專利名稱：禽流感和傳染性囊病混合病毒樣顆粒、制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽流感和傳染性囊病混合病毒樣顆粒，及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza, Al)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽類(家禽和野禽)的一種感染和/或疾病綜合征，發(fā)生在雞、鴨、鵝、鴿子等禽類和鳥類身上，但主要侵害火雞和雞，哺乳動(dòng)物如豬、馬、海豹、人等也可感染。根據(jù)禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)株的致病性、禽的種類、環(huán)境、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件以及并發(fā)疾病等因素，感染后的禽只表現(xiàn)為無癥狀感染、輕度的上呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋量下降到急性的致病性死亡等多種形式， 直接影響雞體的健康及其產(chǎn)品質(zhì)量，是現(xiàn)代化養(yǎng)禽業(yè)難以對(duì)付的重要禽類呼吸道傳染病之一，與馬立克氏病、傳染性法氏囊病、白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥等一樣，也是嚴(yán)重威脅家禽的重要免疫抑制病。被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。自從1955年證實(shí)了 1878年意大利暴發(fā)的雞瘟是由A型流感病毒引起的流感以來到2001年，全球共報(bào)道了 19起高致病性禽流感疫情，其中火雞發(fā)生5起，雞14起。進(jìn)入本世紀(jì)以來，高致病性禽流感疫情也不斷發(fā)生。2001年中國(guó)香港發(fā)生H5W亞型流感；2003 年初，歐洲大陸相繼暴發(fā)禽流感，2003年2月荷蘭發(fā)生H7N7亞型、2003年4月比利時(shí)發(fā)生 H7N7亞型、2003年5月德國(guó)發(fā)生H7N7亞型禽流感。2003年末2004年初，亞洲各國(guó)相繼暴發(fā)禽流感，疫情共涉及10個(gè)國(guó)家或地區(qū)。2003年12月，韓國(guó)發(fā)生禽流感，2004年1月，日本、越南、臺(tái)灣、泰國(guó)、柬埔賽、印度尼西亞、巴基斯坦、老撾和中國(guó)等國(guó)家和地區(qū)先后發(fā)生禽流感，其中日本、臺(tái)灣發(fā)生了 H5N2亞型禽流感，其他國(guó)家和地區(qū)發(fā)生了 H5W亞型禽流感。這些疫情的暴發(fā)，不但給亞洲各國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊，而且嚴(yán)重影響到人民的身體健康， 越南、泰國(guó)等國(guó)家先后發(fā)生了禽流感感染人類，造成死亡的嚴(yán)重后果。2004年2月，禽流感又在美洲大陸發(fā)生，其中美國(guó)發(fā)生了 H7N7禽流感，4月份加拿大也發(fā)生了禽流感。目前，高致病性禽流感特別是H5W禽流感還在亞洲和北美部分國(guó)家和地區(qū)蔓延。我國(guó)目前流行的高致病性禽流感主要是H5m亞型禽流感。目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的用于預(yù)防禽流感的疫苗大部份是采用傳統(tǒng)的雞胚法培養(yǎng)增殖活病毒，經(jīng)化學(xué)試劑滅活后生產(chǎn)成疫苗。這種技術(shù)又分為兩類不同的制備法一是直接用野生型病毒感染雞胚制備，另一類是先采用反向遺傳技術(shù)改造野生病毒的遺傳性，然后用“拯救”改造的新病毒來感染雞胚，增殖病毒，生產(chǎn)疫苗。這些流感疫苗制備技術(shù)有其優(yōu)點(diǎn)，但亦存在著很大的缺陷。尤其是流感感毒的與眾不同特性，例如高頻率突變，雙重及多重亞型病毒之間遺傳物質(zhì)重組及抗原漂移等—— 使這些疫苗的長(zhǎng)期安全性及有效性受到了極大挑戰(zhàn)，甚至產(chǎn)生了 “無效疫苗”，難以應(yīng)付新的突變型流感病毒的傳染。除此以外，這些疫苗制劑還存在著以下不足(1)生產(chǎn)周期長(zhǎng) 從獲得新的亞型病毒株到疫苗生產(chǎn)上市，耗時(shí)5-8個(gè)月，難以遏制新的疫情大爆發(fā)。(2)生產(chǎn)條件高為預(yù)防人為的污染環(huán)境及生產(chǎn)的活病毒的泄漏擴(kuò)散，整套生產(chǎn)必須按規(guī)定在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，病毒的滅活必須保證完全，徹底。(3)無法區(qū)別被免疫過的雞只與受病毒感染的雞只。傳染性囊病病毒(IBDV)屬于雙RNA病毒科(Birnaviridae)禽雙RNA病毒屬 (Avibirnavirus)，它是雞傳染性囊病的病原。目前普遍認(rèn)為IBDV具有4種成熟蛋白質(zhì) VPU VP2、VP3 和 VP4，分子量分別為 90kDa、37_40kDa、32_35kDa 和 24_30kDa。其中 VP2 和 VP3是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別占病毒總蛋白的51%和40%。VP2分子量約為40kDa，它含有血清型特異性的能誘導(dǎo)中和抗體的抗原決定簇，是病毒的主要宿主保護(hù)性免疫原(Hudson et al，1986)。病毒樣顆粒(VLP)是含有某種病毒的一個(gè)或多個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，在體外表達(dá)系統(tǒng)中自動(dòng)組裝成的不包含病毒核酸的空心顆粒，它的形態(tài)和大小與真實(shí)的病毒粒子相同或相似，所以能有效的誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，作為一種新型疫苗顯示出了良好的應(yīng)用前景。