒等，由于肝臟在新陳代謝及體內(nèi)平衡中扮演關鍵性角色，例如白蛋白的合成及血管的形成，因此受損的肝功能會造成神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)的嚴重結(jié)果。在此，所謂的有效劑量是指藥物組合物的量足以在受治療的對象中產(chǎn)生醫(yī)學上所想要的效果，治療可以單獨使用或與其它的藥物或治療并用。在本發(fā)明的一個實施例中，上述的細胞及方法可用于有效率的促進干細胞或前驅(qū)細胞(前體細胞)的體外培養(yǎng)，這些干細胞或前驅(qū)細胞是取自于攜帶型骨髓、外圍血液及內(nèi)皮層器官并且適合于移植進入肝臟，同時這些體外培養(yǎng)的細胞能夠用于治療肝臟疾病即恢復肝臟功能，本發(fā)明的這些方法并能用于移植器官的細胞基因治療。本發(fā)明的上述方法并可包括在這些植入細胞之前、同時或之后，對受試驗者進行抑制免疫反應的照護(護理)，這些免疫照護的方法包括使用免疫抑制的藥物，提高對植入細胞的容忍度(耐受性)以及使用的免疫抑制的放射線照射，這些免疫治療照護的方法是本領域中習知的技術并見諸于下列文獻。(例如Kirkpatrick et al. , 1992. JAMA. 268, 2952 ；Higgins et al.，1996. Lancet 348,1208 ；Suthanthiran et al.,1996. New Engl. J.Med. 331,365；Midthun et al. ,1997. Mayo Clin Proc. 72,175 ；Morrison et al., 1994. Am J. Med. 97,14 ；Hanto 1995. Annu Rev Med. 46,381 ；Senderowicz et al. , 1997. Ann Intern Med. 126,882 ；Vincenti et al.,1998. New Engl. J. Med. 338,161；Dantal et al.1998.Lancet 351,623)。
適用的免疫抑制藥物包括CTLA4_Ig、抗-⑶40抗體、抗-⑶40配體抗體(anti-⑶40 ligand antibodies)、抗-B7抗體、抗-CD3抗體(例如，抗-人CD3抗體0KT3)、甲氨喋呤 (methotrexate, MTX)、5S的豐公(prednisone) >(methyl prednisolone) > 1 ^ (azathioprene) ^ (cyclosporin)A(CsA) >^3 ^ (tacrolimus) > 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)和氟達拉賓(f ludarabin)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、達利珠單抗(daclizumab)(人源化(IgGlFc)抗-IL2R α 鏈(CD25)抗體)、連接至毒素的抗-T-淋巴細胞抗體(例如，霍亂(Cholera)A鏈、或假單胞菌(I^eudomonas)毒素)、以及能夠抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian-target-of-rapamycimmTOR)活性的試劑。在此需要特別說明的是以下實施例僅用于說明本發(fā)明而并非用于限制本發(fā)明的范圍，根據(jù)本發(fā)明所敘述的內(nèi)容任何熟悉此項技術人員當然能據(jù)以充分實施本發(fā)明，而任何依據(jù)本發(fā)明所做的任何變化與修改亦將包含于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。下述為本發(fā)明的實施步驟。華頓氏膠干細胞的培養(yǎng)根據(jù)先前的報告，本試驗使用的華頓氏膠質(zhì)干細胞是在捐贈者同意之下取自于捐贈的臍帶，這些華頓氏膠干細胞的取得是在佛教慈濟醫(yī)院審核委員會的同意之下進行， 這些取得的細胞是在含有5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，在攝氏37°C進行培養(yǎng)，這些取得的細胞是在IMDM(Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium)的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)及增值， 此培養(yǎng)液含10%的胎瘤血清(HYCL0NE，Logan, UT, USA)及l(fā)Ong/mL的堿性纖維組織母細胞增長因子(R&D，Minneapolis,麗，USA)、2mM的麩胺酰胺和100U/L的盤尼西林鏈霉素 (INVITR0GEN, Carlsbad, CA, USA)。