專利名稱：促生長素抑制素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體而言涉及自然界中并非天然存在的生物合成肽、編碼該肽的多核苷酸、制備這種肽的方法以及這種肽的用途。本發(fā)明的肽可以用于醫(yī)藥領(lǐng)域中，例如治療激素紊亂、癌癥和出血紊亂。此外，本發(fā)明總體上涉及穩(wěn)定性增強(qiáng)的修飾形式的肽、制造這種修飾肽的方法以及這種修飾肽的用途。具體而言，本發(fā)明涉及可以使用諸如聚乙二醇之類的聚合物來進(jìn)行化學(xué)修飾的生物合成肽、以及所述肽或修飾形式的肽在治療肢端肥大癥、腫瘤(包括消化道激素分泌腫瘤)以及胃腸出血中的用途。
背景技術(shù)：
肢端肥大癥是一種致殘性的激素紊亂，其表征為頭、手和腳的骨骼以及軟組織增大。其導(dǎo)致過早死亡。每年，肢端肥大癥的發(fā)病率為每百萬人口 3例?；疾÷蕿槊堪偃f人口 60例。由于這種疾病的特征的發(fā)展具有潛伏性，所以在臨床癥狀發(fā)病后在進(jìn)行診斷時通常會耽擱7到10年。肢端肥大癥是由于垂體腺體過多地分泌生長激素(GH)所導(dǎo)致的(通常由于垂體腺瘤的存在)。垂體生長激素細(xì)胞的增殖導(dǎo)致生長激素分泌達(dá)到異常高的水平， 這會導(dǎo)致肢端肥大癥的獨(dú)特的臨床特征。生長激素被分泌為191-氨基酸、4-螺旋束蛋白和更少豐富的176-氨基酸形式。 生長激素通過穿越垂體門靜脈循環(huán)的下丘腦釋放激素和下丘腦抑制激素在下丘腦的控制之下以脈沖的方式進(jìn)入循環(huán)。然后，其直接作用于特定的生長激素細(xì)胞表面受體。生長激素⑴誘導(dǎo)了外周胰島素樣生長因子I(IGF-I)的合成；(ii)誘導(dǎo)了循環(huán)(內(nèi)分泌)和局部(自分泌和旁分泌)IGF-I誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖；以及(iii)抑制了細(xì)胞凋亡。肢端肥大癥的過多的發(fā)病和死亡是GH和IGF-I水平的持續(xù)升高的結(jié)果。對這兩種激素的水平進(jìn)行細(xì)致的終身的控制可以改善患者的健康并恢復(fù)正常的平均壽命。在針對肢端肥大癥的當(dāng)前治療中，通常實(shí)施手術(shù)來除去分泌生長激素的微腺瘤。 對于術(shù)后復(fù)發(fā)或持續(xù)的腫瘤而言，在抵抗醫(yī)學(xué)治療或?qū)︶t(yī)學(xué)治療不耐受的患者中，通常保留放射療法。此外，當(dāng)前治療包括給藥天然激素(生長激素抑制素)的化學(xué)合成類似物，其抑制了生長激素的分泌。奧曲肽乙酸鹽(購自Novartis Wiarmaceuticals，商品名為 Sandostatin . )為一種這樣的類似物。在過去的二十年中，奧曲肽乙酸鹽成為有效的且臨床認(rèn)可的治療方法來治療肢端肥大癥。奧曲肽乙酸鹽(系統(tǒng)IUPAC名為J4RJS，10S， 13R，16S，19R)-10- (4-氨基丁基)-19-[ [ (2R) -2-氨基-3-苯基-丙?；鵠氨基]-16-芐基-N-[ (2R, 3R)-1，3- 二羥丁 -2-基]-7-(1-羥乙基)-13- (1H-吲哚-3-基甲基)-6，9，12， 15，18-五氧-1，2- 二噻-5，8，11，14，17-吡咯環(huán)糊精_4_甲酰胺))為通過固相化學(xué)合成方法產(chǎn)生的八肽(Bauer et al.，(1982) Life Sciences，Vol. 31，pp. 1133-1140)?；瘜W(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽的氨基酸序列為(D) Phe-c [ (L) Cys- (L) Phe- (D) Trp- (L) Lys- (L) Thr- (L) Cys] - (L) Thr (ol)12345678
另一種化學(xué)合成的生長激素抑制素類似物為蘭樂肽乙酸鹽(系統(tǒng)IUPAC名為 (4S, 7S，10S，13R，16S，19S)-10- (4-氨基丁基)-19- [ [ (2R) -2-氨基-3-萘 _2_ 基-丙?；鵠 氨基]-N-[(1S，2R)-1-氨基甲酰基-2-羥-丙基]-16-[(4-羥苯基)甲基]-13_(1H-吲哚-3-基甲基)-6,9,12，15，18-五氧-7-丙-2-基 _1，2- 二噻-5,8,11，14，17-吡咯環(huán)糊精-4-甲酰胺))。其購自Ipsen Pharmaceuticals，商品名為Somatuline LA⑧。蘭樂肽乙酸鹽的氨基酸序列為β -萘基-(D)丙氨酸-Cys-Tyr- (D) Trp-Lys-Val-Cys-Thr-CONH21 2 3 4 5 6 7 8顯然，蘭樂肽乙酸鹽在位置1處包含(D)丙氨酸，在位置4處包含(D)色氨酸。此外，它還具有交聯(lián)兩個半胱氨酸殘基的二硫鍵。在結(jié)構(gòu)上，蘭樂肽乙酸鹽與奧曲肽乙酸鹽非常接近，蘭樂肽乙酸鹽表現(xiàn)出與奧曲肽乙酸鹽非常相似的生長激素抑制素受體結(jié)合概況， 并且蘭樂肽乙酸鹽與奧曲肽乙酸鹽具有相同的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥(WedibeckenG. et al.，(2003) Nature Reviews, Vol. 2，pp.999-1017)。已知，天然激素生長激素抑制素在其構(gòu)造中具有環(huán)狀部分，這是因?yàn)榇嬖谟醒由斓姆雌叫笑缕?，而該反平行β片是由于在β轉(zhuǎn)角的轉(zhuǎn)彎處存在有Trp和Lys殘基的原因。 在奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽中，引入的D-Trp4以相同的方式來穩(wěn)定藥效基團(tuán)β轉(zhuǎn)角。此外，普遍已知的是，通過形成二硫鍵橋而環(huán)化的肽使得蛋白質(zhì)和肽(包括生長激素抑制素)具有改善的化學(xué)和代謝穩(wěn)定性。由于這個原因，將橋接單元Cys2-S-S-Cys7 以化學(xué)方式引入到化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽中。在奧曲肽乙酸鹽中，所述的橋接單元使得所述肽的代謝穩(wěn)定性提高3倍(Bauer et al. , (1982)Life Sciences, Vol. 31, pp. 1133-1140 ；Cai et al. , (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) , Vol. 83, pp.1896-1900)?？