專利名稱：包括胎盤提取物的細(xì)胞保護(hù)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括胎盤提取物的細(xì)胞保護(hù)劑，更具體地，涉及用于儲(chǔ)存和保護(hù)動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)劑，所述細(xì)胞保護(hù)劑包括氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、生長因子和胎盤提取物。
背景技術(shù)：
通常，細(xì)胞是在_196°C的極低溫度下冷凍保藏，并在需要活細(xì)胞時(shí)迅速解凍獲得。盡管凍融細(xì)胞(frozen-and-then-thawed cells)的存活率根據(jù)細(xì)胞類型或操作員的熟練程度而不同，但是正常且有用的細(xì)胞，非癌癥細(xì)胞，的存活率非常低。另外，在只需要運(yùn)輸或儲(chǔ)存幾小時(shí)或幾天，而并非長期運(yùn)輸或儲(chǔ)存的情況下，深低溫保藏(cryopreservation)法是不實(shí)際的。
近來，正在開發(fā)使用從動(dòng)物組織分離的成熟細(xì)胞或干細(xì)胞來治療各種疾病的細(xì)胞治療技木。因此，強(qiáng)烈需要開發(fā)出能長時(shí)間維持從組織獲得的成熟細(xì)胞和干細(xì)胞的存活性(viability)并提供更佳保藏的保護(hù)劑。目前，暫時(shí)將用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基用作細(xì)胞保護(hù)劑，而關(guān)于專用于保藏細(xì)胞的有用保護(hù)劑的研究很少。針對(duì)人類干細(xì)胞培養(yǎng)，使用包括動(dòng)物血清(胎牛血清)的培養(yǎng)基。由于使用胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞即使在用無血清溶液洗滌細(xì)胞后，仍舊與感染瘋牛病或其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，因此美國禁止將使用胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞移植給人類。從人骨髓以及從脂肪組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell)的技術(shù)分別公開于Pittenger et al. [Science284 143-147，1997]和 Van et al. [J. Clin. Invest. 58 699-704，1976]，其中使用a-MEM或DMEM和10_20%胎牛血清來培養(yǎng)細(xì)胞。然而，動(dòng)物血清(胎牛血清)的使用在涉及向人體移植的安全性方面具有爭議。
為了克服這ー問題，嘗試使用人血清代替胎牛血清[Kuznetsov SA, et al.,Transplantation. 2000Dec 27; 70 (12) : 1780-7]。然而，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基中使用人血清而不進(jìn)行任何處理時(shí)，干細(xì)胞容易喪失它們的特性，例如増殖和分化能力降低、易于分化成骨細(xì)胞等等。另外，移植后，干細(xì)胞的存活性極低并且不會(huì)完全發(fā)揮它們的能力。為了優(yōu)化成體干細(xì)胞的組織再生，需要對(duì)提高移植的干細(xì)胞的存活性以及優(yōu)化并提高移植效果的技術(shù)進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題因此，本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞保護(hù)劑，所述細(xì)胞保護(hù)劑相比于現(xiàn)有的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基能夠提高在低溫下儲(chǔ)存的細(xì)胞的存活性，井能夠提高干細(xì)胞的増殖和能力(capability)。技術(shù)方案本發(fā)明的發(fā)明者們致カ于解決前述現(xiàn)有技術(shù)的問題。結(jié)果，他們開發(fā)了ー種包括氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、生長因子和胎盤提取物的細(xì)胞保護(hù)劑，并證實(shí)該細(xì)胞保護(hù)劑能夠不使用動(dòng)物血清而提高動(dòng)物細(xì)胞的存活性且能夠增強(qiáng)干細(xì)胞的能力。有益效果本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑可用于安全地儲(chǔ)存細(xì)胞，不僅是干細(xì)胞而且還有各種其他的動(dòng)物細(xì)胞。當(dāng)用于細(xì)胞治療的細(xì)胞在低溫儲(chǔ)存和運(yùn)輸時(shí)，該細(xì)胞保護(hù)劑可用于保護(hù)所述細(xì)胞。當(dāng)在培養(yǎng)前用本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑處理動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，可獲得提高的細(xì)胞増殖率和干細(xì)胞能力。因此，本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑作為保藏細(xì)胞以及提高干細(xì)胞能力的保護(hù)劑是非常有用的。


