專利名稱：精氨酸酶的定向位點聚乙二醇化及其作為抗癌和抗病毒試劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及為增加精氨酸酶的血清或循環(huán)半衰期并提高其藥代動力學性質(zhì)、體內(nèi)生物學活性、穩(wěn)定性并降低對該酶的體內(nèi)免疫反應(免疫原性)的目的而對該酶進行的修飾。更具體地說，本發(fā)明涉及通過遺傳修飾編碼精氨酸酶的基因使單聚乙二醇 (monopolyethylene glycol)與精氨酸酶發(fā)生的位點特異性共價偶聯(lián)，以生成單-和位點-特異性聚乙二醇化精氨酸酶，這成為眾多精氨酸依賴型疾病例如各種癌癥和人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的有效措施。
背景技術(shù)：
精氨酸酶精氨酸酶是含有受金屬激活的氫氧化物離子的錳金屬酶，所述離子是催化水解和水合反應的金屬酶中的關(guān)鍵親核物質(zhì)。精氨酸酶將天然存在的精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸和尿素。所述酶存在于包括細菌和人類在內(nèi)的很多活體生物中(Jenkinson等，1996，Comp Biochem Physiol B Biochem MoI Biol,114 :107-32)。精氨酸酶的聚乙二醇化精氨酸酶可以用作治療劑并通過腸胃外施用于各種病狀。然而，腸胃外施用的精氨酸酶(其是一種蛋白)可能具有免疫原性并且具有短的藥理學半衰期。因此，在患者中難以實現(xiàn)該蛋白的治療有用的血液水平。這些問題可以通過將該蛋白與聚合物例如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)來克服。具有惰性的、非毒性的生物降解性聚合物PEG與分子的共價結(jié)合在生物技術(shù)和醫(yī)藥中具有重要的應用。據(jù)報道，具有生物學和藥學活性的蛋白的聚乙二醇化提高了藥代動力學，從而延長了持續(xù)時間、改善了安全性(例如更低的毒性、免疫原性和抗原性)、增加了功效、降低了給藥頻率、提高了藥物溶解度和穩(wěn)定性、降低了蛋白質(zhì)水解性并促進了藥物的可控釋放(Roberts 等，2002，Adv Drug Deliv Rev, 54 :459-76 ；Harris & Chess，2003，Nat Rev Drug Discov,2 :214-221)。通過本領(lǐng)域中的常規(guī)方法生成的PEG-蛋白偶聯(lián)物含有不均一的物種，各自結(jié)合有數(shù)量不定(從O至該蛋白具有的氨基數(shù))的PEG分子。即使對于結(jié)合有相同數(shù)目的PEG 分子的物種，在該蛋白上的結(jié)合位點在這些物種之間也是不同的。然而，這種非特異性的聚乙二醇化可能得到部分無活性或基本無活性的偶聯(lián)物?；钚缘慕档涂赡苁窃赑EG結(jié)合于不正確位點時遮蔽了該蛋白的活性受體結(jié)合域而造成的。因此，明確需要生成能夠保留親本蛋白的活性的均一(homogeneous)的聚乙二醇化蛋白分子并且使得臨床用途所需的正確和一致的劑量的施用成為可能的更好的方法。通過氨基酸剝奪的癌癥治療氨基酸剝奪療法是用于一些癌癥治療的有效措施。雖然正常細胞不需要精氨酸， 但是很多癌細胞系就這種氨基酸而言是營養(yǎng)缺陷型的。很多證據(jù)表明，體外精氨酸耗損 (利用精氨酸降解酶或使用缺乏精氨酸的介質(zhì))導致大范圍的癌細胞的迅速破壞(Scott et al. ,2000, Br J Cancer，83 :800-10)。酶(其是一種蛋白)的直接使用存在免疫原性、 抗原性和短的循環(huán)半衰期的問題。通過精氨酸剝奪對病毒講行的抑制病毒感染是死亡的主要原因之一，每年數(shù)百萬的死亡病例直接歸因于若干種病毒，包括肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒(HIV)。然而，使用目前的抗病毒療法還存在若干問題。首先，有效的抗病毒藥物相對較少。很多現(xiàn)有的抗病毒物質(zhì)導致不利的或不希望的副作用。大部分有效的療法(例如接種疫苗)只對單個病毒株具有高特異性。病毒經(jīng)常發(fā)生突變，使得其對藥物或疫苗產(chǎn)生抗性。需要不具有與現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)的所述問題的抑制病毒復制的方法。過去30年的研究表明，病毒的體外復制需要胞外精氨酸。