專利名稱：用于細(xì)胞刺激隨后進(jìn)行治療性免疫的乙肝病毒抗原制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是通過轉(zhuǎn)移已經(jīng)經(jīng)過こ肝病毒(HBV)的表面抗原(HBsAg)和核衣殼抗原(HBcAg)的制劑刺激的細(xì)胞而進(jìn)行的治療性免疫。通過包含這些抗原的混合物的制劑誘導(dǎo)細(xì)胞刺激，所述抗原從懸浮液中沉淀，其比例是基于在被動免疫治療應(yīng)用之前實(shí)現(xiàn)最大化細(xì)胞刺激而選擇的。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為世界上三分之一以上的人口已經(jīng)被こ肝病毒(HBV)感染。認(rèn)為5%至10%的成人和高達(dá)90%的被感染的新生兒是以持續(xù)方式產(chǎn)生感染，在世界水平而言有350，000，000人口攜帶該病毒。長時(shí)間段內(nèi)HBV的持續(xù)復(fù)制導(dǎo)致進(jìn)行性的肝病，其在大約25%的攜帯者中進(jìn)展為肝硬化或肝癌。認(rèn)為每年有一百萬以上的死亡與不同進(jìn)展形式的該病毒的感染相關(guān)(Zuckerman JN. J MED VIROL 2006 ；78 :169-177)。使用綴合于聚こニ醇(PEG)的干擾素α (IFN-α)或其變體和核苷或核苷酸、例如拉米夫定、阿德福韋-ニ匹伏、恩替卡韋和Telbivudina進(jìn)行的治療構(gòu)成了治療慢性こ肝(CHB)的現(xiàn)有技木。一般地，就持續(xù)消除病毒而言，這些藥物有效性差，并且它們的使用與嚴(yán)重的次級效應(yīng)相關(guān)(Osborn MK, et to the one. J ANTIMICROB CHEM0THER. 2006 ；57 1030-34)。具有高百分率的預(yù)防こ肝的有效性的疫苗的開發(fā)構(gòu)成了世界水平的預(yù)防醫(yī)學(xué)的重大成就。目前，超過150個(gè)國家在免疫項(xiàng)目中向兒童、青少年和風(fēng)險(xiǎn)群體提供抗こ肝疫苗。第一代疫苗是基于從無癥狀攜帯者的血漿獲得的純化且滅活的HBsAg。這些制劑是免疫原性的；但是，它們迅速被在酵母中產(chǎn)生的具有更高安全性的重組疫苗替代(ZuckermanJN. J MED VIROL 2006 ；78 :169-177)。目前，研究聚焦于免疫原性更高、更有效的制劑的開發(fā)，起始于強(qiáng)有力的佐劑的導(dǎo)入，但是這些制劑對于治療慢性感染未獲成功。從上世紀(jì)90年代開始，進(jìn)行了 g在評估使用疫苗接種來治療HBV慢性感染的研究。該治療策略已經(jīng)受到了強(qiáng)烈關(guān)注，其來自證實(shí)了免疫應(yīng)答對于控制該病毒的基礎(chǔ)性作用的證據(jù)。研究此課題的研究組尋求顛覆對于HBV的免疫耐受態(tài)，從施用疫苗制劑開始(Hui CK, et al. INT J MED SCI. 2005 ；2 :24-29)。最近，以治療目的使用常規(guī)的預(yù)防性疫苗在免疫治療領(lǐng)域獲得的結(jié)果提示了研究使用更強(qiáng)有力的、包含新的抗原、佐劑、新施用途徑和合理的組合治療的疫苗候選物的必要性(Pol S，et al. Expert Rev Vaccines 2006 ；5 :707-16)。設(shè)計(jì)最佳疫苗候選物時(shí)應(yīng)牢記與抗原性成分相關(guān)的方面，以及與制劑的佐劑成分相關(guān)的方面。遺傳工程與生物技術(shù)中心(CIGB)使用酵母“巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris) ”作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)了重組HBsAg。該抗原是古巴從九十年代初期批準(zhǔn)和使用的抗こ肝疫苗的一部分(Muzio V, et al. European patent No. EP 480525)。HBsAg具有在健康人中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性免疫應(yīng)答(抗體的和輔助性T細(xì)胞的)的能力。另外，已經(jīng)證明HBsAg表位可以由I類主要組織相客性系統(tǒng)(HLA)的分子呈遞，即使是當(dāng)該蛋白像異源蛋白一祥被抗原呈遞細(xì)胞加工的時(shí)候。該性質(zhì)允許非佐劑化的HBsAg通過經(jīng)替代性加工途徑產(chǎn)生的表位誘導(dǎo)細(xì)胞毒性應(yīng)答，允許HBsAg特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞庫的擴(kuò)增(Bertoletti A，J Hepatol 2003 ；39 :115-124)。然而，該抗原在治療性免疫中的使用未在II期研究中產(chǎn)生可重現(xiàn)的益處。目前，尚不存在針對HBV慢性感染的治療性疫苗。用于促進(jìn)慢性患者中的免疫應(yīng)答的策略之ー是使用HBcAg作為疫苗抗原。HBcAg的氨基酸序列的顯著特性是在羧基末端存在富含精氨酸的區(qū)域。該區(qū)域具有在天然顆粒中連接前基因組核糖核酸(RNA)的功能。在重組顆粒的情況下，該區(qū)域與細(xì)菌RNA(大小為30-3000個(gè)核苷酸)結(jié)合，這賦予了重要的免疫性質(zhì)(Riedl P. J Immunol 2002 ; 168 :4951-59)。治療HBC時(shí)的“免疫治療”的概念暗示了缺陷性免疫應(yīng)答的重激活，目標(biāo)是控制病毒復(fù)制和消除或控制感染。在骨髄移植研究中已經(jīng)直接驗(yàn)證了該概念?？梢宰C明，來自具有針對HBV的免疫力的供體的細(xì)胞的骨髄移植至被該病毒慢性感染的受體時(shí)，該程序能夠治愈受體患者的慢性感染(Lau GK, Gastroenterology 2002 ；122 :614-24 ；SH0UVALD，ILAN Y. J HEPATOL 1995;23:98-101)。然而，使用商售疫苗免疫對HBV無免疫的供體(non-immune donor)未在受體患者骨髓淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生治療性應(yīng)答,這使得該治療策略的エ業(yè)應(yīng)用產(chǎn)生了巨大的局限性，因?yàn)槠湟蕾囉诠w的天然感染。