專利名稱：一種錳配合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磁共振成像(MRI)技術(shù)領(lǐng)域，特指一種用于磁共振成像的成像劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
磁共振成像(MRI)技術(shù)一種無創(chuàng)性快速檢測腦腫瘤和血管的成像方法。磁共振成像具有安全、無創(chuàng)、無電離輻射、無放射性損傷、高時(shí)間分辨力及空間分辨力等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為臨床上診斷血管病變、顱內(nèi)腫瘤等的主要影像學(xué)檢查技術(shù)。自1983年使用Gd-DTPA進(jìn)行臨床試驗(yàn)以來，為提高成像劑的靈敏度和靶向性，降低其毒性，人們對(duì)MRI造影劑進(jìn)行了大量的研發(fā)(B.Jebasingh，V.Alexander.Inorg.Chem.，2005，449434-9443)。常用的成像劑為二乙三胺五乙酸釓(Gd-DTPA)和四乙酸四氮雜環(huán)十二烷(Gd-DOTA)。Gd-DTPA和Gd-DOTA為細(xì)胞外分布，不能通過正常的血腦屏障，其作用機(jī)制是改變局部組織的磁環(huán)境而間接增強(qiáng)。由于分子量小、半衰期短、體內(nèi)信號(hào)弱，造影時(shí)間短、滲透壓較高，常需加大劑量乃至多次注射，副作用較大(俞開潮，王國平，丁尚武等.波譜學(xué)雜志，2004，21(4)505-525)。為增加成像劑的親脂性，降低其滲透壓，提高對(duì)靶組織如肝臟的選擇性，Unger等人合成聚集有順磁性金屬螯合物Gd-DTPA，Mn-EDTA等的脂質(zhì)體成像劑(Unger E，Shen D K，F(xiàn)ritz T.InvestRadiol.，1994，29S168-169)。雖然連接大分子順磁性成像劑的水質(zhì)子的弛豫速較小分子成像劑有較大提高，但化合物存在穩(wěn)定性和生物相溶性等問題。低成本，生物相溶性的腫瘤靶向性大分子順磁性成像劑的研究仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。此外由于增進(jìn)磁共振成像內(nèi)部結(jié)構(gòu)的可見性的釓基造劑可造成腎源性系統(tǒng)纖維化(NSF)。FDA已要求小分子釓基成像劑生產(chǎn)商在其產(chǎn)品標(biāo)簽上增加“黑框”警告。超順磁性氧化鐵粒子(SPIO)是目前研究得較多的磁化率型成像劑，其磁矩遠(yuǎn)比其它順磁性物質(zhì)高，對(duì)鄰近組織中氫核的弛豫速率起明顯的加速作用，用作成像劑時(shí)所需劑量很小，但因其水溶性極小，只能采用勻漿或膠體的形式給藥。超小型超順磁性氧化鐵、單晶氧化鐵微聚體、脂質(zhì)體包裹的超順磁性氧化鐵等均屬于T2陰性造影劑，不符合人類對(duì)亮的、白的物體敏感的特性(1.Li Z，Wei L，GaoM Y.Adv.Mater.，2005，171001-1005；2.Hu F Q，Wei L，ZhouZ.Adv.Mater.，2006，182553-2556)。與此同時(shí)，SPIO外包被與其他活性物質(zhì)的連接也受到較多限制。通過降低成像劑的用量來降低其對(duì)生物體的毒性已成為人們研究成像劑的共識(shí)。隨著MRI新成像技術(shù)(如MR血管造影、灌注MR、擴(kuò)散加權(quán)MRI等)的迅速發(fā)展及其在臨床診斷中應(yīng)用的普及，MRI成像劑的研究和開發(fā)面臨更大的挑戰(zhàn)，用于腫瘤診斷的成像劑也越來越受到重視。研制低毒性，高弛豫率，靶向性強(qiáng)，多重作用，體內(nèi)穩(wěn)定的造影劑是未來的發(fā)展趨勢。
錳為生物體內(nèi)存在的微量元素，順磁性錳配合物能特異性聚集在腫瘤細(xì)胞上，成為新型腫瘤靶向性分子(陳秋云，黃娟，高靜，郭文杰，“具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物及其制備方法”，中國發(fā)明專利號(hào)200710192228.5)。進(jìn)一步研究我們發(fā)現(xiàn)螯合型錳配合物在體類能顯著提高腫瘤細(xì)胞的成像效果，可作為新型腫瘤靶向型具有治療作用的磁共振成像造影劑。具有腫瘤治療作用的磁共振成像造影劑未見報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備新型磁共振成像劑的方法。新型磁共振成像劑成分為二氯N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺合錳螯合物。試驗(yàn)結(jié)果顯示能顯著提高體內(nèi)肝癌細(xì)胞MRI成像的特性。本發(fā)明的成像劑可通過腹腔注射或靜脈注射。該成像劑可用于腫瘤的體外和體內(nèi)磁共振成像。也可用于區(qū)別正常組織和腫瘤細(xì)胞的磁共振成像劑。這是首次報(bào)道的具有治療效果的多功能成像劑，與臨床運(yùn)用的單一成像功能的成像劑不同。
一種錳配合物，為二氯N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺合錳，分子式C17H21Cl2MnN3O2，結(jié)構(gòu)如式1
式1 式1簡寫為LMnCl2，其中L代表N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺，其結(jié)構(gòu)式見式2
式2 制備上述所說錳配合物的方法是 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶于水溶液中，控制溫度在20-40℃；加入氯化胺為催化劑，氯化銨與MnCl2的摩爾比為0.2∶1，最佳反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間1-4小時(shí)，最佳反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。
