專利名稱：自主神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)用組合物和調(diào)節(jié)自主神經(jīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)自主神經(jīng)活動(dòng)的組合物和調(diào)節(jié)自主神經(jīng)活動(dòng)的方法。特別是，本發(fā)明涉及用于抑制交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)的組合物和用于促進(jìn)副交感神經(jīng)活動(dòng)的組合物。另外，本發(fā)明涉及抑制交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)的方法和促進(jìn)副交感神經(jīng)活動(dòng)的方法。
背景技術(shù)：
自主神經(jīng)系統(tǒng)是構(gòu)成無法通過意識(shí)調(diào)節(jié)的神經(jīng)系統(tǒng)的一部分的神經(jīng)系統(tǒng)，與主要控制骨骼肌的軀體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)不同，支配著心肌、平滑肌、腺體組織。另外，自主神經(jīng)系統(tǒng)在構(gòu)造上也與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)不同，由被稱為節(jié)前神經(jīng)元和節(jié)后神經(jīng)元的2種神經(jīng)元構(gòu)成。 自主神經(jīng)系統(tǒng)大致分為交感神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)這兩種，各自的功能不同。已知交感神經(jīng)的活動(dòng)通常會(huì)引起心率增大、血壓上升、瞳孔擴(kuò)大、血中葡萄糖的游離等，副交感神經(jīng)的活動(dòng)通常會(huì)刺激消化道運(yùn)動(dòng)的增加、消化液的分泌等，心率減少。兩者協(xié)同作用，對(duì)于維持生物體的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)(homeostasis)發(fā)揮了重要的作用。關(guān)于肽或肽衍生物，作為直接測(cè)定對(duì)自主神經(jīng)活動(dòng)的影響的報(bào)道，有文獻(xiàn)報(bào)道了肌肽的自主神經(jīng)調(diào)節(jié)作用(專利文獻(xiàn)1)。但是，該作用通過靜脈內(nèi)給藥而得以測(cè)定，基于經(jīng)口給藥的作用還不明確。此外，關(guān)于二肽Tyr-Pr0 (YP)及其類似物，沒有直接測(cè)定對(duì)自主神經(jīng)活動(dòng)的影響的報(bào)道。另一方面，關(guān)于Tyr-Pro及其類似物的生理功能，有若干報(bào)道。例如，通過使用了摘除的回腸縱肌的試驗(yàn)，獲知以Tyr-Pro-作為N末端部分的某種五肽具有緩和疼痛的類鴉片活性，對(duì)于控制感情、調(diào)節(jié)呼吸、體溫和消化活動(dòng)有效(專利文獻(xiàn)2)。另外已知，對(duì)于Tyr-Pro而言，雖然不具有與類鴉片受體的結(jié)合性，但在對(duì)大鼠的腹腔內(nèi)給藥時(shí)顯示出鎮(zhèn)痛作用(非專利文獻(xiàn)1)。另外據(jù)報(bào)道，若干種由包含Tyr-Pro的4 9殘基構(gòu)成的肽可調(diào)節(jié)壓力負(fù)荷對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的作用(專利文獻(xiàn)3)。但是，這些報(bào)道中均沒有直接測(cè)定肽對(duì)自主神經(jīng)活動(dòng)的影響的例子，并且沒有著眼于其調(diào)節(jié)作用的具體報(bào)道。此外，這些肽或肽衍生物是對(duì)摘除的消化器官的作用或腹腔內(nèi)給藥后對(duì)生物體的作用，因此沒有顯示出作為可口服的物質(zhì)的充分效果。另一方面，已知通過Tyr-Pro的經(jīng)口給藥而具有降低血壓的作用(專利文獻(xiàn)4)，其與自主神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)有關(guān)的作用也尚不明確。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 國(guó)際公開第2002/076455號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開05-247089號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 國(guó)際公開第2007/030035號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 日本專利第3364579號(hào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 -.Izn. Akad. Nauk. Ser. Biol. (2008)No. 1，61-67

發(fā)明內(nèi)容
