專利名稱：具有抗炎活性的乳桿菌分離株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)于兩株具有抗炎活性以及有益的益生性質(zhì)(beneficial probiotic properties)的乳桿菌分離株，也就是沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei)GMNL-76以及羅 伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89，它們分別以保藏編號BCRC 910355與BCRC 910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)，以及以 保藏編號CCTCC M 207153與CCTCC M 2071M被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。 這兩株乳桿菌分離株及其繼代培養(yǎng)后代可被用于制備各式的食品產(chǎn)品，以及用于制備用于 治療和/或緩解與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病(諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的藥物組合物。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性自身免疫疾病，它會造 成關(guān)節(jié)(例如手、足、腕、肘、膝以及踝關(guān)節(jié))的腫脹、變形、疼痛、萎縮以及僵硬。長期的慢 性關(guān)節(jié)炎會逐漸侵蝕掉正常的關(guān)節(jié)骨細(xì)胞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形以致最后喪失功能。此外，類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎也會侵犯關(guān)節(jié)以外的部位，例如腺體(諸如唾液腺、淚腺以及淋巴腺等)、器官(諸 如肝臟、脾臟、心臟以及肺臟等)或系統(tǒng)(諸如循環(huán)系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng))，進(jìn)而造成類風(fēng)濕性 血管炎、胸膜肺征候(pleuropulmonary manifestations)(包括間質(zhì)纖維化、胸膜肺結(jié)節(jié)、 肺炎與動脈炎)以及費(fèi)耳提氏綜合征等。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病年齡主要是落在40至50歲之間，而女性的發(fā)病率是男性 的2至4倍。至今，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的確切致病原因仍是未知，但是，先前的研究顯示遺傳 傾向、環(huán)境誘發(fā)、自身免疫現(xiàn)象、慢性炎癥、細(xì)胞運(yùn)輸以及治療等都可能與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 的免疫發(fā)病機(jī)制有關(guān)聯(lián)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要病灶是滑膜組織。正常關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜細(xì)胞不會超過3層， 但在關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)內(nèi)則會出現(xiàn)明顯的增生。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有可能是肇因于患者的免 疫細(xì)胞不正常地攻擊自身的關(guān)節(jié)軟骨與滑膜組織的II型膠原(collagen type II，CII)。類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者可被檢測出具有對II型膠原具特異性的自身抗體和/或類風(fēng)濕因子。類 風(fēng)濕因子是由IgG的Fc區(qū)域的糖基化缺陷而引發(fā)的自身抗體，其中以IgM最多見，而IgG、 IgA也有發(fā)現(xiàn)。類風(fēng)濕因子在大約80%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中可檢測到，它與原始抗原 結(jié)合之后所形成的免疫復(fù)合物會沉積于滑膜、軟骨或血管中而造成病變。已知細(xì)胞因子涉及到許多重要的生物學(xué)過程，包括炎癥、組織修復(fù)、細(xì)胞生長、纖 維化、血管發(fā)生，以及免疫應(yīng)答。因此，細(xì)胞因子在自身免疫疾病中扮演一個重要的角色。在 M. Feldmann et al. (1996)，Annu. Rev. Immunol.，14 :397-440 此篇回顧性論文 中，M. Feldmann等人借由分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜組織中細(xì)胞因子的表達(dá)與調(diào)控來探討 RA的發(fā)病機(jī)制，其中細(xì)胞因子被區(qū)分為下面四大類別(1)促炎細(xì)胞因子；(2)免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子；C3)趨化性細(xì)胞因子；以及(4)促有絲分裂細(xì)胞因子等。促炎細(xì)胞因子是一群由1型T輔助細(xì)胞(簡稱Thl細(xì)胞)所產(chǎn)生的能夠調(diào)節(jié) 延遲型過敏反應(yīng)的分子，包括白細(xì)胞介素-1 (IL-I)、干擾素-γ (IFN- y )、腫瘤壞死因 子-α (TNF-α)以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等。