在本發(fā)明的實驗中是使用繁殖10到20倍的細胞。華頓氏膠干細胞的特征在使用各種抗體對華頓氏膠干細胞的表面標志進行標記之后，華頓氏膠干細胞的表面標志用流式細胞儀加以分析(FC500 ；BECKMANCOULTER, Brea, CA, USA)，這些抗體是針對各種人類的抗原 CD105 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, Santa Cruz, CA, USA) ；CD13、CD14、 CD29、CD34、CD44、CD45、HLA-DR 和 IgG2a(DAK0, Carpinteria, CA, USA)以及 CD49b、CD49d、 CD73 和 CD90 (BECT0N DICKINSON, Franklin Lakes, NJ, USA)，次級抗體(二抗)則與異硫氰酸酯熒光素(CHEMIC0N，Temecula，CA，USA)結(jié)合以便進行檢測。試管內(nèi)肝細胞分化在本發(fā)明中，試管內(nèi)肝細胞分化實驗是依據(jù)一個改良的細胞培養(yǎng)方案進行，該方案記載于下列文獻(2004, Nat. Cell Biol. 6(6) :532-539, by Jang et al.), Wyss (3 X IO4) 與50毫克的肝臟組織共同培養(yǎng)于一個6孔培養(yǎng)皿(BECT0N DCKINS0N)，該培養(yǎng)皿具有孔徑大小為0.4微米的薄膜分開細胞及組織，這些肝臟組織是取自于一種雄性的老鼠，而這些雄性的老鼠在培養(yǎng)之前其父母以350毫克/公斤的劑量暴露于一種肝毒性的試劑，例如硫乙酰胺中M小時，在培養(yǎng)期間的第二天及第四天，從華頓氏膠干細胞萃取出所有的RNA，同時cDNA則被制備成樣本以進行肝臟特異基因的聚合酶鏈式反應分析(PCR)。該聚合酶鏈式反應是在下列條件下進行35個周期，每一周期包含在95°C進行變性反應30秒，再進行退火30秒，依據(jù)所使用的引物對(primer set)在56_60°C進行，在 72°C延伸60秒，最后在72°C進行10分鐘的培養(yǎng)，使用這些引物對擴增的DNA則使用凝膠電泳進行分析。白蛋白(F)5' -TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGG-3‘ (SEQ ID NO :1)禾口(R) 5' -AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3‘ (SEQ ID NO :2)。色氨酸2，3雙加氧酶(F)5' -TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG-3‘ (SEQ ID NO :3)和(R)5' -CTCTGGATTGACTGTGGAAGT-3‘ (SEQ ID NO :4)。a-胎兒蛋白(F) 5' -ATACAGAGACTTCAGGAGC-3 ‘ (SEQ ID NO :5)禾口(R)5' -GTGAAGAGGGAAGACATAACTG-3‘ (SEQ ID NO :6。肝臟生長因子(F) 5' -CAGATCATCCATTGCATTCG-3 ‘ (SEQ ID NO :7)禾口(R)5' -ACTCCAGAGGCATTTCCATG-3‘ (SEQ ID NO :8)。金屬蛋白酶(F) 5，-TgAATgCCCTTgATgTCATCCT-3，(SEQ ID NO :9)和(R)5，-ACACCTACACCAAgAACTTC-3，(SEQ ID NO :10)。CYP7A1 (F) 5，-GAGAAGGCAAACGGGTGAAC-3，(SEQ ID NO :11)禾口(R)5，-ATCGGGTCAATGCTTCTGTG-3，(SEQ ID NO :12)。Nanog (F) 5，-TGCCTCACACGGAGACTGTC-3，(SEQ ID NO :13)禾口(R)5，-TGCTATTCTTCGGCCAGTTG-3，(SEQ ID NO :14)。OCT 4 (F) 5，-CTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAA-3，(SEQ ID NO :15)禾口(R)5，-CTGCAGTGTGGGTTTCGGGCA-3，(SEQ ID NO :16)。