典型的H5N1AIV粒子呈球形或橢圓形，直徑80 120nm，H5N1流感病毒的基因組8個(gè)基因片段共編碼11種蛋白，病毒的外殼是一層由脂質(zhì)及脂蛋白構(gòu)成的膜，包裹著病毒的遺傳物質(zhì)及核蛋白。共有4種蛋白質(zhì)，屬于病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，它們是基質(zhì)蛋白M1， 形成病毒外殼的主體蛋白；核蛋白NP，形成病毒粒子核衣殼，參與病毒粒子形成；紅細(xì)胞凝集素HA，病毒外殼表面膜上的主要糖蛋白，共有16個(gè)亞型。是誘發(fā)宿主機(jī)體產(chǎn)生抗體的主要抗原體。神經(jīng)氨酸苷酶NA，亦是病毒外殼表面膜上的一種糖蛋白，共有9個(gè)亞型，同樣是誘發(fā)抗體產(chǎn)生的主要抗原體。流感病毒的表面膜蛋白HA和NA是引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要誘發(fā)物，而基質(zhì)蛋白Ml是形成病毒外殼的主體，亦可作為組織型免疫應(yīng)答的誘發(fā)物。有關(guān)的研究證明，基質(zhì)蛋白Ml的正確表達(dá)，是保證病毒外殼形成的重要環(huán)節(jié)，而膜蛋白NA的功能之一是把病毒實(shí)體從宿主細(xì)胞表面剝離下來，形成病毒顆粒，因此禽流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Ml、HA和NA是合成新型抗禽流感病毒疫苗的核心。蛋白HA、NA和Ml等3個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白同時(shí)表達(dá)就可以自動(dòng)組裝成空心的沒有病毒基因組的病毒樣顆粒。另外研究證明流感病毒的保守蛋白一NP 蛋白可有效刺激CTL (細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)反應(yīng)，抑制病毒感染，在病毒樣顆粒中加入NP蛋白將會(huì)在一定程度上提高這種新型疫苗的細(xì)胞免疫水平。禽流感病毒和傳染性囊病病毒在雞體內(nèi)互為影響，同時(shí)感染會(huì)加重病情。故有必要提供一種二價(jià)疫苗同時(shí)預(yù)防H5m禽流感和傳染性囊病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種疫苗，該疫苗能夠同時(shí)預(yù)防H5m禽流感和傳染
性囊病。本發(fā)明的目的是通過以下內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供一種混合病毒樣顆粒包含流感病毒的基質(zhì)蛋白M1，流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA，一個(gè)融合膜蛋白，其包含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的5’端的大致相同長(zhǎng)度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時(shí)表達(dá)流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA和傳染性囊病病毒的表面抗原VP2蛋白。本發(fā)明還提供一種禽流感和傳染性囊病二價(jià)疫苗，包含所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。本發(fā)明還提供一種制備所述混合病毒樣顆粒的方法。利用包含所述融合膜蛋白的混合病毒樣顆粒構(gòu)成的疫苗，可同時(shí)預(yù)防H5W禽流感和傳染性囊病，并具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和效果(1)H5N1禽流感和傳染性囊病VLP 二價(jià)疫苗能引起機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)型應(yīng)答， 免疫力強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，能同時(shí)預(yù)防H5m禽流感和傳染性囊病。(2)由于病毒樣顆粒不含病毒基因組，這種空殼結(jié)構(gòu)的VLP在免疫動(dòng)物體內(nèi)就不會(huì)發(fā)生病毒基因與宿主染色體基因整合，而且整個(gè)生產(chǎn)過程不接觸活的有感染力的病毒， 因此非常安全，對(duì)于流感病毒和傳染性囊病病毒兩種病毒來說，都無病毒擴(kuò)散之虞。(3)和一般的基因工程亞單位疫苗比較，因?yàn)椴《緲宇w粒更接近天然病毒的形態(tài)和大小，能刺激機(jī)體產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)，免疫效果更好。(4)可區(qū)別出被人工免疫了的動(dòng)物與被病毒感染的動(dòng)物。病毒樣顆粒不含流感病毒NS、PB1、PB2等蛋白，因此進(jìn)行血清測(cè)試時(shí)，用VLP疫苗免疫的動(dòng)物，將不會(huì)產(chǎn)生特異性抗 NS或PB的抗體，可以區(qū)分是否為野毒感染。對(duì)于傳染性囊病來說，用VP2蛋白之外的任何病毒結(jié)構(gòu)蛋白如VP3等作為檢測(cè)抗原，都可以區(qū)分是否為野毒感染。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施方式，任何在本發(fā)明基本精神上的改進(jìn)或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的范圍。


