專利名稱：魚藤酮作為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增敏劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及線粒體呼吸鏈抑制劑魚藤酮在逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對靶向性抗腫 瘤藥物耐受的新用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病。江蘇省近幾年開展了以惡性腫瘤為主的全 人口死因回顧性調(diào)查，結(jié)果顯示男女性第1位死因均為惡性腫瘤，其死亡率占全部死因的 27. 41 %。資料顯示，2003年江蘇省城市地區(qū)位于惡性腫瘤死亡前4位的分別是肺癌、胃癌、 肝癌、食管癌；而農(nóng)村地區(qū)為肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明顯高于農(nóng) 村。尤其是通過分析1973至2004年幾種主要惡性腫瘤的死亡情況發(fā)現(xiàn)，肺癌死亡率大幅 上升，2004年肺癌死亡率是1973年的5. 65倍。由此可見，肺癌已經(jīng)成為我省惡性腫瘤數(shù)一 數(shù)二的“殺手”，嚴(yán)重威脅著我省人民的生存健康。為什么在短短的幾十年間，肺癌的發(fā)病率及死亡率有如此迅猛的發(fā)展趨勢？ 1 大樣品調(diào)查研究表明肺癌的主要危險(xiǎn)因素為吸煙和大氣污染，而近年來吸煙人數(shù)有增加的 趨勢，汽車尾氣和工業(yè)廢氣的大量排放，又加重了大氣環(huán)境污染的程度。因此，隨著我省經(jīng) 濟(jì)的發(fā)展，城市化、工業(yè)化進(jìn)程的加快，空氣污染將會(huì)越來越嚴(yán)重，這將不可避免地導(dǎo)致肺 癌死亡率進(jìn)一步增加。2:肺癌在早期時(shí)往往沒有明顯的癥狀，當(dāng)有癥狀被診斷出來時(shí)，常常 已經(jīng)是局部晚期或晚期無法手術(shù)切除的情形。一般而言，新診斷的肺癌僅約不到20%的病 人屬于早期可以有機(jī)會(huì)接受手術(shù)切除的病患。而另外80%的晚期肺癌病人則失去了外科手 術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)。3:到目前為止，對肺癌的治療，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治 療干預(yù)手段。臨床上，肺癌通常分為小細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌兩種類型，總的肺癌病例中，非小細(xì) 胞肺癌(包括肺鱗癌，肺腺癌)約占80%。因此針對非小細(xì)胞肺癌的治療研究是攻克肺癌 的一項(xiàng)極其重要的課題，引起了全世界醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。如上所述，雖然手術(shù)治療是治療非小細(xì)胞肺癌的重要手段，但對絕大部分晚期肺 癌病人來說手術(shù)治療并不能有效解決腫瘤轉(zhuǎn)移的問題。因此對于這些晚期或已經(jīng)有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn) 移的肺癌病人，全身性的化學(xué)治療是非小細(xì)胞肺癌多學(xué)科綜合治療的主要策略之一。尤其 是化療與手術(shù)、放射等療法綜合運(yùn)用能明顯防止癌腫轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，提高長期生存率。現(xiàn)在，非 小細(xì)胞肺癌化療已經(jīng)初步形成共識，通常采用順鉬加泰索帝、紫杉醇、健擇、諾維本等中的 一種。根據(jù)患者的具體情況，選擇不同的組合，可以達(dá)到提高療效，降低毒性反應(yīng)的目的，特 別是出現(xiàn)了一些極具前景的新型靶向藥物，其作用機(jī)制與傳統(tǒng)化療藥物不同。傳統(tǒng)化療藥 物屬于細(xì)胞毒性藥物，是通過毒性殺死腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)不可避免會(huì)傷害正常細(xì)胞。而靶向 藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，可以通過特異性作用于腫瘤生長的細(xì)胞信號途徑，抑制腫瘤細(xì)胞的 增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移，不良反應(yīng)輕，患者可以很好耐受。在這些靶向藥物中，TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體)越來越受到人們 的關(guān)注。TRAIL是由Wiley于1995年檢索EST時(shí)首次發(fā)現(xiàn)并克隆的，是一種II型糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子家族，與相應(yīng)受體結(jié)合后，可以快速誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。