專利名稱：一種miRNA的抗腫瘤作用、實施方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)學領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種RNA小分子—— miR-99a的抗腫瘤作用、實施方法及用途。
背景技術：
微小RNAOnicro RNA，簡稱miRNA)是一類短序列、非編碼、具有調控功能的單鏈小分子RNA，長約18 Mnt。關于miRNA的最早報道是1993年Lee等報道的在秀麗線蟲(C. elegants)體內發(fā)現的一種呈時間特異性表達的小分子RNA，即可調節(jié)線蟲發(fā)育的 lin_Lee,R. C.等，The C. elegans heterochronic genelin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin—14. Cell. 1993，75 :843_854。2000 年，Reinhart 等Reinhart，B. J.等，The 21-nucleotide let~7 RNAregulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 2000,403 :901_906又發(fā)現不同時期表達的 let_7。到目前，公用miRNA數據庫中已收錄了數百種人類miRNA序列，其中三分之二已被實驗證實。微小RNA來源于長度約為IOOObp的長鏈RNA初始轉錄產物(Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在細胞核中經Drosha酶剪切形成長度約60 80nt的具有莖環(huán)結構的 miRNA前體(Pre-miRNA)。miRNA前體轉運至胞質后，被進一步加工成miRNA。微小RNA在動植物細胞中通過對目標mRNA的切割和轉錄抑制發(fā)揮重要作用，參與細胞生長、組織分化和腫瘤形成等多種過程。miRNA在物種間具有高度的保守性、時續(xù)性和組織特異性。目前認為miRNA在細胞凋亡、增殖、分化、血管生成及腫瘤形成等方面均具有重要的調節(jié)作用，參與人體大約30 %的基因調節(jié)，與腫瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊亂及代謝紊亂等多種發(fā)病有關。在上述疾病中，miRNA與腫瘤的關系是很多研究的重點。已經發(fā)現若干miRNA通過負調控基因的表達與慢性淋巴細胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結腸癌高度相關。miRNA的正調控靶基因現象是最近的發(fā)現，具體機制還不明確。有學者提出了“癌 microRNA” (OncomiRs) ” 的觀點Esquela-Kerscher，Α.等， Oncomirs-microRNAs with a role in cancer.Nat Rev Cancer. 2006,6 :259-269 ； Hammond, SM.等，MicroRNAs as oncogenes. Curr Opin Genet. 2006，16 :4_9，即認為某些 miRNA的異常表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中充當了類似癌基因的角色。miRNA的表達主要由miRNA基因首先表達為miRNA前體(pri-miRNA)，pri-mi RNA 經轉運出核后，由Dicer酶剪切成為pre-miRNA，pre-miRNA表現為典型的莖環(huán)結構，莖部序列不完全互補配對。其莖部序列經剪切后成為成熟體miRNA從而發(fā)揮生物學功能。miR-99a位于人基因組的21q21位。根據已有文獻報道，miR_99a在舌鱗狀細胞癌Wong TS 等，Mature miR-184 as potential oncogenic microRNA ofsquamous cell carcinoma of tongue. Clinical Cancer Research. 2008,14 :2588-2592.，兒童 lIf ±1/11 M@Doghman M Regulation of Insulin-IikeGrowth Factor-Mammalian Target of Rapamycin Signaling by MicroRNA inChildhood Adrenocortical Tumors.Cancer Research. 2010，70 :4666-4675.、暴露于香煙煙霧的大鼠肺中Izzotti A等， Downregulation of microRNAexpression in the lungs of rats exposed to cigarette smoke. Faseb Journal. 2009,23 :806-812.下降。miR-"a 在 HCMV 感染 MRC_5(人胎肺細胞)后下降并抑制 HCMV 的增殖。Wang FZ 等，Human cytomegalovirus infection alters the expression ofcellular microRNA species that affect its replication. J Virol. 2008,82(18) :9065-74.。另有報道表明 miR-99a/let_7c/miR-125b 基因簇在肺癌中易丟失George Adrian Calin 等，Human microRNA genes are frequently located atfragile sites and genomic regions involved in cancers. PNAS. 2004,101 (9) 2999-3004.，說明miR_99a可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，本領域中尚無關于miR_99a 在肝癌中的作用的報道。腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，其造成了諸多患者和家庭的痛苦，也給醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了極大的壓力。目前雖然已開發(fā)和應用了多種腫瘤治療的藥物和方法，但本領域仍然迫切需要開發(fā)出可有效地治療和預防腫瘤的新型藥物。以原發(fā)性肝細胞癌Ofepatocellular carcinoma,HCC)為例，其是我國常見的惡性腫瘤，患者死亡率在所有惡性腫瘤中居第三位。根據世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，全球每年新增約 60萬HCC患者，而每年死于肝癌的人數也約為60萬。HCC的發(fā)生是一個多步驟漸進的過程， 和慢性肝炎及肝硬化緊密相關。我國約有1. 2億乙肝病毒攜帶者，占全球感染人數的1/3。 因此，如何有效的干預HCC的發(fā)生并治療HCC患者是一個緊迫的重要問題。目前，HCC患者在手術或藥物治療后的轉移復發(fā)比例依然很高，5年存活率僅約為50%。因此，探求HCC的發(fā)病機制并尋求有效的治療靶點十分重要。近年來，隨著miRNA功能研究的不斷深入，miRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用也逐漸為研究者所關注。自 2006 年 Murakami 等Murakami，Y.等，Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues. Oncogene. 2006,25 :2537_45首次報道m(xù)iRNA在正常肝臟和HCC中的表達差異以來，已有多篇文獻報道了 HCC中異常表達的miRNA。例如，對HCC組織miRNA表達譜進行基因芯片研究發(fā)現，肝癌組織中miR-222、 miR-221 和 miR-31 上調，miR-223、miR_126 和 miR_122a 下調Wong，QW.等，MicroRNA-223 is commonly repressed in hepatocellular carcinoma and potentiates expression of Stathminl. Gastroenterology. 2008 ；135 :257_269。對 52 例肝癌前和 HCC 患者進行研究發(fā)現，miR-122、miR-10和miR-10a在肝癌中表達上調，miR-145下降Varnholt，H.等， MicroRNA gene expression profile ofhepatitis C virus associated hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2008 ；47 :1223—1232。對肝硬化患者的肝組織miRNA情況也開展了研究，發(fā)現肝硬化發(fā)病與miRNA表達異常有關，而且是發(fā)生肝癌的重要參考指標，研究者還對人肝癌標本進行了研究，發(fā)現miR-21和miR-301在肝癌中表達明顯，且與預后有關Jiang，J.等，Association of MicroRNA expressionin hepatocellular carcinomas with hepatitis infection, cirrhosis, and patient survival. Clin Cancer Res. 2008 ;14 :419_427J0基于上述研究，有學者認為miRNA是肝癌診斷和治療研究的重要靶點Ji，J.等， New kids on the block !diagnostic and prognostic microRNAs inhepatocellular一1693?？傮w來說，與HCC癌旁組織相比，在HCC中表達上調的miRNA有miR_l、miR_21、 miR-221、miR-222、miR-224和miR-301 等，在HCC 中表達下調的miRNA有l(wèi)et_7a、miR-101、 miR-122、miR-125a、miR_139a、miR-143、miR-195、miR-26 和 miR-29 等。然而，本領域中已知的miRNA種類繁多，功能各異，要從中篩選出與腫瘤相關的 miRNA存在較大的難度。目前尚無miR-99a在肝癌中作用的研究報道。綜上所述，本領域中迫切需要開發(fā)出可有效針對肝癌診斷和治療的抗腫瘤天然免疫劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明正是從數百種已知的miRNA中篩選出了腫瘤(尤其是肝癌)表達相關性及其對肝癌生長的具有調控作用的miRNA--miR-99a，由此本發(fā)明提供了 miR_99a有效抗腫瘤的新用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了微小RNA miR-99a或其前體在制備預防或治療肝癌的組合物中的應用。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述miR_99a的序列如SEQ ID NO 1所示。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述miR-99a的前體在對象體內經加工轉化為 miR-99a。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述miR-99a或其前體來自人、大鼠、小鼠、犬、 馬、牛、兔或猴。在一個優(yōu)選例中，所述肝癌選自原發(fā)性肝癌、肝細胞癌、膽管細胞癌、轉移性肝癌、或繼發(fā)性肝癌，優(yōu)選原發(fā)性肝癌，更優(yōu)選原發(fā)性肝細胞癌。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述組合物是藥物組合物或疫苗組合物。