3
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)自主神經(jīng)活動(dòng)的可口服的組合物。另外，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)自主神經(jīng)活動(dòng)的方法。特別是，本發(fā)明提供用于抑制交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)的可口服的組合物和用于促進(jìn)副交感神經(jīng)活動(dòng)的可口服的組合物。用于解決問題的方案(1)本發(fā)明涉及一種自主神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。(2)本發(fā)明還涉及一種副交感神經(jīng)活動(dòng)的促進(jìn)用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。(3)本發(fā)明涉及一種交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)抑制用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。(4)另外，本發(fā)明涉及(2)或(3)所述的組合物，其具有消化道運(yùn)動(dòng)促進(jìn)作用、健忘預(yù)防作用或抗焦慮作用。(5)本發(fā)明還涉及一種消化道運(yùn)動(dòng)促進(jìn)用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。(6)本發(fā)明還涉及一種健忘預(yù)防用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。(7)本發(fā)明還涉及一種焦慮抑制用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。(8)本發(fā)明還涉及(1) (7)中任一項(xiàng)所述的組合物，其為口服使用。(9)另外，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)非人動(dòng)物的自主神經(jīng)活動(dòng)的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥Tyr-Pro或其鹽的步驟。(10)本發(fā)明還涉及一種促進(jìn)非人動(dòng)物的副交感神經(jīng)活動(dòng)的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥Tyr-Pro或其鹽的步驟。(11)本發(fā)明還涉及一種抑制非人動(dòng)物的交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥Tyr-Pro或其鹽的步驟。(12)另外，還涉及(10)或(11)所述的方法，其在非人動(dòng)物中促進(jìn)消化道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防健忘或抑制焦慮。(13)本發(fā)明還涉及一種促進(jìn)非人動(dòng)物的消化道運(yùn)動(dòng)的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥Tyr-Pro或其鹽的步驟。(14)本發(fā)明還涉及一種預(yù)防非人動(dòng)物的健忘的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥 Tyr-Pro或其鹽的步驟。(15)本發(fā)明還涉及一種抑制非人動(dòng)物的焦慮的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥 Tyr-Pro或其鹽的步驟。(16)本發(fā)明還涉及(9) (15)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，給藥為經(jīng)口給藥。


圖1示出肽Tyr-Pro (YP)對(duì)于胃的副交感神經(jīng)活動(dòng)的效果。對(duì)大鼠(η = 3)給藥水或者Tyr-Pro 0. 045mg/kg體重或者Tyr-ProO. 12mg/kg體重，經(jīng)時(shí)測(cè)定支配胃的副交感 (迷走)神經(jīng)的動(dòng)作電位?？v軸以百分率表示將給藥前的值(O分鐘值)設(shè)為100時(shí)的各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)動(dòng)作電位(GVNA:胃迷走神經(jīng)活動(dòng))。橫軸為樣品給藥后的時(shí)間(分鐘)。與水給藥對(duì)照組的顯著性差異檢驗(yàn)以給藥5 60分鐘的值作為組并采用方差分析法(ANOVA) 來進(jìn)行。圖2示出肽Tyr-Pro (YP)對(duì)于腎上腺交感神經(jīng)活動(dòng)的效果。對(duì)大鼠(η = 3)給藥水或Tyr-Pro 0. 12mg/kg體重，經(jīng)時(shí)測(cè)定支配腎上腺的交感神經(jīng)的動(dòng)作電位?？