但與其它凋亡 誘導(dǎo)分子顯著不同的是，TRAIL主要?dú)D(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，而正常細(xì)胞可以逃逸它的殺 傷作用。體內(nèi)研究表明，TRAIL可以明顯抑制腫瘤生長，甚至徹底清除腫瘤。TRAIL的這種 腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷作用使該蛋白在抗腫瘤方面具有很強(qiáng)的開發(fā)價(jià)值與潛力。但是值得注 意的是，并非所有的腫瘤細(xì)胞對TRAIL都具有很強(qiáng)的敏感性。體外研究表明，有些腫瘤細(xì)胞 對TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用具有很強(qiáng)的耐受性。這可能與腫瘤細(xì)胞表面缺乏TRAIL受體(DR4， DR5)，或分布有假受體(DcRl，DcR2)，或過度表達(dá)一些抗凋亡蛋白如bcl_2，F(xiàn)LIP, survivin 有關(guān)。因此TRAIL的抗腫瘤作用因不同的腫瘤類型而異。研究表明，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對TRAIL有明顯的耐受性，但具體的機(jī)理目前并不 清楚。為了充分發(fā)揮TRAIL對腫瘤細(xì)胞的選擇殺傷作用，有必要尋找新的策略以逆轉(zhuǎn)非小 細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對TRAIL的敏感性，從而達(dá)到運(yùn)用TRAIL有效治療非小細(xì)胞肺癌的目的。魚藤酮(rotenone)是從天然植物中分離出來的化合物，其結(jié)構(gòu)見式1。該物質(zhì)能 與線粒體呼吸鏈復(fù)合物I結(jié)合，從而抑制線粒體氧化磷酸化、降低線粒體膜電位、導(dǎo)致細(xì)胞 發(fā)生損傷，該化學(xué)物質(zhì)是殺蟲劑的重要組成成分之一，能通過抑制昆蟲細(xì)胞線粒體功能殺 死昆蟲細(xì)胞。但有研究表明長期使用含該化合物的殺蟲劑使農(nóng)民易患帕金森氏病與老年癡 呆。進(jìn)一步研究表明，該物質(zhì)在田間作業(yè)，通過農(nóng)民長期吸入、吸收后能抑制神經(jīng)元細(xì)胞線式1但是近來也有研究表明，魚藤酮能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。 如魚藤酮能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞K562或Jurkat細(xì)胞凋亡，或誘導(dǎo)神經(jīng)瘤細(xì)胞SH SY-5Y細(xì)胞凋 亡，因而顯示了該物質(zhì)在抗腫瘤藥物開發(fā)上的應(yīng)用。由上述背景可知，魚藤酮能抑制腫瘤細(xì)胞，但該化合物本身也能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋 亡而產(chǎn)生諸多毒副作用，如何揚(yáng)長避短，充分發(fā)揮該化合物潛在的抗腫瘤效果是值得深入 研究的問題。遵循這樣的思路，我們發(fā)現(xiàn)低劑量的魚藤酮能增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對TRAIL 的敏感性，從而為TRAIL的聯(lián)合用藥抗腫瘤提供了一個(gè)新的侯選化合物。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對TRAIL的耐受性問題，本發(fā)明提供了魚藤酮化合物 的新用途，有效地解決了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對TRAIL的耐受性問題。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是魚藤酮化合物在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的
粒體功能，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。
4應(yīng)用。上述所說的應(yīng)用，具體可以是將魚藤酮與TRAIL制成治療非小細(xì)胞肺癌的組合 物。具體地，魚藤酮作為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增敏劑的應(yīng)用。本發(fā)明表明魚藤化合物與TRAIL的聯(lián)合用藥本身對正常細(xì)胞(HEK293)的無明顯 毒副作用，表明魚藤酮與TRAIL是一種新的可用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物組合。