過去這通過如下方法來實現(xiàn)使組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基缺乏精氨酸，并對作為增補物使用的血清進行透析以獲得沒有精氨酸的培養(yǎng)基。使用這種方法來實現(xiàn)精氨酸剝奪導致很多不同的病毒家族的復制受到抑制，所述病毒家族包括腺病毒(Rouse等，1963，Virology, 20 =357-365)和孢疹病毒 (Tankersley,1964，J Bacteriol,87 :609-13)。人類免疫缺陷病毒(HIV)獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ是一種致命的疾病，據(jù)報道，該疾病的病例在過去數(shù)年內(nèi)急劇增加。AIDS病毒在1983年首次得到鑒定。該疾病具有數(shù)個名稱和首字母縮略名。它是第三個已知的T-嗜淋巴細胞病毒(HTLV-III)，并且具有在免疫系統(tǒng)的細胞內(nèi)復制的能力，導致深度的細胞破壞。AIDS病毒式一種逆轉(zhuǎn)錄病毒(一種在復制期間使用逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒)。目前已報道有兩種明顯不同的HIV病毒家族，即HIV-I和HIV-2。本文中使用的首字母縮略名“HIV”一般表示人類免疫缺陷病毒。HIV復制據(jù)信是精氨酸依賴型的，因此精氨酸的消耗將抑制HIV復制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供新型的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物基本上是均一的并且具有共價結(jié)合到精氨酸酶分子上的特異性位點的PEG部分。本發(fā)明的兩個優(yōu)選的實施方式是Cys45-人類精氨酸酶I (HAI)和Cys161-熱溶芽孢桿菌(Bacillus caldovelox) 精氨酸酶(BCA)。本發(fā)明的另一個目的是提供制備定向位點、單聚乙二醇化精氨酸酶偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物具有強力的抗癌和抗病毒效果。本發(fā)明的一個特定的實施方式包括三個基本步驟。 第一步驟是用于編碼精氨酸酶的基因的遺傳修飾，使所得到的精氨酸酶將在給定的位置上具有單個自由的半胱氨酸殘基。第二步驟是在選定的系統(tǒng)中表達經(jīng)修飾的基因以生成所期望的精氨酸酶。表達系統(tǒng)可以是人類細胞或組織或者其它的生物體，包括例如細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或轉(zhuǎn)基因動物。第三步驟是精氨酸酶的所述自由的半胱氨酸殘基與PEG化合物的馬來酰亞胺基團(MAL)之間的偶聯(lián)，這導致所述PEG 化合物與精氨酸酶的所述自由的半胱氨酸之間發(fā)生共價結(jié)合。本發(fā)明的另一個目的是提供了通過精氨酸消耗治療病毒感染的方法。該治療方法采用均一的單聚乙二醇化精氨酸酶來抑制病毒的復制。本發(fā)明的另一個目的是提供抗人類免疫缺陷病毒(HIV)的方法。該方法采用均一的單聚乙二醇化精氨酸酶來抑制HIV的復制。本發(fā)明的另一個目的是提供通過用另外的氨基酸殘基(例如脯氨酸)取代熱溶芽孢桿菌精氨酸酶位置20 (或者HAI和其它精氨酸酶的對應位置)上的纈氨酸來增強精氨酸酶的酶促活性的方法。本發(fā)明的又一個目的是提供增強精氨酸酶的酶促活性的方法，所述方法通過用鈷取代天然金屬輔因子錳來實現(xiàn)。表征本發(fā)明的各種新穎性特征在所附的并構(gòu)成本公開內(nèi)容的一部分的權(quán)利要求書中具體指出。為了更好地理解本發(fā)明、本發(fā)明的操作優(yōu)點以及使用本發(fā)明所實現(xiàn)的具體目標，應參考附圖以及隨后的其中展示并描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的具體實施方式
部分。