v軸以百分率表示將給藥前的值(O分鐘值)設(shè)為100時(shí)的各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)動(dòng)作電位(ASNA 腎上腺交感神經(jīng)活動(dòng))。橫軸為樣品給藥后的時(shí)間(分鐘)。與水給藥對(duì)照組的顯著性差異檢驗(yàn)以給藥5 60分鐘的值作為組并采用方差分析法(ANOVA)來進(jìn)行。圖3示出Tyr-Pro(YP)(圖3A)或酪蛋白分解物(圖3B)對(duì)于皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)活動(dòng)的效果。對(duì)大鼠(η = 3)給藥水、或Tyr-ProO. 12mg/kg體重、或酪蛋白分解物4. 2mg/ kg體重，經(jīng)時(shí)測(cè)定尾部的皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)的動(dòng)作電位?？v軸以百分率表示將給藥前的值 (O分鐘值)設(shè)為100時(shí)的各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)動(dòng)作電位(CASNA 皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)活動(dòng))。橫軸為樣品給藥后的時(shí)間(分鐘)。與水給藥對(duì)照組的顯著性差異檢驗(yàn)以給藥5 60分鐘的值作為組并采用方差分析法(ANOVA)來進(jìn)行。圖4示出肽Tyr-Pro(YP)對(duì)于胃排空能力的作用。對(duì)大鼠(η= 10)給藥水或 Tyr-Pro 0. lmg/kg體重，30分鐘后給藥色素(酚紅)，進(jìn)而20分鐘后摘除胃，測(cè)定胃內(nèi)的殘存色素。與水給藥對(duì)照組的顯著性差異檢驗(yàn)通過非配對(duì)的學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行。圖5-1示出肽Tyr-Pro(YP)的預(yù)防東莨菪堿誘發(fā)健忘的效果。對(duì)小鼠給藥水、或者單獨(dú)給藥東莨菪堿、或者同時(shí)給藥東莨菪堿與Tyr-Pro 1. 5mg/kg體重或Tyr-Pro 15mg/ kg體重，分別利用實(shí)施例3所述的方法對(duì)健忘預(yù)防效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖5-1A的縱軸表示自發(fā)性交替行為變化率，圖5-1B的縱軸表示進(jìn)入臂中的總進(jìn)入次數(shù)。組間的顯著性差異檢驗(yàn)采用鄧尼特型多重比較檢驗(yàn)來進(jìn)行，圖5-1A中，_表示與水給藥對(duì)照組比較P < 0. 001，#表示與東莨菪堿單獨(dú)給藥組比較P < 0.05，###表示P < 0.001。另外，圖5-1B中，*表示與水給藥對(duì)照組比較P < 0. 05，##表示與東莨菪堿單獨(dú)給藥組比較P < 0. 01。圖5-2表示酪蛋白分解物的預(yù)防東莨菪堿誘發(fā)健忘的效果。對(duì)小鼠給藥水、或者單獨(dú)給藥東莨菪堿、或者同時(shí)給藥東莨菪堿與酪蛋白分解物200mg/kg體重或酪蛋白分解物2000mg/kg體重，分別利用實(shí)施例3所述的方法對(duì)健忘預(yù)防效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖5-2A的縱軸表示自發(fā)性交替行為變化率，圖5-2B的縱軸表示進(jìn)入臂中的總進(jìn)入次數(shù)。組間的顯著性差異檢驗(yàn)采用鄧尼特型多重比較檢驗(yàn)來進(jìn)行，圖5-2A中，_表示與水給藥對(duì)照組比較P < 0. 001，#表示與東莨菪堿單獨(dú)給藥組比較P < 0. 05，##表示P < 0. 001。另外，圖5-2B 中，_表示與水給藥對(duì)照組比較P < 0. 001，#表示與東莨菪堿單獨(dú)給藥組比較P < 0. 05。圖6表示肽Tyr-Pro(YP)或酪蛋白分解物的抗焦慮作用。對(duì)小鼠(η = 12)給藥水、或Tyr-Pro 0. lmg/kg體重 100mg/kg體重、或酪蛋白分解物10mg/kg 1000mg/kg體重，測(cè)定開臂停留時(shí)間(實(shí)施例4)。縱軸表示僅提供水的對(duì)照組、Tyr-Pro給藥組和酪蛋白分解物給藥組的開臂停留時(shí)間比例。數(shù)據(jù)表示平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。與水給藥對(duì)照組的顯著性差異檢驗(yàn)采用非配對(duì)的學(xué)生t檢驗(yàn)來進(jìn)行，和_分別表示P < 0. 05、P < 0. 01和 P < 0. 001。
具體實(shí)施方式