通過下面結(jié)合附圖對(duì)給出的優(yōu)選實(shí)施方式的描述，本發(fā)明的上述以及其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見，在附圖中圖I比較了在對(duì)照培養(yǎng)基或在本發(fā)明的CeLLGUARD溶液中低溫(4°C )儲(chǔ)存了 72小 時(shí)的從脂肪組織中分離的脂肪細(xì)胞在沒有培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞存活率；圖2a比較了用對(duì)照培養(yǎng)基或CeLLGUARD處理的源自脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的干細(xì)胞能力；圖2b比較了用對(duì)照培養(yǎng)基或CeLLGUARD處理的源自脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞増殖率；圖3a比較了用對(duì)照培養(yǎng)基或CeLLGUARD處理的源自脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞在7天、10天和14天的細(xì)胞增殖率；圖3b示出了用對(duì)照培養(yǎng)基或者CeLLGUARD處理源自脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞后，鑒定表面表達(dá)標(biāo)記的結(jié)果；圖4a和圖4b比較了用對(duì)照培養(yǎng)基或CeLLGUARD處理的間充質(zhì)干細(xì)胞愈合傷ロ的效果;圖5示出了在用對(duì)照培養(yǎng)基或CeLLGUARD處理從皮膚組織分離的角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte)并培養(yǎng)后,鑒定表面表達(dá)標(biāo)記的結(jié)果；以及圖6比較了從皮膚組織分離的角質(zhì)形成細(xì)胞在用對(duì)照培養(yǎng)基或CeLLGUARD處理后，培養(yǎng)后的干細(xì)胞能力。最佳實(shí)施方式下文中，將參考附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方式。一方面，本發(fā)明提供ー種包括氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、生長因子和胎盤提取物的細(xì)胞保護(hù)劑。在本發(fā)明中，細(xì)胞保護(hù)劑指ー種培養(yǎng)基組成，所述組成用于在低溫或者室溫下儲(chǔ)存動(dòng)物細(xì)胞幾小時(shí)至幾天，直至所述動(dòng)物細(xì)胞被用于實(shí)驗(yàn)、操作或處理。細(xì)胞保護(hù)劑與為了生長和増殖特定細(xì)胞所優(yōu)化的普通動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基在組成、含量和使用上不同。盡管本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑可作為培養(yǎng)細(xì)胞的添加劑而添加，但是它自身不足以用作培養(yǎng)基。也即，對(duì)于特定細(xì)胞的培養(yǎng)和生長來說，推薦使用針對(duì)它們優(yōu)化的培養(yǎng)基，而并不推薦使用本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑自身作為培養(yǎng)基。所述細(xì)胞保護(hù)劑可用于保藏細(xì)胞，添加到培養(yǎng)基中以提高細(xì)胞的存活性或生長，或者在細(xì)胞在充分培養(yǎng)基中生長之前處理細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑可用于動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，更優(yōu)選成體干細(xì)胞。通常，動(dòng)物細(xì)胞需要氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等以便存活。通常使用的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基包括這些成分。盡管本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑也包括諸如氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等的那些成分，但是細(xì)胞保護(hù)劑中的這些成分的組成和含量與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基不同，因?yàn)榧?xì)胞保護(hù)劑的目的是保藏各種動(dòng)物細(xì)胞而不是培養(yǎng)或增殖細(xì)胞(參見表1-4)。在本發(fā)明實(shí)施例I中，對(duì)脂肪細(xì)胞執(zhí)行細(xì)胞存活性測試。當(dāng)細(xì)胞在低溫下儲(chǔ)存72小時(shí)，獲得了至少70%的存活性(參見表I)。此外，角質(zhì)形成細(xì)胞和脂肪源性干細(xì)胞的細(xì)胞増殖率和干細(xì)胞能力的測試結(jié)果也顯著優(yōu)于現(xiàn)有動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的測試結(jié)果(參見圖2和圖6)?，F(xiàn)有動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基包括動(dòng)物血清作為營養(yǎng)成分。盡管這有助于細(xì)胞穩(wěn)定生長，但是當(dāng)細(xì)胞保護(hù)劑中包括動(dòng)物血清并且室溫或低溫(非超低溫)下長期放置時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活性降低。然而，由于本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑并非用于培養(yǎng)或増殖細(xì)胞，而是用于提高細(xì)胞存活性直至該細(xì)胞被用于實(shí)驗(yàn)或操作，因此本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑是無血清的并且含有為更大量存活所需的成分。 尤其是，本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑可有用地用于保藏干細(xì)胞。對(duì)于近來研究很多的細(xì)胞治療，本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑可用作能儲(chǔ)存并運(yùn)輸干細(xì)胞的保護(hù)劑。此外，通過用本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑處理干細(xì)胞，可提高干細(xì)胞的能力。當(dāng)處理干細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑降低了細(xì)胞死亡并活化了細(xì)胞。因此，本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑對(duì)于穩(wěn)定干細(xì)胞是非常有用的。優(yōu)選地，在本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑中，除了組成蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸以外，氨基酸還包括L-胱氨酸和L-輕脯氨酸(L-Hydroproline)。L-羥脯氨酸用于抵御還原的DNA的氧化攻擊，修復(fù)受損DNA并產(chǎn)生膠原蛋白。它