圖1是用各自特異性引物？0 擴(kuò)增出的撤仏)、嫩仏)^103)、呢(()、￥/撤((1)基因片段的電泳圖片。圖2是重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒rBacmid-HA(/V/HA)_NA、rBacmid-Ml、 rBacmid-NP 示意圖。圖3是病毒樣顆粒western blot結(jié)果。圖4是病毒樣顆粒中的Ml蛋白和VP2蛋白的間接免疫熒光結(jié)果。A、Ml抗體為 RBITC標(biāo)記顯示橙色熒光，C、VP2抗體為FITC標(biāo)記顯示綠色熒光，B、D為陰性對(duì)照。圖5A是蔗糖密度梯度離心純化后的病毒樣顆粒在電子顯微鏡下的圖象，圖5B是放大圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以Bac-to-Bac 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用H5W禽流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml、表面膜蛋HA和NA蛋白(以及任選地，核蛋白NP)，共同自動(dòng)組裝構(gòu)建出H5W禽流感病毒的病毒樣顆粒(VLP)。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建H5W禽流感病毒與傳染性囊病病毒的二價(jià) VLP。首先，將傳染性囊病病毒的主要表面抗原基因VP2的大部分膜外域替換H5W禽流感病毒的HA蛋白基因的一部分膜外域，二者構(gòu)成融合基因(V/HA)，VP2基因位于融合基因 V/HA的5’端，替換大致相等長(zhǎng)度的HA基因的5’端序列，以保障融合基因V/HA的長(zhǎng)度與 HA基因長(zhǎng)度大致相等。
然后，按照形成流感病毒樣顆粒的方法，將H5W禽流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml、核蛋白NP及表面膜蛋白HA和NA的基因，以及表達(dá)傳染性囊病病毒VP2和流感病毒HA的融合蛋白V/HA的基因，構(gòu)建于昆蟲桿狀病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)，并使其重組入昆蟲桿狀病毒的遺傳物質(zhì)DNA內(nèi)，利用宿主昆蟲細(xì)胞表達(dá)這些外源蛋白，自動(dòng)組裝成不含禽流感病毒遺傳物質(zhì)的病毒樣顆粒，病毒樣顆粒形成后將釋放入細(xì)胞培養(yǎng)液中。這樣形成的VLP既具有H5W禽流感病毒的主要表面抗原，又具有傳染性囊病病毒的主要表面抗原VP2，為H5W禽流感病毒與傳染性囊病病毒二價(jià)VLP。需要指出的是，有研究表明，不同的膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜的不同微區(qū)域，在細(xì)胞膜上的分布主要取決于膜蛋白的跨膜區(qū)和膜內(nèi)域。未經(jīng)改造的VP2和 HA蛋白有可能在表達(dá)后分布于細(xì)胞膜的不同微區(qū)域，因而當(dāng)未經(jīng)改造的VP2和HA蛋白同時(shí)表達(dá)時(shí)，他們有可能同時(shí)整合到同一 VLP，但他們?cè)赩LP中的含量和比例有很大差異。本發(fā)明將VP2蛋白的部分膜外域融合到缺失部分膜外域的HA上，這樣V/HA融合蛋白和HA蛋白含有同樣的HA的部分膜外域，跨膜區(qū)和膜內(nèi)域；這樣保證V/HA融合蛋白和HA蛋白分布在同一細(xì)胞膜的微區(qū)域；因此在VLP的形成過程中，V/HA融合蛋白和HA蛋白非?？赡艿乇灰粯佑行У卣系絍LP上，他們?cè)赩LP中的含量和比例得到保證。另外，流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白作為二價(jià)VLP的骨架是因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)流感病毒VLP高產(chǎn)、穩(wěn)定；同時(shí)HA蛋白的整合到VLP是高效的；這樣可以保證在VLP的表面有足夠的HA蛋白，可以作為有效的疫苗使用。實(shí)施列1 :M1、NP、HA、NA和融合基因V/HA的擴(kuò)增(1) H5N1亞型禽流感病毒RNA抽提和RT-PCR按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取試劑盒的使用說明書(方法)進(jìn)行。分別取250 μ L禽流感病毒H5m亞型毒株感染尿囊液和750 μ L TRIzol LS，加入1.5mL 微量離心管內(nèi)，用吸管吹打充分混勻，室溫放置IOmin ；加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置5分鐘后，4°C下12000rpm離心15min ；取上清于一新的滅菌1. 5mL離心管內(nèi)，加入 500 μ L異丙醇，充分混勻，室溫放置lOmin，在4°C下12000rpm離心IOmin ；傾去上清，沉淀中加入70%的乙醇750 μ L，輕輕混勻，洗滌一次，4°C下12000rpm離心15min，棄去上清，風(fēng)干；加入10 μ L用DEPC水處理的無RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA (沉淀)，直接用于RT-PCR 或_80°C保存?zhèn)溆?。參照TaKaRa的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的使用說明進(jìn)行，在20 μ L反應(yīng)體系中分別加入以下組分:RNA :3μ L ；5XRTbuffer :4μ L ；dNTP :4μ L ；RNA 酶抑制劑0. 5μ L ；引物 UP :1 μ L ；引物 DN :1 μ L ；AMV :2 μ L ；DEPC 水補(bǔ)至 20 μ L?；靹蚝?，室溫放置 10min，42°C保溫lh，冰浴2min，RT產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增或_20°C保存。(2) Ml、NP、HA、NA 基因的 PCR 擴(kuò)增來源于(1)的RT-PCR產(chǎn)物可用于Ml、NP、HA、NA基因的擴(kuò)增。根據(jù)HA基因序列(SEQ ID NO 1)設(shè)計(jì)的1對(duì)引物，用于擴(kuò)增HA基因，其兩端分別加上了 Bio I和Nco I/酶切位點(diǎn)，位于PlO啟動(dòng)子下，引物序列如下HA Xho I 5' -GCCCTCGAGATGAAGGCAATACTAGTG-3，(SEQ ID NO 11)HA Nco I :5’ -GCCCCATGGTTAAATACATATTCTGCACTG-3，(SEQ ID NO 12)根據(jù)NA基因序列(SEQ ID NO 3)設(shè)計(jì)的1對(duì)引物，用于擴(kuò)增NA基因，其兩端分別加上了 Ml I和Hind III的酶切位點(diǎn)位于Pph啟動(dòng)子下，這2個(gè)引物序列分別是