在風(fēng)濕性疾病中所觀 察到的軟骨破壞已被普遍地認(rèn)為是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的活性所造成，該基質(zhì)金屬蛋白 酶是由對促炎細(xì)胞因子(諸如IL-I或TNF-α )有反應(yīng)并被活化的巨噬細(xì)胞與成纖維細(xì)胞 所產(chǎn)生。M. Feldmarm等人進(jìn)一步提到將IL-I或TNF-α注射至經(jīng)膠原免疫的小鼠或大鼠 體內(nèi)，或?qū)FN-Y局部注射到經(jīng)II型膠原免疫的小鼠的腳掌中，皆會加速關(guān)節(jié)炎的發(fā)生并 增高疾病的嚴(yán)重性(M. Feldmann et al. (1996)，同上述)。免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(也被稱為抗炎細(xì)胞因子)是一群由2型T輔助細(xì)胞(簡稱 Th2細(xì)胞)所產(chǎn)生的能夠抑制炎癥反應(yīng)的分子，包括IL-4、IL-10、IL-13以及轉(zhuǎn)化生長因 子-β (TGF-β)等。在 G.Garcia et al. (1999)，Journal of Autoimmunity, 13 :315-324 中，G.Garcia等人提到TGF_i3與IL-10這兩種免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子不僅會抑制誘發(fā)MMP 的促炎細(xì)胞因子的生成，也會誘發(fā)MMP的天然抑制劑(也就是基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制 劑TIMP)的生成。G. Garcia等人進(jìn)一步提到IL_10被廣為知曉除了會抑制從Th 1細(xì)胞 生成IFN-γ之外，還會抑制從其它的白細(xì)胞群生成各種不同的細(xì)胞因子。IL-10會抑制從 巨噬細(xì)胞生成IL-I、IL-6,TNF-a、IL-8以及G-C SF (粒細(xì)胞集落刺激因子)，并且會抑制 從多形核細(xì)胞生成IL-1、TNF、IL-8、巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)1 a (MIP1 a )以及巨噬細(xì)胞炎性 蛋白質(zhì)1 β (ΜΙΡ1 β )，而這些細(xì)胞因子與趨化因子之中的大多數(shù)涉及到關(guān)節(jié)炎的病理過程 (G. Garcia et al. (1999)，同上述)。這些研究結(jié)果顯示與Thl細(xì)胞有關(guān)的促炎細(xì)胞因子(諸如TNF- α與IFN- y )會 促進(jìn)炎癥而使得類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病況更為惡化，而與Th2細(xì)胞有關(guān)的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因 子(諸如IL-10與IL-4)除了可以抑制促炎細(xì)胞因子的生成之外，也可通過誘導(dǎo)TIMP的生 成來減少軟骨破壞。目前尚無藥物可有效地治愈類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，因此臨床上所使用的藥物僅能著重 于防止關(guān)節(jié)與其它組織或器官的炎癥與破壞、修復(fù)受損關(guān)節(jié)以減輕疼痛、以及維持關(guān)節(jié)的 功能并防止變形等。治療的模式可區(qū)分為藥物治療、手術(shù)治療、康復(fù)治療、運(yùn)動治療以及飲 食控制等。藥物治療主要是針對炎癥的癥狀進(jìn)行治療，而現(xiàn)今常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 的藥物可被歸納為下面五大類(謝調(diào)揚(yáng)與陳培瑛0001)，“類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療”，藥學(xué) 雜志，17 (4) :109-116)1.生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRM)例如依那西普(商品名稱為Enbrel )與英利西單 抗(商品名稱為Remicade )，它們是抗-TNF藥劑，可借由特異性地結(jié)合至TNF-α來抑制 TNF-α的生物活性，進(jìn)而減輕TNF-α所造成的炎癥現(xiàn)象；2.非甾體抗炎藥(NSAID)例如阿司匹林與布洛芬，此類藥物具有消炎與止痛的 功效，因此可供用于緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者長期或短期的疼痛與炎癥；3.疾病改善型抗風(fēng)濕藥(DMARD)例如來氟米特(商品名稱為Arava )、氨甲碟 呤、青霉胺、羥氯喹以及金化合物等，它們適用于對NSAID沒有反應(yīng)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患 者。DMARD借由調(diào)節(jié)會引起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的異常免疫反應(yīng)來延緩疾病過程，而使用此類藥 物來進(jìn)行治療時必須有醫(yī)師的監(jiān)督以避免副作用的發(fā)生；