在被HBV慢性感染的過程中，在效應(yīng)子細(xì)胞和專職抗原呈遞細(xì)胞中，T和B效應(yīng)子細(xì)胞的應(yīng)答是差的、缺失的或功能上有缺陷的。然而，產(chǎn)生自我限制或急性感染的患者顯示出針對表面蛋白、核衣殼和聚合酶的多克隆和多特異性的強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性和輔助性應(yīng)答(Webster GJ, J Virol 2004 ;78 :5707-19)。另ー方面，在慢性感染過程中，被不同病毒抗原刺激的外周血的淋巴細(xì)胞分泌的Thl相關(guān)的細(xì)胞因子的水平非常差，與急性感染時(shí)的情況正相反(Jung MC. Virologyl999 ；261 :165-72 ；PENNA A, HEPAT0L0GY 1997 ；25 :1022-27)。這些發(fā)現(xiàn)提示促進(jìn)特異性免疫應(yīng)答能構(gòu)成治療替代方案。另ー項(xiàng)有趣的發(fā)現(xiàn)是JAHBC自發(fā)復(fù)原的患者，或?qū)τ贗FN- α治療有應(yīng)答的患者，能夠產(chǎn)生強(qiáng)度類似于產(chǎn)生急性感染的患者的細(xì)胞毒性應(yīng)答(Rehermann B, J Clin Invest1996 ；97 =1655-65)。另外，證明了以拉米夫定治療的患者中的⑶4+和⑶8+細(xì)胞應(yīng)答的水平的升高，這提示可以從病毒的持續(xù)抑制出發(fā)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(Boni C，Hepatology 2001 ； 33 :963-71 ；Β0ΝΙ C，J HEPATOL 2003 ；39 :595-605)。在免疫治療策略中，治療性疫苗接種構(gòu)成了 1990年代治療被HBV慢性感染的患者時(shí)應(yīng)用的替代方案。主要的免疫治療策略著眼于表面和病毒核衣殼抗原的使用。通過過繼轉(zhuǎn)移(adoptive transfer)的方式證明了針對HBcAg的細(xì)胞免疫カ在控制こ肝慢性感染中的重要性。在患有CHB、接受免疫供體的骨髓細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移的患者中進(jìn)行的研究證明可以消除這些患者的血清中的HBsAg。能夠通過此治療消除HBsAg的患者的研究證明了 HBV慢性感染的消除與特異于HBcAg的⑶4+T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)(Chee-KinH, Int J Med Sci 2005 ；2 :24-29)。使用抗原呈遞細(xì)胞的免疫治療樹突細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的專職抗原呈遞細(xì)胞，其指令并控制T和B淋巴細(xì)胞(特異性免疫力的介導(dǎo)者)的激活。從1996年直至2004年，使用載入了腫瘤抗原或以腫瘤抗原脈沖化處理的樹突細(xì)胞進(jìn)行了超過60項(xiàng)臨床研究(Steinman RM. Nature 2007 ；449 419-426)。這些研究中多數(shù)是在黑色素瘤患者中進(jìn)行。在很多患者中，臨床應(yīng)答與特異性細(xì)胞毒性T應(yīng)答的誘導(dǎo)匹配(Figdor CG. Nat Med 2004;10:475-480)。顯然，以樹突細(xì)胞治療的癌癥患者的臨床進(jìn)展不令人滿意。目前,使用樹突細(xì)胞的免疫治療(免疫治療中使用的所有呈遞細(xì)胞中最先進(jìn)的)領(lǐng)域的專家預(yù)測以抗原脈沖化處理的樹突細(xì)胞極有可能在未受癌癥影響的患者中是更有效的，因?yàn)樗鼈兊拿庖呦到y(tǒng)損傷小(Onji M, Akbar SMF. Dendritic cells inclinics. 2008 ；2nd edition, Springer)。然而,這仍然是空想計(jì)劃。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了上述問題，提供了用于刺激同源或異源細(xì)胞的最佳制劑。本發(fā)明的制劑是由懸浮液中的HBsAg和HBcAg抗原的顆粒構(gòu)成的。另外，公開了使用特定和合適比例的該制劑進(jìn)行細(xì)胞刺激的方法，以及基于異源或自體細(xì)胞(包括樹突細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的體內(nèi)或體外最大刺激而進(jìn)一步被動免疫CHB患者。本發(fā)明的制劑包含HBsAg和HBcAg抗原,作為懸浮液中的顆粒的混合物,大小分別為小于500nm和大于500nm,這些大小的顆粒的比例為50% -50 %至80% -20%。本發(fā)明的目標(biāo)還有被動免疫方法，其特征在于通過使用包含HBsAg和HBcAg抗原的制劑體內(nèi)免疫未受感染的人——供體，從而進(jìn)行細(xì)胞刺激；提取特異性激活的免疫細(xì)胞；然后將其被動轉(zhuǎn)移至被HBV慢性感染的患者。在本發(fā)明的替代性實(shí)施方式中，細(xì)胞刺激是體內(nèi)免疫未受影響的人——供體；提取特異性激活的免疫細(xì)胞；使用HBsAg和HBcAg抗原的制劑在體外重新刺激所述細(xì)胞；然后將其被動轉(zhuǎn)移至被HBV慢性感染的患者。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞刺激這樣進(jìn)行提取對于HBsAg或HBcAg無免疫的人的免疫細(xì)胞；使用HBsAg和HBcAg抗原的制劑在體外刺激所述細(xì)胞；然后被動轉(zhuǎn)移至患者。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞刺激這樣進(jìn)行提取患者的免疫細(xì)胞；使用HBsAg和HBcAg抗原的制劑在體外刺激所述細(xì)胞；然后被動轉(zhuǎn)移至同一患者。在本發(fā)明中，對于抗原性刺激，已經(jīng)獲得了 HBsAg和HBcAg沉淀物，以及，就它們的物理-化學(xué)性質(zhì)而言，最適用作刺激元件的這些抗原的制劑。