專利名稱：黑素生成抑制劑及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黑素生成抑制劑，及其制備和使用的方法。更為具體地，該黑素生成抑制劑包含一種天然的蛋白質(zhì)或其有效片段。它能降低酪氨酸酶活性、抑制色素細(xì)胞增殖，并對黑素瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性。
色素沉著過多癥影響全世界許多人，常常使人極其窘迫或產(chǎn)生更壞后果。這類疾病包括諸如雀斑、日照著色斑(褐黃斑)、燒傷病人移植皮膚常見的顏色明顯變深，以及最為嚴(yán)重的黑素瘤。此外，許多人僅僅從美容角度也希望減輕他們的皮膚底色。
過去采用了不同的方法來降低色素沉著過多區(qū)域的色素沉著或減輕皮膚底色。雖然這些治療取得了種種結(jié)果，然而大部分會產(chǎn)生不希望得到的副作用。用于漂白皮膚或脫去色素的化合物包括氫醌及其衍生物。氯化氨基汞、抗壞血酸、巰基胺類、4-異丙基兒茶酚、以及過氧化物。然而沒有一種業(yè)已證明是完全可靠，沒有副作用的。
歐洲專利申請389，950揭示了一種促黑素細(xì)胞激素(MSH)抑制劑，據(jù)報道其對諸如預(yù)防或減輕褐黃斑或雀斑等癥狀是有用的。該抑制劑包含由下列式子代表的氨基酸順序-His-Ser-Arg-Trp-;-Trp-Arg-Ser-His;或-Leu-Ala-Cys-Ala-Arg-。前面二種順序代表的肽類對黑素細(xì)胞表面包含的MSH受體具有親和力，由此拮抗MSH。第三種順序代表的肽類對MSH本身具有親和力，由此抑制MSH的作用。
在他們發(fā)明之后，申請人得知一篇新近的出版論文，其中揭示了一種蛋白質(zhì)，可能與他們已經(jīng)制備的有關(guān)，事實上可能是一樣的(Madsen，P.etal.，I.InvestDermatol99∶299-305(1992)。這種蛋白質(zhì)據(jù)報道在牛皮癬角質(zhì)細(xì)胞中受到高度的正調(diào)節(jié)，但是報道沒有提到與黑素生成的關(guān)系。
一種更為嚴(yán)重的皮膚色素沉著過多癥是黑素瘤。它影響世界上數(shù)百萬人。雖然早期診斷的活，有時可以得到治療，但黑素瘤常常是致命的。目前已有的治療方法，如化學(xué)療法，常會引起嚴(yán)重的副作用，并且從不會對所有病人完全有效。
然而，迄今為止，沒有一種天然來源的組合物能夠可靠的抑制黑素生成，由此減少皮膚色素沉著，并對黑素瘤細(xì)胞有選擇性細(xì)胞毒性，而且沒有任何副作用。
下面描述本發(fā)明的一些重要特征和目的，但不是全部的。
本發(fā)明的一個目的是提供一種天然來源的黑素生成抑制劑，用于減少皮膚色素沉著，有選擇地破壞黑素瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種天然來源的黑素生成抑制劑，包含一種天然來源的黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)或其有效片段。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用天然來源的黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)或其有效片段來控制皮膚和/或毛發(fā)色素沉著。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用天然來源的黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)或其有效片段來破壞黑素瘤細(xì)胞，而不影響正常的非色素細(xì)胞。
如本文所用，“黑素生成”是指由活細(xì)胞生成黑素;“抑制黑素生成”包括抑制各個細(xì)胞產(chǎn)生黑素的能力和/或減小能產(chǎn)生黑素的細(xì)胞群體。
按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種在此之前未知的天然來源的蛋白質(zhì)，它能夠抑制色素細(xì)胞的黑素生成，選擇性破壞黑素瘤細(xì)胞，而不傷害其他細(xì)胞。該黑素生成抑制因子(MI)蛋白質(zhì)具有下列氨基酸順序(與其相應(yīng)的密碼子一起列出，每個氨基酸下面的數(shù)字指MI順序中氨基酸的位置)SEQIDNO3ATGGCCACAGTTCAGCAGCTGGAAGGAAGATGGCGCCTGGTGMetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510GACAGCAAAGGCTTTGATGAATACATGAAGGAGCTAGGAGTGAspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GGAATAGCTTTGCGAAAAATGGGCGCAATGGCCAAGCCAGATGlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540TGTATCATCACTTGTGATGGTAAAAACCTCACCATAAAAACTCysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GAGAGCACTTTGAAAACAACACAGTTTTCTTGTACCCTGGGAGluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GAGAAGTTTGAAGAAACCACAGCTGATGGCAGAAAAACTCAGGluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ACTGTCTGCAACTTTACAGATGGTGCATTGGTTCAGCATCAGThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GAGTGGGATGGGAAGGAAAGCACAATAACAAGAAAATTGAAAGluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110