作為向膠原蛋白生物合成和維持的必需氨基酸-輕脯氨酸(hydroxyproline)和輕賴氨
酸提供羥基的供體，是膠原蛋白生物合成中的必要輔因子。因此，預(yù)計(jì)L-羥脯氨酸起到抗氧化劑的作用來除去反應(yīng)性氧物種并防止細(xì)胞死亡。L-胱氨酸含有硫并且是毛發(fā)或角(horn)的組分。尤其是，L-胱氨酸以約10%的量存在于角蛋白中，并且易于還原成L-半胱氨酸。L-胱氨酸在決定多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及酶或激素的活性中起到重要作用。因此，L-胱氨酸對(duì)于細(xì)胞活性有重要作用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑中，除了細(xì)胞生長所需的諸如鈣、鈉、鉀、銅、鉄、鎂和鋅之類的一般元素以外，礦物質(zhì)還包括痕量元素鋯、鍺和釩。本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑中包括的礦物質(zhì)可以以無機(jī)鹽的形式存在，例如ZrOCl2 8H20, GeO2和NaV03。優(yōu)選地，在本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑中，維生素包括能夠抑制反應(yīng)性氧物種的泛酸鈣、氯化膽堿、葉酸、肌醇和抗壞血酸。礦物質(zhì)和維生素用于除去細(xì)胞(例如抗氧化作用)產(chǎn)生的毒性物質(zhì)并促進(jìn)細(xì)胞代謝，由此提高細(xì)胞存活性。這些功能被認(rèn)為是通過本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑中包括的成分間的相互作用而獲得的。優(yōu)選地，在本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑中，生長因子包括堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和血小板源性生長因子(PDGF)。這些生長因子是細(xì)胞存活所必需的并且也影響細(xì)胞的活化。除了生長因子以外，本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑可進(jìn)ー步包括血清替代物，例如白蛋白。優(yōu)選地，細(xì)胞保護(hù)劑的前述成分以下面的含量存在基于整個(gè)保護(hù)劑計(jì)，氨基酸0.5 M 20g/L,維生素0. 01至I. Og/L，礦物質(zhì)I. 0至100g/L以及生長因子0. 001至0. Img/し在本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑中，包括有胎盤提取物，以在存儲(chǔ)期間保持細(xì)胞存活，并且如果需要還能在儲(chǔ)存后的培養(yǎng)期間提高細(xì)胞活性。可以是胎盤提取物或者胎盤水解產(chǎn)物?；诒Ｗo(hù)劑的總重量計(jì)，胎盤提取物或者胎盤水解產(chǎn)物可以以l_20wt%，優(yōu)選5_20wt%的量包括在細(xì)胞保護(hù)劑中。胎盤提取物可通過用鹽酸水解來自對(duì)こ型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)以及人免疫缺陷病毒(HIV)呈陰性的健康人的胎盤而制備。具體地，為了使病毒或類似物失活，用鹽酸在超過101°C處理胎盤至少I小時(shí)，然后通過約121°C的高壓蒸汽處理60分鐘進(jìn)行滅菌。胎盤水解產(chǎn)物可通過用丙酮處理胎盤以除去脂肪并用胃蛋白酶和鹽酸進(jìn)行充分水解來制備。在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用從Hwa Sung Bio Pharm市售購得的胎盤提取物和胎盤水解產(chǎn)物。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞保護(hù)劑包括表1-4中列出的成分。本發(fā)明的發(fā)明者們開發(fā)的細(xì)胞保護(hù)劑，被稱作“CeLLGUARD”，的組分和含量列于表1_4中。本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑可用于提高在0-37°C下，優(yōu)選在0-10°C的低溫下，更優(yōu)選在
0-4°C的低溫下，最優(yōu)選在4°C的低溫下，儲(chǔ)存的細(xì)胞的存活性。不同于用于細(xì)胞増殖和分化的現(xiàn)有干細(xì)胞培養(yǎng)基，本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑提高了干細(xì)胞的能力以及干細(xì)胞的細(xì)胞増殖率，而不改變細(xì)胞特性。當(dāng)用本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑處理干細(xì)胞然后培養(yǎng)時(shí)，干細(xì)胞増殖良好并且具有提高的干細(xì)胞能力。在本發(fā)明的實(shí)施例2和3中，測量了脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的干細(xì)胞能力和細(xì)胞増殖率。結(jié)果掲示，相比于現(xiàn)有干細(xì)胞培養(yǎng)基，本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑具有顯著的效果。