傊迦雰蓚€D-氨基酸并形成二硫鍵橋會增加這種化學(xué)合成8氨基酸肽的血漿半衰期。在奧曲肽乙酸鹽中，增加的半衰期由幾分鐘至1.5小時(Harris AG. , (1994) Somatostatin and somatostatin analogues !pharmacokinetics and pharmacodynamic effects. Gut, Vol. 35, pp. 1-4)。奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽以高的親和性與生長激素抑制素受體亞型2 (SST2) 和生長激素抑制素受體亞型5 (SSI^)結(jié)合。它們以適度的親和性與生長激素抑制素受體亞型3結(jié)合。它們不與生長激素抑制素受體亞型1或生長激素抑制素受體亞型4結(jié)合。此外， 奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽還顯示與D2多巴胺受體結(jié)合。已知，在奧曲肽乙酸鹽的結(jié)構(gòu)中，唯有Wie3-Trp4-LyS5-Thr6對其生物學(xué)活性是必需的。當(dāng)奧曲肽乙酸鹽與生長激素抑制素受體結(jié)合時，其向垂體發(fā)出了信號，從而抑制生長激素的分泌以及生長激素細(xì)胞的增殖，并且奧曲肽乙酸鹽在肝臟上阻斷了 IGF-I的合成。作為針對SST2和SST5受體的生長激素抑制素配基，奧曲肽乙酸鹽抑制了 GH和IGF-I 的水平，限制了腫瘤的生長，并阻止了 GH與其受體間的、肝介導(dǎo)的結(jié)合和作用。作為GH受體拮抗劑，奧曲肽乙酸鹽阻止了 GH受體的信號傳導(dǎo)，該信號傳導(dǎo)使得外周血中的IGF-I的水平降低。生長激素分泌的抑制(響應(yīng)于對患有肢端肥大癥的患者給藥奧曲肽乙酸鹽)取決于生長激素抑制素受體亞型的可用性。已經(jīng)證明，在試驗(yàn)?zāi)[瘤模型中，奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽的直接抗腫瘤活性是通過腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的生長激素抑制素受體而介導(dǎo)的。這些抗增殖作用是由于阻斷了細(xì)胞分化以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)果?；瘜W(xué)合成的生長激素抑制素類似物與生長激素抑制素受體的結(jié)合引發(fā)了特定的信號傳導(dǎo)途徑。在這種方式中，每一種生長激素抑制素受體亞型都可以介導(dǎo)不同的生物學(xué)作用。介導(dǎo)這些機(jī)制的受體亞型為 SST1、SST2、SST4和SST5。雖然許多人類腫瘤表達(dá)出多于一種的生長激素抑制素受體亞型， 但是SST2是主要的。生長激素抑制素類似物奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽對SST2受體具有高的親和性。此外，生長激素抑制素及其合成類似物還發(fā)揮了多種間接的抗腫瘤作用。這些作用包括抑制會驅(qū)使腫瘤生長的生長因子和激素的釋放。由這些生長激素抑制素類似物的間接作用所導(dǎo)致的腫瘤生長的降低包括抑制生長因子和激素(包括IGF-I和生長激素)的合成和分泌(并由此減小所述的作用)。生長激素抑制素類似物通過中樞和外周機(jī)制抑制了生長激素-IGF-I軸。SST2和SST5是介導(dǎo)對垂體生長激素釋放的抑制作用的主要受體亞型。此外，生長激素抑制素類似物還通過SST2介導(dǎo)的酪氨酸磷酸酶(其導(dǎo)致STAI^b的脫磷酸以及IGF-I基因轉(zhuǎn)錄的減少)活性來抑制肝生長激素誘導(dǎo)的IGF-I的產(chǎn)生(Weclcbecker， G.et al.，(2003)Nature Reviews, Vol. 2,pp.999-1017 ；Susini C&Buscail L, (2006)Ann of Oncology Vol. 17，pp.1733—1742)。生長激素抑制素受體亞型的可用性轉(zhuǎn)而預(yù)示了奧曲肽乙酸鹽療法對患者血液中血清生長激素和IGF-I濃度的長期作用。使用300-600微克/天的皮下劑量見到了血清生長激素和IGF-I的最大程度的抑制。最初，以皮下注射的方式每天至少3次給予患者奧曲肽乙酸鹽(因?yàn)槠浒胨テ趦H為1. 5h)，并持續(xù)幾個月的時間，以便將生長激素的水平降至正常水平。一旦過量產(chǎn)生的生長激素降低至正常水平，患者通常被轉(zhuǎn)為(經(jīng)過幾個星期的時間)基于緩釋聚合物的絡(luò)合物集庫(cbpot)制備物(例如Sandostatin . 長效)。這種制備物通過深度肌內(nèi)注射到臀部肌肉中來進(jìn)行給予；但是不能給予到三角肌中，這是因?yàn)榕c大塊的臀部肌肉相比，善寧(Sandostatin)在所述的肌肉中會產(chǎn)生過度的疼痛。奧曲肽乙酸鹽由基于這種聚合物的緩釋集庫中的緩慢釋放意味著，與每周一次(如果通過無痛皮下注射給予)相比，所述聚合物集庫通常可以每兩周給予一次(伴有疼痛)。集庫制備物(S卩，長效釋放奧曲肽乙酸鹽-購自Sandostatin LAR. )可以每14 天注射給予。這些制備物可以保持有效的奧曲肽乙酸鹽水平。報(bào)告表明，跟蹤了 9年、同時使用奧曲肽乙酸鹽進(jìn)行治療的80%的這些患者，其生長激素的水平升高低于2. 5μ g/升， 而IGF-I的水平是正常的。Eugonadism儲存在患有肢端肥大癥的三分之二的患者(患有性腺機(jī)能減退)中(S. Farooqi et al. (1999)Pituitary, Vol. 2,pp. 79-88 ；Α. N. Paisley and PJ. Trainer, (2003)Current opinion in Pharmacology, Vol. 3, pp. 672-677 ；S. Melmed. (2006)New England Journal of Medicine, Vol. 355，pp.2558—2573)。奧曲肽乙酸鹽的效力的決定因素包括治療前生長激素的水平、大量的腫瘤SST2 和SST5表達(dá)的存在或缺乏、藥品的劑量、用于評估狀態(tài)的生物化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)以及患者對治療的依從性。