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種組合物，所述組合物包含(a)有效量的微小 RNA miR-99a或其前體；和(b)藥學上或免疫學上可接受的載體。在一個優(yōu)選例中，組分(a)的含量占組合物總重量的0. 001 99. 9wt%，優(yōu)選1 95wt %，更優(yōu)選 5 90wt %。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述組合物還包含治療或預防腫瘤(優(yōu)選肝癌)的其它活性成分。在一個優(yōu)選例中，所述治療或預防腫瘤(優(yōu)選肝癌)的其它活性成分包括化療劑或放療劑。在一個優(yōu)選例中，所述其它活性成分選自烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素、或免疫制劑，優(yōu)選細胞有絲分裂抑制劑、喜樹堿、高三尖杉酯堿、丙卡巴胼、門冬酰胺酶、順鉬、卡鉬、米托蒽醌、他莫昔芬、環(huán)磷酰胺、鹽酸氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、塞替派、白消安、氮甲、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、喃氟啶、優(yōu)氟啶、卡莫氟、巰嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、環(huán)胞苷、巰鳥嘌呤、六甲蜜胺、羥基脲、絲裂霉素、阿霉素、表柔比星、博萊霉素、培萊霉素、阿伐司汀、赫賽汀、格列衛(wèi)、吉西他濱、托泊替康和/或亮丙瑞林。在另一個優(yōu)選例中，所述細胞有絲分裂抑制劑選自長春堿、長春新堿、長春地辛、 長春瑞濱、秋水仙胺、秋水仙堿、秋水仙酰胺、鬼白毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇或多西他賽。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述組合物的形式適于直接裸RNA注射法、脂質體包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細菌攜帶質粒RNA法或復制缺陷腺病毒攜帶目的RNA法。在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種預防和/或治療腫瘤的方法，所述方法包括 給予需要預防和/或治療的對象有效量的微小RNA miR-99a或其前體。在一個優(yōu)選例中，所述微小RNA miR-99a或其前體是通過如下方法給予對象的 直接裸DNA注射法、脂質體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法或復制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1 :HCC中miR_99a表達水平與患者生存時間之間的關系。其中，圖IA為無瘤生存時間的Kaplan-Meier生存曲線；圖IB為總體生存時間的Kaplan-Meier生存曲線(P值使用 SPSS 17. 0 中的 log-rank test 計算)。圖 2 :miR-99a 對 HCC 細胞系！fepG2、SMMC_7721、Huh7 增殖的影響。其中，圖 2A 禾口圖2B為EdU檢測結果，圖2C為MTT檢測結果(結果顯示為平均值士標準差(n = 4) ；*，Ρ
<0. 05 ；**，P < 0. 01)。圖3 :miR-99a對HCC細胞系H印G2、SMMC_7721、Huh7細胞周期(Gl期)的阻滯作用。其中，圖3A為各細胞系在所示時間點的細胞周期分析圖，同步化后的釋放時間點記為 Oh ；圖;3B為細胞同步化釋放后:3h(HepG2和SMMC7721)或9小時(Huh7)時，各細胞系不同處理的Gl期細胞比例的統(tǒng)計(結果顯示為平均值士標準差(n = 4) ；*，P < 0. 05 ；#，P
<0. 01)。圖4 :miR-99a對HCC細胞系H印G2、SMMC-7721、Huh7克隆形成能力的降低作用。圖5 瘤內注射miR_99a后，miR_99a在SMMC-LTNM腫瘤中的表達情況的qRT_PCR 檢測(**，P < 0. 01)。圖6 瘤內注射miR_99a后對腫瘤生長的影響。其中，圖6A為剝離的腫瘤圖片； 圖6B為腫瘤生長曲線；圖6C為血清AFP含量(結果顯示平均值士標準差(n = 8) ；*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01)。
具體實施例方式本發(fā)明人經過長期而深入的研究發(fā)現HCC患者的腫瘤組織中微小RNAmiR-99a的表達會顯著下調，且下調的幅度與患者的生存時間存在相關性，其低表達與患者的預后差顯著相關，從而證實了 miR-99a在腫瘤進展和患者預后中起重要作用。發(fā)明人在此基礎上進行進一步的研究發(fā)現miR-99a可在體、內外有效抑制腫瘤細胞的繁殖和生長，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。由此，發(fā)明人發(fā)現了 miR-99a在抗腫瘤中的新用途，從而在此基礎上完成了本發(fā)明。如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構成”、“基本上由......構成”、和“由......構成”;“主要由......構成”、“基本上由......構成”
和“由......構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，“分離的”或“分離純化的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。本發(fā)明提到的特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的