已經(jīng)以核蛋白形式產(chǎn)生了HBcAg，其包含小的但數(shù)量明顯的Toll樣受體(TLR)配體，和脫氧核糖核酸(DNA)及RNA。在本發(fā)明中，通過允許HBsAg與HBcAg物理結(jié)合的方法沉淀了這些抗原。該方法使得細(xì)胞的刺激水平在轉(zhuǎn)基因小鼠和人類中是最大的，分別誘導(dǎo)HBsAg和病毒載量的下降。通過該方式，證明了這種類型的被動免疫在治療HBV慢性感染中的功能和重要性。在本發(fā)明中，使用外周血單核細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞證明了被動免疫，顯示了其控制患者中的HBsAg水平和病毒載量水平的能力。本發(fā)明提供了解決存在于現(xiàn)有技術(shù)中的問題的方法，該方法是通過加強(qiáng)供體中的抗-HBsAg和抗-HBcAg免疫應(yīng)答，起始于使用包含HBsAg和HBcAg抗原的制劑主動免疫供體，另外，在轉(zhuǎn)移之前在體外激活待轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，從而使得當(dāng)細(xì)胞被接種于受體生物時(shí)，針對這些抗原的應(yīng)答是最大化的。通過實(shí)施本發(fā)明所獲得的結(jié)果證明了獲得具有最佳的同化能力的抗原、APC的激 活和成熟、以及用于獲得有效免疫應(yīng)答的方法的重要性。本發(fā)明的目標(biāo)還在于，由懸浮液中的乙肝病毒(HBV)的表面抗原(HBsAg)的顆粒和核衣殼(HBcAg)的顆粒構(gòu)成的制劑用于細(xì)胞刺激以及同時(shí)或不同時(shí)主動免疫患有HBC的患者的用途。


圖I.關(guān)于與HBcAg結(jié)合的核酸的物理方面、色譜和存在的研究。A.透射電鏡，t匕例尺是200nm。B :通過高效液相色譜(HPLC)研究顆粒的大小和均一性顯示了 HBsAg(上面的圖板)和HBcAg (下面的圖板)的圖譜。在TSK-G6000柱中以PBS中的O. 25mL/分鐘的流速運(yùn)行，應(yīng)用IOOyg每種蛋白。檢測在280nm進(jìn)行。兩種顆粒具有73分鐘的保留時(shí)間。下面的色譜圖中的第二個(gè)峰對應(yīng)于溶液的非蛋白成分，其中HBcAg被稀釋(乙二胺四乙酸)。C :在瓊脂糖電泳中檢測與HBcAg結(jié)合的核酸的存在。泳道I :DNA分子量模式；2 =HBcAg ；3 以RNAse (2mg/mL)在37°C處理了 6小時(shí)的HBcAg。被處理的HBcAg的濃度是O. 447mg/mL。圖2.通過流式細(xì)胞術(shù)研究溶液中的HBsAg-HBcAg復(fù)合物的大小的增加。A. IXPBS、pH 7. O中的HBsAg和HBcAg抗原的制劑。B.在pH 4. O以50mm乙酸溶液透析I小時(shí)之后的制劑。C.在pH 4. O以50mm乙酸溶液透析2小時(shí)之后的制劑。D.在pH 4. O以50mm乙酸溶液透析3小時(shí)之后的制劑。E.在pH 4. O以50mm乙酸溶液透析5小時(shí)之后的制劑。F.在pH 4. O以50mm乙酸溶液透析8小時(shí)之后的制劑。G.在pH 4. O以50mm乙酸溶液透析24小時(shí)之后的制劑。H.流式細(xì)胞儀校正珠，2. 5微米。圖3.轉(zhuǎn)基因小鼠中的被動免疫的研究從以HBsAg和HBcAg抗原的制劑免疫的供體開始。A.在不同的評價(jià)時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)處理和未經(jīng)處理的動物的血清中的抗原血癥的動態(tài)(HBsAg的濃度以yg/ml表示)。B.小鼠血清中的抗-HBsAg IgG抗體應(yīng)答。C.通過ELISA測定的血清中的抗-HBcAg IgG抗體應(yīng)答。發(fā)明詳述/實(shí)施例實(shí)施例I.懸浮液中的HBV表面抗原和核衣殼抗原的酸沉淀物的產(chǎn)生HBcAg (CIGB，Cuba)表達(dá)為183個(gè)氨基酸的重組蛋白，純化自大腸桿菌。在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中產(chǎn)生重組HBsAg, adw2亞型(CIGB, Cuba)。按照之前的描述(Aguilar JC. Tmmunol Cell Biology 2004 ；82 :539_546)進(jìn)行HBcAg蛋白的發(fā)酵和純化過程。該抗原的純化過程產(chǎn)生高度純化的核衣殼抗原(> 95% )，如圖IA中可見。該抗原的分子大小與HBsAg相似，這意味著也形成病毒樣顆粒(圖1B)，并另外包含與其化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合的痕量核酸，其作為TLR刺激物發(fā)揮作用，如圖IC中可見。這些痕量結(jié)合的TLR配體主要可表征為RNA和殘余量的DNA，二者都是細(xì)菌來源的。
與純化的HBcAg蛋白結(jié)合的核物質(zhì)的存在可以通過260nm處吸光度相對于其他蛋白(例如HBsAg和牛血清白蛋白)的增加來檢測，當(dāng)它們的濃度與HBcAg相同時(shí)，在260nm處具有1/2的吸收值(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，為了研究核物質(zhì)是否與顆粒結(jié)合，在存在溴化乙啶的情況下進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳。該實(shí)驗(yàn)證明在檢測到蛋白的相同區(qū)域存在核物質(zhì)。使用RNAse酶的處理允許消除與顆粒結(jié)合的多數(shù)核物質(zhì)，這證明RNA構(gòu)成該核蛋白中較高百分率的核成分(圖1C，泳道2和3)。綜合起來，這些結(jié)果顯示了病毒樣顆粒的物理方面，以及重組HBcAg蛋白的核蛋白性質(zhì)，并且核酸的主要部分是RNA，雖然也有與其結(jié)合的DNA。為了產(chǎn)生HBsAg和HBcAg沉淀物懸浮液，進(jìn)行了針對pH 4. O的50mM乙酸溶液的兩種抗原的混合物的透析，蛋白濃度為O. I至2mg/mL。根據(jù)顆粒大小選擇沉淀物懸浮液，透析時(shí)間限定為10分鐘至24小時(shí)。備選方法是改變HBsAg-HBcAg混合物的緩沖溶液。這可以使用具有小于抗原大小的孔徑(<20nm)的纖維筒，通過滲濾法進(jìn)行。在該情況下，當(dāng)調(diào)節(jié)pH值至4. O時(shí)發(fā)生酸沉淀過程。在這兩種沉淀方法中，暴露于pH變化確定了沉淀物的大小。根據(jù)其大小選擇沉淀物，取決于該特征的是以這些制劑免疫之后所刺激的細(xì)胞的類型。然后，將這些沉淀物佐劑化或不進(jìn)行佐劑化，取決于所需的制劑。一種變體進(jìn)行與氫氧化鋁的吸附，但是也進(jìn)行了與貯庫效應(yīng)佐劑組(鹽和油性佐劑)的其他佐劑或免疫刺激劑(脂多糖、皂苷及其衍生物)的吸附。