圖1顯示了人類精氨酸酶I的核苷酸序列(a) (SEQ ID No 1)及其根據(jù)本發(fā)明為定向位點聚乙二醇化所設(shè)計的突變核苷酸酶序列(b) (SEQ ID No 2)；熱溶芽孢桿菌精氨酸酶的核苷酸序列(c) (SEQ ID No 3)及其根據(jù)本發(fā)明為定向位點聚乙二醇化所設(shè)計的突變核苷酸酶序列(d) (SEQ ID No :4)。圖2顯示了人類精氨酸酶I的氨基酸序列(a) (SEQ ID No :5)及其根據(jù)本發(fā)明為 Cys45定向位點聚乙二醇化所設(shè)計的經(jīng)修飾的氨基酸酶序列(b)(SEQ ID No 6)；熱溶芽孢桿菌精氨酸酶的氨基酸序列(c) (SEQ ID No:7)及其根據(jù)本發(fā)明為Cys161定向位點聚乙二醇化所設(shè)計的經(jīng)修飾的氨基酸酶序列(d) (SEQ ID No 8)。圖3顯示了為Cys45定向位點聚乙二醇化所設(shè)計的人類精氨酸酶I突變體(C168S/ C303S)的核苷酸序列和氨基酸序列(a) (SEQ ID No :9和SEQ ID No :10)，為Cys45定向位點聚乙二醇化所設(shè)計的帶有6XHis標簽的人類精氨酸酶I突變體(C168S/C303S)的核苷酸序列和氨基酸序列(b) (SEQ ID No :11和SEQ ID No 12)的比對，為Cys161定向位點聚乙二醇化所設(shè)計的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶突變體(S161C)的核苷酸序列和氨基酸序列(c) (SEQ ID No:13和SEQ ID No :14)，為Cys161定向位點聚乙二醇化所設(shè)計的帶有6XHis標簽的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶突變體(S161C)的核苷酸序列和氨基酸序列(d) (SEQ ID No :15和SEQ ID No 16)的比對。圖4顯示了(a)野生型人類精氨酸酶I的晶體結(jié)構(gòu)(使用Cn3D 4. 1軟件從NCBI 網(wǎng)站下載)，其中示出Cys45遠離活性位點；(b)野生型熱溶芽孢桿菌精氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)， 其中示出Ser161遠離活性位點。圖5顯示了用于具有單鏈mPEG-馬來酰亞胺(20kDa)的帶有6XHis標簽的人類精氨酸酶I突變體的Cys45-特異性單聚乙二醇化的偶聯(lián)程序，其中示出馬來酰亞胺的雙鍵與巰基發(fā)生烷基化反應而形成穩(wěn)定的硫醚鍵，和(b)用于帶有6XHis標簽的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶突變體的Cys161-特異性單聚乙二醇化的對應程序。圖6顯示了利用含有精氨酸酶基因的大腸桿菌(E. coli)BL21-DE3在2升發(fā)酵罐中發(fā)酵的時間過程，其中示出分批發(fā)酵獲得的結(jié)果(al)和補料-分批發(fā)酵獲得的結(jié)果 (a2)；分批發(fā)酵的時間關(guān)系曲線圖(bl)和補料-分批發(fā)酵的時間關(guān)系曲線圖(1^2)，其中示出諸如溫度、攪拌速率、PH、溶解氧值等參數(shù)的變化；來自螯合型FF s印harose(瓊脂糖)柱的帶有6XHis標簽的人類精氨酸酶I突變體的洗脫曲線(c)，第一峰為蛋白雜質(zhì)，第二峰為經(jīng)純化的人類精氨酸酶I ；和來自螯合型FF sepharose柱的帶有6XHis標簽的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶突變體的洗脫曲線(d)，第一峰為蛋白雜質(zhì)，第二峰為經(jīng)純化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶。圖7顯示了含有帶6XHis標簽的人類精氨酸酶I突變體(a)和帶6XHis標簽的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶突變體(b)的不同組分的SDS-PAGE分析。圖8顯示了(a)沒有聚乙二醇化的人類精氨酸酶I突變體和Cys45聚乙二醇化的人類精氨酸酶I突變體的SDS-PAGE分析(泳道1 蛋白分子量標記，泳道2 沒有聚乙二醇化的人類精氨酸酶I突變體，和泳道3 :Cys45聚乙二醇化的人類精氨酸酶I(HAI-PEG20)) ； (b) 沒有聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶突變體和Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶的SDS-PAGE分析(泳道1 蛋白分子量標記，泳道2 沒有聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶突變體，和泳道3 =Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶(BCA-PEG20))。