NA Sal I :5，-GCCGTCGACATGAATCCAAACCAAAG-3，(SEQ ID NO 13)NA Hind III :5，-GCCAAGCTTCTACTTGTCAATGGTG-3，(SEQ ID NO 14)根據(jù)Ml基因序列(SEQ ID NO 5)設(shè)計(jì)的1對(duì)引物，用于擴(kuò)增Ml基因，其兩端分別加上了 Ml I和Hind III的酶切位點(diǎn)，位于Pph啟動(dòng)子下，這2個(gè)引物序列分別是Ml Sal I :5，-GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3，(SEQ ID NO 15)Ml Hind III :5，-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3，(SEQ ID NO 16)根據(jù)NP基因序列(SEQ ID NO 7)設(shè)計(jì)的1對(duì)引物，用于擴(kuò)增NP基因，其兩端分別加上了 Bio I和Nco I/酶切位點(diǎn)，位于PlO啟動(dòng)子下，引物序列如下NP Xho I ,5' -AGTCTCGAG ATGAGTGACATCGGAGCCAT-3，(SEQ ID NO 17)NP Nco I :5’ -CATGCCATGGTTAATTGTCATACTCCTCTGCATTG-3，(SEQ ID NO 18)(3)融合基因V/HA的合成V/HA基因的核酸序列見SEQ ID NO 9 ；V/HA蛋白質(zhì)的氨基酸序列見SEQ ID NO 10。融合基因根據(jù)其核酸序列合成。融合基因V/HA包含傳染性囊病病毒的主要表面抗原 VP2基因5，端的1-200氨基酸和H5W的HA基因的3，端185-568(共384)氨基酸。融合基因V/HA編碼584氨基酸，其基因序列如SEQ ID N0:9所示。融合基因V/HA由人工合成。 根據(jù)融合基因V/HA的序列(SEQ ID N0:9)，設(shè)計(jì)的1對(duì)引物，用于擴(kuò)增融合基因V/HA，其兩端分別加上了》ιο I和SphI酶切位點(diǎn)，位于PlO啟動(dòng)子下，引物序列如下V/HA EcoR I :5，-CCGGAATTCATGTCTGCAACAGCCAACA-3，(SEQ ID NO 19)V/HA Hind III :5，-CCCAAGCTTTTAAATGCAAATTCTGCATTG-3，(SEQ ID NO 20)采用M1、NP、HA、NA、V/HA各自特異性引物，將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物或合成的DNA片斷直接用作PCR擴(kuò)增M1、NP、HA、NA、V/HA基因的模板。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性 40S，56°C退火90s，72°C延伸90s，循環(huán)30次，最后延伸lOmin，PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠 (含0. 5ug/ml溴化乙錠，EB)電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增的HA基因的長(zhǎng)度約1. 7Kb (圖la)，NA基因的長(zhǎng)度約1. 35Kb (圖la)，Ml基因的長(zhǎng)度約0. 75Kb (圖lb)，NP基因的長(zhǎng)度約為1. 5Kb (圖 Ic)，融合基因V/HA的長(zhǎng)度約為1. 7Kb (圖Id)。所有的PCR產(chǎn)物樣品經(jīng)電泳凝膠抽提后，獲得純化的M1、NP、HA、NA、V/HA基因DNA片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Biol/Nco I (消化HA片段)、 &il/HindIII (消化 NA 片段)，)(ho I/Nco I (消化 NP 片段)、Sal I/Hind 111(消化 Ml 片段)、EcoR I和Hind III (消化V/HA片斷)37°C分別消化后，再進(jìn)一步純化，以備下一步構(gòu)建重組質(zhì)粒用。具體操作如下制備瓊脂糖凝膠含0. 5ug/ml溴化乙錠，將所有PCR樣品加入凝膠的樣品槽內(nèi)，設(shè)置電壓100V，電泳時(shí)間40min在長(zhǎng)波紫外燈下，切下含有樣品帶的凝膠條，裝入小塑料離心管中。參照膠回收試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)說明書，抽提純化 Ml、NP、HA、V/HA和NA基因DNA片段。經(jīng)限制性內(nèi)切酶37°C過夜消化后，用膠回收試劑盒 (Qiagen公司產(chǎn)品)，按照說明指導(dǎo)，離心過柱，純化回收酶切消化后的Ml、NP、HA、ΝΑ、V/HA 片段。實(shí)施例2 構(gòu)建表達(dá)Ml、NP、HA、ΝΑ、Υ/ΗΑ基因的昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒及在昆蟲細(xì)胞中合成重組的昆蟲桿狀病毒(1)構(gòu)建表達(dá)Ml和NP基因的重組質(zhì)粒昆蟲桿狀病毒質(zhì)粒Pi^astBac anvitrogen公司產(chǎn)品)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ml I/Hind III 37°c酶切3小時(shí)后，用膠回收試劑盒回收純化酶切后的質(zhì)粒PFastBac。