實(shí)施例2. HBsAg和HBcAg抗原懸浮的分子大小的表征和選擇用于同化和抗原刺激的最佳大小的方法為了選擇用于刺激專職抗原呈遞細(xì)胞的最佳大小的沉淀物，選擇了 4種沉淀物變體。通過實(shí)施例I中描述的方法產(chǎn)生沉淀物變體，進(jìn)行透析和滲濾法，PH調(diào)節(jié)為4. 0，進(jìn)行預(yù)先確定的溫育時(shí)間。通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行大小選擇，對于校正，使用2. 5 μ m的大小式樣珠子作為上限。在實(shí)驗(yàn)中使用50nm至2.5 μ m，其證明了 一般地，同化和細(xì)胞刺激的區(qū)別在于沉淀物大小和細(xì)胞類型的依賴性。巨噬細(xì)胞似乎是更容易同化的細(xì)胞，沉淀物大小大于500nm。通過這種方式，選擇了沉淀物混合物以增加抗原性混合物的刺激能力。因此，相對于使用非沉淀物顆粒所獲得的，使用這些混合物獲得了較高水平的刺激和免疫原性。圖2顯示了使用不同顆粒進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)產(chǎn)生的圖像和直方圖。顯示出“正向散射”水平的偏移，其代表所獲得的顆粒的大小的增加。該大小增加的發(fā)生與抗原混合物(HBsAg和HBcAg)的溫育時(shí)間成直接比例關(guān)系。還觀察到“側(cè)向散射”水平的增加，其是懸浮液中顆粒的內(nèi)在粗糙性的反映，由大小為22nm的抗原形成，達(dá)到2. 5 μ m，如考慮到2. 5 μ m的珠子式樣所觀察到的，如圖2H所示?？紤]到流式細(xì)胞術(shù)允許建立象限系統(tǒng)和以直方圖表示的范圍，根據(jù)具有已建立的范圍的象限內(nèi)的坐標(biāo)或通過直方圖中范圍的建立而進(jìn)行沉淀的顆粒的選擇。在圖2中顯示了透析中的抗原性混合物的溫育結(jié)果，其允許選擇不同大小的沉淀物。通過直接沉淀獲得了相似的結(jié)果，乙酸鹽緩沖溶液的PH從pH 7. O降低至pH 4.0，但是時(shí)間范圍不同。最后的選擇通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫原性標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行。實(shí)施例3.使用來自之前以包含HBsAg和HBcAg抗原的制劑免疫的Balb/c小鼠的細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至表達(dá)HBsAg的轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠而進(jìn)行的被動免疫的研究基于開發(fā)疫苗候選物而進(jìn)行的免疫治療，構(gòu)成了慢性乙肝治療的策略之一。候選物的有效性取決于能夠克服對于病毒抗原的耐受態(tài)(這是該疾病的特征)的強(qiáng)有力的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。在本發(fā)明中，通過使用包含HBsAg和HBcAg的制劑進(jìn)行的主動免疫加強(qiáng)了供體中的抗-HBsAg和抗-HBcAg免疫應(yīng)答。另外，在轉(zhuǎn)移之前，在體外激活待轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，從而當(dāng)細(xì)胞被接種于受體生物時(shí)，針對這些抗原的應(yīng)答是最佳的。通過這種人工方式，產(chǎn)生了在人類中不存在的應(yīng)答類型，其允許增加具有相似單體型(haplotype)的供體(包括人類)的邊緣，與他們是否被HBV感染無關(guān)。
在本實(shí)施例中，通過過繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞的方式測評了通過使用包含HBsAg和HBcAg抗原的疫苗候選物(通過鼻子/胃腸外途徑施用)進(jìn)行疫苗接種而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答在表達(dá)HBsAg的轉(zhuǎn)基因小鼠(作為HBV持續(xù)感染的模型)中的效應(yīng)。該研究的目標(biāo)之一是測評轉(zhuǎn)移的免疫應(yīng)答對于轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中的HBsAg濃度(抗原血癥)的效應(yīng)。另外，將通過鼻子/胃腸外途徑施用所描述的制劑進(jìn)行的主動免疫所誘導(dǎo)的應(yīng)答的效應(yīng)與通過過繼轉(zhuǎn)移經(jīng)HBsAg刺激(體內(nèi)和體外)的細(xì)胞而產(chǎn)生的效應(yīng)進(jìn)行了比較。另外，在轉(zhuǎn)基因小鼠中就該抗原研究了所轉(zhuǎn)移的抗-HBsAg抗體應(yīng)答的動力學(xué)。測定了免疫力的過繼轉(zhuǎn)移對于血液化學(xué)和組織學(xué)參數(shù)的影響，作為通過鼻子/胃腸外途徑施用的疫苗候選物的安全性的度量。在本研究中，使用了 Balb/c小鼠(H-2d單體型，其來自CENPALAB，Cuba)和HBsAg(+)轉(zhuǎn)基因小鼠(具有Balb/c遺傳基礎(chǔ)，獲自CIGB)。Balb/c小鼠中抗-HBsAg免疫力的產(chǎn)生
在雌性、8-12周齡的Balb/c小鼠中進(jìn)行免疫方案。使用包含HBsAg和HBcAg抗原的疫苗候選物免疫小鼠，同時(shí)通過鼻內(nèi)(IN)和胃腸外途徑進(jìn)行，在后一種情況下，測定了肌內(nèi)(頂)、皮下(SC)和真皮內(nèi)(ID)途徑。在第O天和第14天施藥(體積為ΙΟΟμ ，在第100天施用加強(qiáng)劑量，此后進(jìn)行轉(zhuǎn)移。在第_2、10和25天通過眶后網(wǎng)狀組織取血。表I顯示了免疫方案設(shè)計(jì)。表I.在非轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠中進(jìn)行的免疫方案