圖9顯示了(a)腹膜內(nèi)注射到BALB/c小鼠中的單劑量非聚乙二醇化的和Cys45 聚乙二醇化的人類精氨酸酶I(HAI-PEG20)的藥代動力學曲線，和(b)腹膜內(nèi)注射到 BALB/c小鼠中的單劑量非聚乙二醇化的和Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶 (BCA-PEG20)的藥代動力學曲線。圖10顯示了腹膜內(nèi)注射到BALB/c小鼠中長達14天的單劑量Cys45聚乙二醇化的人類精氨酸酶I (HAI-PEG20)的藥效動力學曲線，和(b)腹膜內(nèi)注射到BALB/c小鼠中長達 14天的單劑量Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶(BCA-PEG20)的藥效動力學曲線。圖11顯示了在研究過程中用不同藥物注射的異種移植有HepIBB人類肝癌細胞的 BALB/c裸小鼠(a)、用Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶注射的異種移植有MCF-7 人類乳癌細胞的BALB/c裸小鼠(b)、用不同藥物注射的異種移植有A549肺癌細胞的BALB/ c裸小鼠(c)和用不同藥物注射的異種移植有HCT-15結(jié)腸直腸癌細胞的BALB/c裸小鼠(d) 的平均體重(士標準誤差(s. e. m.))。圖12顯示了(a)非聚乙二醇化的和Cys45聚乙二醇化的人類精氨酸酶 I (HAI-PEG20)在皮下移植有H印人類肝腫瘤細胞的BALB/c裸小鼠中的體內(nèi)活性(功效)；(b) Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶(BCA-PEG20)在皮下移植有MCF-7人類乳癌細胞的BALB/c裸小鼠中的體內(nèi)活性；(C)Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶在皮下帶有A549肺癌異種移植物的BALB/c裸小鼠中的體內(nèi)功效；(d)Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶在皮下帶有A549肺癌異種移植物的BALB/c裸小鼠中的體內(nèi)功效 (數(shù)據(jù)表示為腫瘤體積的增大倍數(shù)的平均數(shù)士s. e. m) ； (e)Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶在皮下帶有HCT-15結(jié)腸直腸癌異種移植物的BALB/c裸小鼠中的體內(nèi)功效；和 (f)Cys161聚乙二醇化的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶在皮下帶有HCT-15結(jié)腸直腸癌異種移植物的BALB/c裸小鼠中的體內(nèi)功效(數(shù)據(jù)表示為腫瘤體積的增大倍數(shù)的平均數(shù)士s. e. m)。圖13顯示了 Cys45聚乙二醇化的人類精氨酸酶I (HAI-PEG20)的HIV抑制測定。圖14顯示了疊氮胸腺嘧啶脫氧核苷(azido-thymidine，AZT)的HIV抑制測定。圖15顯示了 Cys45聚乙二醇化的人類精氨酸酶I (HAI-PEG20)的細胞毒性。圖16顯示了帶有不同金屬輔因子即Mn2+和Co2+的人類精氨酸酶I的穩(wěn)態(tài)動力學的比較。圖17顯示了熱溶芽孢桿菌精氨酸酶(BCA)的V20P突變體和由Mn2+(BCAWTMn2+)或 Co2+取代的野生型BCA的穩(wěn)態(tài)動力學的比較。
具體實施例方式人類精氨酸酶I基因(HAI)的克降人類精氨酸酶I的基因序列如圖Ia所示(SEQ ID No 1)。通過聚合酶鏈式反應 (PCR)由pAED4/HAI質(zhì)粒產(chǎn)生帶有6XHis標簽的人類精氨酸酶I的基因(HAI)，其中使用如下寡聚核苷酸以在5'末端產(chǎn)生NdeI位點和在3'末端產(chǎn)生BamHI位點引物HuAr07-F: 5‘ GAT. ATA. CAT. ATG. CAT. CAC. CAT. CAC 3' (SEQ ID NO : 17)和引物 HuAr08-R 5' AGT. GCA. GGA. TCC. TTA. CTT. AGG. TGG. GTT. AAG. GTA. GTC 3' (SEQ ID NO 18)。PCR 產(chǎn)物用 NdeI 和BamHI切割并亞克隆到pET3a表達質(zhì)粒載體(Strategene)中。pET3a大腸桿菌表達質(zhì)粒載體含有T7啟動子。