一般性例子。miR~99a 及其前體如本文所用，術語“miR_99a”或“微小RNA miR_99a”可互換使用，是指包含SEQ ID NO 1所示序列或其同源序列的微小RNA。本領域中已知各種來源的miR-99a，例如人、黑猩猩、馬、雞等，這些同源序列均包含在本發(fā)明的術語“miR-99a”中。本發(fā)明的術語中還包含上述天然存在的miR-99a序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸，或經過生物學化學修飾，且仍然具有抗腫瘤活性的衍生RNA。如本文所用，術語“miR-99a前體”是指在被施予對象的細胞內或體內可被加工成為miR-99a的miRNA前體。本領域普通技術人員知曉獲得天然存在的miR_99a前體的方法和手段，也可基于分子和遺傳學理論和手段構建所述前體，例如Doghman M 等，Regulation of Insulin-like Growth Factor-Mammalian Target of Rapamycin Signaling by MicroRNA in Childhood Adrenocortical Tumors. Cancer Research. 2010, 70 :4666-4675]0本領域中已知miR-99a編碼基因的初始轉錄產物經過一系列的加工成熟之后，形成成熟的miR-99a。miR-99a前體只有在加工成成熟的miR_99a后才具有相應的生物學功能，因此，本領域普通技術人員可合理預期利用miR-99a的成熟序列及能夠產生或加工成為miR-99a的各種其它形式的核酸物質(即本發(fā)明所述的“miR_99a前體”)均可獲得本發(fā)明所需獲得的效果，即起到抗腫瘤的效果，從而均可用于制備治療或預防腫瘤的組合物。本發(fā)明還包括一種載體，它含有攜帶所述miRNA或其前體的構建物。所述的表達載體通常還含有啟動子、復制起點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建本發(fā)明所需的構建物或表達載體。這些方法包括但不限于基因重組技術、體外合成技術等。所述的表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。組合物本發(fā)明還提供了一種組合物(尤其是藥物組合物或疫苗組合物)，所述的組合物可用于預防和/或治療腫瘤、及由其引起的相關癥狀和疾病。所述組合物含有有效量的本發(fā)明的miR-99a以及藥學上或免疫學上可接受的載體。所述“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。所述“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。
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所述“藥學上/免疫學上可接受的載體”指用于治療劑或疫苗給藥的載體，包括各種賦形劑、稀釋劑和佐劑。該術語指這樣一些藥劑或疫苗載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物/疫苗制劑應與給藥方式相匹配，例如，本發(fā)明的組合物可以用生理鹽水或含有葡萄糖和其它輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備，以制得針劑形式。所述組合物宜在無菌條件下制造。本發(fā)明的制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明的miR-99a的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于miR-99a的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。當本發(fā)明的miR-99a或其前體以適當劑量給予對象時可獲得令人滿意的效果。例如，當本發(fā)明的miR-99a或其前體，每天以約2. 5-25nmol/20g (優(yōu)選的為20nmol/20g)動物 (如小鼠)體重的劑量給予動物時，可獲得令人滿意的抗腫瘤效果。給藥方式本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如口服液)或其它合適的形狀。給藥途徑可采用例如(但不限于)(1)直接裸RNA注射法；(2)脂質體包裹RNA 直接注射法；(3)金包被RNA基因槍轟擊法；(4)繁殖缺陷細菌攜帶質粒RNA法；(5)復制缺陷腺病毒攜帶目的RNA法；(6)電打孔法，等等。此外，本發(fā)明的組合物中還可含有用于改善和/或治療腫瘤的其它活性物質，所述的其它活性物質選自下組(包括但不限于)臨床常用抗腫瘤藥物(包括但不限于)化療劑或放療劑，優(yōu)選烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素、或免疫制劑，更優(yōu)選細胞有絲分裂抑制劑、喜樹堿、高三尖杉酯堿、丙卡巴胼、門冬酰胺酶、順鉬、卡鉬、米托蒽醌、他莫昔芬、環(huán)磷酰胺、鹽酸氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、塞替派、白消安、氮甲、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、喃氟啶、優(yōu)氟啶、卡莫氟、巰嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、環(huán)胞苷、巰鳥嘌呤、六甲蜜胺、羥基脲、絲裂霉素、阿霉素、表柔比星、博萊霉素、培萊霉素、阿伐司汀、赫賽汀、格列衛(wèi)、吉西他濱、托泊替康和/或亮丙瑞林。本發(fā)明的miR-99a還可以與其它藥物和治療手段(例如手術療法)聯(lián)合，用于腫瘤的預防和治療。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的優(yōu)點主要在于(a)本發(fā)明揭示了 miR_99a在預防和/或治療肝癌中的新用途，為miR_99a、乃至 miRNA的研究和開發(fā)利用提供了新的思路和途徑；(b)本發(fā)明的miR-99a或其前體可有效用于抗肝癌，從而為本領域提供了一種新穎的肝癌發(fā)生診斷劑和/或治療劑，具有一定的臨床應用前景。實施例