4.皮質(zhì)類固醇此類藥物對于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎十分有效，但是會產(chǎn)生許多副 作用。皮質(zhì)類固醇通常是以口服或注射的劑型進(jìn)行施用，但是經(jīng)常注射皮質(zhì)類固醇會傷害 軟骨，因此注射次數(shù)以每年1至2次為限。目前，口服潑尼松是醫(yī)師最常開立的處方箋；以 及5.其它例如透明質(zhì)酸(諸如透明質(zhì)酸鈉(商品名稱為Hyalgan ))及其衍生物 (諸如Hylan G-F 20 (商品名稱為Synvisc ))。透明質(zhì)酸是關(guān)節(jié)軟骨與滑液的主要成份， 因此借由透明質(zhì)酸的關(guān)節(jié)內(nèi)注射可以達(dá)到刺激軟骨細(xì)胞增生、保護(hù)與潤滑關(guān)節(jié)，以及減輕 炎癥的效用。有關(guān)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的選用，一般初期會以效力較弱、安全性較 高的NSAID作為第一線用藥，若治療效果不顯著，再以效力較強(qiáng)的DMARD作為第二線用藥。 當(dāng)這兩類藥物均無法達(dá)到所期望的療效時，則會考慮使用皮質(zhì)類固醇或施行手術(shù)。雖然藥 物具有減輕疼痛、僵硬感及炎癥的功效，但長期服用可能會產(chǎn)生失眠、耳鳴、水腫、胃潰瘍、 胃出血、胃穿孔(gastrobrosia)、皮膚敏感性、蛋白尿、糖尿病、高血壓、骨質(zhì)疏松癥、白內(nèi) 障、抵抗感染能力降低等副作用，同時在治療的過程中需要定期地作血液生化、血清檢查， 以確保治療成效以及避免上述副作用的發(fā)生。迄今，尚未有一種可以有效地治療或緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并且不會產(chǎn)生非所需的 副作用的藥物。聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織(FAO)以及世界衛(wèi)生組織(WHO)將益生菌定義為活的 微生物，當(dāng)它呈適當(dāng)數(shù)量進(jìn)行施用時，可賦予宿主一健康益處(Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food,Joint FA0/WH0 Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, April 30 and May 1,2002)。 目前可作為益生菌使用的微生物有許多種類，例如乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、酵母、鏈球菌屬 (Streptococcus)等等，特別是前兩個菌屬的菌種。Eli Metchnikoff在1908年提出存在于胃腸道(GI tract)內(nèi)的有害腐敗菌 會被產(chǎn)酸的乳桿菌所抑制或拮抗(Eli Metchnikoff, 1908, The Prolongation Of Life, Ed. P. Chalmers Mitchell, G. P.Putnam' s Sons, The Knickerbocker Press, New York & London)。之后，有許多的研究以及臨床試驗也陸續(xù)證實乳桿菌與健康之間存在有重要的相關(guān)性。乳桿菌是一群革蘭氏陽性的兼性厭氧菌，它們普遍存在于人類的胃腸道與陰道 內(nèi)，它們能夠發(fā)酵糖類并以乳酸為主要代謝產(chǎn)物。乳桿菌已被發(fā)現(xiàn)的功效包括(1)增進(jìn)腸 道菌群的菌相平衡；(2)預(yù)防腹瀉；(3)降低結(jié)腸癌的危險性；(4)刺激胃腸上皮粘膜系統(tǒng) 的正常發(fā)育與功能；(5)產(chǎn)生各種維生素與營養(yǎng)素；以及(6)預(yù)防與治療陰道病。基于乳桿菌的有益益生性質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)具有所期望的生 物活性的乳桿菌分離株。在此方面，可以參見，例如TW 588109揭示鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)T cell-1 及其用途。Tff 1241912 揭示 6 株具有降低與同 化膽固醇能力的新的耐酸與耐膽鹽乳桿菌分離株，它們是加氏乳桿菌(LactcAacillus gasseri)B21Tl、B21T6、C21Tl、X21B7 與 B38T38 以及嗜酸乳桿菌(L. acidophilus)B6T7。Tff 1283268公開了鼠李糖乳桿菌GM-020及其治療肥胖的用途。Tff 1284149揭示副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-32及其治療過敏相關(guān)疾病的用途。另外，TW200611973 揭示發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum) GM-090能有效刺激IFN-γ的分泌和/或治 療過敏。此外，Jae-Seon So等人報導(dǎo)干酪乳桿菌(LactcAacillus casei)的口服施用 會抑制膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎(CIA)以及降低腳掌腫脹、淋巴細(xì)胞浸潤和軟骨組織的破壞。干 酪乳桿菌通過⑶4+T細(xì)胞降低II型膠原-反應(yīng)性促炎分子(IL-1 β、IL-2、IL_6、IL-12、 IL-17、IFN-Y、TNF-a以及Cox-2)。施用干酪乳桿菌也降低NF-κ B向細(xì)胞核內(nèi)的移位以 及CII-反應(yīng)性Thl-型IgG同種型IgGh和IgG^，同時上調(diào)免疫性IL-IO水平(Jaeleon So et al. (2008)，Mol.Immunol.，45(9) :2690-2699 ；Epub 2008 Feb 19)。如果類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可以通過服用乳桿菌分離株來達(dá)到治療效果，應(yīng)可為患者提 供一用藥安全而且價格不貴的藥品。為達(dá)到這個目的，申請人從本土的成人胃腸道標(biāo)本中篩選出兩株乳桿菌分離株， 它們在種系上(phylogenetically)是不同于各自所屬菌種中已公開的菌株，而且具有能 夠刺激產(chǎn)生大量的IL-IO以及較少量的IFN- Y和/或TNF- α的抗炎活性，因而被預(yù)期可 用于治療與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病，包括但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

發(fā)明內(nèi)容