所述T7啟動子定位于基因10前導序列片段的的上游。通過對人類精氨酸酶I的整個編碼區(qū)進行DNA測序來證實序列的正確性(圖la)。該質(zhì)粒表示為pET3a/HAI。m^^fflfflfMMilSlga (BCA)的克降熱溶芽孢桿菌精氨酸酶的基因序列如圖Ic所示(SEQ ID No 3)。使用NdeI和 BamHI限制酶從質(zhì)粒pUC57/BCA上切下帶有6XHis標簽的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶的基因 (BCA)。將插入片段亞克隆到pET3a表達質(zhì)粒載體(Strategene)中。通過對熱溶芽孢桿菌精氨酸酶的整個編碼區(qū)進行測序來證實序列的正確性(圖 Ic)。該質(zhì)粒表示為pET3a/BCA。HAI的誘變使用質(zhì)粒pET3a/HAI作為模板，根據(jù)QuikChange 定向位點誘變試劑盒 (Strategene)進行定向位點誘變。使用如下誘變引物(分別為SEQ ID No 19、20、21和22) 將Cys168和Cys3tl3殘基的密碼子分別突變?yōu)镾er168和Ser3tl3的密碼子Cys168密碼子突變?yōu)镾er168密碼子弓丨物 HuArO I-F 5 ‘ GGG. TGA. CTC. CCT. CTA. TAT. CTG. CCA. AGG 3 ‘
引物 HuAr02-R 5 ‘ CCT. TGG. CAG. ATA. TAG. AGG. GAG. TCA. CCC 3 ‘Cys3tl3密碼子突變?yōu)镾er3tl3密碼子弓丨物 HuAr03-F 5 ‘ GCA. ATA. ACC. TTG. GCT. TCT. TTC. GGA. CTT. GC 3 ‘弓丨物 HuAr04-R 5 ‘ GCA. AGT. CCG. AAA. GAA. GCC. AAG. GTT. ATT. GC 3 ‘。首先將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌Top 10細胞。通過DNA測序證實突變質(zhì)粒的序列。為定向位點聚乙二醇化設(shè)計的HAI突變體的基因序列如圖Ib所示(SEQ ID No 2)。然后將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21-DE3細胞中進行蛋白表達。野生型HAI的氨基酸序列如圖2a所示(SEQ ID No :5)。C168S/C303S突變體的氨基酸序列如圖2b (SEQ ID No 6)、圖3a(SEQ ID No :10)、圖北(SEQ ID No :12)所示。如圖2b所示，人類精氨酸酶I中的兩個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基代替。這兩個絲氨酸殘基標有下劃線。僅呈現(xiàn)的Cys是 Cys45。該突變體稱為C168S/C303S，其只含有一個單獨的Cys殘基(也標有下劃線)。野生型HAI的晶體結(jié)構(gòu)如圖如所示。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，進行用于構(gòu)建C168S/C303S突變體的推理蛋白質(zhì)藥物設(shè)計(rational protein drug design)。在圖2d中顯示，熱溶芽孢桿菌精氨酸酶中的一個絲氨酸殘基被半胱氨酸殘基代替。該半胱氨酸殘基標有下劃線。6XHis標簽區(qū)域也標有下劃線并且定位在C末端。該突變體稱為S161C。帶有6XHiSU^mmmmmmmmnmt使帶有含突變精氨酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌BL21-DE3在37°C在LB培養(yǎng)基中生長過夜，所述突變精氨酸酶基因編碼帶有6XHis標簽的人類精氨酸酶I，所述LB培養(yǎng)基含有80 μ g/mL氨芐青霉素。將接種物按1 25稀釋并使其在搖瓶中生長到OD6tltl為約0. 8， 或者按1 10稀釋并使其在發(fā)酵罐中生長到0D_為約15。然后用0. 4mM IPTG對細胞進行4小時的誘導。細菌細胞通過離心收集、重懸在50mM Tris,0. IM NaClUOmM MnCl2(pH 7.4)中，并通過高壓勻漿進行破碎。通過經(jīng)緩沖液A(0. 02M磷酸鈉，0. 5M NaCl, pH 7. 4)平衡的螯合型FF sepharose (GE Healthcare)柱(5. OcmX9cm ；床體積為 176mL)純化帶有 6XHis 標簽的人類精氨酸酶I。