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克隆實驗室指南》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1 :miR-99a表汰量與HCC的關系采用實時定量反轉錄PCR(qRT-PCR)方法對2002至2006年收集的共142例HCC 患者的HCC組織與癌旁組織(來自東方肝膽醫(yī)院標本庫)中miR-99a的表達進行了分析。采用TRIzol (Invitrogen 公司)抽提組織總 RNA。qRT-PCR 使用 STOR RT-PCR 試劑盒(Takara公司)，在LightCyclerl. 5 (Roche公司)實時定量PCR儀上完成。miR_99a反轉錄引物為5 ‘ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAG-3‘ (SEQ ID NO 2)；定量PCR引物5' -GCAACCCGTAGATCCGAT-3‘(上游，SEQ ID NO 3)禾口5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3‘(下游，SEQ ID NO 4)；內參TO小核RNA的反轉錄反應引物與其定量PCR的下游引物相同，序列為5，-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT—3，(SEQ ID NO 5)；定量PCR引物5，-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3，(上游，SEQ ID NO 6)；和5，-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3，(下游，同上 SEQ ID NO :5)。miRNA的相對定量使用2_ΔΔ"法計算(U6為內參)[Livak, KJ.等，Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Δ Δ Ctmethod. Methods. 2001 ；25 :402-408。qRT-PCR結果顯示，miR-99a在約87%的HCC癌旁組織中有所下降(結果未顯示)。 對miR-99a的低表達與患者生存時間的性關性進行分析，P值使用SPSS17. 0中的log-rank test計算，結果分別如圖IA和圖IB所示。通過試驗結果發(fā)現miR-99a的低表達與患者更短的無瘤生存時間和總體生存時間顯著相關。對影響HCC預后的危險因素進行Cox回歸分析，危害比(95%可信區(qū)間)和P值使用SPSS 17.0中的單因素和多因素Cox回歸分析計算。結果如表1所示。表1影響HCC患者預后危險因素的單因素和多因素Cox回歸分析
權利要求
1.微小RNAmiR-99a或其前體在制備預防或治療肝癌的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述miR-99a的序列如SEQIDNO :1所示。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述miR-99a的前體在對象體內經加工轉化為 miR-99a。
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述miR-99a或其前體來自人、大鼠、小鼠、犬、馬、牛、兔或猴。
5.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的肝癌選自原發(fā)性肝癌、肝細胞癌、膽管細胞癌、轉移性肝癌、或繼發(fā)性肝癌。
6.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述組合物是藥物組合物或疫苗組合物。
7.一種組合物，所述組合物包含(a)有效量的微小RNA miR-99a或其前體；和(b)藥學上或免疫學上可接受的載體。
8.如權利要求7所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含治療或預防腫瘤的其它活性成分。
9.如權利要求8所述的組合物，其特征在于，所述治療或預防腫瘤的其它活性成分包括化療劑或放療劑。
10.如權利要求7所述的組合物，其特征在于，所述組合物的形式適于直接裸RNA注射法、脂質體包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細菌攜帶質粒RNA 法或復制缺陷腺病毒攜帶目的RNA法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種miRNA的抗腫瘤作用、實施方法及用途，屬于生物醫(yī)學材料技術領域。具體涉及miR-99a在抑制肝癌生長中的用途和應用方法。本發(fā)明的miR-99a在肝癌中表達顯著低于正常肝組織；此外，本發(fā)明的miR-99a在體外、體內均能夠抑制肝癌細胞的生長?？捎糜谥苽漕A防或治療腫瘤的藥物。尤其用于制備預防或治療肝癌的藥物。
文檔編號A61P35/00GK102451474SQ20101052742
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權日2010年10月29日
發(fā)明者曹雪濤, 李冬, 李楠 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學