雖然50%的患者都發(fā)生了腫塊的收縮，但是如果終止使用奧曲肽乙酸鹽進(jìn)行治療， 則腫塊還會逆轉(zhuǎn)。此外，不愿意接受全外科切除手術(shù)的大腺瘤減負(fù)荷手術(shù)會增加隨后奧曲肽乙酸鹽治療的效力。接受了所述藥品的多于80%的患者報(bào)告癥狀有所改善，所述的癥狀包括頭疼和外周軟組織腫脹。腫瘤收縮與生物化學(xué)控制不必同時發(fā)生。因此，由于生長激素的水平保持較高，所以在未能改變對GH和IGF-I水平進(jìn)行生物化學(xué)控制的手術(shù)之后以及在放射療法之后，通常給藥奧曲肽乙酸鹽。使用奧曲肽乙酸鹽的基本醫(yī)藥治療是有效且安全的。由于不管患者是否經(jīng)歷了手術(shù)或輻射都可以取得與給藥的長效藥品等效的生物化學(xué)應(yīng)答，所以可以對患有⑴不具有中樞壓迫作用的跡象的外鞍區(qū)大腫瘤、(ii)太虛弱以至于不能進(jìn)行手術(shù)的那些患者以及(iii)謝絕手術(shù)的那些患者提供基本的醫(yī)藥治療。此外，奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽還可以用于治療與消化道有關(guān)的良性腫瘤以及轉(zhuǎn)移性良性腫瘤。估計(jì)每年胃腸良性腫瘤的總體發(fā)病率為8400萬人。胃腸良性腫瘤包含90%的所有的良性腫瘤。使用奧曲肽乙酸鹽進(jìn)行治療會改善患有良性綜合癥的50-80% 患者的癥狀和生命品質(zhì)。此外，奧曲肽乙酸鹽可以停止腫瘤的發(fā)展。此外，已經(jīng)顯示奧曲肽乙酸鹽在治療方法上能夠有效地治療患有分泌血管活性腸肽的腫瘤(VIPomas)患者的腹瀉，并且奧曲肽乙酸鹽已經(jīng)用于治療由其他原因引起的嚴(yán)重的頑固性腹瀉。在毒理學(xué)中，奧曲肽乙酸鹽還用于治療在過量使用磺酰脲類藥物之后長期復(fù)發(fā)的低血糖癥，并且已經(jīng)用于患有胰島細(xì)胞增殖癥的嬰兒中以幫助降低胰島素的過多分泌。在患有疑似食管血管曲張的患者中，可以給予奧曲肽乙酸鹽以幫助減少出血。此外，奧曲肽乙酸鹽可以用于治療伴有慢性胰腺炎所導(dǎo)致的疼痛的患者，治療胸腺贅生物以及由糖尿病所導(dǎo)致的眼病。蘭樂肽乙酸鹽與奧曲肽乙酸鹽具有相同的治療適應(yīng)癥。需要規(guī)律地使用許多年的基于所有小分子肽的醫(yī)藥(例如奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽)的主要實(shí)踐缺點(diǎn)是缺乏成本有效的大規(guī)模的制造方法來將它們制造成為全世界使用的藥物醫(yī)藥。在當(dāng)前，采用化學(xué)肽合成來制造天然形成的以及基因工程的肽，但是這種方法是非常昂貴的。結(jié)果，奧曲肽乙酸鹽在患者中的臨床應(yīng)用達(dá)到用不起的昂貴程度。在患有肢端肥大癥的患者中，在UK治療單個患者的費(fèi)用為大約￡16，000/年。當(dāng)奧曲肽乙酸鹽用于患有惡性腫瘤(malignant carcinoid tumour)的患者中時，在UK治療單個患者的費(fèi)用為大約￡32，000/年。工業(yè)制備作為醫(yī)藥的肽的主要障礙是經(jīng)濟(jì)型的大規(guī)模制備。在奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽的制造中，需要逐步式的固相化學(xué)合成，然后形成分子內(nèi)的二硫鍵。在分子內(nèi)形成二硫鍵以便在D-Trp存在下將所述肽的代謝穩(wěn)定性提高3倍是主要的問題。此外，在化學(xué)合成的過程中還需要對側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)。這些技術(shù)問題導(dǎo)致產(chǎn)量低至14%。固相合成奧曲肽乙酸鹽的其他意想不到的困難包括(i)C-末端Cys殘基的外消旋作用；(ii)所述肽的無效組裝；(iii)有害的副反應(yīng)；(iv)殘基上無效的二硫鍵的形成；(ν)在二硫鍵形成的過程中D-Trp的修飾；(vi)通過氨解作用而形成的不完全的及無效的肽殘基裂解；(vii)在片段偶聯(lián)過程中的外消旋作用；以及(viii)復(fù)雜的純化過程。此外，當(dāng)(a)L-Phe需要被 D-Phe所替代時；(b) L-Trp需要被D-Trp所替代時；(c)需要線性肽進(jìn)行環(huán)化以創(chuàng)建二硫鍵、從而增加線性肽的穩(wěn)定性時，基于化學(xué)肽的合成的費(fèi)用大量增加。蘭樂肽乙酸鹽的固相合成也存在相似的意想不到的困難。因此，可選擇地，需要更經(jīng)濟(jì)且更有效的合成小肽(例如奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽)的方法。在這一方面中，通常使用細(xì)菌和酵母菌中的重組DNA方法。此外，如果顯示糖基化在蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性中不起作用，則在常規(guī)使用的宿主(E.coli)中實(shí)施蛋白質(zhì)的制備具有相當(dāng)大的成本和制造益處。已經(jīng)通過所述的技術(shù)在E.coli中制備了許多重組蛋白質(zhì)。然而，所述的系統(tǒng)使用重組DNA技術(shù)提供了高的蛋白質(zhì)產(chǎn)率，但是對于極小的天然形成的肽而言，問題在于它們必須作為較大的融合蛋白質(zhì)的一部分來制備。因此，天然形成的肽的基因與較大的載體蛋白質(zhì)的基因相連，然后所述的融合蛋白質(zhì)在諸如E. coli之類的宿主細(xì)胞中作為單個的大型蛋白質(zhì)表達(dá)。在合成蛋白質(zhì)之后，所關(guān)注的肽接著必須由所述的融合伴侶上切除。事實(shí)上，該方法的主要問題在于這種極小肽非常容易被在大多數(shù)微生物的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的酶而形成蛋白質(zhì)降解(這是因?yàn)檫@種極小的尺寸阻止了它們形成高級的三級結(jié)構(gòu))。因此，小肽通常在制備它們的宿主細(xì)胞中并且在它們可以由細(xì)胞的其他細(xì)胞質(zhì)成分中成功分離之前被快速降解。此外，其他的問題在于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多異源蛋白質(zhì)(即，并非宿主細(xì)胞中天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì))會干擾細(xì)菌/酵母菌的生長，這是由于所述宿主細(xì)胞中制備的大量的異源蛋白質(zhì)所導(dǎo)致的毒性作用的原因。