ckit (F) 5，-ATGAGAGGCGCTCGCGGCGC-3，(SEQ ID NO :17)禾口(R)5，-AGCTTGGCAGGATCTCTAAC-3，(SEQ ID NO :18)。甘油酸-3-磷酸脫氧酶(F)5' -GGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3‘ (SEQ ID NO 19)禾口(R)5' -GCAGGTTTTTCTAGACGG-3‘ (SEQ ID NO :20)。建立老鼠肝臟纖維化的模型及確定其肝臟纖維化的程度Wistar Kyoto (WKY)老鼠自LASCO公司(臺北、臺灣)取得，所有的試驗程序皆遵 循道德規(guī)范并由東華大學動物照護使用委員會所批準。20只成年的雄性WKY老鼠重量320士20克被使用來建立慢性肝臟纖維化的模型， 其中的20只在父母內(nèi)被注射200毫升/公斤的硫乙酰胺(SIGMA-ALDRICH)，鋒三天一次總 共60天，亦即總共注射20次以作為纖維化模型組，其中的八只則被注射食鹽水做為對照 組，在第64天，亦即在最后一次注射之后的四天，這些老鼠被處死并且取其心臟血液樣本 及肝臟樣本。
這些血液樣本使用生化分析儀(INTEGRA 800 ；ROCHE, Holliston, MA, USA)分析，以測量肝功能指數(shù)，這些肝功能指數(shù)包含GOT (谷草轉(zhuǎn)氨酶，glutamate oxaloacetate transaminase)與 GPT (谷丙轉(zhuǎn)氨酶，glutamate pyruvate transaminase)。這些肝臟組織的樣本使用膠質(zhì)纖維染色法(麻省三色染色，Masson’ s trichrome staining)檢查組織，并以是否有過度膠原蛋白的累積造成的纖維化切片，這些肝臟組織樣本以3. 7%的甲醛固定，然后包埋于石蠟中，然后一系列的三微米厚的切片是被包埋的組織中取出，并以蘇木色素、曙紅染料與麻省三色染色。就膠質(zhì)纖維染色法而言，被切片的樣本放置于56 °C的布安氏液(Bouin’ s solution ；SIGMA-ALDRICH)中一個小時，然后依照順序在下列溶液中培養(yǎng)，蘇木紫溶液 (Mayer' s hematoxylin solution) 5 分I中、酸溶液(Biebrich scarlet-acid fuchsin solution) 15 分鐘、磷銷酸-磷鶴酸溶液(phosphomolybdic acid-phosphotungstic acid) 15分鐘、苯胺藍溶液(aniline blue)5分鐘。每一個實驗組的肝臟纖維化程度由以下文獻記載的方法加以定量(Bruck et al.，2007，J. Gastroenterol. Hepatol. 22(12) :2189-2194)，這些由膠質(zhì)纖維染色的肝臟組織切片被拍照，然后由三位獨立的病理學家從0-3作半定量的評分，每一塊載玻片選取十個不同位置加以評分，然后平均這些分數(shù)以確定肝臟纖維化的程度，分數(shù)越高表示肝臟纖維化的程度越高。細胞移植步驟如前所述華頓氏膠干細胞QX IO7個)已經(jīng)與硫乙酰氨中毒的肝臟組織在75平方公分的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后華頓氏膠干細胞以胰蛋白酶消化的方法分離并用離心的方法加以收集，這些收集的細胞再以2X IO6個細胞/毫升的濃度懸浮于一般的食鹽水中。細胞移植是依照一個改良的實驗方案進行，該實驗方案記載于以下文獻(Abdel Aziz et al. , 2007, Clin. Biochem. 40 (12) :893-899 and Zhao et al. ,2005, World J. Gastroenterol. 11(22) :3431-3440)，在上述建立肝臟纖維化模型中所提到的，用硫乙酰胺引起纖維化肝臟的30只老鼠在第64天，即在最后一次注射硫乙酰胺后的4天，被用于細胞移植實驗，這些老鼠被隨意分成兩組，一組是華頓氏膠干細胞組，一組偽治療組，15只在華頓氏膠干細胞組的老鼠用乙醚加以麻醉后，再經(jīng)由門靜脈注入含有100萬個華頓氏膠干細胞的食鹽水，而治療組的老鼠則被注射0. 5毫升的一般生理食鹽水。自細胞移植之后，每周從兩組各取出5只老鼠加以處死，連續(xù)三周，然后進行生化肝功能組織檢查及肝臟病理組織學檢查。被移植的華頓氏膠干細胞s的特征被移植的華頓氏膠干細胞的表達對人類白蛋白、人類線粒體、人類金屬蛋白酶以及人類肝臟生長因子有特異性的單株抗體被用來確定被移植的華頓氏膠干細胞是否有表達出如前面所述的肝臟標記。使用抗人類白蛋白，抗金屬蛋白酶以及抗人類肝臟生長因子的試劑，對包埋于石蠟并經(jīng)過切片的肝臟樣本進行免疫組織化學分析，然后一個免疫組織化學分析的套組(INN0GENEX，San Ramon, CA, USA)用來將存在的抗原予以可視化，為使用于熒光顯微鏡檢測抗原，這些被切片的肝臟樣本先在抗人類線粒體培育一個晚上，再與二級抗體(羅丹明連接的抗小鼠二抗)一起培育。統(tǒng)計分析