作為本發(fā)明組合物的有效成分的肽Tyr-Pro可以是采用有機(jī)化學(xué)的方法合成的肽，另外也可以是來自天然物質(zhì)的肽。作為這些肽的有機(jī)化學(xué)的合成法，可以使用固相法 (Boc法、Fmoc法)或液相法等一般的方法，例如，可以使用島津制作所制造的肽合成裝置 (PSSM-8型)等肽自動(dòng)合成裝置進(jìn)行合成。關(guān)于肽合成的反應(yīng)條件等，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識(shí)任意地設(shè)定所選擇的合成方法、適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件等。通過化學(xué)方法合成的肽的純化方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。本說明書中，提到肽Tyr-Pro時(shí)，除了特別聲明的情況和從上下文可明確除外的情況之外，“Tyr-Pro”和“肽Tyr-Pro”包括其鹽。這種鹽包含例如鈉鹽、鉀鹽等能夠在生理?xiàng)l件下存在的鹽。另外，除了作為本發(fā)明組合物的有效成分的肽、Tyr-Pro以外，本發(fā)明的組合物還可以含有其他肽和游離氨基酸或其鹽。需要說明的是，在與發(fā)明相關(guān)的內(nèi)容中，氨基酸的三字母表示和單字母表示以及肽的表示依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般規(guī)則。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，肽Tyr-Pro可以來源于下述發(fā)酵物，該發(fā)酵物是通過利用屬于瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)種的菌等使包含含有Tyr-Pro序列的蛋白質(zhì)的原料(例如，牛乳、馬乳、山羊乳或羊乳、以及它們的脫脂奶粉、大豆、小麥等)發(fā)酵而得到的。發(fā)酵時(shí)的蛋白質(zhì)原料含量沒有特別限定，通常優(yōu)選為1 19重量％。這樣的發(fā)酵物可以直接制成本發(fā)明的組合物，或者也可以進(jìn)行離心分離、過濾、層析、干燥等適當(dāng)?shù)奶幚砗笾瞥杀景l(fā)明的組合物。本發(fā)明的其他方式中，Tyr-Pro也可以來源于含有Tyr-Pro的蛋白質(zhì)的水解物。 這樣的蛋白質(zhì)中含有例如牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等的酪蛋白那樣的獸乳酪蛋白或其濃縮物。另外，還可以來源于將含有獸乳酪蛋白的食品原料通過曲霉菌或乳酸菌等菌類發(fā)酵而得到的發(fā)酵物。將獸乳酪蛋白水解或發(fā)酵時(shí)的酪蛋白濃度沒有特別限定，通常優(yōu)選為1 19重量％。使用市售的酶群時(shí)，通常設(shè)定最佳條件，為了得到上述酪蛋白水解物，可以根據(jù)所使用的酶群適當(dāng)變更條件、例如使用酶量或反應(yīng)時(shí)間等。例如，可以向溶解有獸乳酪蛋白的水溶液中以酶群/獸乳酪蛋白的重量比為1/1000以上、優(yōu)選為1/100 1/10、特別優(yōu)選為1/40 1/10的比例添加蛋白質(zhì)分解酶。反應(yīng)條件可以根據(jù)所使用的酶群適當(dāng)選擇，通?？梢栽O(shè)為25 60°C、優(yōu)選為45 55°C，pH3 5、優(yōu)選為5 9。另外，關(guān)于反應(yīng)時(shí)間， 可以以2 48小時(shí)、優(yōu)選7 15小時(shí)來進(jìn)行。這樣的蛋白質(zhì)水解物、特別是酪蛋白水解物可以直接制成本發(fā)明的組合物，或者也可以進(jìn)行離心分離、過濾、層析、干燥等處理后制成本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的組合物具有自主神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用。自主神經(jīng)的活動(dòng)包括交感神經(jīng)的活動(dòng)和副交感神經(jīng)的活動(dòng)，本發(fā)明的組合物具有抑制交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)的作用和促進(jìn)副交感神經(jīng)活動(dòng)的作用。特別是，本發(fā)明的組合物可以抑制交感神經(jīng)的活動(dòng)的亢進(jìn)、或者促進(jìn)副交感神經(jīng)活動(dòng)，其結(jié)果具有促進(jìn)消化道運(yùn)動(dòng)的作用、預(yù)防健忘的作用、抗焦慮作用或者促進(jìn)血流的作用。此外，本發(fā)明的組合物具有自主神經(jīng)的調(diào)節(jié)作用，因此廣泛地具有心率調(diào)節(jié)作用、血糖調(diào)節(jié)作用、胃液分泌調(diào)節(jié)作用、體溫調(diào)節(jié)作用、血壓調(diào)節(jié)作用和壓力緩和作用等。本發(fā)明的組合物及其有效成分肽Tyr-Pro的自主神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)作用、特別是抑制交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)的作用和促進(jìn)副交感神經(jīng)活動(dòng)的作用，例如可以通過下述方式確認(rèn)。本發(fā)明的組合物的副交感神經(jīng)活動(dòng)促進(jìn)作用例如可以通過下述方式確認(rèn)對(duì)大鼠或小鼠給藥本組合物，經(jīng)時(shí)測(cè)定支配胃的副交感(迷走)神經(jīng)的動(dòng)作電位，動(dòng)作電位上升，從而確認(rèn)。