于是，在第一個方面，本發(fā)明提供一種具有抗炎活性的乳桿菌屬菌種 (Lactobacillus sp.)的分離株，其中該分離株是(i) 一選自于下列的保藏菌株(a)沙克乳桿菌GMNL-76，其以保藏編號BCRC 910355被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究 所的生物資源保存及研究中心，以及以保藏編號CCTCC M 207153被保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心；以及(b)羅伊氏乳桿菌GMNL-89，其以保藏編號BCRC 910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研 究所的生物資源保存及研究中心，以及以保藏編號C CTCC M 2071M被保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心；或(ii)在(i)項中的所述保藏菌株的繼代培養(yǎng)后代。在第二個方面，本發(fā)明提供一種食品產(chǎn)品，其包含有一如上所述的乳桿菌屬菌種 的分離株以及一可食性材料。在第三個方面，本發(fā)明提供一種可用于治療和/或緩解與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的藥 物組合物，其包含有一如上所述的乳桿菌屬菌種的分離株。在第四個方面，本發(fā)明提供一種用于治療個體的與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的方法，其 包括對需要該治療的個體施用一如上所述的乳桿菌屬菌種的分離株。


下面結(jié)合附圖及實施例來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，所以本發(fā)明在上述以及其它目 的與特征，可借由參照下文的描述、所附的權(quán)利要求書和附圖而變得更為明顯，附圖中圖1顯示患有膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠在經(jīng)連續(xù)喂食本發(fā)明的乳桿菌分離株 GMNL-76以及GMNL-89歷時8周之后被收集血清并進(jìn)行IL-10的ELISA試驗的結(jié)果，其中不患有關(guān)節(jié)炎并被喂食以逆滲透水的大鼠以及患有關(guān)節(jié)炎但被喂食以逆滲透水的大鼠是分 別作為對照組以及安慰劑組；圖2顯示患有膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠在經(jīng)連續(xù)喂食本發(fā)明的乳桿菌分離株 GMNL-76以及GMNL-89歷時8周之后被收集血清并進(jìn)行IFN- γ的ELISA試驗的結(jié)果，其中 不患有關(guān)節(jié)炎并被喂食以逆滲透水的大鼠以及患有關(guān)節(jié)炎但被喂食以逆滲透水的大鼠分 別是作為對照組以及安慰劑組；圖3顯示患有膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠在經(jīng)連續(xù)喂食本發(fā)明的乳桿菌分離株 GMNL-76以及GMNL-89歷時8周之后被收集血清并進(jìn)行TNF- α的ELISA試驗的結(jié)果，其中 不患有關(guān)節(jié)炎并被喂食以逆滲透水的大鼠以及患有關(guān)節(jié)炎但被喂食以逆滲透水的大鼠是 分別作為對照組以及安慰劑組；圖4顯示本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76的16S rDNA核苷酸序列；圖5顯示分別以本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76以及2株以往的沙克乳桿菌BCRC 12933與BCRC 17500的基因組DNA作為模板并使用Lac P2引物進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性 DNA(RAPD)分析，繼而以1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，于紫外光下觀察所得到的照相結(jié) 果，其中在(A)區(qū)中，泳道Ml :DNA梯(100-3000bp)，泳道1 :GMNL_76 ；在(B)區(qū)中，泳道M2 DNA 梯(100-3000bp)，泳道 2 =BCRC 12933 ；以及在(C)區(qū)中，泳道 M3 :DNA 梯(100_3000bp)， 泳道 3 =BCRC 17500 ；圖6顯示本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-89的16S rDNA核苷酸序列；以及圖7顯示分別以本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-89以及5株以往的羅伊氏乳桿菌 BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC 17476 與 BCRC 17478 的基因組 DNA 作為模板 并使用LacP2引物進(jìn)行RAPD分析，繼而以1. 8%瓊脂糖凝膠來進(jìn)行電泳后，于紫外光下觀 察所得到的照相結(jié)果，其中在㈧區(qū)中，泳道Ml :DNA梯(100-3000bp)，泳道1 :GMNL_89 ； 在(B)區(qū)中，泳道 M2 :DNA 梯(100-3000bp)，泳道 2 =BCRC 14625 ；在(C)區(qū)中，泳道 M3 =DNA 梯(100-3000bp)，泳道 3 =BCRC 16090 ；在(D)區(qū)中，泳道 M4 :DNA 梯(100_3000bp)，泳道 4 BCRC 16091 ；在(E)區(qū)中，泳道 M5 :DNA 梯(100_3000bp)，泳道 5 =BCRC 17476 ；以及在(F) 區(qū)中，泳道 M6 :DNA 梯(100-3000bp)，泳道 6 :BCRC 17478。發(fā)明詳細(xì)說明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種全身性的慢性疾病，但目前臨床上所用的藥物并無法有效 地治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，而且長期使用此類藥物還會引起非所需的不利副作用。