帶有6XHis標簽的精氨酸酶用0. 15至0.25M梯度的咪唑進行洗脫(圖6a 和圖6b)。流速為20mL/min (毫升/分鐘)。收集含有經(jīng)純化的精氨酸酶的組分(圖7a和圖7b)。經(jīng)純化的精氨酸酶的產(chǎn)率為約^Omg/L細胞培養(yǎng)物。重復帶有6XHis標簽的人類精氨酸酶I的上述提取程序以獲得經(jīng)純化的帶有 6XHis標簽的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶。帶有6XHis標簽的精氨酸酶的定向位點聚乙二醇化圖5顯示了用于將帶有6 XHis標簽的人類精氨酸酶I突變體與單鏈mPEG-馬來酰亞胺(20kDa)偶聯(lián)(稱為HAI-PEG20)的Cys45_特異性單聚乙二醇化的程序。馬來酰亞胺的雙鍵經(jīng)歷了與巰基的烷基化反應而形成穩(wěn)定的硫醚鍵。圖恥顯示了用于將帶有6XHis 標簽的熱溶芽孢桿菌精氨酸酶突變體與單鏈mPEG-馬來酰亞胺(20kDa)(稱為BCA-PEG20) 的Cys161-特異性單聚乙二醇化的偶聯(lián)程序。使用帶有IOK(截留值)膜(Millipore)的 Millipore Tangential Flow Filtration 系統(tǒng)(500mL)，將 1 克帶有 6XHis 標簽的精氨酸酶在0.02M磷酸鈉、0. 5M NaCl, pH 7. 4中進行滲濾。精氨酸酶的濃度最終稀釋到約^iig/ mL。將10摩爾的摩爾超量的還原劑Tris (2-羧乙基)膦(TCEP)添加到1摩爾的精氨酸酶中進行還原，并在室溫下溫和攪拌4小時。按20摩爾的摩爾超量的mPEG-馬來酰亞胺或 mPEG-MAL(20kDa) (Sunbright)比1摩爾的精氨酸酶將mPEG-馬來酰亞胺添加到經(jīng)還原的精氨酸酶中并在4°C攪拌過夜。通過SDS-PAGE監(jiān)測定向位點聚乙二醇化的進程(圖8a和8b)。在上述條件下， 人類精氨酸酶I上的位置45處的半胱氨酸的自由巰基通過穩(wěn)定的硫醚鍵特異性地連接到mPEG-MAL(20kDa)的經(jīng)激活的馬來酰亞胺基團上。最終偶聯(lián)產(chǎn)物包含優(yōu)勢量的Cys45聚乙二醇化人類精氨酸酶I、未偶聯(lián)的人類精氨酸酶I和m PEG-MAL(20kDa)。對于熱溶芽孢桿菌精氨酸酶，類似地，位置161處的半胱氨酸殘基通過穩(wěn)定的硫醚鍵特異性地連接到mPEG-MAL (20kDa)的經(jīng)激活的馬來酰亞胺基團上。mPEG-MAL (20kDa)聚乙二醇化精氨酸酶就更長的半衰期而言相對于 mPEG-MAL(5kDa)聚乙二醇化精氨酸酶是有利的，并且就更好的溶解性而言相對于 mPEG-MAL (40kDa)聚乙二醇化精氨酸酶是有利的。在2升發(fā)酵罐中的分批發(fā)酵將含有精氨酸酶基因的大腸桿菌BL21-DE3株保存在_80°C。為了制備用于分批發(fā)酵和補料-分批發(fā)酵的種子接種物，將100 μ 1上述菌株的冷凍儲存液轉(zhuǎn)移到裝有SOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中。將細菌培養(yǎng)物在37°C和pH 7. 0于以250rpm旋轉(zhuǎn)的定軌搖床中培養(yǎng)。當在約8至10小時0D600nm達到5. 5至6.0時，終止培養(yǎng)。將12mL(l%)種子接種物導入到裝有1200mL經(jīng)高壓滅菌的滋養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的2L發(fā)酵罐中。在37°C的溫度進行分批發(fā)酵。通過添加氫氧化鈉和鹽酸將PH保持在7.0。通過以1至4L/分鐘導入空氣并將發(fā)酵罐的攪拌速度調(diào)節(jié)為300至1200rpm，將溶解氧水平控制為高于30%空氣飽和度。當 0D600nm在5小時為約11. 0時，將異丙基- β -D-硫代半乳糖-P(IPTG) (IOOmM)(熱溶芽孢桿菌精氨酸酶(BCA)的蛋白表達的誘導劑)導入發(fā)酵液至0.5mM的終濃度。導入IPTG后， 繼續(xù)發(fā)酵到9小時(當OD 600nm為約16. 4時)。IPTG導入后4小時，收獲發(fā)酵細胞用于 BCA的分離和純化。前述菌株以約105mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基的量生成活性BCA。發(fā)酵的時間過程作圖于圖6al中。顯示諸如溫度、攪拌速率、pH、溶解氧值等參數(shù)的變化的該分批發(fā)酵的時間關(guān)系曲線圖在圖6bl中示出。