組____途徑動物數(shù)目
1HBsAg + HBcAg + 氧化鋁/ IM / IN 13 __HBsAg + HBcAg___
2HBsAg + HBcAg + 氧化鋁/ SC / IN 13 __HBsAg + HBcAg___
3HBsAg + HBcAg + 氧化鋁/ ID / IN 13 __HBsAg + HBcAg___4 HBsAg + HBcAg / IM / IN 13 __HBsAg + HBcAg___
5HBsAg + HBcAg / SC / IN 13 __HBsAg + HBcAg___
6HBsAg + HBcAg / ID / IN 13 __HBsAg + HBcAg___
7氧化鋁/ IM/IN 9 __PBS___通過ELISA測定通過這些處理產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答。測定了每次給藥后的抗-HBsAg IgG和IgG亞類。在第一次給藥10天之后，通過ELISPOT技術(shù)測定了細(xì)胞免疫應(yīng)答。將所使用的ELISPOT設(shè)計(jì)為測定由⑶8+脾細(xì)胞分泌的抗-HBsAg特異性Y-IFN。這些測定結(jié)果表明第5組免疫產(chǎn)生了最高的細(xì)胞應(yīng)答和類似于其余研究組的體液應(yīng)答。據(jù)此，選擇了該組的動物作為用于過繼轉(zhuǎn)移的脾細(xì)胞供體。所選的免疫劑量是I : I的比例(HBsAg HBcAg)，懸浮液中沉淀的抗原的量是10%至50%。也測定了其他比例。免疫脾細(xì)胞的獲得接受加強(qiáng)劑量后15天，殺死第5組的2只小鼠和第7組的3只小鼠(安慰劑)并提取脾。將第5組和第7組的脾分別歸組。按照通常方法處理脾以進(jìn)行脾細(xì)胞的純化。將脾細(xì)胞分離為30xl06個(gè)細(xì)胞的等份(在100 μ L磷酸鹽緩沖溶液(I XPBS)中)，以轉(zhuǎn)移至受體小鼠。這些等份中的2個(gè)在轉(zhuǎn)移之前接受重新刺激，為此，將它們各與500 μ L包含HBsAg和HBcAg抗原的制劑和500 μ L RPMI補(bǔ)充培養(yǎng)基一起溫育。溫育在15ml的管中在37°C和5% CO2中進(jìn)行I小時(shí)。樣品各攪拌15分鐘。溫育之后，洗滌這兩個(gè)細(xì)胞等份并分別懸浮于100 μ L IXPBS中以用于轉(zhuǎn)移。免疫力的過繼轉(zhuǎn)移表達(dá)HBsAg的轉(zhuǎn)基因小鼠用作受體。所用的轉(zhuǎn)基因小鼠是兩種性別的，16-20周齡。它們按照表2所示分為不同的處理組。在脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移之前，進(jìn)行部分血液提取以檢測血清中的基礎(chǔ)HBsAg水平。2天后，通過腹膜內(nèi)(IP)方式施用30χ106個(gè)脾細(xì)胞(在體積為100 μ L的IXPBS中)。在5周的時(shí)間內(nèi)，通過眶后網(wǎng)狀組織每周進(jìn)行血液提取，以測定免疫力的過繼轉(zhuǎn)移之效應(yīng)。在轉(zhuǎn)移后第8周，測定動物并稱重，然后將它們放血并殺死。對主要的器官進(jìn)行稱重并保存于甲醛中以進(jìn)行組織學(xué)分析。該實(shí)驗(yàn)點(diǎn)所提取的血液的一部分用于測定血液化學(xué)參數(shù)，例如肝轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，堿性磷酸酶和肌酸酐。表2.免疫力的過繼性轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
組____動物數(shù)目__小鼠的鑒別
01具有 HBsAg 和 HBcAg 應(yīng)答的 3 29,35,79 __Balb/c小鼠的脾細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(IP)___
02具有HBsAg和HBcAg應(yīng)答的269, 71Balb/c小鼠的脾細(xì)胞(并且之前經(jīng)
__過體外重新刺激)的轉(zhuǎn)移(IP)___
03安慰劑組Balb/c小鼠的脾細(xì)胞的 2 3,67 __轉(zhuǎn)移(IP)___
04_PBS Ix (IP)_ 2 _82，85_HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中的HBsAg的定量在我們自己的實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)了用于測定血清中的HBsAg水平的ELISA程序。使用被稱作H印4的抗-HBsAg單克隆抗體(CIGB，Cuba)在50°C涂覆ELISA平板20分鐘。然后，使用PBS 1X-0. 05% Tween 20進(jìn)行一系列洗滌，將平板與血清樣品在50°C溫育I小時(shí)，所述血清樣品在含有2%脫脂牛奶的IX PBS中按照1/200稀釋。在該步驟中，在每個(gè)平板中加入已知濃度的HBsAg (CIGB, Cuba)標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)物從141ng/ml濃度開始進(jìn)行連續(xù)稀釋。作為陰性對照，使用了非轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠的預(yù)免疫血清的混合物。一旦過了溫育時(shí)間，進(jìn)行洗滌，將平板與綴合于過氧化物酶的抗-HBsAg單克隆抗體Hepl [在緩沖液(O. 44g脫脂牛奶，220 μ L Tween20，在Ilml蒸餾水中)中稀釋]在50°C溫育30分鐘。經(jīng)過一系列洗滌之后，將平板與底物(檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液；lmg/mL鄰苯二胺；0. I % H2O2)在室溫溫育10分鐘。最后，通過加入50 μ L/孔的3M H2SO4而終止反應(yīng)。