本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑可用于儲(chǔ)存和運(yùn)輸細(xì)胞治療劑，以增強(qiáng)細(xì)胞治療劑的療效。術(shù)語“細(xì)胞治療劑”指ー種用于治療、診斷或預(yù)防疾病目的的新概念藥物，所述藥物通過體外増殖或篩選自體的、同種異體的或者異種的活細(xì)胞，或者以其他方式改變細(xì)胞的生物特性，以恢復(fù)或提高所述細(xì)胞和組織的功能。具體地，患者自身或者其他動(dòng)物的體細(xì)胞可增殖，或者干細(xì)胞可分化成想要的細(xì)胞，以治療燒傷或諸如癌癥、癡呆(dementia)等的各種不愈癥。在這方面，美國正在進(jìn)行成百種臨床實(shí)驗(yàn)，而韓國也在積極進(jìn)行研究。在用于細(xì)胞治療的細(xì)胞應(yīng)用前,安全地儲(chǔ)存和運(yùn)輸它們非常重要。大部分的動(dòng)物細(xì)胞，特別是干細(xì)胞，在從它們的組織中分離后就死亡或者失活。在本發(fā)明的實(shí)施例I中，使用現(xiàn)有的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基或本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑，將從脂肪組織分離的脂肪細(xì)胞在4°C的低溫下儲(chǔ)存72小吋，然后測量細(xì)胞存活性。使用本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑儲(chǔ)存的細(xì)胞顯示出70%或更高的細(xì)胞存活率，而使用現(xiàn)有的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)存的細(xì)胞顯示出50%或更低的細(xì)胞存活率。因此，本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑對(duì)于細(xì)胞在用于細(xì)胞治療前保持細(xì)胞存活非常有用。發(fā)明實(shí)施方式現(xiàn)在將描述實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)。下面的實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)僅僅是用于說明的目的，而不旨在限制本公開內(nèi)容的范圍。制備例I :細(xì)胞保護(hù)劑的制備通過將表I列出的氨基酸、表2列出的礦物質(zhì)、表3列出的維生素和表4列出的其他組分混合，制備本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)劑，并命名為“CeLLGUARD”。作為對(duì)照，對(duì)脂肪源性間充
質(zhì)干細(xì)胞使用Invitrogen的進(jìn)ー步含有10%胎牛血清的DMEM/F12 (I: I)培養(yǎng)基，而對(duì)角質(zhì)
形成細(xì)胞使用Lonza的KGM培養(yǎng)基。[表I]氨基酸
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞保護(hù)劑，包括氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、生長因子和胎盤提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞保護(hù)劑，其中所述氨基酸除了組成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)氨基酸以夕卜,還包括L-胱氨酸和L-羥脯氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞保護(hù)劑，其中所述礦物質(zhì)除了細(xì)胞生長所需的一般元素以外，還包括痕量元素錯(cuò)、鍺和鑰；。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞保護(hù)劑，其中所述維生素包括能夠抑制反應(yīng)性氧物種的泛酸鈣、氯化膽堿、葉酸、肌醇和抗壞血酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞保護(hù)劑，其中所述生長因子包括堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和血小板源性生長因子(PDGF)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞保護(hù)劑，其中所述胎盤提取物是胎盤的提取物或者胎盤的水解產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞保護(hù)劑，所述細(xì)胞保護(hù)劑包括表1-4中列出的成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞保護(hù)劑，所述細(xì)胞保護(hù)劑提高在0-37°C下儲(chǔ)存的細(xì)胞的存活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞保護(hù)劑，所述細(xì)胞保護(hù)劑提高干細(xì)胞的能力和細(xì)胞增殖率但不改變細(xì)胞特性。
10.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞保護(hù)劑，所述細(xì)胞保護(hù)劑用于儲(chǔ)存和運(yùn)輸細(xì)胞治療劑以增強(qiáng)所述細(xì)胞治療劑的療效。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包括胎盤提取物的細(xì)胞保護(hù)劑，更具體地，一種用于儲(chǔ)存和保護(hù)動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)劑，包括氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、生長因子和胎盤提取物。
文檔編號(hào)A61K31/195GK102791278SQ201080064653
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者李定宣, 李彩軟, 柳洋桓, 蔡炳哲 申請(qǐng)人:現(xiàn)代細(xì)胞與組織技術(shù)公司