此外，這些外源肽產(chǎn)物在所述的宿主細(xì)胞中通常是不穩(wěn)定的。 這意味著當(dāng)所述的肽作為融合蛋白質(zhì)的一部分在微生物中表達(dá)時需要更多的努力來穩(wěn)定所述肽的表達(dá)。這些問題在需要在微生物系統(tǒng)中表達(dá)極短的肽鏈時、甚至在所關(guān)注的肽序列作為較大融合蛋白質(zhì)的一部分進(jìn)行表達(dá)時是特別相關(guān)的。即使使用重組DNA技術(shù)來進(jìn)行重組肽的制備可以在較大的范圍內(nèi)取得并且可以使得這種制備是經(jīng)濟(jì)的，但是制備成本有效的醫(yī)藥的問題由于由細(xì)菌/酵母菌裂解液中、 然后由所述的融合蛋白質(zhì)中分離和純化極小肽的高成本而復(fù)雜化。對于由細(xì)菌或酵母菌中制備肽而言，這些下游加工步驟通常導(dǎo)致了大量的額外的制備成本。例如，由細(xì)菌或酵母菌細(xì)胞中初始回收所述的肽可能需要多個不同的加工步驟，包括細(xì)胞的崩解和裂解；由崩解的和裂解的細(xì)胞中分離包含體(即，聚集的，并由此形成不可溶的蛋白質(zhì))；使分裂的包含體溶解以獲得可溶的融合蛋白質(zhì)；以及融合蛋白質(zhì)的裂解，然后由載體蛋白質(zhì)上分離所述的肽。因此，理想的是制備極小的重組肽的所有方面都得到改善和優(yōu)化，從而使大規(guī)模的成本有效的制備成為現(xiàn)實(shí)。此外，對于基于肽的醫(yī)藥，問題還在于取得有效的藥品傳遞。在研發(fā)用于肽的控釋藥品傳遞系統(tǒng)中當(dāng)使用基于聚合物的基質(zhì)時重要且未充分解決的問題之一是在所述肽被引入到基于生物降解的聚合物的基質(zhì)中之后該肽的穩(wěn)定性。高度酸性的微環(huán)境(即， PHI. 5)通常通過聚(乳酸)和聚(乳酸-co-乙醇酸)聚合物(通常在微球體中使用)的降解而在包含所述肽的微球體中產(chǎn)生。已知這種情況是引入到所述基質(zhì)中的肽的不穩(wěn)定性的主要來源。肽的不穩(wěn)定性是由于聚(乳酸)和聚(乳酸-co-乙醇酸)微球體的降解所導(dǎo)致，其中所述的降解使得引入的肽通過所產(chǎn)生的乳酸和乙醇酸單元的酰化作用而被共價修飾。酰化作用減緩了肽由肌內(nèi)集庫注射位點(diǎn)的吸收速率。目前，在降解的聚(乳酸)和聚(乳酸-co-乙醇酸)微球體內(nèi)的肽藥品的?；饔米鳛橹饕恼系K(就作為新型且高效的藥品的、基于生物活性肽的藥品的穩(wěn)定、持久且成功傳遞而言，仍需要克服)而被許多專家關(guān)注(Werle M. et al.，Amino Acids, (2006) Vol. 30 ；pp. 351-367)。上述問題在一項(xiàng)研究中得到了闡明，其中所述的研究為在37°C下在不同濃度 (42. 5%、21. 3%和 8. 5%，wt/wt)和 pH 值(分別為 2. 25、1. 47 和 1.85)的 3 種乳酸溶液中調(diào)查奧曲肽乙酸鹽的?；磻?yīng)(Na et al.，AAPS PharmSciTech. ,2003,4(4) :article 72)。在這種溫育過程中，以時間依賴性和濃度依賴性的方式測量奧曲肽乙酸鹽的?；a(chǎn)物。在30天的溫育之后，在42. 5%的乳酸溶液(pH 2.25)中，所保留的完整的奧曲肽乙酸鹽的量僅為起始材料的51%。這是不具有生物活性的?；瘖W曲肽乙酸鹽的量增加的結(jié)果。聚乙二醇化是使用緩釋制備物的備選方法，其可以用于增加蛋白質(zhì)或肽的穩(wěn)定性和半衰期。聚乙二醇化的肽和蛋白質(zhì)的治療作用效果包括更好的物理和熱穩(wěn)定性、增長的循環(huán)半衰期、降低的免疫原性和抗原性、以及降低的毒性。與天然的肽和蛋白質(zhì)對抗暴露于有機(jī)溶劑的情況相比，聚乙二醇化的肽和蛋白質(zhì)還顯示出更好的穩(wěn)定性。此外，聚乙二醇化的蛋白質(zhì)的微球體還表現(xiàn)出不同的藥品釋放概況，與未聚乙二醇化的肽和蛋白質(zhì)的情況相比，所述的微球體的肽和蛋白質(zhì)的初始突釋減少。但是，到目前為止，這些基于聚乙二醇化的方法局限于分子量(MWt)大于IOkDa的基于蛋白質(zhì)的藥品。此外，穩(wěn)定性的重點(diǎn)主要在于改善蛋白質(zhì)的物理穩(wěn)定性，例如它們的團(tuán)聚和變性。本發(fā)明人目前已經(jīng)制備出編碼新型肽(并非在自然界中天然存在的)的、可以用于制備該新型肽的多核苷酸。所述的肽保持了奧曲肽乙酸鹽中由重要的4個氨基酸構(gòu)成的三維結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)。所述的肽可以在宿主細(xì)胞中經(jīng)濟(jì)地制得，并可以在工業(yè)范圍內(nèi)在較少的成本有效的步驟中由宿主細(xì)胞中分離得到。此外，所述的肽還可以進(jìn)行少數(shù)的成本有效的其他化學(xué)修飾，從而較大程度地增強(qiáng)它們的化學(xué)和代謝穩(wěn)定性，由此較大程度地增加它們在患者中的治療效力。在本發(fā)明的以下說明中，參照以下附圖，其中

圖1示出了化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽的結(jié)構(gòu)。僅有環(huán)狀的氨基酸(即，Phe-(D) Trp-Lys-Thr)與生長激素抑制素細(xì)胞表面的受體結(jié)合。圖2示出了包含兩個D-氨基酸的化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽(分子量為IOlSDa) 的分子模型。經(jīng)標(biāo)記的氨基酸(即，Phe-(D)Trp-Lys-Th)與生長激素抑制素細(xì)胞表面的受體結(jié)合。圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的疊加在化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽(包含兩個D-氨基酸) 的分子模型上的、生物合成的奧曲肽(包含L氨基酸Phe-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr) 的分子模型。較粗的灰色的線=生物(均為L-氨基酸)合成的八肽；較細(xì)的黑色的線=化學(xué)(兩個D-氨基酸)合成的奧曲肽乙酸鹽。圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的生物合成的奧曲肽的分子模型，隨后其通過插入與聚乙二醇共價連接的3-碳橋而被化學(xué)修飾。圖5示出了根據(jù)本發(fā)明的生物合成的奧曲肽的分子模型，隨后其通過插入與聚乙二醇共價連接的3-碳橋而被化學(xué)修飾。聚乙二醇化的八肽的每個化學(xué)成分顯示如下(a) 點(diǎn)線圓圈畫出了受體的結(jié)合氨基酸Wie-Trp-Lys-Thr ;(b)虛線形狀畫出了余下的氨基酸 (即，Phe-Cys-二硫鍵-Cys-Th) ； (c)實(shí)線形狀畫出了聚乙二醇。圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的生物合成的奧曲肽的分子模型，隨后其通過插入跨越八肽的二硫鍵的3-碳橋(顯示為CCC)而被化學(xué)修飾。聚乙二醇可以與3-碳橋以共價方式連接。圖7示出了本發(fā)明的生物合成的八肽的柔韌性。采用已經(jīng)公開的分子模型協(xié)議 (Zloh et al.，(2007)Nature Protocols，Vol. 2，pp. 1070-1083)，表明具有氨基酸序列 FCFffKTCT的生物合成的八肽表現(xiàn)出一定程度的柔韌性，該柔韌性可以通過記錄在刺激期間主鏈原子的均方根偏差(RMSD)值來進(jìn)行監(jiān)測。RMSD值的范圍為1-4. 4A。這表明所述八肽的柔韌性沒有通過3-碳橋連接聚乙二醇而變差。因此，這種二硫鍵位點(diǎn)特異性的聚乙二醇化的八肽會保留充分的柔韌性從而能夠與其生物學(xué)靶物有效地相互作用。圖8示出了根據(jù)本發(fā)明的具有氨基酸序列FCFWKTCT且包含L-氨基酸的生物合成的八肽的分子模型，隨后其通過插入具有聚乙二醇(其以共價方式與3-碳橋連接)的3-碳橋而被化學(xué)修飾，并且所述的分子模型疊加在包含D-氨基酸的化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽的分子模型上。這兩種結(jié)構(gòu)為能量最低的構(gòu)象體(即，最穩(wěn)定的形式)，并且使用在Zloh et al.，(2007)Nature Protocols,Vol. 2,pp. 1070-1083中公開的相同的分子建模方法預(yù)測出這兩種結(jié)構(gòu)。較粗的灰色的線=生物(均為L-氨基酸)合成的八肽；較細(xì)的黑色的線=化學(xué)(兩個D-氨基酸)合成的奧曲肽乙酸鹽。圖9示出了用于克隆實(shí)施例2所定義的版本1的八肽質(zhì)粒的氨基酸序列和核苷酸序列。編碼八肽FCFWKTCT的序列具有下劃線。編碼EcoRl和B10I限制性位點(diǎn)的序列以黑體表示。圖10示出了本發(fā)明的版本1的質(zhì)粒載體，并示出了如實(shí)施例2所定義的質(zhì)粒八肽的pGex4. 3克隆5 (包含與甲硫氨酸殘基連接的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，其中在甲硫氨酸殘基之后為編碼插入的八肽的序列)和pGex4. 3載體的核苷酸排列。八肽八肽FCFWKTCT和克隆序列。編碼八肽FCFWKTCT的序列具有下劃線。在得自GE LifeSciences的GST-融合系統(tǒng)手冊中具有載體和PGex系統(tǒng)的描述，其中所述的GE LifeSciences的網(wǎng)址為 http//www4. gelifesciences. com/aptrix/upp00919. nsf/Content/87478CFA7E09E0C7C 1256EB400417E59/$file/l 8115758. pdf。圖11示出了用于克隆實(shí)施例3所定義的版本2的八肽質(zhì)粒的氨基酸序列和核苷酸序列。其包括TEV識別位點(diǎn)。X=除了脯氨酸以外的任何氨基酸。八肽FCFWKTCT及其編碼序列具有下劃線。圖12示出了本發(fā)明的版本2的質(zhì)粒載體。其示出了實(shí)施例3所定義的質(zhì)粒八肽的pGex4. 3以及編碼八肽FCFWKTCT的、具有額外的TEV酶切位點(diǎn)序列的序列的核苷酸序列排列。編碼八肽FCFWKTCT的序列具有下劃線。TS8v2包含與TEV蛋白酶識別序列連接的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，其中在TEV蛋白酶識別序列之后為插入的編碼八肽的序列。圖13示出了如實(shí)施例2所述的由編碼SjGST-TM-八肽的質(zhì)粒(版本1)所表達(dá)的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠電泳(泳道1 標(biāo)志物；泳道2 作為全部的細(xì)菌裂解液的 SjGST-TM-八肽；泳道3 流過谷胱甘肽瓊脂糖柱的SjGST-TM-八肽；泳道4 作為單一種類的^t為27kDa的、經(jīng)洗滌的SjGST-TM-八肽蛋白質(zhì))。圖14示出了如實(shí)施例3所述的由編碼SjGST-TEV-八肽融合蛋白質(zhì)(版本2)所表達(dá)的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠電泳。泳道1 分子量標(biāo)志物；泳道2 得自誘導(dǎo)細(xì)胞的全部裂解液；泳道3 經(jīng)洗滌的SjGST-TEV-八肽蛋白質(zhì)(Mol Wt = 28. 4kDa)。圖15示出了實(shí)施例5所定義的化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽的基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜(Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight Mass Spectroscopy(MALDI-TOF-MS))分析?；瘜W(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽的理論質(zhì)量為 1018Da。發(fā)現(xiàn)化學(xué)合成的奧曲肽的試驗(yàn)質(zhì)量為1019Da?；瘜W(xué)合成的奧曲肽Na+的理論質(zhì)量為1041Da?；瘜W(xué)合成的奧曲肽Na+的理論質(zhì)量為1041Da。圖16示出了實(shí)施例6所定義的試驗(yàn)質(zhì)量的SjGST-TM-八肽融合蛋白質(zhì)版本1的分析。SjGST的理論質(zhì)量為25498Da。