使用平板讀數(shù)器(Sensident Scan, Merck)在 492nm 讀取所產(chǎn)生的光密度(O. D)。所有接受了具有先前的HBsAg免疫力的細(xì)胞的小鼠都顯示出血清中的HBsAg的 明顯下降，因?yàn)檗D(zhuǎn)移后I周時(shí)的評估發(fā)現(xiàn)在時(shí)間零點(diǎn)與第二和第三周之間有顯著性差異(P<0.05)。從第4周(第35天)開始,觀察到血清中的HBsAg開始升高,這表明經(jīng)轉(zhuǎn)移的小鼠中的抗原血癥的控制開始消失。從該時(shí)間點(diǎn)開始直到第8周(第63天)，未觀察到相對于時(shí)間零點(diǎn)的抗原血癥上的統(tǒng)計(jì)上的差異(圖3A)。如圖3A所示，在接受了具有HBsAg特異性免疫力的脾細(xì)胞的小鼠中，檢測到血清中的HBsAg濃度的明顯下降，在第7天至28天更為明顯。然而，對于接受安慰劑脾細(xì)胞或以鹽水免疫的小鼠而言，雖然檢測到了血清中的HBsAg濃度的波動，但是數(shù)值與時(shí)間零點(diǎn)相比無顯著差異，并且從未檢測到低于5 μ g/ml的值。這些結(jié)果說明有可能通過細(xì)胞免疫力的過繼轉(zhuǎn)移有效降低轉(zhuǎn)基因動物的血清中的循環(huán)HBsAg水平。由于轉(zhuǎn)移的免疫應(yīng)答而在抗原血癥上建立的控制是有效的，在單次細(xì)胞轉(zhuǎn)移后持續(xù)大約3周。隨后進(jìn)行的另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明該效應(yīng)與HBsAg上的HBcAg的刺激相關(guān)，因?yàn)橐灾话琀BsAg的制劑刺激的供體動物未產(chǎn)生對于抗原載量的任何控制，并且，相對于以HBsAg與HBcAg組合制劑而言，在這些小鼠中產(chǎn)生較低的應(yīng)答。血清中的抗-HBsAgIgG應(yīng)答除了 79號小鼠之外，在所有接受了具有先前的針對HBsAg的免疫力的脾細(xì)胞的小鼠中都檢測到了 HBsAg特異性IgG抗體應(yīng)答(圖3B)。這與在該特定動物中獲得的抗原血癥結(jié)果是一致的，在該動物中，HBsAg的濃度僅有輕微下降。在具有陽性抗-HBsAg應(yīng)答的動物中，檢測到的效價(jià)是高水平的(> IO4)，從第3周開始下降。這可能與在第4周左右時(shí)(第35天)在這些動物中觀察到的抗原血癥的增加相關(guān)。接受安慰劑細(xì)胞或鹽水的轉(zhuǎn)移的組未顯示出HBsAg特異性抗體效價(jià)。血液化學(xué)參數(shù)的測評在研究的末尾，第8周的時(shí)候，測定了數(shù)項(xiàng)血液化學(xué)參數(shù)。將血液化學(xué)研究設(shè)計(jì)為目標(biāo)是測定由于HBsAg免疫脾細(xì)胞向轉(zhuǎn)基因小鼠(在肝、腎和其它器官中組成型表達(dá)HBsAg)的過繼轉(zhuǎn)移而造成的潛在的器官損傷，測定了肝功能的兩個(gè)標(biāo)志物ALT和堿性磷酸酶，和作為腎功能標(biāo)志物的肌酸酐。所有的小鼠(處理的和安慰劑)的ALT和肌酸酐的測量值都在這些動物的正常數(shù)值范圍內(nèi)。對于所測定的任何參數(shù)，經(jīng)處理的(接受具有抗-HBsAg免疫力的脾細(xì)胞)和未經(jīng)處理的(接受安慰劑脾細(xì)胞或IX PBS溶液)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較未顯示出顯著性差異。按照性別進(jìn)行的比較僅僅在堿性磷酸酶的情況下顯示出差異對于雄性獲得了較高的數(shù)值。組織學(xué)分析在轉(zhuǎn)移后第8周(第63 天)，將本研究中的所有動物殺死，提取并稱重所有的相關(guān)器官。動物的數(shù)據(jù)包括處理開始時(shí)的年齡，結(jié)束時(shí)的重量和大小，數(shù)據(jù)顯示不存在由于處理造成的任何顯著性差異。將提取的器官放入甲醛中以進(jìn)行組織學(xué)分析。進(jìn)行了所測定的參數(shù)之間的一些統(tǒng)計(jì)學(xué)比較；結(jié)果表明在經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的動物之間，就動物和器官而言，不存在差異。發(fā)現(xiàn)性別之間的一些差異。對于雄性病例中的一些器官獲得了較高的數(shù)值。體外重新刺激增強(qiáng)了接受免疫脾細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移的小鼠中的血清抗-HBcAg免疫應(yīng)答考慮到轉(zhuǎn)移至Balb/c轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫脾細(xì)胞來自具有強(qiáng)有力的抗-HBs和抗HBc免疫應(yīng)答的小鼠，我們決定評估在受體小鼠的血清中是否可以檢測到抗-HBc應(yīng)答。如圖3C所示，只有那些被轉(zhuǎn)移和接受了之前經(jīng)過組合制劑的體外重新刺激的小鼠(第69和71號小鼠)保留了針對HBcAg的高IgG抗體應(yīng)答。接受了具有先前的抗-HBcAg免疫力但是未在體外重新刺激的脾細(xì)胞的動物(第29、35和79號小鼠)未顯示出血清中的HBcAg特異性IgG應(yīng)答，類似于在轉(zhuǎn)移了安慰劑脾細(xì)胞或以IX PBS免疫的小鼠中所觀察到的。該結(jié)果證明，當(dāng)進(jìn)行這種類型的免疫時(shí)，可以加強(qiáng)抗-HBcAg免疫應(yīng)答。雖然在本研究中，選擇了具有不同大小的沉淀物混合物的特定變體(50%的沉淀物具有小于500nm的大小，其余50 %具有大于500nm的大小)，所使用的HBsAg和HBcAg的懸浮液中沉淀物的比例具有差別化的有效性，不同大小的沉淀物的混合物的測定結(jié)果允許將免疫原引向不同的抗原呈遞細(xì)胞群體，這對于同化、細(xì)胞激活能力和最終制劑的免疫原性具有影響。相對于未經(jīng)處理的相同制劑而言，當(dāng)使用懸浮液中的抗原制劑時(shí)，所獲得的抗原呈遞細(xì)胞激活結(jié)果令人奇地好。綜合以上獲得的所有結(jié)果，可以得出結(jié)論免疫力的過繼轉(zhuǎn)移是有效的，因?yàn)槠浣档土搜逯械难h(huán)HBsAg的水平，使用HBsAg和HBcAg組合制劑進(jìn)行的主動免疫未達(dá)到此效果。