上述錳配合物肝癌體內(nèi)磁共振成像方面的運(yùn)用，與不加錳配合物的空白水溶液相比(見圖1)，配合物能顯著提高腫瘤診斷效果，說明配合物具有磁共振成像功能和腫瘤靶向性，可用作腫瘤磁共振成像造影劑。目前臨床運(yùn)用的磁共振成像劑主要為釓基造(Gd-DTPA)，增進(jìn)磁共振成像內(nèi)部結(jié)構(gòu)的可見性的釓基造劑可造成腎源性系統(tǒng)纖維化(NSF)。FDA已要求小分子釓基成像劑生產(chǎn)商在其產(chǎn)品標(biāo)簽上增加“黑框”警告。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明多齒配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺錳配合物具有順磁性，一次注射0.5ml濃度為5mg/ml的配合物水溶液在體類能顯著提高腫瘤細(xì)胞的磁共振成像效果。錳配合物在90分鐘內(nèi)能持續(xù)增強(qiáng)腫瘤部位的成像效果，說明具有良好的穩(wěn)定性和腫瘤靶向性。由于用量低，錳為生物體內(nèi)存在的微量元素，由于配合物還具有良好的抗腫瘤活性，所以配合物可作為新型低毒性多功能腫瘤靶向型磁共振成像造影劑。這是首次報(bào)道的具有治療效果的多功能成像劑，與臨床運(yùn)用的單一成像功能的成像劑不同。



圖1錳配合物對(duì)大鼠體內(nèi)腫瘤磁共振成像的影響。
(a)空白；(b)注射后30分鐘；(c)，注射后60分鐘；(d)注射后90分鐘
具體實(shí)施例方式 1試劑和原料 實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純，除特別注明外，未經(jīng)進(jìn)一步處理。元素分析用Carlo-Erba-1106型元素分析儀測定，紅外光譜用Fr-IR 169(固體用KBr壓片)。
抗腫瘤試驗(yàn)試劑如下(1)RPMI 1640培養(yǎng)基(RPMI 1640+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO3 2.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/l)。(2)高糖DMEM培養(yǎng)基(DMEM+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO3 2.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/l)。(3)MTT(美國Amresco公司產(chǎn)品)。
2、錳配合物的合成 實(shí)施例1(最佳反應(yīng)條件舉例) 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶于水溶液中，控制在30℃；加入氯化胺(0.1mol)為催化劑，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。Yield，63％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析實(shí)測值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.計(jì)算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 實(shí)施例2 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比2∶1溶于水溶液中，控制在20℃；加入氯化胺(0.1mol)為催化劑，反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。Yield25％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析實(shí)測值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.計(jì)算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 實(shí)施例3 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶于水溶液中，控制在40℃；加入氯化胺(0.1mol)為催化劑，反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。Yield45％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析實(shí)測值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.計(jì)算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 實(shí)施例4 將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶于水溶液中，控制在20℃；加入氯化胺(0.1mol)為催化劑，反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜柱層析純化(展開劑為四氫呋喃∶石油醚＝3∶2)，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物[LMnCl2]。Yield55％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析實(shí)測值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.計(jì)算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 實(shí)施例5抗腫瘤活性測定 以實(shí)施例1得到的配合物為受試化合物 篩選的細(xì)胞株有人癌細(xì)胞株(HepG2，U251)(由江蘇大學(xué)藥學(xué)院提供)。測定采用溴化四氮唑藍(lán)(MTT)法。活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性溴化四氮唑藍(lán)還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值。
操作步驟如下 3.1.1接種取處于指數(shù)生長期，狀態(tài)良好的細(xì)胞一瓶，加入適量胰蛋白酶 消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，用含12％小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞密度調(diào)整稀釋至2.2*104/ml.取細(xì)胞懸液接種于96孔板上，180ul/孔(含腫瘤細(xì)胞4000/孔)。
3.1.2培養(yǎng)將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入恒溫CO2培養(yǎng)箱中，在37℃，5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
