專(zhuān)利名稱(chēng):沒(méi)食子提取物在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種沒(méi)食子提取物在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的藥物中的用途。
背景技術(shù):
維吾爾醫(yī)藥是維吾爾民族在長(zhǎng)期生活,生產(chǎn)和同疾病斗爭(zhēng)中積累起來(lái)的經(jīng)驗(yàn)和智 慧的結(jié)晶,是祖國(guó)醫(yī)藥的一個(gè)重要組成部分,無(wú)論在基礎(chǔ)理論方面,還是在醫(yī)療方法和用藥 規(guī)則方面都獨(dú)樹(shù)一幟,并已形成比較完備,獨(dú)特的理論體系。沒(méi)食子自古以來(lái)在維吾爾醫(yī)學(xué) 中被視為治療各種急、慢性炎癥性疾病的良藥,具有消炎、止血、固澀、收斂的功效,用于治 療牙周炎、瀉痢不止、習(xí)慣性腸炎等。沒(méi)食子的主要成分是鞣質(zhì),鞣質(zhì)又稱(chēng)單寧(tannin),是 存在于自然界的一類(lèi)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多元酚類(lèi)化合物,具有收斂、抗炎、抗過(guò)敏、抑菌、抗病 毒、抗腫瘤、止血、鎮(zhèn)痛、降血脂、降血糖、增強(qiáng)腎功能等作用。由于鞣質(zhì)具有較多的鄰位酚羥 基,易被氧化,因此,很難獲得單體,國(guó)內(nèi)外也對(duì)鞣質(zhì)化學(xué)成分的研究很少。潰瘍性結(jié)腸炎是一種原因未明與自身免疫有關(guān)的炎癥性腸病,以腹瀉、粘膜膿血 癥、腹痛及里急后重為主要癥狀,以結(jié)腸粘膜慢性炎癥和潰瘍形成為病理特點(diǎn)的消化道常 見(jiàn)病和疑難病。研究發(fā)現(xiàn),潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸癌發(fā)生之間存在聯(lián)系,認(rèn)為有部分潰瘍性結(jié) 腸炎病例最終可發(fā)展為結(jié)腸癌。結(jié)腸炎的癌變主要決定于結(jié)腸炎的發(fā)生程度、發(fā)生部位及 病程長(zhǎng)短。雖然臨床采用非留體抗炎藥物治療可以降低結(jié)腸炎的癌變率,但長(zhǎng)期服用,藥物 的副作用使病人難以耐受,并且非留體抗炎藥物同時(shí)增加了消化道潰瘍和出血的概率,在 腸道反復(fù)出血和末端回腸炎反復(fù)發(fā)作的患者中,該類(lèi)藥物的使用是相對(duì)禁忌的。因此,尋 找新的治療藥物,有效控制結(jié)腸炎的發(fā)展,并阻止結(jié)腸炎的癌變,一直是研究者們關(guān)注的熱 點(diǎn)ο研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的異常增殖及分化受到抑制是腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制。對(duì)細(xì)胞凋亡 的研究發(fā)現(xiàn),正常組織的相對(duì)穩(wěn)定實(shí)際上是細(xì)胞增殖、分化和凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡。腫瘤細(xì) 胞的增殖、凋亡不僅受到藥物、放射線(xiàn)等多種因素和途徑的影響,而且某些腫瘤基因或腫瘤 抑制基因?qū)?xì)胞凋亡也起重要的調(diào)控作用。本發(fā)明是根據(jù)已獲得的“防治口腔病的口潔液及制備方法”(專(zhuān)利號(hào)為ZL 97116074. 0)的基礎(chǔ)上,研制開(kāi)發(fā)沒(méi)食子(西帕依)固齦液,并被列入為《中華人民共和國(guó) 衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)_維吾爾藥分冊(cè)》1999年版收載品種(編號(hào)02CJ-15-02-13)。將沒(méi)食子 (西帕依)固齦液通過(guò)改變其給藥途徑增加新的適應(yīng)癥,以灌腸的方式使用于潰瘍性結(jié)腸 癌的治療得到了良好的臨床療效。研究表明,藥品沒(méi)食子(西帕依)固齦液的主要成分為沒(méi)食子提取物,對(duì)慢性潰瘍 性結(jié)腸炎的腹痛、腹瀉和膿血癥等療效顯著;對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎 雙球菌等口腔疾病的常見(jiàn)致病菌有很強(qiáng)的抑制作用;明顯抑制角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹 及大鼠腹腔白細(xì)胞游出;抑制醋酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性增加;抑制棉球肉芽腫;抑制 醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)及酵母所致大鼠體溫升高;延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間;抑制DNCB誘導(dǎo)的小 鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng);能使小鼠凝血時(shí)間明顯縮短,證明其對(duì)急、慢性炎癥反應(yīng)均有顯著抑制作用,并能有效抑制炎癥階段毛細(xì)血管的通透性,減輕滲出反應(yīng),同時(shí)有較強(qiáng)的解熱鎮(zhèn)痛及 抗疲勞功能。本發(fā)明針對(duì)藥品名為沒(méi)食子固齦液在治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床有效性及潰瘍性 結(jié)腸炎和結(jié)腸癌發(fā)生之間的內(nèi)在聯(lián)系,對(duì)藥品沒(méi)食子固齦液中的主要成分沒(méi)食子提取物 抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖及誘導(dǎo)其調(diào)亡的應(yīng)用加以闡述,增加了該制劑的臨床使用范 圍,為結(jié)腸癌的防治提供了新的天然藥物。