同樣，以上描述的免疫力的過繼轉(zhuǎn)移是安全的，因?yàn)樵谒芯康钠鞴僦形达@示出組織學(xué)破壞。這些結(jié)果證明了免疫治療的安全性，因?yàn)檗D(zhuǎn)移免疫力能夠抑制2周以上，在一些病例中，所測定的模型中的血清HBsAg濃度甚至變得檢測不到。另外證明了在轉(zhuǎn)移之前使用HBsAg和HBcAg在體外進(jìn)行重新刺激的益處，促進(jìn)了抗-HBcAg免疫應(yīng)答的存在，這在人類中是至關(guān)重要的。實(shí)施例4.使用HBsAg和HBcAg抗原的制劑在體外進(jìn)行脈沖化處理的非免疫小鼠的異源細(xì)胞的轉(zhuǎn)移為了證明在體外使用HBsAg和HBcAg抗原的混合物進(jìn)行刺激或脈沖化處理的異源細(xì)胞誘導(dǎo)針對這些抗原的強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，在Balb/c小鼠(HBsAg轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的)中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。非轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠用作供體。殺死8只Balb/c小鼠，提取它們的脾。根據(jù)實(shí)施例3中描述的方法純化脾細(xì)胞。使用抗原的不同制劑和比例，在不同的上清液濃度，在體外刺激總脾細(xì)胞或從這些脾細(xì)胞獲得的特定細(xì)胞群體(B細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。刺激之后，洗滌細(xì)胞3次并轉(zhuǎn)移至HBsAg轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠。所有的經(jīng)轉(zhuǎn)移的Balb/c小鼠(轉(zhuǎn)基因的和非轉(zhuǎn)基因的)都產(chǎn)生可檢測的免疫應(yīng)答。該應(yīng)答能夠在那些HBsAg轉(zhuǎn)基因組受體小鼠中誘導(dǎo)HBsAg水平的顯著下降，在1_20周的時(shí)間內(nèi)是可檢測的，在一些情況下是持久性的。通過使用相同制劑進(jìn)行主動免疫未達(dá)到該結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例5.使用HBsAg和HBcAg抗原的制劑在體外進(jìn)行脈沖化處理的非免疫小鼠的同源細(xì)胞的轉(zhuǎn)移為了證明在體外使用HBsAg和HBcAg抗原的混合物進(jìn)行刺激的同源細(xì)胞誘導(dǎo)針對這些抗原的強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，在Balb/c小鼠(HBsAg轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的)中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。非轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠用作脾細(xì)胞供體。殺死8只Balb/c小鼠，提取它們的脾。根據(jù)實(shí)施例3中描述的方法純化脾細(xì)胞。使用抗原的不同制劑和比例，在不同的上清液濃度，在體外刺激總脾細(xì)胞或特定脾細(xì)胞群體(B細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。刺激之后，洗滌細(xì)胞3次并轉(zhuǎn)移至HBsAg轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠。所有的經(jīng)轉(zhuǎn)移的Balb/c小鼠(轉(zhuǎn)基因的和非轉(zhuǎn)基因的)都產(chǎn)生可檢測的免疫應(yīng)答。該應(yīng)答能夠在那些HBsAg轉(zhuǎn)基因組受體小鼠中誘導(dǎo)HBsAg水平的顯著下降。血清中的HBsAg濃度的降低在1-20周的時(shí)間內(nèi)是可檢測的，在一些情況下是持久性的。通過使用相同制劑進(jìn)行主動免疫未達(dá)到該結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例6.使用不同抗原和不同顆粒大小和比例的抗原性混合物研究樹突細(xì)胞的抗原性刺激在轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明抗原對細(xì)胞的刺激效應(yīng)與HBsAg上的HBcAg產(chǎn)生的刺激相關(guān)，并與HBcAg與HBsAg之間的相互作用的性質(zhì)相關(guān)，后者與混合物中的顆粒大小和不同顆粒大小的比例相關(guān)。如果使用僅包含HBsAg的制劑刺激用作供體的動物，則不產(chǎn)生對于抗原載量的控制。相對于以HBsAg和HBcAg組合制劑刺激的動物而言，這些動物產(chǎn)生較低的應(yīng)答。不同大小的沉淀物的混合物在不同的抗原呈遞細(xì)胞類型中產(chǎn)生最強(qiáng)烈的刺激。該結(jié)果來自于控制轉(zhuǎn)基因小鼠中的循環(huán)HBsAg的能力的測定?？傊?，較高的刺激效力變體由下列比例組成50% -80%的尺寸小于500nm和20 % -50 %的尺寸大于500nm。研究了該范圍，刺激包含B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞混合物，并轉(zhuǎn)移這些細(xì)胞混合物至HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其中顯示出控制HBsAg 的能力上的差異(表3)。如可認(rèn)識到的，變體E和F顯示出最佳的刺激范圍。表3.使用經(jīng)不同處理刺激的細(xì)胞轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)基因小鼠中的血清HBsAg濃度
權(quán)利要求
1.こ肝病毒(HBV)的表面(HBsAg)和核衣殼(HBcAg)抗原的制劑，其特征在于，其包含所述抗原的懸浮液中的沉淀物。
2.權(quán)利要求I的制劑，其中懸浮液中的沉淀物構(gòu)成大小小于500nm和大于500nm的顆粒的混合物。