加入到SjGST中的八肽的理論質(zhì)量為2259Da。這樣得到了 SjGST-TM-八肽版本1融合蛋白質(zhì)的結(jié)合理論質(zhì)量為27757。發(fā)現(xiàn)SjGST-TM-八肽的試驗(yàn)質(zhì)量為27751Da。質(zhì)量誤差百分率為0. 02%。理論質(zhì)量與試驗(yàn)質(zhì)量之間的質(zhì)量誤差百分率為0. 是可接受的。圖17示出了如實(shí)施例7所定義的試驗(yàn)質(zhì)量的SjGST蛋白質(zhì)(版本1)在其被凝血酶切割之后的MALDI-T0F-MS分析。使用IOOmM DTT還原純化的融合蛋白質(zhì)溶液，并通過 PD-10凝膠濾柱與包含2mM EDTA的IOmM磷酸鈉緩沖液(pH7. 8)進(jìn)行緩沖液交換。然后在 37°C下，在IOmM的磷酸鈉緩沖液(pH7. 8)中，將融合蛋白質(zhì)的溶液經(jīng)過M小時的凝血酶消化。向該溶液中加入3mM DTT，以防止二硫鍵的錯誤形成。然后進(jìn)行MALDI-T0F-MS分析。 SjGST-TM-八肽融合蛋白質(zhì)版本1的理論質(zhì)量為27757Da。SjGST蛋白質(zhì)在其被凝血酶切割后的理論質(zhì)量為^150Da。SjGST蛋白質(zhì)在其被凝血酶切割后的試驗(yàn)質(zhì)量為^153Da。質(zhì)量誤差百分率為0.01%。八肽在其被凝血酶切割后的理論質(zhì)量為1607Da。八肽在其被凝血酶切割后的試驗(yàn)質(zhì)量不能由這種特定的MALDI-T0F光譜確定，這是因?yàn)閷τ谛Wt分子而言，其分辨率低-如圖18所示。圖18示出了實(shí)施例8所定義的經(jīng)純化的SjGST-TM-八肽融合蛋白質(zhì)版本1通過溴化氰在甲硫氨酸處進(jìn)行化學(xué)切割之后得到的具有本發(fā)明序列FCFWKTCT的八肽的 MALDI-T0F-MS分析。使用IOOmM DTT還原純化的融合蛋白質(zhì)溶液，并通過PD-10凝膠濾柱與包含2mM EDTA的IOmM磷酸鈉緩沖液(pH7. 8)進(jìn)行緩沖液交換。然后在37°C下，在IOmM 的磷酸鈉緩沖液(PH7.8)中，將所述溶液在與八肽緊密相連的甲硫氨酸殘基處進(jìn)行溴化氰 (艮P，化學(xué))介導(dǎo)的切割，并持續(xù)M小時。向所得溶液中加入3mM DTT，以防止二硫鍵的錯誤形成。然后進(jìn)行MALDI-T0F-MS分析。八肽的理論質(zhì)量為1035Da。生物合成的八肽在其由甲硫氨酸處被化學(xué)切割之后的試驗(yàn)質(zhì)量為1034Da。質(zhì)量誤差百分率為0.09%?；瘜W(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽與生物合成的八肽FCFWKTCT之間的試驗(yàn)質(zhì)量差異為16Da。這是因?yàn)閵W曲肽乙酸鹽經(jīng)過化學(xué)修飾而具有L-蘇氨醇作為其C末端殘基。在生物學(xué)八肽FCFWKTCT的情況下，天然形成的氨基酸L-蘇氨酸作為C末端殘基存在。圖19示出了如實(shí)施例9所述的在具有乳糖的E. coli中SjGST-TEV-八肽融合蛋白質(zhì)(版本2)的反應(yīng)自誘導(dǎo)及其由包含體中的純化。泳道1 :MWt標(biāo)志物；泳道2 ^gE. coli 誘導(dǎo)細(xì)胞的全部裂解液；泳道3 :E. coli細(xì)胞裂解液在其經(jīng)歷超聲處理之后得到的上清液； 泳道4 所述的細(xì)胞團(tuán)在使用2M脲和IOOmM Tris pH12. 5處理后得到的上清液；泳道5 所述的細(xì)胞團(tuán)在使用2M脲和IOOmM Tris pH12. 5處理、然后用HCl將pH調(diào)節(jié)至8后得到的上清液；泳道6:由E. coli細(xì)胞在2M脲以及IOOmM Tris pH12. 5中裂解、然后用HCl將pH 調(diào)節(jié)至8后剩余得到的細(xì)胞團(tuán)。在各泳道中，在17kDa處所見的蛋白質(zhì)條帶是加入用于消化細(xì)胞的溶菌酶。圖20示出了實(shí)施例10所述的化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽的三碳橋聚乙二醇化。為了進(jìn)行比較，奧曲肽乙酸鹽的MALDI-T0F-MS光譜示于圖15中。在圖20中，顯示化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽通過跨越所述肽的二硫鍵的三碳橋而與5kDa聚乙二醇共價連接。聚乙二醇化的奧曲肽乙酸鹽的理論質(zhì)量為6092Da (即，聚乙二醇為5073+奧曲肽乙酸鹽為1019)。 聚乙二醇的試驗(yàn)麗t為5073Da。聚乙二醇化的奧曲肽乙酸鹽的試驗(yàn)麗t為6097Da。質(zhì)量誤差百分率為0.08%。
圖21如實(shí)施例11所述采用SDS-PAGE證明了 SjGST-TM-八肽融合蛋白質(zhì)(版本 1)通過化學(xué)插入三碳橋(聚乙二醇以共價方式與其連接)而進(jìn)行的修飾。泳道1 :MWt標(biāo)志物；泳道2 理論麗t為27757Da的經(jīng)純化的SjGST-TM-八肽(版本1)；泳道3 在4°C下 5Da聚乙二醇與SjGST-TM-OCT之間的二硫鍵位點(diǎn)特異性的橋接反應(yīng)(持續(xù)72小時)、然后在37°C下使用凝血酶消化M小時。在27. 7kDa處的SjGST-TM-八肽蛋白質(zhì)條帶消失，并且出現(xiàn)了單聚乙二醇化的蛋白質(zhì)條帶(即，所述肽的二硫鍵的單聚乙二醇化)、二聚乙二醇化的蛋白質(zhì)條帶(即，所述肽的二硫鍵的單聚乙二醇化以及在GST中二硫鍵的單聚乙二醇化) 以及三聚乙二醇化的蛋白質(zhì)條帶(即，所述肽的二硫鍵的單聚乙二醇化以及在GST中兩個二硫鍵的二聚乙二醇化)；泳道4 在反應(yīng)緩沖液中5kDa聚乙二醇反應(yīng)物(3當(dāng)量濃度)的二硫鍵位點(diǎn)特異性的橋接。圖22如實(shí)施例12所述采用MALDI-T0F-MS證明了 SjGST-TM-八肽(版本1)融合蛋白質(zhì)通過化學(xué)插入三碳橋(聚乙二醇以共價方式與其連接)而進(jìn)行的修飾。該圖示出了凝血酶狡猾的二硫鍵位點(diǎn)特異性的聚乙二醇化SjGST-TM-八肽(版本1)蛋白質(zhì)溶液的 MALDI-T0F-MS. SjGST-TM-八肽(版本I)融合蛋白質(zhì)的理論質(zhì)量為27757Da。