所有取得的數(shù)據(jù)與具有標準差的平均值呈現(xiàn)，使用學生氏t實驗(student’ s t test)來比較治療組與對照組的數(shù)據(jù)差異，考慮到治療組及對照組的統(tǒng)計差異ρ值小于 0. 05。實驗結(jié)果華頓氏膠干細胞的形態(tài)及其表面標記分別用顯微鏡及流式細胞儀加以確定，華頓氏膠干細胞的表面標記類似于前面所述(Tang et al.，2006，World J. Gastroenterol. 12(25) :4014-4019)，在此一研究中所取得的華頓氏膠干細胞并不具有造血細胞的標記，例如⑶14、⑶34或⑶45但是具有間葉干細胞的標記(例如⑶四、⑶44、 ⑶49b、⑶49d、⑶73、⑶90和⑶10 及骨髓細胞的標記⑶13，及主要組織兼容性復合體標記HLA-DR，如圖第IA到圖IM所示，同時華頓氏膠干細胞具有類似人類纖維母細胞的形態(tài)， 如圖IN所示。為了測試華頓氏膠干細胞與受硫乙酰胺所傷害的老鼠肝臟組織共同培養(yǎng)時是否能夠進行肝臟細胞分化，前面所述方法去測試肝臟細胞標志，RT-PCR顯示，在分化條件下所培養(yǎng)的華頓氏膠干細胞能夠取得肝臟特異性基因的表達，包括色氨酸2，3雙加氧酶、白蛋白、α -胎兒蛋白和CYP7A1，同時肝臟生長因子和金屬蛋白酶的基因表達亦有所增加，而干細胞的基因表達，包括nan0g、0ct4和ckit則減少，這些結(jié)果顯示華頓氏膠干細胞具有在試管中分化成類肝臟細胞的潛力。肝臟纖維化模型的特征及華頓氏膠干細胞細胞治療的效果評估如表1所示，相較于正常的老鼠群組，肝臟纖維化老鼠群組的GOT及GPT有顯著的增加(GOT 從 110 士 16U/L 至 1034士 361U/L，以及 GPT 從 77 士 10U/L 至 185 士 50U/L)，這樣的結(jié)果顯示肝臟有受到傷害。表1正常老鼠及肝纖維化老鼠的血漿生化值
權(quán)利要求
1.一種取得肝祖細胞的方法，包括取得含有被培養(yǎng)的多功能動物細胞的制備物，所述制備物對一種或多種選自以下群組的標記呈陽性反應，所述群組由⑶29、⑶44、⑶49b、 ⑶49d、⑶73、⑶90、⑶105、⑶13和HLA-DR所組成，并對一種或多種取自以下群組的標記呈陰性反應，所述群組由⑶14、⑶34和⑶45所組成，將所述多功能動物細胞與肝臟組織培養(yǎng)于培養(yǎng)液中一段時間，然后收集所述共培養(yǎng)的多功能動物細胞的后代以取得肝祖細胞，其中，所述多功能動物細胞是取自于第一實驗對象的臍帶的華頓氏膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一實驗對象是人類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述共培養(yǎng)肝臟組織是一種受傷的肝臟組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述受傷的肝臟組織是通過以下過程取得，所述過程包含使取自于第二試驗對象的肝臟組織經(jīng)受肝臟毒性試劑的作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述肝臟毒性試劑是一種化學試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述化學試劑是硫乙酰胺或四氯甲烷。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述肝祖細胞表達一種或多種選自于以下群組的基因，所述群組由CK18、白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶、α-胎兒蛋白、CYP7A1、nanog、 oct4、ckit、肝臟生長因子和金屬蛋白酶所組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多功能動物細胞對肝臟生長因子或金屬蛋白酶呈陽性反應。