3.權(quán)利要求2的制劑，其中大小小于500nm和大于500nm的顆粒的比例分別為50% -50%至 80% -20%。
4.權(quán)利要求I的制劑，其中懸浮液中的沉淀物通過使這些抗原的混合物經(jīng)歷酸沉淀而獲得。
5.權(quán)利要求4的制劑，其中通過以酸溶液進(jìn)行透析或滲濾而進(jìn)行酸沉淀。
6.獲得こ肝病毒(HBV)的表面(HBsAg)和核衣殼(HBcAg)抗原的制劑的方法，所述制劑由這些抗原的懸浮液中的沉淀物構(gòu)成，所述方法的特征在于a)制備HBsAg和HBcAg抗原的混合物山)使該混合物經(jīng)歷酸沉淀；和c)根據(jù)它們的大小、按照它們對于異源或自體抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生最大的體內(nèi)或體外刺激的方式選擇沉淀物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中經(jīng)歷酸沉淀的混合物中的HBsAg和HBcAg抗原的濃度是0. l_2mg/mL 蛋白。
8.權(quán)利要求6的方法，其中通過以酸溶液進(jìn)行透析或滲濾而進(jìn)行酸沉淀。
9.權(quán)利要求8的方法，其中用于透析或滲濾的酸溶液是こ酸，優(yōu)選為pH4. O的50mM的こ酸。
10.權(quán)利要求8的方法，其中酸沉淀持續(xù)10分鐘至24小時(shí)。
11.權(quán)利要求6的方法，其中沉淀物的顆粒的大小按照如下方式選擇使得那些大小小于500nm和大于500nm的顆粒的比例分別為50% -50%至80% -20%。
12.用于被動免疫治療的細(xì)胞刺激方法，其特征在于刺激劑是由こ肝病毒(HBV)的HBsAg和HBcAg抗原的懸浮液中的沉淀物構(gòu)成的制劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中懸浮液中的沉淀物構(gòu)成大小小于500nm和大于500nm的顆粒的混合物。
14.權(quán)利要求12的方法，其中待刺激的細(xì)胞群體來自選自下列的個(gè)體未被感染的個(gè)體，對HBV無免疫的個(gè)體，和慢性こ肝(CHB)患者。
15.權(quán)利要求12的方法，其中待刺激的細(xì)胞群體選自外周血單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
16.權(quán)利要求12的方法，其中通過體外刺激分離自個(gè)體的細(xì)胞、體內(nèi)免疫所述個(gè)體，或這兩種刺激策略的組合來產(chǎn)生細(xì)胞的刺激。
17.被動免疫CHB患者的方法，其特征在干a)使用由こ肝病毒(HBV)的HBsAg和HBcAg抗原的懸浮液中的沉淀物構(gòu)成的制劑刺激細(xì)胞；和b)將經(jīng)刺激的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至患有CHB的患者。
18.權(quán)利要求17的方法，其中懸浮液中的沉淀物構(gòu)成大小小于500nm和大于500nm的顆粒的混合物。
19.權(quán)利要求17的方法，其中待刺激的細(xì)胞群體來自選自下列的個(gè)體未被感染的個(gè)體，對HBV無免疫的個(gè)體，和慢性こ肝(CHB)患者。
20.權(quán)利要求17的方法，其中待刺激的細(xì)胞群體選自外周血單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
21.權(quán)利要求17的方法，其中通過體外刺激分離自個(gè)體的細(xì)胞、體內(nèi)免疫所述個(gè)體，或這兩種刺激策略的組合來產(chǎn)生細(xì)胞的刺激。
22.由こ肝病毒(HBV)的表面(HBsAg)和核衣殼(HBcAg)抗原的懸浮液中的沉淀物構(gòu)成的制劑用于細(xì)胞刺激和同時(shí)或不同時(shí)主動免疫CHB患者的用途。
23.權(quán)利要求22的方法，其中懸浮液中的沉淀物構(gòu)成大小小于500nm和大于500nm的顆粒的混合物。
24.權(quán)利要求22的方法，其中待刺激的細(xì)胞群體選自外周血單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
25.權(quán)利要求22的方法，其中通過體外刺激分離自個(gè)體的細(xì)胞、體內(nèi)免疫所述個(gè)體，或這兩種刺激策略的組合來產(chǎn)生細(xì)胞的刺激。
26.權(quán)利要求22的方法，其中待刺激的細(xì)胞群體來自選自下列的個(gè)體未被感染的個(gè)體，對HBV無免疫的個(gè)體，和慢性こ肝(CHB)患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療性免疫的領(lǐng)域，特別涉及使用乙肝病毒(HBV)的抗原的新的制劑用于細(xì)胞刺激。所述制劑由HBV的懸浮液中沉淀的表面抗原(HBsAg)和核衣殼(HBcAg)構(gòu)成。該制劑包含這些抗原的大小小于500nm和大于500nm的懸浮顆粒的混合物，其中所述大小的顆粒的比例分別是50％-50％和80％-20％。選擇一定范圍的大小的顆粒允許使數(shù)種細(xì)胞類型的刺激水平最大化。另外，描述了使用該制劑的細(xì)胞刺激方法和后續(xù)對患有慢性乙肝的患者的被動免疫，其是基于使用異源或自體細(xì)胞(樹突細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)在體內(nèi)或體外的最大化的刺激。以該制劑刺激的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至慢性感染HBV的患者。
文檔編號A61K9/14GK102665687SQ201080048991
公開日2012年9月12日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者D·赫南德茲尹古安佐, E·潘頓阿利亞斯, F·D·L·M·弗雷爾阿爾梅達(dá), G·E·吉倫涅托, H·特魯吉洛佩爾茲, J·阿古拉魯比多, L·S·赫里拉馬丁內(nèi)斯, R·烏比塔戈麥斯, S·岡薩雷斯布蘭克, V·L·穆茲歐岡薩雷斯, Y·洛拜納馬托 申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心