凝血酶切割的SjGST大片段的理論質(zhì)量為^150Da。使用凝血酶的理論小切割產(chǎn)物為1607Da的片段。 這意味著與八肽(1607Da)連接的聚乙二醇(5073Da)的理論質(zhì)量=6680Da。與八肽連接的聚乙二醇的試驗(yàn)質(zhì)量為6692Da。質(zhì)量誤差百分率為0. 1%。圖23示出了本發(fā)明的肽的三個實(shí)例(與化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽相比)在減少 BALB/C小鼠的血清生長激素(GH)水平中的作用。圖23A示出了小鼠GH的水平(ng/ml)。 圖2 示出了與化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽相比GH的抑制百分率。在第一個方面中，本發(fā)明提供了由氨基酸序列^C1CX2WKX3CT構(gòu)成的經(jīng)分離的肽，其中&為F或A，&為F或Y，而&為T或V，它們可以為任意的組合或置換，并且其中每一個氨基酸均為L-構(gòu)型，而且所述的肽在兩個半胱氨酸殘基之間包含二硫鍵。因此，本發(fā)明的肽可以具有以下氨基酸序列的任意一種FCFWKTCT、FCFffKVCT, FCYffKTCT, FCYffKVCT, ACFffKTCT、ACFffKVCT、ACYffKTCT或ACYWKVCT。優(yōu)選的是，本發(fā)明的肽由氨基酸序列FCFWKTCT 或ACYWKVCT構(gòu)成。在本文中使用標(biāo)準(zhǔn)的單字母或三字母氨基酸密碼來定義氨基酸序列，其中G =甘氨酸(GIy)、P =脯氨酸(ftx))、A =丙氨酸(Ala)、V =纈氨酸(Val)、L =亮氨酸(Leu)、I =異亮氨酸(He)、M =甲硫氨酸(Met)、C =半胱氨酸(Cys)、F =苯丙氨酸(Wie)、Y =酪氨酸(Tyr)、W =色氨酸(Trp)、H =組氨酸(His)、K =賴氨酸(Lys)、R =精氨酸(Arg)、Q = 谷氨酰胺(Gln)、N =天冬酰胺(Asn)、E =谷氨酸(GIu)、D =天冬氨酸Asp)、S =絲氨酸 (Ser)和 T =蘇氨酸(Thr)。用于各氨基酸的DNA密碼子如表1所示表 1
氨基酸SLCDNA密碼子異亮氨酸IATT，ATC，ATA亮氨酸LCTT, CTC, CTA, CTG, TTA, TTG纈氨酸VGTT，GTC，GTA, GTG苯丙氨酸FTTT，TTC甲硫氨酸MATG半胱氨酸CTGT，TGC丙氨酸AGCT，GCC，GCA, GCG甘氨酸GGGT，GGC，GGA, GGG脯氨酸PCCT，CCC，CCA, CCG蘇氨酸TACT，ACC，ACA, ACG絲氨酸STCT，TCC，TCA, TCG，AGT，AGC酪氨酸YTAT, TAC色氨酸WTGG谷氨酰胺QCM, CAG天冬氨酸NAAT, AAC組氨酸HCAT, CAC谷氨酸EGAA, GAG天冬氨酸DGAT, GAC賴氨酸KAAA, AAG精氨酸RCGT, CGC, CGA，CGG, AGA, AGG終止密碼子終止TM，TAG，TGA
本發(fā)明的經(jīng)分離的肽保持了與化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽相同的三維結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，由此保持了與化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽相同的活性，其中在所述的肽中，每個氨基酸都以L-構(gòu)型的形式(與D-構(gòu)型相反)存在并且所述的肽在兩個半胱氨酸殘基之間都包含二硫鍵。奧曲肽乙酸鹽包含D-Phel和D-I~rp4殘基而蘭樂肽乙酸鹽包含D-Alal和D-I~rp4殘基，然而本發(fā)明的肽完全由L-對映體構(gòu)成。本發(fā)明的肽可以包含末端化學(xué)修飾。這種修飾可以通過例如由蛋白酶進(jìn)行降解而降低所述肽的敏感性來增加其穩(wěn)定性。本發(fā)明的肽FCFWKTCT的分子建模顯示，該肽的預(yù)測的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)不能有效地與化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽相區(qū)分。如圖3所示，所述肽FCFWKTCT中的氨基酸的相對位置位于與化學(xué)合成的奧曲肽乙酸鹽的氨基酸相同的位置處。最重要的是，Phe3、Trp4、LyS5 和Thr6在本發(fā)明的肽中與它們在奧曲肽乙酸鹽中具有相同的相對位置。雖然賴氨酸5顯示出不同的趨向，但是它的線性性質(zhì)意味著它在溶液中具有極好的柔韌性。這意味著就賴氨酸5而言，圖3中所述的兩個位置之間的差異不具有生物學(xué)意義。已知圖3中標(biāo)記的氨基酸對于奧曲肽的生物學(xué)活性而言是必需的；它們負(fù)責(zé)奧曲肽乙酸鹽與其細(xì)胞表面的受體相結(jié)合。因此，本發(fā)明的所述肽FCFWKTCT具有與奧曲肽乙酸鹽相同的三維化學(xué)結(jié)合位點(diǎn)性質(zhì)，并且分子建模研究預(yù)測本發(fā)明的所述肽FCFWKTCT在生物學(xué)系統(tǒng)中以相同的方式起作用。同樣通過分子建模研究預(yù)測本發(fā)明的各種所述肽的三維構(gòu)型均保留了奧曲肽乙酸鹽和蘭樂肽乙酸鹽的相同的三維化學(xué)結(jié)合位點(diǎn)的性質(zhì)。優(yōu)選的是，通過使編碼所述肽的多核苷酸在生物學(xué)宿主中表達(dá)來制得本發(fā)明的肽，因此取決于產(chǎn)生所述肽的生物學(xué)有機(jī)體蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。因此，與用于產(chǎn)生奧曲肽乙酸鹽或蘭樂肽乙酸鹽的化學(xué)合成方法相比，優(yōu)選的是所述的肽是生物合成的。此外，本發(fā)明的肽的生物合成還可以使得兩個半胱氨酸之間的二硫鍵自發(fā)形成。因此，在另一個方面中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸。優(yōu)選的是所述的多核苷酸編碼了與天然激素生長激素抑制素的其他氨基酸相分離的本發(fā)明八肽的8個氨基酸。因此，編碼生長激素抑制素的天然基因組DNA由本發(fā)明的范圍內(nèi)排除?？梢允褂媚軌虮磉_(dá)所述肽的任何生物學(xué)宿主。 合適的宿主是本領(lǐng)域已知的，包括細(xì)菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞和動物細(xì)胞。