在T4 DNA連接酶的作用下，酶切后的質(zhì)粒與酶切后的Ml DNA片段于16°C連接過夜。反應(yīng)體系如下 10XT4連接緩沖液lml，Ml酶切回收的DNA片段:3ml，酶切PFastBac質(zhì)?；厥债a(chǎn)物lul，T4 DNA連接酶lul，ddH20補(bǔ)至IOul。采用熱休克方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)入ToplO感受態(tài)細(xì)胞中加入到于一小塑料離心管中，輕輕混合后將小管置于冰上30min，轉(zhuǎn)入42°C水浴中熱休克 90s，迅速放回冰上5分鐘，向其中加入200ulLB培養(yǎng)液。37°C搖床培養(yǎng)1小時(shí)。取IOOul 菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有氨芐和慶大霉素兩種抗生素)上，37°C培養(yǎng)16h，從平板上挑取陽性克隆菌落，進(jìn)行菌液PCR，抽提質(zhì)粒后用Ml I /Hind III進(jìn)行單雙酶切鑒定。DNA 序列測(cè)定后，獲得重組質(zhì)粒PFastBac-Ml。表達(dá)NP基因的重組質(zhì)粒PFastBac-NP的構(gòu)建方法同上。(2)構(gòu)建表達(dá)HA或V/HA和NA基因的重組質(zhì)粒昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒PFastBac-dual經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bio I/Nco I酶切后，在 T4DNA連接酶的作用下，將被同樣的內(nèi)切酶消化后的HA基因DNA片段插入到PlO啟動(dòng)子的下方，此連接產(chǎn)物隨后經(jīng)熱體克法轉(zhuǎn)導(dǎo)入ToplO感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)、抽提數(shù)個(gè)陽性克隆菌落的重組質(zhì)粒DNA，菌液PCR和Bio I/Nco I酶切鑒定及DNA序列測(cè)序確定無誤后，挑選其中的1個(gè)重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行第二次酶切。所用的限制性內(nèi)切酶為Ml I/Hind III。用同樣的內(nèi)切酶酶切NA基因DNA片段，并將其插入到重組質(zhì)粒的另一個(gè)啟動(dòng)子Pph的下方，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、培養(yǎng)、抽提，獲得二度重組的質(zhì)粒。DNA測(cè)序后，即為所需的重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒 PFastBac-dual-HA-NA。同時(shí)表達(dá)融合基因V/HA和NA基因的重組質(zhì)粒PFastBac-dual-V/HA_NA的構(gòu)建方法同上。(3)重組昆蟲桿狀病毒基因組的合成及提取將純化的重組PfatBac-Ml、PfatBac-NP、PFastBac-dual-HA-NA 禾口 PFastBac-dual-V/HA-NA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入特殊的E. coli感受態(tài)細(xì)胞株DH IOBac細(xì)胞中 (美國(guó)hvitrogen公司產(chǎn)品)。DHlOBac細(xì)胞含有一特殊的大分子質(zhì)粒Bacmid，其內(nèi)包含有昆蟲桿狀病毒AcMNPV的全部基因組。一旦重組的表達(dá)質(zhì)粒整合入大分子質(zhì)粒Bacmid的特別位點(diǎn)后，經(jīng)3種抗菌素(慶大霉素、四環(huán)素和卡那霉素)的篩選及IPIG的誘導(dǎo)和X-Gal 底物反應(yīng)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，陽性克隆菌落呈白色，而非重組的野生菌落呈蘭色。實(shí)驗(yàn)條件均按照^witrogen公司提供的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)指導(dǎo)而設(shè)定。挑選的陽性克隆置于3ml的LB培養(yǎng)液中(含上述3種抗生素)，經(jīng)37°C搖床培養(yǎng)M小時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)手冊(cè)標(biāo)明的大分子質(zhì)粒 Bacmid小量制備法，提取純化帶有Ml基因、NP基因、HA-NA或V/HA-NA基因的重組大分子質(zhì)粒 Bacmid。(4)重組昆蟲桿狀病毒的制備將昆蟲細(xì)胞株sf9細(xì)胞(美國(guó)hvitrogen公司產(chǎn)品)培養(yǎng)于無血清的sf_900II 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中anvitrogen公司產(chǎn)品)，溫度設(shè)置為27 °C，根據(jù)hvitrogen公司提供的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將純化的重組大分子質(zhì)粒Bacmid與脂質(zhì)溶液 eellfectin (Invitrogen公司產(chǎn)品)混合，轉(zhuǎn)染入sf9細(xì)胞中，27°C培養(yǎng)4至5天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3000rpm離心10分鐘收集上清液，獲得低滴度的重組昆蟲桿狀病毒，再用此上清液感染新培養(yǎng)的sf-9細(xì)胞；3天后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為所需的放大培養(yǎng)后的高濃度重組昆蟲桿狀病毒，命名為Bac-Ml，Bac-NP, Bac-HA-NA和Bac-V/HA_NA。對(duì)獲取