另外，對(duì)大鼠或小鼠給藥本發(fā)明的組合物，經(jīng)過一定時(shí)間后(例如15分鐘 30 分鐘后)，向大鼠或小鼠的胃中投入色素例如酚紅，經(jīng)過一定時(shí)間后(例如20分鐘后)摘除該大鼠或小鼠的胃并測(cè)定殘存色素的量，從而以胃排空能力的增強(qiáng)、即胃的活動(dòng)活躍化為指標(biāo)，可以確認(rèn)本組合物的副交感神經(jīng)活動(dòng)促進(jìn)作用。另外，本發(fā)明的組合物對(duì)于交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的抑制作用可以通過下述方式確認(rèn)對(duì)大鼠或小鼠給藥本組合物，經(jīng)時(shí)測(cè)定支配腎上腺的交感神經(jīng)的動(dòng)作電位，動(dòng)作電位降低，從而確認(rèn)。此外，本組合物的抗焦慮作用例如可以通過小鼠的高架式十字迷宮試驗(yàn)來確認(rèn)。具體地說，可如下地進(jìn)行確認(rèn)對(duì)小鼠給藥水或本組合物或肽Tyr-Pro，將小鼠放置在位于高處的迷宮的中心的平臺(tái)上，在一定時(shí)間內(nèi)測(cè)定分別停留于開臂(無壁的臂)和閉臂(有壁的臂)的時(shí)間，與僅給藥水的對(duì)照組比較， 若在開臂中的停留時(shí)間增加，則可確認(rèn)到抗焦慮作用。本組合物或肽Tyr-Pro的健忘預(yù)防作用可以利用例如使用了 Y字型迷宮并基于阿爾茨海默病治療藥的評(píng)價(jià)體系來確認(rèn)。具體地說，對(duì)大鼠或小鼠單獨(dú)給藥像東莨菪堿那樣的誘發(fā)健忘癥的藥物，或者同時(shí)給藥本發(fā)明的組合物與這樣的藥物，或者在給藥這樣的藥物之前給藥本發(fā)明的組合物，在利用Y字型迷宮的試驗(yàn)中，以進(jìn)入不同的臂的自發(fā)性交替行為變化率、進(jìn)入迷宮的總進(jìn)入次數(shù)為指標(biāo)， 能夠確認(rèn)本發(fā)明的組合物的健忘預(yù)防作用(參照實(shí)施例3)。本發(fā)明的組合物的有效成分為肽Tyr-Pro，通過經(jīng)口給藥或經(jīng)口攝取，能夠?qū)崿F(xiàn)上述所期望的效果。本發(fā)明的組合物或肽Tyr-Pro的給藥或攝取期間可以考慮到給藥或攝取的對(duì)象例如人或非人動(dòng)物的年齡或該對(duì)象的健康狀態(tài)等而進(jìn)行各種調(diào)整。非人動(dòng)物包括非人高等脊椎動(dòng)物、特別是非人哺乳類，包括狗、貓等玩賞動(dòng)物、牛、馬、豬、綿羊等家畜，但并不限定于此。本發(fā)明的組合物通過1次給藥即可觀察到效果，通過1天1次以上持續(xù)攝取， 能夠期待持續(xù)的效果。將本發(fā)明的組合物用作藥品時(shí)的形態(tài)可以制成經(jīng)口給藥用的制劑的形態(tài)。例如，可列舉出片劑、丸劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微膠囊、散劑、顆粒劑、液劑等。作為藥品制造時(shí)，例如，可以根據(jù)需要適當(dāng)?shù)厥褂弥扑幧峡山邮艿妮d體、賦形劑、補(bǔ)形劑、防腐劑、穩(wěn)定化劑、結(jié)合劑、PH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、增稠劑、凝膠化劑、保存劑、抗氧化劑等，以通常認(rèn)可的制劑給藥所要求的單位用量形態(tài)制造。本發(fā)明的組合物還可以作為飲食品用原材料或動(dòng)物用飼料原材料使用，例如，可以將本發(fā)明的組合物或作為本發(fā)明的組合物的有效成分的肽Tyr-Pro制成具有消化道運(yùn)動(dòng)促進(jìn)作用、抗焦慮作用、血流促進(jìn)作用、健忘預(yù)防、心率調(diào)節(jié)作用、血糖調(diào)節(jié)作用、胃液分泌調(diào)節(jié)作用、體溫調(diào)節(jié)作用、或壓力緩和作用等功效的特定保健用食品等功能性食品。關(guān)于用于得到所期望的效果的本組合物或肽Tyr-Pro的給藥量或攝取量，每一次作為有效成分的肽Tyr-Pro的量通常為0. 045mg/kg體重 100mg/kg體重左右。特別是， 主要期望促進(jìn)消化道運(yùn)動(dòng)的情況下，本發(fā)明的組合物的攝取量以Tyr-Pro的量計(jì)優(yōu)選為 0. 045mg/kg體重 0. 12mg/kg體重。另外主要期望抗焦慮作用的情況下，以Tyr-Pro的量計(jì)特別優(yōu)選為0. lmg/kg體重 100mg/kg體重，主要期望健忘預(yù)防作用的情況下，以Tyr-Pro 的量計(jì)優(yōu)選為1. 5mg/kg體重 15mg/kg體重。根據(jù)每一天的攝取次數(shù)，還可以使食品例如功能性食品的每一次的攝取量低于上述量。關(guān)于合適的攝取量，如上所述可以考慮到各種因素進(jìn)一步進(jìn)行調(diào)整。含有本發(fā)明的組合物或其有效成分肽Tyr-Pro的食品例如功能性食品可以如下制造將如上所述得到的含有Tyr-Pro的蛋白質(zhì)的分解物或其濃縮物、包含含有Tyr-Pro的蛋白質(zhì)的原料的發(fā)酵物自身添加到各種食品中而制造，或者將發(fā)酵物制成粉末狀或顆粒狀添加到各種食品中而制造。