編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸可以為DNA或RNA。因此，在本文中描述DNA序列之處，可以理解為可以使用等價的RNA序列。編碼本發(fā)明的肽FCFWKTCT的多核苷酸包含核心核苷酸序列 5' -TTYTGYTTYTGGAARACNTGYACN-3‘，其中 R = A 或 G，并且其中 N = A、C、T 或 G，它們可以為任意的組合或置換。當(dāng)所述的多核苷酸被引入到細(xì)菌中用于表達(dá)的載體中時，根據(jù)細(xì)菌中最普通的密碼子的使用情況，優(yōu)選的多核苷酸序列為5' TTC TGT TTT TGG AAA ACC TGT ACC 3'。16個編碼肽FCFWKTCT的備選核苷酸序列的實(shí)例如表2所示，其中帶有下劃線的序列相當(dāng)于最通用的細(xì)菌密碼子。所述的多核苷酸可以包含表2所示的任意一個序列，但是不限于這些序列。當(dāng)編碼肽FCFWKTCT的多核苷酸在酵母菌宿主細(xì)胞中表達(dá)時，可以根據(jù)酵母菌中最通用的密碼子的使用情況來選擇優(yōu)選的密碼子。表權(quán)利要求
1.一種由氨基酸序列X1QC2WKX3CT構(gòu)成的經(jīng)分離的肽，其中&為F或A，&為F或Y，而 &為T或V，它們可以為任意的組合或置換，并且其中每一個氨基酸均為L-構(gòu)型，而且所述的肽在所述的兩個半胱氨酸殘基之間包含二硫鍵。
2.一種由氨基酸序列X1QC2WKX3CT構(gòu)成的經(jīng)分離的肽，其中&為F或A，&為F或Y，而 &為T或V，它們可以為任意的組合或置換，并且其中每一個氨基酸均為L-構(gòu)型，而且所述的兩個半胱氨酸殘基的兩個硫原子通過三個碳原子連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽，其進(jìn)一步包含與三個碳原子中的一個共價連接的親水性聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中所述的親水性聚合物為聚乙二醇。
5.一種融合蛋白質(zhì)，其包含權(quán)利要求1-4中的任何一項(xiàng)的肽、以及一個或多個載體蛋白質(zhì)。
6.一種多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1所述的肽的第一核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多核苷酸，其中所述的第一核苷酸序列為 5' -TTYTGYTTYTGGAARACNTGYACN-S‘，其中 Y = C 或 T，其中 R = A 或 G，而其中 N = A、C、 T或G，它們可以為任意的組合或置換。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的多核苷酸，其進(jìn)一步包含編碼載體蛋白質(zhì)的第二核苷酸序列。
9.一種載體，其包含權(quán)利要求6-8中的任何一項(xiàng)所述的多核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其進(jìn)一步包含與權(quán)利要求6-8中的任何一項(xiàng)所述的多核苷酸可操作地連接的啟動子。
11.一種制備權(quán)利要求1所述的肽的方法，其包含將權(quán)利要求6-8中的任何一項(xiàng)所述的多核苷酸或權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的載體引入到能夠表達(dá)所述的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞中，并由所述的宿主細(xì)胞中分離所述的肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞或酵母菌細(xì)胞。
13.一種制備權(quán)利要求2所述的肽的方法，其包含-將權(quán)利要求6-8中的任何一項(xiàng)所述的多核苷酸或權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的載體引入到能夠表達(dá)所述的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞；-由所述的宿主細(xì)胞中分離所述的肽；以及-將三碳橋引入到所述的兩個半胱氨酸殘基的兩個硫原子之間。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其進(jìn)一步包含親水性聚合物與三個碳原子之一共價連接的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的親水性聚合物為聚乙二醇。
16.用于醫(yī)藥用途的權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的肽，其用于治療激素紊亂；癌癥；患有分泌血管活性腸肽的腫瘤患者的腹瀉；嚴(yán)重的頑固性腹瀉；長期復(fù)發(fā)的低血糖癥；患有胰島細(xì)胞增殖癥的嬰兒的胰島素過多分泌；疑似食管血管曲張的患者的出血；以及由糖尿病所導(dǎo)致的眼病。
18.—種包含權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的肽和可藥用的載體的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及一種由氨基酸序列X1CX2WKX3CT構(gòu)成的經(jīng)分離的肽，其中X1為F或A，X2為F或Y，而X3為T或V，它們可以為任意的組合或置換，并且其中每一個氨基酸均為L-構(gòu)型，而且所述的肽在所述的兩個半胱氨酸殘基之間包含二硫鍵?？蛇x擇地，所述的兩個半胱氨酸殘基的兩個硫原子可以通過三個碳原子連接。此外，本發(fā)明總體上涉及包含所述的肽的融合蛋白質(zhì)、編碼所述的肽或融合蛋白質(zhì)的多核苷酸、制備所述的肽或融合蛋白質(zhì)的方法、包含所述的肽或融合蛋白質(zhì)的藥物以及該藥物的用途。
文檔編號A61K47/48GK102264397SQ200980148966
公開日2011年11月30日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月1日
發(fā)明者I·特奧, S·肖納克 申請人:帝國創(chuàng)新技術(shù)有限公司