3.1.3加藥受試化合物先用DMSO或超純水配制成0.1M濃度，再作4個(gè)稀釋度，濃度依次為10-4M，10-5M，10-6M，10-7M。加入受試化合物，20ul/孔，培養(yǎng)48小時(shí)。每組設(shè)3個(gè)平行孔，并重復(fù)3次。
3.1.4染色 3.1.4.1將MTT加入96孔板(貼壁細(xì)胞)中，20ul/孔，置于培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，吸棄孔內(nèi)上清液，加入DMSO100ul/孔，置平板搖床上震蕩5分鐘。
3.1.4.2將MTT加入96孔板中(懸浮細(xì)胞)，20ul/孔，置于培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，再加入20％SDS 50ul/孔，置于培養(yǎng)箱中過夜。
3.1.5測定酶標(biāo)儀設(shè)定波長為570nm，參考波長為630nm，測定96孔板每孔吸光值，記錄結(jié)果并計(jì)算細(xì)胞抑制率，以判斷受試藥物的抗腫瘤活性。
3.3數(shù)據(jù)處理 3.3.1細(xì)胞抑制率的計(jì)算 抑制率＝(對(duì)照組平均OD值-給藥組平均OD值)/對(duì)照組平均OD值×100％ IC50的計(jì)算根據(jù)中國藥科大學(xué)新藥篩選中心提供的IC50軟件計(jì)算所得。
MTT法測試結(jié)果示于表1。
表1錳配合物對(duì)癌細(xì)胞抑制作用MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
錳配合物[LMnCl]對(duì)種癌細(xì)胞U251半數(shù)抑制率需要的化合物濃度IC50為4.5umol/L，錳配合物[LMnCl2]癌細(xì)胞半數(shù)抑制率需要的化合物濃度為IC50為在12umol/L。而MnCl2在小于300umol/L對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長沒有抑制作用。這說明本發(fā)明的錳配合物具有良好的抗腫瘤活性，可作為抗癌藥用先導(dǎo)物。
實(shí)施例6腫瘤體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn) 以實(shí)施例1得到的錳配合物為受試化合物 腫瘤體內(nèi)磁共振成像實(shí)驗(yàn)用西門子3.0TMR成像儀測定。將肝癌細(xì)胞HepG-2接種于體重170-200克的腋下。接種腫瘤5天后的大鼠用于成像實(shí)驗(yàn)。核磁共振成像采用multislice-multiecho T1-weighted spin-echo sequence成像方法，掃描參數(shù)為TR＝800ms、TE＝11.4ms，影像切片厚度1mm。每一個(gè)動(dòng)物首先在注射探針前作一次腫瘤掃描，然后在靜脈注射后每隔30分鐘掃描一次。腹腔靜脈注射方式，一次注射0.5ml濃度為5mg/ml成像劑的水溶液。成像結(jié)果示于圖1。
圖1數(shù)據(jù)顯示與不含錳配合物的空白水溶液相比，錳配合物顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的磁共振成像清晰度。目前臨床運(yùn)用的磁共振成像劑主要為釓基造(Gd-DTPA)，增進(jìn)磁共振成像內(nèi)部結(jié)構(gòu)的可見性的釓基造劑可造成腎源性系統(tǒng)纖維化(NSF)。FDA已要求小分子釓基成像劑生產(chǎn)商在其產(chǎn)品標(biāo)簽上增加“黑框”警告。本發(fā)明數(shù)據(jù)錳配合物一次注射0.5ml濃度為5mg/ml在體類能顯著提高腫瘤細(xì)胞的成像效果，由于用量低，錳為生物體內(nèi)存在的微量元素，所以配合物可作為新型低毒性多功能腫瘤靶向型磁共振成像造影劑。
權(quán)利要求
1.一種錳配合物，其特征在于所述錳配合物具有如下結(jié)構(gòu)
2.權(quán)利要求1所述錳配合物的制備方法，具體為將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶于水溶液中，以氯化銨為催化劑進(jìn)行合成，氯化銨與MnCl2的摩爾比為0.2∶1，反應(yīng)溫度為20-40℃，反應(yīng)時(shí)間1-4小時(shí)，產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜柱層析純化，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物。
3.權(quán)利要求1所述錳配合物的制備方法，其特征在于反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)。
4.權(quán)利要求1所述錳配合物的在制備抗腫瘤藥物中以及在制備腫瘤磁共振成像造影劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述錳配合物作為腫瘤磁共振成像造影劑使用的量為一次使用0.5ml濃度為5mg/ml的錳配合物水溶液。
全文摘要
一種錳配合物及其制備方法和用途，涉及磁共振成像(MRI)技術(shù)領(lǐng)域，所述錳配合物為二氯N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺合錳，分子式C17H21Cl2MnN3O2，所述錳配合物的制備方法，具體為將配體N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩爾比1∶1溶于水溶液中，控制在20-40℃；以氯化銨為催化劑進(jìn)行合成，氯化銨與MnCl2的摩爾比為0.2∶1，反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間1-4小時(shí)，產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜柱層析純化，濃縮去溶液，獲得淺黃色錳配合物。上述錳配合物肝癌體內(nèi)磁共振成像方面的運(yùn)用，與不加錳配合物的空白水溶液相比，配合物能顯著提高腫瘤診斷效果，說明配合物具有磁共振成像功能和腫瘤靶向性，可用作腫瘤磁共振成像造影劑。
文檔編號(hào)A61K31/555GK101812092SQ20101015881
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者陳秋云 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)