此外，先前的研究指出與Thl細(xì)胞有關(guān)的促炎細(xì)胞因子(諸如IFN-Y以及 TNF-α)會促進(jìn)炎癥而使得類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病況更為惡化，而與Th2細(xì)胞有關(guān)的免疫調(diào) 節(jié)性細(xì)胞因子(諸如IL-10與IL-4)可以抑制促炎細(xì)胞因子的生成以及可通過誘導(dǎo)TIMP 的生成來減少軟骨破壞。因此，本發(fā)明人推論類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療也許可以借由調(diào)控免 疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子以及促炎細(xì)胞因子的分泌量來達(dá)成。乳酸菌，特別是乳桿菌屬的菌株，是為人所熟悉與廣泛使用的益生性微生物，它們 已被證實具有許多有益于宿主健康的功效，例如增進(jìn)腸道菌群的菌相平衡、預(yù)防腹瀉、降 低結(jié)腸癌的危險性、刺激胃腸上皮粘膜系統(tǒng)的正常發(fā)育與功能、產(chǎn)生各種維生素與營養(yǎng)素 以及預(yù)防與治療陰道病等。因此，申請人嘗試從被視為是益生性微生物的乳酸菌當(dāng)中找出具有有利的抗炎活性的乳桿菌分離株以用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。于是，申請人以來自臺灣健康成人的胃腸道標(biāo)本作為乳桿菌分離株的分離來源， 并將所得到的分離株分別與實驗動物的單核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)以刺激單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因 子，然后使用IL-10以及IFN-Y作為篩選標(biāo)記，而篩選出能夠刺激單核細(xì)胞分泌大量的 IL-10以及較少量的IFN- Y和/或TNF- α的兩株乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89，它 們經(jīng)特征鑒定被分別歸屬于沙克乳桿菌以及羅伊氏乳桿菌。沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89已分別于2007年6月14日以及 2006年11月14日以保藏編號BCRC 910355與BCRC 910340被保藏于臺灣的食品工業(yè)發(fā) 展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保 存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC) (300 新竹市食品路 331號)。這兩個分離株也依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于2007年11月19日分別以保藏編 號CCTCC M 207153與CCTCC M 2071 被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(武漢， 武漢大學(xué)，430072，中華人民共和國)。當(dāng)本發(fā)明的沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89被喂食給患有膠原誘 發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠時，可觀察到大鼠血清中的IL-10升高而IFN-Y與TNF-α降低，這顯示 本發(fā)明的乳桿菌分離株GMNL-76以及GMNL-89能夠使大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀況不再惡化。相比于以往菌株沙克乳桿菌BCRC 1四33與BCRC 17500以及羅伊氏乳桿菌BCRC 14625、BCRC 16090、BCRC 16091、BCRC 17476 與 BCRC 17478，沙克乳桿菌 GMNL-76 與羅伊 氏乳桿菌GMNL-89在活體外刺激單核細(xì)胞分泌IL-10的能力分別地要比它們各自所屬菌種 的以往菌株更佳?；谏鲜龅挠欣锘钚?，本發(fā)明的兩株乳桿菌分離株或它們的繼代培養(yǎng)后代被 預(yù)期具有可用于治療與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的潛力。于是，本發(fā)明提供一種用于治療與炎癥 有關(guān)聯(lián)的疾病的藥物組合物，其包含有(i)至少一種選自于下列的保藏菌株(a)沙克乳桿菌GMNL-76，其以保藏編號BCRC 910355被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究 所的生物資源保存及研究中心，以及以保藏編號CCTCC M 207153被保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心；以及(b)羅伊氏乳桿菌GMNL-89，其以保藏編號BCRC 910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研 究所的生物資源保存及研究中心，以及以保藏編號CCTCC M 2071M被保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心；或(ii)在(i)項中的該保藏菌株的繼代培養(yǎng)后代。本發(fā)明也提供一種用于治療個體的與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的方法，其包括對需要該 治療的個體施用如上所述的乳桿菌屬分離株或其繼代培養(yǎng)后代。