在2升發(fā)酵罐中講行的補料-分批發(fā)酵使用高細胞密度培養(yǎng)物在37°C、pH 7. 0進行補料-分批發(fā)酵，并在整個發(fā)酵過程中將溶解氧保持在高于30%空氣飽和度。用于制備種子接種物的程序與上述分批發(fā)酵的類似。發(fā)酵最初通過將5mL(l% )種子接種物導入裝有500mL經(jīng)高壓滅菌的滋養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的2L發(fā)酵罐中而采用分批培養(yǎng)策略開始。溶解氧在分批培養(yǎng)周期中的生長期逐漸降低到約30%空氣飽和度。一旦溶解氧水平增加到高于80% (表示碳源消耗)，則添加補充性滋養(yǎng)培養(yǎng)基開始P02 stat補料-分批策略。在該策略中，補料速度調(diào)整為將溶解氧水平保持低于60%，這在發(fā)酵過程中提供了最小但是足夠量的碳源。當在18小時0D600nm為約100 時，將異丙基-β-D-硫代半乳糖-P(IPTG) (IOOmM)向發(fā)酵液中導入至0. 5mM的終濃度。導入IPTG后，繼續(xù)發(fā)酵到28小時(當OD 600nm為約186. 8時)。IPTG導入后10小時，收獲發(fā)酵細胞用于BCA的分離和純化。前述菌株以約1489. 6mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基的量生成活性 BCA。這高于所有其他所報道的不同類型精氨酸酶的產(chǎn)率。發(fā)酵的時間過程作圖于圖6a2 中。顯示諸如溫度、攪拌速率、PH、溶解氧值等參數(shù)的變化的該分批發(fā)酵的時間關(guān)系曲線圖在圖6b2中示出。分批發(fā)酵和補料-分批發(fā)酵的比較下表1比較了分批發(fā)酵和補料-分批發(fā)酵的結(jié)果。該比較證明，就培養(yǎng)物0D600、 細胞干重和每升培養(yǎng)物的BCA產(chǎn)率而言，補料-分批發(fā)酵遠遠優(yōu)于分批發(fā)酵。表 權(quán)利要求
1.一種包含PEG部分的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，所述PEG部分在預定位置共價結(jié)合到精氨酸酶上，并且所述PEG =精氨酸酶偶聯(lián)物就分子量而言是均一的。
2.如權(quán)利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，其中所述PEG部分與所述精氨酸酶的比例基本為1。
3.如權(quán)利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，其中所述PEG部分具有10，000至 30, 000的分子量。
4.如權(quán)利要求3所述的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，其中所述PEG部分具有約20，000的分子量。
5.如權(quán)利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，其中所述預定位置是所述精氨酸酶的 Cys45并且所述精氨酸酶為人類精氨酸酶I。
6.如權(quán)利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，其中所述預定位置是所述精氨酸酶的 Cys161并且所述精氨酸酶為熱溶芽孢桿菌(Bacillus caldovelox)精氨酸酶。
7.如權(quán)利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，其中所述PEG部分是聚乙二醇。
8.如權(quán)利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，其中所述PEG部分具有單鏈。
9.如權(quán)利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物，其中所述PEG部分具有支鏈。