另外，根據(jù)需要，還可以添加用于食品的其他成分例如糖類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、調(diào)味品例如各種碳水化物、脂質(zhì)、維生素類、礦物質(zhì)類、甜味劑、 香料、色素、口感改善劑等或它們的混合物等添加物，改善營(yíng)養(yǎng)的平衡或風(fēng)味等。含有本發(fā)明的組合物或作為其有效成分的肽Tyr-Pro的動(dòng)物用飼料也可以與人食用食品同樣地制備。例如上述功能性食品可以制成固態(tài)物、凝膠狀物、液態(tài)物的任一種形態(tài)，例如，可列舉出乳酸菌飲料等發(fā)酵乳制品、各種加工飲食品、干燥粉末、片劑、膠囊劑、顆粒劑等，此外可以制成各種飲料、酸奶、流食、果凍、糖果、蒸煮袋裝食品(retort food)、清涼果片、小甜餅干、蛋糕、面包、餅干、巧克力等。制造含有本發(fā)明的組合物的特定保健用食品等功能性食品時(shí)，依賴于添加形態(tài)、 制品形態(tài)，按照最終制品中所含有的有效成分即肽Tyr-Pro的含量為0. 00001質(zhì)量％ 10 質(zhì)量％、優(yōu)選為0. 00003質(zhì)量％ 3質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選為0. 0001質(zhì)量％ 1質(zhì)量％的方式進(jìn)行制備。以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明的范圍不限定于實(shí)施例。實(shí)施例1Tyr-Pro對(duì)于自主神經(jīng)活動(dòng)的效果使用體重約300g的Wistar系雄性大鼠(約9周齡)(η = 3)，食物和水自由攝取。 為了研究自主神經(jīng)的活動(dòng)，斷食3小時(shí)后，在光照期(light period)的中間期在氨基甲酸乙酯麻醉下將經(jīng)口給藥用的聚乙烯管插入口腔內(nèi)。之后，利用銀電極將支配腎上腺的交感神經(jīng)、支配胃的副交感(迷走)神經(jīng)或尾巴的皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)吊起來，測(cè)定神經(jīng)的電活動(dòng)。需要說明的是，從手術(shù)開始至測(cè)定結(jié)束為止將軟管插入氣管以確保呼吸道暢通，利用保溫裝置將體溫(大鼠直腸溫)保持在35.0士0.5°C。在這些神經(jīng)活動(dòng)穩(wěn)定的時(shí)期將各樣品通過Iml聚乙烯管經(jīng)口給藥，測(cè)定這些神經(jīng)活動(dòng)的變化。樣品為=Tyr-Pro 0. 045mg/kg體重、Tyr-ProO. 12mg/kg體重、Tyr-Pro 1. 2mg/kg體重和酪蛋白分解物4. 2mg/kg體重。所使用的酪蛋白分解物是利用酶將牛乳酪蛋白水解而得到的，相對(duì)于酪蛋白分解物的總量含有 0. 5重量％以上的Tyr-Pro。作為對(duì)照，經(jīng)口給藥作為溶劑的水1ml。腎上腺交感神經(jīng)、胃副交感神經(jīng)和皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)的活動(dòng)的數(shù)據(jù)通過每5分鐘平均5秒的放電頻率(pUlse/5s)的平均值進(jìn)行分析，將刺激開始前的值(0分鐘值)作為100%以百分率來表示，以其平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差示出。與對(duì)照組的顯著性差異檢驗(yàn)以給藥5 60分鐘的值作為組并采用方差分析法(ANOVA) 來進(jìn)行。結(jié)果示于圖1 圖3。與水給藥組相比，Tyr-Pro 0. 045mg/kg體重和Tyr-ProO. 12mg/kg體重給藥的任一情況下，給藥后的胃副交感神經(jīng)活動(dòng)顯著上升(圖1)。另外，與水給藥組相比，通過 Tyr-Pro 0. 012mg/kg體重給藥，腎上腺交感神經(jīng)活動(dòng)顯著降低(圖2)。此外，與水給藥組相比，通過Tyr-Pro 0. 12mg/kg體重給藥，顯示出皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)活動(dòng)降低的傾向(圖 3A)。另外，與水給藥組相比，通過酪蛋白分解物4. 2mg/kg體重給藥，皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)活動(dòng)顯著降低(圖3B)。由該結(jié)果可知，Tyr-Pro的經(jīng)口給藥在0. 045mg/kg體重 0. 12mg/ kg體重的范圍內(nèi)促進(jìn)胃副交感神經(jīng)活動(dòng)、抑制腎上腺交感神經(jīng)活動(dòng)、以及抑制皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)活動(dòng)。另外可知，在所使用的酪蛋白分解物的情況下，通過4. 2mg/kg體重給藥可以抑制皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)活動(dòng)。