8的用于放大培養(yǎng)和蛋白表達(dá)的重組昆蟲桿狀病毒進(jìn)行蝕斑實(shí)驗(yàn)，確定病毒的噬斑形成單位 (plaque forming units, PFU)。1)用含10% FBS的Grace氏培養(yǎng)基將Sf9細(xì)胞傳代接種到六孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為約1 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，每孔加2ml (6孔板)，輕輕混勻室溫使細(xì)胞貼壁1小時(shí)以上。2)將P3代種毒液用不含F(xiàn)BS的Grace’ s培養(yǎng)基做10倍倍比稀釋待用。3)棄去六孔板中的培養(yǎng)基，用不含血清的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，然后將上述稀釋好的重組病毒液加入孔中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)復(fù)孔，室溫下感染1小時(shí)。4)制備覆蓋液(以下為一塊六孔板的量)7ml 2 X Grace氏培養(yǎng)基+140 μ 1的雙抗+7ml 2%的高壓滅菌瓊脂糖凝膠+1. 4ml FBS,輕輕地混勻，然后將瓶再放置42°C水浴， 病毒感染Ih后吸盡每孔中的病毒液，并快速用上述制備的覆蓋液覆蓋細(xì)胞。5)待瓊脂糖凝固后將六孔板用保鮮膜包好并置于27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。6)加入Iml濃度為lmg/ml的中性紅，室溫孵育2小時(shí)后吸去染液，觀察到重組病毒形成的近似透明的小點(diǎn)即為空斑。計(jì)算統(tǒng)計(jì)觀察病毒空斑的形成情況(PFU)。用于放大培養(yǎng)重組桿狀病毒Bac-Ml，Bac-NP, Bac-HA-NA和Bac-V/HA-NA的細(xì)胞離心沉淀物，經(jīng)細(xì)胞裂解緩沖液處理后，4°C離心(13，OOOrpm) 10分鐘(或者將細(xì)胞在冰浴的情況下進(jìn)行超聲波破碎)，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分析基質(zhì)蛋白Ml (或者 NP、HA、V/HA和NA蛋白)是否在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)。簡(jiǎn)單而言，將10 μ 1上清液樣品中加入IOul的2XSDS上樣緩沖液，100°C處理5min后，IOOOOrpm離心5分鐘，將所有20ul的上清樣品加入4%-12%505-聚丙烯酰胺凝膠(11^1廿呢611公司產(chǎn)品)的點(diǎn)樣孔中。設(shè)置電泳條件為恒定電壓100V，溫度為4°C，電泳時(shí)間約3小時(shí)。待指示液溴酚蘭接近凝膠底部時(shí)，停止電泳。凝膠置于R型考馬斯亮藍(lán)染色液中，搖晃染色1小時(shí)，然后置于脫色液中脫色過夜。實(shí)施例3 :M1、NP、HA、V/HA和NA基因在共同轉(zhuǎn)染的懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞sf_9中的表汰將200ml sf-9細(xì)胞混合液懸浮培養(yǎng)于1升體積的三角搖瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)液為無血清的8€-90011(或化￥^1^8611公司的Grace昆蟲培養(yǎng)基)，搖床的搖速為lOOrpm， 溫度恒定于27°C。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到2X106細(xì)胞/ml時(shí)，用Bac-Ml、Bac-NP, Bac-HA-NA, Bac-V/HA-NA昆蟲桿狀病毒共同轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞。病毒的MOI比例為3 (Bac-Ml和 Bac-ΝΡ) 1 (Bac-HA-NA) 1 (Bac-V/HA-NA)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)恒溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)3天后，收集所有樣品，4°C離心30分鐘，離速為3000rpm，收集上清液。離心下來的細(xì)胞沉淀物用細(xì)胞裂解液處理后，4°C離心10分鐘，離速10，OOOrpm。保留離心后的上清液。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的同時(shí)構(gòu)建合成的野生型昆蟲桿狀病毒用于轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的sf-9細(xì)胞，MOI為5。作為設(shè)置的陰性對(duì)照， 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)、樣品的收集及細(xì)胞裂解的條件與步驟與上述實(shí)驗(yàn)一樣。收集的所有樣品，用于Western blots分析。其實(shí)驗(yàn)操作如下每個(gè)樣品(包括陰性對(duì)照)分別取10 μ 1 的細(xì)胞裂解抽提液及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再各自加入IOul的2XSDS上樣緩沖液。100°C處理5!^11后，將所有2(^1的混合樣品加入4% -12% SDS聚丙烯酰胺凝膠的點(diǎn)樣孔中。設(shè)置恒定電壓120V,溫度為4°C，時(shí)間3小時(shí)，當(dāng)藍(lán)色指示劑溴酚蘭完全靠入凝膠底端時(shí)，停止電泳，取出凝膠。剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜(PVDF膜)及兩張濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡5分鐘后與凝膠、濾紙一起浸入預(yù)冷2小時(shí)以上的轉(zhuǎn)移緩沖液中，按濾紙——凝膠——硝酸纖維素膜——濾紙的順序安裝入轉(zhuǎn)印夾。將夾中靠近凝膠的一側(cè)接負(fù)極，恒壓 25V轉(zhuǎn)移電泳lh。用鑷子夾取出硝酸纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌，而后轉(zhuǎn)移至5%的脫脂奶粉/PBS溶液中，搖蕩封閉1小時(shí)。用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次3分鐘；然后將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入一塑料袋中，加入:3ml以1 500稀釋于5%脫脂奶粉/PBS中抗H5W禽流感病毒雞源多克隆抗體(一抗)，置于4°C平緩搖動(dòng)過夜。翌日，取出纖維素膜，用PBS-T 漂洗液洗滌3次，每次10分鐘，將此硝酸纖維素膜再裝入另一新的塑料袋中，加入5ml以 1 10000稀釋于5%脫脂奶粉/PBS中的辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗雞IgG(二抗)，室溫下?lián)u動(dòng)溫育lh。棄二抗，PBS-T漂洗纖維素膜3次，每次10分鐘，將漂洗后的硝酸纖維素膜移至一平皿中，加入DAB第五顯色液，可見在各自相對(duì)應(yīng)的分子量位置上，Ml、NP、HA/V/HA 和NA的特異性條帶。說明Ml，NP, HA/V/HA和NA在轉(zhuǎn)染的懸浮培養(yǎng)的SF-9昆蟲細(xì)胞中有效地表達(dá)了。_仿丨丨4碰白糊細(xì)日H棘僅_申細(xì)·。將上述離心收集的細(xì)胞上清液裝入13ml的超速離心管內(nèi)，稱重、平衡、封管后，放入超速離心機(jī)(Bechmem公司產(chǎn)品)內(nèi)，4°C 100, OOOrpm離心1小時(shí)，然后取出離心管，小心倒掉上清液，保留離心管底的深沉物。加入5ml的PBS，放入4°C冰箱內(nèi)，溶解M小時(shí)。次日，在另一個(gè)13ml的超速離心管內(nèi)，先小心地加入Iml 60%的庶糖溶液，然后依次加入Iml 30%及:3ml 20%的庶糖溶液，最后將5ml的溶解后的樣品液置于其上。精確稱重、平衡后， 封管上超速離心機(jī)。4°C 100，OOOrpm離心1小時(shí)。取出離心管，分別收集位于20%與30% 及30%與60%濃度交界處的二條帶，即純化的病毒樣顆粒。Weatern blots分析純化濃縮后的病毒樣顆粒樣品。其操作步驟與上述實(shí)施例3中Western blots分析一樣，只是將所取的樣品進(jìn)行了稀釋，即1μ 1的病毒樣顆粒樣品，加入9ul的水，再加入IOul的2XSDS上樣緩沖液。100°C變性5min后，上樣入4% -12%聚丙烯酰氨凝膠樣品槽內(nèi)，Western blots 結(jié)果顯示，從這二條帶所獲得的大分子顆粒，的確是由Ml、NP、HA/V/HA和NA構(gòu)成的病毒樣顆粒。尤其是從30%與60%濃度交界處取得的似病毒顆粒含量大，特異性條帶濃度深。說明轉(zhuǎn)染后，病毒樣顆粒在宿主細(xì)胞中有效地自我組裝，并釋放入細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，進(jìn)一步的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和電鏡結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)(圖4、圖5)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作步驟如下將sf9細(xì)胞種到M孔板中，每孔10萬細(xì)胞，實(shí)施例3的操作步驟，對(duì)所種細(xì)胞進(jìn)行感染，感染72小時(shí)后，用PBS將細(xì)胞洗滌3次，每次5 分鐘，然后加入100%預(yù)冷的甲醇-20°固定細(xì)胞10分鐘，再加入0.05%的1Triton χ-100 室溫處理10分鐘，加入3%的BSA四度封閉過夜，第二天用PBS將細(xì)胞洗滌3次，每次5分鐘，然后向孔中加入RBITC標(biāo)記的A型流感特異的Ml單克隆抗體，或者FITC標(biāo)記的抗傳染性囊病VP2的單抗，37°反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用PBS將細(xì)胞洗滌3次，每次5分鐘，洗滌結(jié)束后在熒光顯微鏡下觀察。用抗Ml的單抗和VP2的單抗進(jìn)行免疫電鏡觀察，可以看到熒光標(biāo)記的病毒樣顆粒，其中抗Ml的抗體為RBITC標(biāo)記，顯示橙色熒光(圖4Α)，抗VP2的抗體為FITC標(biāo)記，顯示綠色熒光(圖4C)，而對(duì)照沒有熒光信號(hào)((圖4B、D)。電鏡拍片實(shí)驗(yàn)操作如下將少量的純化濃縮后的似病毒顆粒樣品固定處理后，置于新制備的無負(fù)荷的塑膠/碳包被網(wǎng)絡(luò)格上，用數(shù)滴蒸餾水輕輕沖洗幾次后，加上2%磷鎢酸鈉溶液進(jìn)行負(fù)染色。電子透視顯微鏡下觀察并拍片，如圖5所示，病毒樣顆粒的外觀及體積大小相近。
實(shí)施例5 :H5N1禽流感和傳染件囊病二價(jià)VLP免疫SPF雞60只SPF雞購自廣東溫氏食品集團(tuán)SPF雞場(chǎng)，各組免疫動(dòng)物具體免疫實(shí)施方式見表1。2周齡的SPF雞在免疫后21天翼靜脈采血，常規(guī)分離血清。采用IDEXX公司IBD抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)雞血清中IBD抗體，采用血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)血清中H5W禽流感抗體，參照甘孟侯000 方法進(jìn)行進(jìn)行。結(jié)果表明，H5W禽流感和傳染性囊病二價(jià)VLPs 免疫2周齡SPF雞，免疫雞血清中既有抗H5W禽流感的抗體(表幻，也產(chǎn)生了傳染性囊病病毒的抗體(表3)。表1 H5W豬流感和傳染性囊病二價(jià)VLP免疫SPF雞實(shí)驗(yàn)方案