9.一種制備物，包含肝祖細胞，其中，所述細胞表達一種或多種選自以下群組的基因， 所述群組由0(18、白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶、0-胎兒蛋白丄丫 7六1、皿11(^、0(^4、01^仏肝臟生長因子和金屬蛋白酶所組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備物，其中，所述細胞由權(quán)利要求1所述的方法制備。
11.一種組合物，包含制備品，所述制備品含有培養(yǎng)的多功能動物細胞和肝臟組織， 其中，所述多功能動物細胞對一種或多種取自于以下群組的標記呈陽性反應，所述群組由 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 所組成，并對一種或多種取自于以下群組的標記呈陰性反應，所述群組由⑶14、⑶34和⑶45所組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述肝臟組織是一種分離的肝臟組織。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述肝臟組織是經(jīng)受肝臟毒性試劑作用而受傷的肝臟組織。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述多功能動物細胞是取自于第一實驗對象的臍帶的華頓氏膠。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中，所述第一實驗對象是人類。
16.一種治療肝纖維化或肝硬化的方法，包括鑒定出患有肝硬化或肝纖維化或具有肝硬化或肝纖維化風險的對象，以及施用于所述對象有效劑量的(一)第一制備物或(二) 第二制備物，其中，所述第一制備物包含培養(yǎng)的多功能動物細胞，所述第二制備物含有肝祖細胞，其中，所述多功能動物細胞對一種或多種選自以下群組的標記呈陽性反應，所述群組由 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 所組成，并對一種或多種選自以下群組的標記呈陰性反應，所述群組由⑶14、⑶34和⑶45所組成。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述多功能動物細胞或所述肝祖細胞施用于所述對象并分化成表達白蛋白的細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述肝祖細胞依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備。
19.一種增加肝臟中白蛋白、肝臟生長因子或金屬蛋白酶含量的方法，包括施用于需要對象有效量的(一)第一制備品或(二)第二制備品，其中，所述第一制備品含有培養(yǎng)的多功能動物細胞，所述第二制備品含有肝祖細胞，其中，所述多功能動物細胞對一種或多種選自以下群組的標記呈陽性反應，所述群組由⑶四、⑶44、⑶49b、⑶49d、⑶73、⑶90、 ⑶105、⑶13和HLA-DR所組成，并對一種或多種選自以下群組的標記呈陰性反應，所述群組由⑶14、CD34和CD45所組成。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述肝祖細胞依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明提供一種肝祖細胞的制備方法及其應用。本發(fā)明的取得肝祖細胞的方法包括取得含有被培養(yǎng)的多功能動物細胞的制備物，該制備物對一種或多種選自由CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13和HLA-DR所組成的群組的標記呈陽性反應，并對一種或多種取自由CD14、CD34和CD45所組成的群組的標記呈陰性反應，將多功能動物細胞與肝臟組織培養(yǎng)于培養(yǎng)液中一段時間，然后收集共培養(yǎng)的多功能動物細胞的后代以取得肝祖細胞，其中，多功能動物細胞是取自于第一實驗對象的臍帶的華頓氏膠。通過本發(fā)明獲得的多功能肝祖細胞能夠用以治療肝病及其相關問題。
文檔編號A61P1/16GK102234626SQ20111011742
公開日2011年11月9日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者林欣榮, 韓鴻志 申請人:國璽干細胞應用技術股份有限公司