實(shí)施例2Tyr-Pro對(duì)于胃排空能力的效果使用Sprague-Dawley (SD)系雄性大鼠(6周齡)(η = 10)，食物和水自由攝取，預(yù)備飼育1周以上后，供于實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)前，使用斷食籠使所有大鼠斷食24小時(shí)。其間，水的攝取是自由的。試驗(yàn)中，對(duì)大鼠經(jīng)口給藥溶劑(注射用蒸餾水)和Tyr-Pro 0. lmg/kg體重， 30分鐘后再以1.5ml/大鼠的容量經(jīng)口給藥0. 05%的色素(酚紅)溶液(含有1.5%羧甲基纖維素)，色素給藥20分鐘后在乙醚麻醉下立即摘除胃。摘除的胃浸漬到裝有0. IN NaOH 的燒杯內(nèi)，用剪刀剪碎后使用Polytron均質(zhì)化。勻漿在室溫下放置1小時(shí)后，向上清中添加30% (w/v)三氯乙酸溶液使蛋白沉淀。將上清離心后，測(cè)定560nm處的吸光度，根據(jù)下式計(jì)算出胃排空能力(GE :gastric emptying)。
GE(%)=
(1 -從待測(cè)物質(zhì)給藥組的胃回收的溶液的吸光度/胃排出0%時(shí)的吸光度)χ 100_結(jié)果示于圖4。測(cè)定結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，與對(duì)照組的組間比較采用非配對(duì)的學(xué)生t檢驗(yàn)。在大鼠胃排空能力試驗(yàn)中，對(duì)照組(蒸餾水給藥組)的色素排出率為 78. 8士2. 41%。Tyr-Pro給藥組的色素排出率為85. 4士2. 01%。由該結(jié)果可知，Tyr-Pro以 0. lmg/kg體重給藥時(shí)顯示出消化道運(yùn)動(dòng)促進(jìn)作用。實(shí)施例3Tyr-Pro和酪蛋白分解物的健忘預(yù)防作用使用ddY系雄性小鼠(約7周齡)(n = 15)，食物和水自由攝取。作為待測(cè)物質(zhì)， 使用Tyr-Pro 1. 5mg/kg體重、Tyr-Pro 15mg/kg體重、酪蛋白分解物200mg/kg體重和酪蛋白分解物2000mg/kg體重。所使用的酪蛋白分解物與實(shí)施例1中記載的物質(zhì)相同。在實(shí)施用于評(píng)價(jià)自發(fā)性交替行為的Y字迷宮試驗(yàn)的60分鐘之前對(duì)小鼠單次經(jīng)口給藥待測(cè)物質(zhì)。另外，實(shí)施Y字迷宮試驗(yàn)的30分鐘之前，為了誘發(fā)小鼠的記憶障礙和/或認(rèn)知障礙，將東莨菪堿以lmg/kg體重的方式在背部進(jìn)行皮下給藥。Y字迷宮試驗(yàn)中，以一根臂的長(zhǎng)度為40cm、壁的高度為12cm、底的寬度為3cm、上部的寬度為IOcm的方式將3根臂分別以120度的角度連接，將連接得到的Y字迷宮用作實(shí)驗(yàn)裝置。將小鼠放置在Y字迷宮的任一個(gè)臂的前端，在8分鐘內(nèi)使其在迷宮內(nèi)自由探索，依次記錄小鼠走過的臂。計(jì)算小鼠在測(cè)定時(shí)間內(nèi)走到各臂中的次數(shù)，以此作為總進(jìn)入數(shù)，調(diào)查其中連續(xù)選擇不同的三個(gè)臂的組合(例如，將3根臂分別設(shè)為A、B、C時(shí)，進(jìn)入的臂的順序?yàn)锳BCBACACB的情況下包括重復(fù)在內(nèi)計(jì)數(shù)為4)，將該數(shù)作為自發(fā)性交替行為數(shù)。將自發(fā)性交替行為數(shù)除以由總進(jìn)入數(shù)減去2 所得的數(shù)，再乘以100，所求得的值作為自發(fā)性交替行為變化率，以此作為自發(fā)性交替行為的指標(biāo)。測(cè)定值每組以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。與對(duì)照組的顯著性差異檢驗(yàn)在單因素方差分析后采用鄧尼特(Durmett)型多重比較檢驗(yàn)來進(jìn)行。結(jié)果示于圖5_1和圖5_2。
由這些結(jié)果可知，Tyr-Pro在1. 5mg/kg體重 15mg/kg體重的范圍內(nèi)顯示出健忘預(yù)防作用，所使用的酪蛋白分解物在200mg/kg體重 2000mg/kg體重的范圍內(nèi)顯示出健忘預(yù)防作用。實(shí)施例4某干高M(jìn)式+字誅宮i式駘的Tvr-Pro的杭#1虎作用的i平價(jià)使用ddY系雄性小鼠(約6周齡)(η = 12)，預(yù)備飼育后，將Tyr-Pro (0. lmg/kg體重，1. Omg/kg體重，10mg/kg體重，30mg/kg體重，100mg/kg體重)或酪蛋白分解物(IOmg/ kg體重，100mg/kg體重，1000mg/kg體重)單次經(jīng)口給藥，給藥30分鐘后通過高架式十字迷宮試驗(yàn)研究抗焦慮作用。酪蛋白分解物與實(shí)施例1中記載的物質(zhì)相同。需要說明的是， 作為陽(yáng)性對(duì)照，給藥作為抗焦慮藥已知的安定(1. Omg/kg體重)。關(guān)于高架式十字迷宮，使 2根長(zhǎng)度65cm、寬度5cm的氯乙烯制的板形成十字交叉的形狀，在其中一根通道的周圍除了中央的交叉部分以外安裝高度為50cm的壁(黑色丙烯酸制樹脂)。即，十字迷宮由無壁的 2根臂(開臂)和有壁的2根臂(閉臂)、以及中央的交差部分構(gòu)成。