在國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子固齦液應(yīng)用于人體抑 制HT-29增殖及誘導(dǎo)其調(diào)亡中的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于,提供一種沒(méi)食子提取物在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的藥物 中的用途,本發(fā)明是在“防治口腔病的口潔液及制備方法”(專(zhuān)利號(hào)為ZL 97116074. 0)的基 礎(chǔ)上,對(duì)防治口腔病的口潔液提供了新的用途。本發(fā)明以人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)載體, 采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法,從癌細(xì)胞增殖和凋亡角度闡述”防治口腔病的口潔液“中 的主要成分沒(méi)食子提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的作用特點(diǎn),通過(guò)抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì) 胞凋亡的方式,抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng),這種作用具有濃度-效應(yīng)依賴(lài)性關(guān)系。從分子生物 學(xué)水平上揭示了沒(méi)食子提取物的抗結(jié)腸癌作用部位即新靶點(diǎn),為結(jié)腸癌的防治提供新的天 然藥物。本發(fā)明所述的一種沒(méi)食子提取物在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的藥物中的用途, 是在濃度為5X IO4個(gè)/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞懸液中加入沒(méi)食子提取物, 使其最終濃度達(dá)到0. 01ug/ul、0. 025ug/ul、0. 05ug/ul、0. lug/ul、0. 25ug/ul、0. 5ug/ul、 1. 0ug/ul、2. 5ug/ul 或 5ug/ul,在 5 % CO2,溫度 37°C,共同培育 3,6,12,24,48,72 小時(shí),采 用MTT比色法測(cè)定沒(méi)食子提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用,結(jié)果證明,沒(méi)食子 提取物能夠以時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性的方式抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖。所述的一種沒(méi)食子提取物在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的藥物中的用途,是在濃 度為5 X IO4個(gè)/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞懸液中加入沒(méi)食子提取物,使其最終 濃度達(dá)到0. lug/ul、0. 25ug/ul、0. 5ug/ul、l. Oug/ul 或 2. 5ug/ul,在 5% CO2,溫度 37°C,共 同培育48,72小時(shí),采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定沒(méi)食子提取物對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作 用,結(jié)果證明,沒(méi)食子提取物能夠以濃度依賴(lài)性方式誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡。本發(fā)明所述的沒(méi)食子提取物,是將沒(méi)食子藥材20g,粉碎,加水200ml,浸泡1小時(shí) 后,煎煮0. 5小時(shí),共煎煮3次,合并煎液,采用板框法過(guò)濾,濾液中依次加入2g甜蜜素、Iml 薄荷香精及0. 5g苯甲酸鈉,攪拌使溶解均勻,加水使藥液體積調(diào)整至1000ml,分裝、滅菌, 即可。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的沒(méi)食子提取物在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的藥物中的用途的技 術(shù)方案是通過(guò)以下途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)1.實(shí)驗(yàn)材料1. 1藥物與試劑防治口腔病的口潔液新疆奇康哈博維藥有限公司
DMEM人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞胎牛血清無(wú)水乙醇MTT胰蛋白酶1. 2主要儀器超凈工作臺(tái)CO2 孵箱電子天平-20°C、4°C 低溫冰箱流式細(xì)胞儀細(xì)胞計(jì)數(shù)板臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)倒置相差顯微鏡2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,溫度37°C,5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每2-3天更換培養(yǎng)液一次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用 于實(shí)驗(yàn)。2. 2MTT法檢測(cè)沒(méi)食子提取物抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的作用(1)收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5X IO4個(gè)/ml,每孔加入100 μ 1,鋪板;(2) 5% CO2,溫度37°C孵育,至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底(96孔平底板),加入沒(méi)食子提取 物,藥物最終濃度達(dá)到0. 