圖1魚藤酮聯(lián)合TRAIL對A549細(xì)胞凋亡的影響；圖2魚藤酮聯(lián)合TRAIL對 NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響；圖3魚藤酮增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的A549細(xì)胞caspase 3激活；圖4 魚藤酮選擇性增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性；圖5魚藤酮上調(diào)A549細(xì)胞表面死 亡受體DR4與DR5 mRNA表達(dá)水平；圖6魚藤酮抑制A549細(xì)胞FLIP^與FLIPs的表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料A549、NCI-H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株均購自ATCC公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng) 液、胰酶購自美國Hyclone公司。MTT、PI、RNAase購自美國Sigma公司。魚藤酮購自美國 Sigma公司。Caspase 3檢測試劑盒購自美國Biovision公司。EGFP標(biāo)記的Annexin V由 本實(shí)驗(yàn)室自行制備獲得。實(shí)施例一魚藤酮對TRAIL誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)死亡的影響非小細(xì)胞 肺癌細(xì)胞A549或NCI-H460于DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 的濕潤無菌環(huán)境。細(xì)胞長至80%-90%融合時(shí)，用PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化。按細(xì)胞 量6X IO4/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁生長完全后，加入藥物分別為TRAIL 50ng/ml,TRAIL 100ng/ml，魚藤酮 10nM，TRAIL 50ng/ml+魚藤酮 10nM，TRAIL 100ng/ml+魚 藤酮 10nM，魚藤酮 ΙΟΟηΜ，TRAIL 50ng/ml+魚藤酮 ΙΟΟηΜ，TRAIL100ng/ml+魚藤酮 ΙΟΟηΜ， 魚藤酮 ΙΟΟΟηΜ，TRAIL 50ng/ml+魚藤酮 ΙΟΟΟηΜ，TRAIL100ng/ml+魚藤酮 ΙΟΟΟηΜ，魚藤酮 10 μ Μ, TRAIL 50ng/ml+ 魚藤酮 10 μ Μ, TRAIL100ng/ml+ 魚藤酮 10 μ Μ,每組 3 個(gè)孔(圖 1， 2)，細(xì)胞經(jīng)藥物處理12h后收集，用預(yù)冷PBS洗2遍，加入EGFP標(biāo)記的Armexin V(2yL),冰 上孵育20min，迅速加入PI (1 μ g/mL)，于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況，Annexin V(+)/ PI(-)為早期凋亡細(xì)胞。結(jié)果采用Armexin V/PI雙染法考察A549細(xì)胞對TRAIL的敏感性，發(fā)現(xiàn)在無魚 藤酮存在的情況下，TRAIL 50ng/ml或lOOng/ml能引起小部分A549細(xì)胞凋亡(圖1)，當(dāng) 加入魚藤酮濃度彡IOOnM時(shí)，對TRAIL誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡增效作用并不強(qiáng)，但當(dāng)加入魚 藤酮濃度> IOOnM時(shí)，可以明顯看出魚藤酮顯著增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡，如在 魚藤酮IOOOnM時(shí)，能將TRAIL 100ng/ml誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡由15. 3 %提高到26. 8 %，同樣 地，在魚藤酮10 μ M時(shí)，能將TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡由25. 3%提高到72. 5%，由此，魚藤酮 (IOOnM-IO μ Μ)能顯著性增強(qiáng)Α549細(xì)胞對TRAIL的敏感性。類似的結(jié)果在NCI-H460細(xì)胞 中也得到驗(yàn)證(見圖2)。實(shí)施例二TRAIL與魚藤酮對caspase 3水解酶活性的影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 于DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2的濕潤無菌環(huán)境。細(xì)胞長