10.一種制備PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物的方法，所述方法包括如下步驟(a)指定精氨酸酶上的至少一個結(jié)合位置，其中在所述位置處的氨基酸殘基用于與 PEG部分形成共價鍵；(b)修飾編碼所述精氨酸酶的基因，其中如果在所述結(jié)合位置處的氨基酸殘基的密碼子是半胱氨酸密碼子，則將所述密碼子改變?yōu)榫幋a半胱氨酸的密碼子，并且如果所述基因具有編碼不在所述結(jié)合位置、從所述精氨酸酶暴露并且能夠與PEG部分形成共價鍵的半胱氨酸殘基的第二密碼子，則將所述密碼子改變?yōu)榫幋a不是半胱氨酸的氨基酸的密碼子；(c)在宿主中表達所述基因以生成所述精氨酸酶；和(d)通過所述精氨酸酶的所述結(jié)合位置處的所述氨基酸和PEG部分之間的共價鍵將所述精氨酸酶蛋白與所述PEG部分偶聯(lián)以獲得分子量上均一的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中在步驟(c)中生成的所述精氨酸酶含有單個半胱氨酸殘基。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在步驟(c)使用的所述宿主選自由細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞和昆蟲細胞、酵母細胞和轉(zhuǎn)基因動物組成的組。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述基因編碼人類精氨酸酶I，并且在步驟(c)中生成的所述精氨酸酶的所述結(jié)合位置處的所述氨基酸殘基為Cys45。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述基因編碼熱溶芽孢桿菌精氨酸酶，并且在步驟(c)中生成的所述精氨酸酶的所述結(jié)合位置處的所述氨基酸殘基為Cys161。
15.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述共價鍵是在來自在所述結(jié)合位置處的所述氨基酸的硫醇基和來自所述PEG部分的馬來酰亞胺基之間形成的硫醚鍵。
16.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述PEG部分具有約20，000的分子量，并且具有直鏈或支鏈。
17.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含分子量上均一的PEG-精氨酸酶偶聯(lián)物和藥學可接受的載體、賦形劑或輔助試劑。
18.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述PEG-精氨酸酶在人類精氨酸酶I和 PEG部分之間形成，所述人類精氨酸酶I具有在位置45處用于與所述PEG部分共價結(jié)合的唯一的半胱氨酸殘基。
19.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述PEG-精氨酸酶在熱溶芽孢桿菌精氨酸酶和PEG部分之間形成，所述熱溶芽孢桿菌精氨酸酶具有在位置161處用于與所述PEG部分共價結(jié)合的唯一的半胱氨酸殘基。
20.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療精氨酸酶依賴型疾病。
21.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述精氨酸酶依賴型疾病是基本不表達 OTC的具有ADI敏感性的或具有ADI抗性的癌癥。
22.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述精氨酸酶依賴型疾病是被選自由HIV、 C型肝炎病毒和B型肝炎病毒組成的組的病毒引起的感染。
全文摘要
單聚乙二醇化精氨酸酶偶聯(lián)物及其制備方法。所述單聚乙二醇化精氨酸酶在分子量上是均一的，并且顯示出用于治療癌癥和病毒感染的治療效果。制備所述精氨酸酶偶聯(lián)物的方法包括遺傳修飾編碼精氨酸酶的基因使得PEG部分能夠在預定的特異性目標位點結(jié)合到該酶上的主要步驟。這通過除去位于該酶的不期望的位點的PEG結(jié)合氨基酸殘基同時在該酶的期望的位點保留(或增加，如果需要的話)PEG結(jié)合氨基酸殘基來實現(xiàn)。如此制備的兩種示例性的單聚乙二醇化精氨酸酶偶聯(lián)物是人類精氨酸酶I(HAI)和熱溶芽孢桿菌精氨酸酶(BCA)，在所述人類精氨酸酶I中，聚乙二醇(PEG)部分位點特異性地共價結(jié)合到該酶的Cys45；在所述熱溶芽孢桿菌精氨酸酶中，聚乙二醇(PEG)部分位點特異性地共價結(jié)合到該酶的Cys161。
文檔編號A61P35/00GK102481345SQ201080023256
公開日2012年5月30日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者勞偉雄, 梁潤松 申請人:香港理工大學