依據(jù)本發(fā)明，所述與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病是選自于下列所構(gòu)成的組類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、骨關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、脊椎炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、 潰蕩性結(jié)腸炎以及銀屑病(Eveline Trachsel et al. (2007), Arthritis Research & Therapy,9(1) :R9，Published online 2007 January 29. doi :10. 1186/ar2115 ；Suchita Nadkarni et al. (2007), The Journal of Experimental Medicine, 204 :33-39 ；Richard 0 Williams et al. (2007), Current Opinion in Pharmacology，7 :412-417)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。依據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可利用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所詳知的技術(shù)，將上述的乳 桿菌分離株或其繼代培養(yǎng)后代配制于一藥學(xué)上可接受的載體中，然后制成適用于口服施用 的劑型。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述藥物組合物呈選自于下列一組中的劑型溶 液、懸浮液、乳劑、粉末、片劑、丸劑、糖漿、錠劑、含錠、咀嚼膠、膠囊、膏劑以及類似物。如本文中所用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”意指一種當(dāng)被施用時不會在被施用 個體內(nèi)造成過敏性反應(yīng)或其它非所需的效用的載體。依據(jù)本發(fā)明，所述藥學(xué)上可接受的載 體可包含一或多種選自于下列的試劑溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、粘合劑、賦形劑、穩(wěn)定 劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑以及類似物。此外，本發(fā)明的沙克乳桿菌GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌GMNL-89也被發(fā)現(xiàn)具有耐 膽鹽與耐胃酸特性，因而適用于作為一種胃腸道益生菌。例如，這種分離株或其繼代培養(yǎng)后 代可用作食品添加劑，經(jīng)現(xiàn)有的方法在原料制備時添加，或是不參與發(fā)酵而于發(fā)酵制作過 程之后添加，而與任一種可食性材料被配制成供人類與非人類動物攝食的食品產(chǎn)品。因此，本發(fā)明也提供一種食品產(chǎn)品，其包含有一如上所述的乳桿菌分離株或其或 其繼代培養(yǎng)后代以及一種可食性材料。適用于本發(fā)明的可食性材料包括但不限于液體乳制品，例如乳、濃縮乳；發(fā)酵 乳，例如酸乳酪、酸乳、冷凍酸乳酪、乳酸菌發(fā)酵飲料；奶粉；冰淇淋；奶酪；干酪；豆?jié){；發(fā) 酵豆?jié){；蔬果汁；果汁；運(yùn)動飲料；甜點；果凍；糖果；嬰兒配方奶粉；保健食品；動物飼料； 膳食補(bǔ)充劑等等。此外，依據(jù)本發(fā)明的食品產(chǎn)品可被制備成其中含有可直接食用的凍干或噴霧干燥 菌體粉末的速溶沖泡食品的形式。有關(guān)食品產(chǎn)品的制備，可以參見，例如US 6，872，565B2、 US 7，244，424B2、US 7，270，994B2、US 7，172，777B2 以及 US 6，872，411B1。依據(jù)本發(fā)明的食品產(chǎn)品可進(jìn)一步包含有至少一種益生性微生物。如本文中所用的 “益生性微生物”或“益生菌”等術(shù)語可被相互交換使用，且意指活的微生物的制備物，當(dāng)被 人類或動物攝食之后，所述微生物可以保持并存活在胃腸道之中，而且能夠提供疾病的預(yù) 防與治療。適用于本發(fā)明的益生性微生物包括但不限于乳桿菌屬菌種(LactcAacillus SP·)、雙歧桿菌屬菌種(Bifidobacterium sp·)、鏈球菌屬菌種(Sti^ptococcus sp·)、酵 母，以及它們的組合。優(yōu)選地，所述乳桿菌屬菌種是選自于下列所構(gòu)成的組嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、瑞 士 乳桿 菌(Lactobacillus helveticus)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳桿 菌(Lactobacillus casei)、植物乳桿菌(Lactobacillus ρIantarum)、唾液乳桿菌 (Lactobacillus salivarius)、雙歧乳桿菌(Lactobacillus bifidus)、保加利亞乳桿菌 (Lactobacillus bulgaricus)、高力口索乳桿菌(Lactobacillus caucasicus)、鼠李糖乳桿 菌(Lactobacillus rhamnosus)、力口氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri),以及它們的組合。優(yōu)選地，所述雙歧桿菌屬菌種是選自于下列所構(gòu)成的組兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacterium bifidum)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、嬰兒雙歧桿菌 (Bifidobacterium infantis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、|L酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)，以及它H 的組合。