5至80% -90%融合時(shí)，用PBS洗滌2次，0. 25%胰酶消化。按細(xì)胞量6 X IO4/孔接種于24孔 細(xì)胞培養(yǎng)板中。加入藥物處理，分別為對照組、TRAIL 100ng/ml, TRAIL lOOng/ml+魚藤酮 1 μ Μ，魚藤酮1 μ Μ，每組重復(fù)3個(gè)孔(圖3)。處理12h后，將細(xì)胞用胰酶消化后，加入FITC 標(biāo)記的DEVD. fmk 1-2 μ 1，于冰上孵育30min后，PBS洗2遍，流式細(xì)胞儀分析FITC熒光強(qiáng)度。結(jié)果caspase 3的激活是細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)，無論是死亡受體介導(dǎo)的，還是線 粒體通路所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，最終均體現(xiàn)在caspase 3的激活上，因此通過測量caspase 3 的活性可以作為細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。在本研究中，采用FITC標(biāo)記的caspase 3底物，與 細(xì)胞共孵育，該底物能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，遇激活的caspase 3時(shí)被酶切，釋放出 FITC，從而被流式細(xì)胞儀檢測到。結(jié)果與免疫熒光相符(圖3)，在單用TRAIL時(shí)，細(xì)胞內(nèi) caspasee3部分激活，而單用魚藤酮對caspase 3酶活性無太大影響，細(xì)胞內(nèi)caspase 3酶 激活不明顯，但是兩藥的聯(lián)用，細(xì)胞內(nèi)caspase 3明顯被激活。實(shí)施例三毒性實(shí)驗(yàn)HEK293與A549細(xì)胞分別于DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2的濕潤無菌環(huán)境。細(xì)胞長至80% -90%融合時(shí)，用PBS洗滌2次， 0.25%胰酶消化。按細(xì)胞量5X IO3/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。加入藥物TRAIL IOOng/ ml+魚藤酮1 μ M處理12h，每組重復(fù)3個(gè)孔(圖4)，處理12h后，收集細(xì)胞，按實(shí)施例一檢測 A549與HEK293細(xì)胞凋亡。結(jié)果為考察TRAIL與魚藤酮的聯(lián)用增效作用是否對正常細(xì)胞具有毒性副作用。 本研究比較TRAIL100ng/ml+魚藤酮(1 μ M)在正常細(xì)胞株(ΗΕΚ293)及腫瘤細(xì)胞株(Α549) 上的細(xì)胞毒性差異。結(jié)果見圖4，在明顯誘導(dǎo)Α549細(xì)胞凋亡的情況下，TRAIL+魚藤酮對正 常細(xì)胞無明顯的毒性，這些數(shù)據(jù)說明TRAIL+魚藤酮對腫瘤具有明顯的選擇性，是具有開發(fā) 前景的治療方案。實(shí)施例四魚藤酮對A549細(xì)胞DR4與DR5mRNA的影響1、細(xì)胞mRNA的提取所有物品 均提前用DEPC處理并滅菌。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549于DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2的濕潤無菌環(huán)境。細(xì)胞長至80% -90%融合時(shí)，用PBS洗滌2次， 0. 25%胰酶消化。按細(xì)胞量IX IO5/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。鋪細(xì)胞于6孔板，等細(xì)胞 長到80% -90%后，加藥(分別為魚藤酮1 μ M處理0，2，4，6h ；或魚藤酮0，10，100，IOOOnM 處理12h)，處理后收集細(xì)胞，PBS洗滌一次。加入lmLTRIZOL，用槍吹打至細(xì)胞完全溶解，室 溫放置5min。加入200 μ L的氯仿，振蕩15s后放置2_3min，2-8°C 12000g離心15min。吸 取上層，轉(zhuǎn)移到干凈印pendorf管中，加入500 μ L異丙醇，放置lOmin，2-8°C下12000g離心 lOmin，可見RNA沉淀。棄上清，加入ImL 75%乙醇洗滌沉淀，7500g離心5min，在空氣中晾 干RNA沉淀，加入30 μ LDEPC處理的DDW溶解。2.、逆轉(zhuǎn)錄PCR采用20 μ L逆轉(zhuǎn)錄體系，將提取的模板RNA約Iyg與5Xbuffer 4μ L, dNTP(10mM)2y L, oligo (dT) 18 (10 μ mol/L) 1 μ L, RNase Inhibitor lyL，逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L混勻后30°C水浴lOmin，42°C水浴30min，98°C水浴lOmin。取等量的cDNA做模板做 PCR 擴(kuò)增，采用 20yL PCR 反應(yīng)體系DDW 15. 2 μ L，10 X Taq buffer 2. 5 μ L, dNTP 2 μ L, Mg2+2 μ L，上游引物 1 μ L，下游引物 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，Taq polymeraseO. 3 μ L。PCR 條 件94°C熱變性4min后；94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸40s (循環(huán)數(shù)為20-45個(gè))； 最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色。