01ug/ul、0. 025ug/ul、0. 05ug/ul、0. lug/ul、0. 25ug/ul、0. 5ug/ ul、1. 0ug/ul、2. 5ug/ul或5ug/ul,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組;(3)5 % CO2,溫度 37 °C 孵育,繼續(xù)培養(yǎng) 3h、6h、12h、24h、48h 和 72h,每孔加入 20ulMTT 溶液(5mg/ml,即 0. 5% MTT),再繼續(xù)培養(yǎng) 4h ;(4)終止培養(yǎng),小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液;(5)每孔加入150 μ 1 二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩lOmin,使結(jié)晶物充分溶解, 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀0D490nm處測(cè)量各孔的吸光度值(A值),同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、 二甲基亞砜),對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜);(6)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次; (7)抑制率的計(jì)算抑制率=[(對(duì)照組A值-空白組A值)_(實(shí)驗(yàn)組A值-空白 組A值)]/(對(duì)照組A值-空白組A值)X100%。結(jié)果見(jiàn)表1表1沒(méi)食子提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用(7 ± ,η = 12)
美國(guó)Gibeo公司產(chǎn)品 上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所 杭州四季青生物工程材料研究所 北京化工廠(chǎng)
美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品 美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品
THEMOR THEMOR 沈陽(yáng)龍騰 西門(mén)子
美國(guó)BECKMAN公司產(chǎn)品。 上海求精公司產(chǎn)品。 Beckman Coulter ,美國(guó) 日本OLMPUS
權(quán)利要求
1.一種沒(méi)食子提取物在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的藥物中的用途,其特征在于在 濃度為5 X IO4個(gè)/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞懸液中加入沒(méi)食子提取物,使其最 終濃度達(dá)到0. 01ug/ul、0. 025ug/ul、0. 05ug/ul、0. lug/ul、0. 25ug/ul、0. 5ug/ul、l. Oug/ ul、2. 5ug/ul 或 5ug/ul,在 5% CO2,溫度 37°C,共同培育 3,6,12,24,48,72 小時(shí),采用 MTT 比色法測(cè)定沒(méi)食子提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用。
2.一種沒(méi)食子提取物在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的藥物中的用途,其特征在于在 濃度為5 X IO4個(gè)/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞懸液中加入沒(méi)食子提取物,使其最 終濃度達(dá)到0. lug/ul、0. 25ug/ul、0. 5ug/ul、l. Oug/ul 或 2. 5ug/ul,在 5% CO2,溫度 37°C, 共同培育48,72小時(shí),采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定沒(méi)食子提取物對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo) 作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種沒(méi)食子提取物在制備抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的藥物中的用途,本發(fā)明以人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)載體,采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法,從癌細(xì)胞增殖和凋亡角度闡述沒(méi)食子提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的作用特點(diǎn),通過(guò)抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式,抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng),這種作用具有濃度-效應(yīng)依賴(lài)性關(guān)系。從分子生物學(xué)水平上揭示了沒(méi)食子提取物的抗結(jié)腸癌作用部位即新靶點(diǎn),為結(jié)腸癌的防治提供新的天然藥物。
文檔編號(hào)A61P1/00GK102000117SQ20101056802
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者哈木拉提·吾甫爾, 庫(kù)熱西·玉努斯, 阿不都熱依木·玉蘇甫 申請(qǐng)人:新疆醫(yī)科大學(xué)