優(yōu)選地，所述鏈球菌屬菌種是選自于下列所構(gòu)成的組嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)、乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、乳月旨鏈球菌 (Streptococcus cremoris)、雙乙酉先鏈球菌(Streptococcus diacetylcatis),以及它們的組合。優(yōu)選地，所述酵母是選自于下列所構(gòu)成的組乳酒假絲酵母(Candida Kefyr)、弗 羅棱糖酵母(Saccharomyces florentinus)、酉良酒酵母(Saccharomyces cereviseae),以及 它們的組合。本發(fā)明將就下面實施例來作進(jìn)一步說明，但應(yīng)了解的是，該等實施例僅是用來作 為例示說明，而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明的實施上的限制。實施例實施例1.具有抗炎活性的乳桿菌分離株的初步篩選實驗材料與方法A.試驗菌株的來源與制備申請人:于91年2月經(jīng)由中國醫(yī)藥大學(xué)附設(shè)醫(yī)院(臺中市)取得眾多健康成人的胃 腸道標(biāo)本，并從這些標(biāo)本中分離出4百余株的乳桿菌分離株。為尋找具有可用于治療類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎的潛力的益生菌，申請人對這些乳桿菌分離株進(jìn)行抗炎活性分析，并使用IL-IO 作為篩選標(biāo)記。將各試驗菌株接種至Bacto乳桿菌MRS肉湯培養(yǎng)基(DIFC0，Cat. No. 0881)內(nèi)，然 后于37°C下厭氧培養(yǎng)12至18小時。所形成的細(xì)菌培養(yǎng)物以4，OOOrpm離心15分鐘，倒除 上清液，將沉淀物以IX磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌共計3次，然后懸浮于IX PBS中。所形 成的菌液以IX PBS調(diào)整濃度至1 5X IO9細(xì)胞/mL(以O(shè)D6tltl進(jìn)行菌數(shù)計數(shù)，OD600 = 1. 00 =5. OX IO8細(xì)胞/mL) ·并以之作為原液進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，生成ΙΟ8、ΙΟ7、ΙΟ6、105、IO4、103、 IO2UO1細(xì)胞/mL的試驗菌液供隨后的實驗用。B.小鼠脾臟單核細(xì)胞的制備以CO2處死6 8周齡的雌性BALB/c小鼠，取出脾臟并用經(jīng)滅菌的玻棒研磨。將 研磨后的脾臟組織與 Ficoll-Paque PLUS(17-1441-03，Amersham Biosciences)以1 1 的體積比進(jìn)行密度梯度離心(720gX 20min，在4°C下)。之后，移除紅血球，將由此得到的小 鼠脾臟單核細(xì)胞以含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4X IO6 細(xì)胞/mL備用。C.乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的評估向96孔的培養(yǎng)盤的各孔加入100 μ L的上述B中所制備的小鼠脾臟單核細(xì)胞樣 品，并分成3組分別加入(1)試驗組，20 μ L的上述A項中所制備的試驗菌液(IXlO7細(xì)胞 /mL)；⑵正常對照組，20 μ L的含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基；以及(3)陽性對照組， 20yL的脂多醣(LPS)(大腸桿菌(Escherichia coli)血清型055:B5，Sigma)。在培養(yǎng)箱 (37°C,5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)歷時M小時之后，將各孔內(nèi)的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，并從所收獲的 上清液取出 100 μ L進(jìn)行使用 Mouse IL-10 OptEIA Set (BD Biosciences, Cat. No. 555252) 的酵聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。將各組的實驗重復(fù)兩次。
IL-10的濃度是借由將ELISA試驗所測得的OD4tl5數(shù)值代入下列公式進(jìn)行計算，并 以ELISA單位(％ )來表示ELISA 單位(% ) = [ (A-C) / (B-C) ] X 100其中A =乳桿菌分離株的OD4tl5數(shù)值B =陽性對照組的OD4tl5數(shù)值C =正常對照組的OD4tl5數(shù)值結(jié)果在所有的試驗菌株當(dāng)中，有46株會刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌較高數(shù)量的 IL-10，它們的實驗結(jié)果示于表1中。表1.乳桿菌分離株刺激小鼠脾臟單核細(xì)胞分泌IL-10的功效評估
權(quán)利要求
1.一種具有抗炎活性的乳桿菌屬菌種(LactcAacillus sp.)的分離株，其特征在于該乳桿菌屬菌種的分離株是(i) 一種保藏菌株羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)GMNL_89，其以保藏編號CCTCC M 207154被保 藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；或( )在(i)項中的所述保藏菌株的繼代培養(yǎng)后代。
2.一種可用于治療和/或緩解與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物包含有(i) 一種保藏菌株羅伊氏乳桿菌GMNL-89，其以保藏編號CCTCC M 2071M被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心；或( )在(i)項中的所述保藏菌株的繼代培養(yǎng)后代。