結(jié)果TRAIL死亡受體是決定腫瘤細(xì)胞對TRAIL是否有敏感性的重要因素，本研究 發(fā)現(xiàn)魚藤酮能時(shí)間依賴性與劑量依賴性地提高A549細(xì)胞內(nèi)DR4與DR5mRNA的表達(dá)量(圖 5)。實(shí)施例四魚藤酮對A549細(xì)胞FLIP蛋白表達(dá)的影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549于 DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2的濕潤無菌環(huán)境。細(xì)胞長至 80% -90%融合時(shí)，用PBS洗滌2次，0. 25%胰酶消化。按細(xì)胞量IX IO5/孔接種于6孔細(xì) 胞培養(yǎng)板中。鋪細(xì)胞于6孔板，等細(xì)胞長到80%-90%后，加藥(分別為魚藤酮0，10，100， 1000，IOOOOnM)，處理12h后收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞沉淀洗滌一次后，加入細(xì)胞裂解液混勻，冰上放置30min后， 12000rpm離心15min，吸取上清，通過考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，最后加入4X loading buffer沸水浴5min，樣品-20°C長期保存。按照分子克隆中的配方配制12% SDS-PAGE gel, 通過測定的樣品蛋白含量計(jì)算，保持各個(gè)樣品上樣量一致，上樣量為30-100yg。上層膠 采用80伏恒壓進(jìn)行壓縮，下層膠120伏電壓分離，然后使用半干法將PAGE膠中蛋白轉(zhuǎn)印 至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上，恒壓IOV電轉(zhuǎn)2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后麗春紅S(0. 5% ponceaus S in 1% acetic acid)對膜進(jìn)行染色，確定轉(zhuǎn)膜效率。配制5%的脫脂奶粉(PBST 配制)對膜進(jìn)行4°C封閉過夜或者室溫lh。包被結(jié)束后，用PBST將牛奶洗去，根據(jù)抗體說 明用PBST稀釋FLIP—抗(1 1000)，將膜一抗包被室溫孵育Ih或4°C過夜。將膜放置在 搖床，用PBST洗滌5次，每次5-lOmin。再包被二抗，將HRP (辣根過氧化物酶)標(biāo)記的二抗 1 2000稀釋(PBST配置的牛奶)，與膜共同孵育Ih后，同樣PBST洗滌5次，每次5-lOmin。 按照產(chǎn)品說明配制發(fā)光底物溶液滴加于PVDF膜上，室溫放置l-2min，用濾紙將多余發(fā)光液 吸干，將膜用保鮮膜包被后放入壓片夾移入暗房，取X光片置于膜上曝光l-5min后，沖洗膠 片，根據(jù)曝光條帶判斷蛋白的表達(dá)結(jié)果。結(jié)果FLIP是細(xì)胞內(nèi)重要的抗凋亡蛋白，分為？！^？^與FLIPs兩種形式。它們通過 與Caspase 8競爭結(jié)合蛋白，從而抑制細(xì)胞凋亡過程中死亡復(fù)合物(DISC)的形成，從而抑 制細(xì)胞凋亡。FLIP在很多腫瘤如肝癌、乳腺癌均為高表達(dá)，它的蛋白質(zhì)表達(dá)受諸多因素調(diào) 控，如泛素化、磷酸化等過程。在本研究中發(fā)現(xiàn)魚藤酮處理的A549細(xì)胞，其FLIPl與FLIPs 蛋白水平的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(圖6)，顯示魚藤酮可能是抑制了 FLIP的表達(dá)，從而 增強(qiáng)A549對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。
權(quán)利要求
魚藤酮作為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增敏劑的應(yīng)用。
2.魚藤酮在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種線粒體呼吸鏈抑制劑魚藤酮在逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對靶向性抗腫瘤藥物耐受的新用途。魚藤酮作為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增敏劑，能逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對靶向性抗腫瘤藥物耐受性。本發(fā)明表明魚藤化合物與TRAIL的聯(lián)合用藥本身對正常細(xì)胞無明顯毒副作用，是一種新的可用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物組合。
文檔編號A61K31/352GK101904837SQ20101024124
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月31日
發(fā)明者華子春, 施怡琳, 殷武 申請人:南京大學(xué)