組別接種材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)(只)1VLPs+油佐劑(約1 μ g HA/只)202H5N1滅活病毒+油佐劑(約1 μ g HA/只)203PBS+油佐劑20 表2 H5N1禽流感和傳染性囊病二價(jià)VLP免疫SPF雞血清HI檢測(cè)結(jié)果
分組最后一次免疫21天后HI滴度log2196±26.8±1292±26. 5±13< 4< 2 表3 H5N1禽流感和傳染性囊病二價(jià)VLP免疫SPF雞血清IBDV抗體檢測(cè)結(jié)果
組別樣本數(shù)ELISA 滴度(0D450)1201. 036±0. 1522200. 042 土 0. 005
3200.038±0.01權(quán)利要求
1.混合病毒樣顆粒，其特征在于，包含流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml ；流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA ；一個(gè)融合膜蛋白，其包含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的5’端的大致相同長(zhǎng)度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時(shí)表達(dá)流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA和傳染性囊病病毒的表面抗原VP2蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的混合病毒樣顆粒，其中所述混合病毒樣顆粒還含有流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶NA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的混合病毒樣顆粒，其中所述混合病毒樣顆粒還含有流感病毒的核蛋白NP。
4.如權(quán)利要求1所述的混合病毒樣顆粒，其中融合膜蛋白的序列如SEQID N0:10所
5.禽流感和傳染性囊病二價(jià)疫苗，其特征在于，包含如權(quán)利要求1-4所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。
6.制備混合病毒樣顆粒的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，其表達(dá)載體含有流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml，流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA，或一個(gè)融合膜蛋白，其包含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述含傳染性囊病病毒 VP2蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的5’端的大致相同長(zhǎng)度的膜外域；用所述構(gòu)建的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體按比例同時(shí)感染昆蟲細(xì)胞，包裝出混合病毒樣顆粒，其表面上同時(shí)表達(dá)流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA和傳染性囊病病毒的表面抗原VP2蛋白。
7.如權(quán)利要求6制備混合病毒樣顆粒的方法，其特征在于，其中所述構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體還含有流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶NA，其包裝出混合病毒樣顆粒含有流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶NA。
8.如權(quán)利要求6或7制備混合病毒樣顆粒的方法，其特征在于，其中所述構(gòu)建昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體還含有流感病毒的核蛋白NP，其包裝出混合病毒樣顆粒含有流感病毒的核蛋白NP。
全文摘要
本發(fā)明提供混合病毒樣顆粒包含流感病毒的基質(zhì)蛋白M1，流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA，一個(gè)融合膜蛋白，其包含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；所述含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細(xì)胞凝集素HA的5’端的大致相同長(zhǎng)度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時(shí)表達(dá)流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA和傳染性囊病病毒的表面抗原VP2蛋白。本發(fā)明還提供禽流感和傳染性囊病二價(jià)疫苗，包含所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。本發(fā)明還提供制備混合病毒樣顆粒的方法。
文檔編號(hào)A61K39/295GK102373182SQ20101024867
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者劉大才, 曹永長(zhǎng), 薛春宜 申請(qǐng)人:中山大學(xué)