3.如權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于所述疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
4.如權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物呈可供口服施用的劑型。
5.如權(quán)利要求4的藥物組合物，其特征在于所述劑型選自下列所構(gòu)成的組溶液、懸 浮液、乳劑、粉末、片劑、丸劑、糖漿、錠劑、含錠、咀嚼膠、膏劑以及膠囊。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的乳桿菌屬菌種的分離株，在制備用于治療和/或緩解與炎癥有關(guān) 聯(lián)的疾病的藥物組合物中的用途。
7.如權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
8.如權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述藥物組合物呈可供口服施用的劑型。
9.如權(quán)利要求8的用途，其特征在于該劑型選自于下列所構(gòu)成的組溶液、懸浮液、乳劑、粉末、片劑、丸劑、糖漿、錠劑、含 錠、咀嚼膠、膏劑以及膠囊。
10.一種食品產(chǎn)品，其特征在于該食品產(chǎn)品包含有權(quán)利要求1的乳桿菌屬菌種的分離 株以及一種可食性材料。
11.如權(quán)利要求10的食品產(chǎn)品，其特征在于該食品產(chǎn)品進(jìn)一步包含有至少一種選自于下列一組中的益生性微生物乳桿菌屬 胃禾中(Lactobacillus sp.)、雙 1 木干胃M 禾中(Bifidobacterium sp. )> IjIit^M ^ft (Streptococcus sp.)、酵母，以及它們的組合。
12.如權(quán)利要求11的食品產(chǎn)品，其特征在于該乳桿菌屬菌種選自于下列所構(gòu)成的組嗜酸乳桿菌(LactcAaci llus acidophilus), 乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、瑞士 乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、短 乳桿菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum) > ( ^ ff lif (Lactobacillus salivarius) > ) 1 ff lif (Lactobacillus bifidus)、保力口利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、高力口索乳桿菌 (Lactobacillus caucasicus)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、力口氏乳桿菌 (Lactobacillus gasseri)，以及它們的組合。
13.如權(quán)利要求11的食品產(chǎn)品，其特征在于所述雙歧桿菌屬菌種選自下列所構(gòu)成的組兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、乳酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)，以及它們的組合。
14.如權(quán)利要求11的食品產(chǎn)品，其特征在于所述鏈球菌屬菌種選自下列所構(gòu)成的組嗜熱鏈球菌(Sti^ptococcus thermophilus)、乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、乳月旨鏈球菌(Streptococcus cremoris)、雙乙酰鏈球菌(Sti^ptococcus diacetylcatis)，以及它們的組合。
15.如權(quán)利要求11的食品產(chǎn)品，其特征在于所述酵母是選自于下列所構(gòu)成的群組乳酒假絲酵母(Candida Kefyr)、弗羅棱糖酵 母(Saccharomyces florentinus)、酉良酒酵母(Saccharomyces cereviseae),以及它們的組口 O
16.如權(quán)利要求10的食品產(chǎn)品，其特征在于所述可食性材料選自下列所構(gòu)成的組液體乳制品、發(fā)酵乳、奶粉、冰淇淋、奶酪、干酪、 豆?jié){、發(fā)酵豆?jié){、蔬果汁、果汁、運(yùn)動飲料、甜點、果凍、糖果、嬰兒配方奶粉、保健食品、動物 飼料以及膳食補(bǔ)充劑。
17.如權(quán)利要求10的食品產(chǎn)品，其特征在于該食品產(chǎn)品被制成速溶沖泡食品的形式。
全文摘要
本發(fā)明揭示兩株具有抗炎活性以及有益的益生性質(zhì)的乳桿菌分離株，也就是沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei)GMNL-76以及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89，它們分別以保藏編號BCRC 910355與B CRC 910340被保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)，以及以保藏編號CCTCC M 207153與CCTCC M 207154被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。這兩株乳桿菌分離株及其繼代培養(yǎng)后代可被用于制備各式的食品產(chǎn)品，以及用于制備用于治療和/或緩解與炎癥有關(guān)聯(lián)的疾病(諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的藥物組合物。
文檔編號A61P19/02GK102115721SQ20101056758
公開日2011年7月6日 申請日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日
發(fā)明者俞篤文, 呂英震, 李浚笙, 謝豐欽, 陳靚珮, 黃璻尹 申請人:景岳生物科技股份有限公司