高架式十字迷宮試驗(yàn)中，在迷宮的中央的交叉部朝向一個(gè)有壁的臂放置小鼠，使其在迷宮上自由探索5分鐘，觀察其行動(dòng)，測(cè)定開臂上的累積停留時(shí)間。由測(cè)定值求出5分鐘的試驗(yàn)中的開臂累積停留時(shí)間比例，以此作為抗焦慮作用的指標(biāo)。需要說明的是，對(duì)照組單次經(jīng)口給藥蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組單次經(jīng)口給藥安定(diaz印am) lmg/kg體重。各測(cè)定值以每組的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，與對(duì)照組的組間比較采用非配對(duì)的學(xué)生t檢驗(yàn)。結(jié)果示于圖6。由這些結(jié)果可知，Tyr-Pro在0. lmg/kg體重 100mg/kg體重的范圍內(nèi)顯示出抗焦慮作用，所使用的酪蛋白分解物在10mg/kg體重 1000mg/kg體重的范圍內(nèi)顯示出抗焦慮作用。
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權(quán)利要求
1.一種自主神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)用組合物，其以Tyr-Pr0或其鹽作為有效成分。
2.一種副交感神經(jīng)活動(dòng)的促進(jìn)用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。
3.一種交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)抑制用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的組合物，其具有消化道運(yùn)動(dòng)促進(jìn)作用、健忘預(yù)防作用或抗焦慮作用。
5.一種消化道運(yùn)動(dòng)促進(jìn)用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。
6.一種健忘預(yù)防用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。
7.一種焦慮抑制用組合物，其以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的組合物，其為口服使用。
9.一種調(diào)節(jié)非人動(dòng)物的自主神經(jīng)活動(dòng)的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥Tyr-Pro或其鹽的步驟。
10.一種促進(jìn)非人動(dòng)物的副交感神經(jīng)活動(dòng)的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥Tyr-Pro或其鹽的步驟。
11.一種抑制非人動(dòng)物的交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥 Tyr-Pro或其鹽的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的方法，其在非人動(dòng)物中促進(jìn)消化道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防健忘或抑制焦慮。
13.一種促進(jìn)消化道運(yùn)動(dòng)的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥Tyr-Pro或其鹽的步驟。
14.一種預(yù)防健忘的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥Tyr-Pro或其鹽的步驟。
15.一種抑制焦慮的方法，其包括對(duì)非人動(dòng)物給藥Tyr-Pro或其鹽的步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求9 15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，給藥為經(jīng)口給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)自主神經(jīng)活動(dòng)的可口服的組合物和方法。特別是，本發(fā)明提供能夠抑制交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)的可口服的組合物和能夠促進(jìn)副交感神經(jīng)活動(dòng)的可口服的組合物。本發(fā)明涉及以Tyr-Pro或其鹽作為有效成分的自主神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)用組合物。
文檔編號(hào)A61K38/00GK102448480SQ20108002330
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者中村康則, 內(nèi)田直人, 大木浩司, 大澤一仁, 馬場(chǎng)秀彥 申請(qǐng)人:可爾必思株式會(huì)社