GATGGGAAATTAGTGGTGGAGTGTGTCATGAACAATGTCACCAspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125TGTACTCGGATCTATGAAAAAGTAGAATAACysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135為了簡明起見,整個MI蛋白質(zhì)的順序如下所示:
SEQIDNO.4:
MetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510AspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540CysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110
AspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125CysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135按照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種制備MI蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟(a)將哺乳動物皮膚，較好是人皮膚，移植到活的裸鼠上;(b)讓此哺乳動物皮膚在裸鼠上保持預(yù)定的一段時間;(c)從裸鼠上移走此哺乳動物皮膚;以及(d)從此哺乳動物皮膚提取包含MI蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)部分。較好是讓哺乳動物植皮在裸鼠上保持至少6個星期。同樣，較好是提取步驟包括用生理鹽水從哺乳動物皮膚提取蛋白質(zhì)，用離子交換色譜法分級分離皮膚蛋白質(zhì)提取物，用雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離色譜法得到的適當(dāng)?shù)募壏种械钠つw蛋白質(zhì)提取物，以及用電洗脫法從電泳凝膠中分離MI蛋白質(zhì)。
按照本發(fā)明的另一個方面，還提供了一種控制色素細(xì)胞(特別是皮膚和毛發(fā)中的色素細(xì)胞)黑素生成的方法，其步驟包括形成一種有效量MI蛋白質(zhì)和合適載體的混合物，然后將此混合物施用于欲控制的色素細(xì)胞。MI蛋白質(zhì)或其活性片段可施用于例如皮膚，來治療某些色素沉著過多癥或僅僅為了美容目的。MI蛋白質(zhì)也可施用于美容方面的毛發(fā)脫色或減色，例如使體毛(如陰毛，腋毛，胸毛，腿毛，臂毛，背毛)變得不那么清晰可見。使用這種組合物可使刮順，脫毛或電針除毛不便之處較少見，比較好的是將混合物局部施用于色素細(xì)胞，并且最好是用MI蛋白質(zhì)活性片段?；蛘進(jìn)白質(zhì)或其活性片段可以與適當(dāng)?shù)妮d體一起注射，以便將組合物施用于色素細(xì)胞。合適的載體可有無數(shù)種，其選擇依賴于施用的最終目的。這樣，MI蛋白質(zhì)或最好是其活性片段，可以與皮膚修補(bǔ)劑結(jié)合使用，以減輕老年斑，同時也改善皮膚皺紋狀態(tài)。
按照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種通過將有效劑量的MI蛋白質(zhì)或其活性片段與合適載體混合，應(yīng)用于黑素瘤細(xì)胞，從而選擇性破壞黑素瘤細(xì)胞的方法。同樣先多種載體可以使用，其選擇依賴于該組合物的應(yīng)用方法。比較好的是將該組合物局部使用，并且利用MI蛋白質(zhì)的活性片段。
A.MI蛋白質(zhì)的開發(fā)研究移植到燒傷病人的皮膚色素過多沉著以前已有記載，并被認(rèn)為是一種炎癥后機(jī)制起作用的結(jié)果。也觀察到皮膚色素沉著增加與日照灼傷和其他皮炎過程的關(guān)系，并把這種增加歸結(jié)于功能性黑素細(xì)胞(“多巴陽性”黑素細(xì)胞)數(shù)量的增加和黑素細(xì)胞實際黑素合成的增加。
為了檢查移植皮膚的色素反應(yīng)，將小塊人皮膚樣本植到先天性無胸腺小鼠(裸鼠)上。裸鼠經(jīng)證明是一種用于研究正常和病理異種移植組織體內(nèi)行為的優(yōu)異宿主，因為它們不會排斥不同系統(tǒng)發(fā)生來源的移植物。裸鼠已經(jīng)廣泛地用于人類皮膚的研究。移植到裸鼠上的人類皮膚仍保持其結(jié)構(gòu)和免疫特性，以及一些主要的功能性質(zhì)。
在這一討論和接下來的所有實施例中，存活的供體皮膚來自于高加索人種成人尸體。用植皮刀取皮膚，厚度為一吋的12-14/1000，并貯存于F-12組織培養(yǎng)基(自GibcoLaboratories，GrandIsland，NY)，4℃。將裸鼠先用Nembutol麻醉，從軀體合適部位除去皮膚，準(zhǔn)備移植部位。將裂口厚度(12-14/1000吋)的供體皮膚置于小鼠合適部位并縫合得當(dāng)。移植皮膚是在供體死亡48小時之內(nèi)移植到小鼠上的。需要時，將小鼠用過量的Nembutol處死，通過消毒外科技術(shù)，取下異種移植物。
如所期望，這種異種移植物表現(xiàn)出與報道的燒傷病人中相同的色素過多沉著。在移植之前以及移植后不同時間，對異種移植物進(jìn)行了各種組織學(xué)試驗和檢查，以研究這種觀察到的色素過多沉著。明顯的異種移植物顏色變深早在移植兩周后就出現(xiàn)了。而且，盡管存在觀察關(guān)異，所有的異種移植物都表現(xiàn)出色素過多沉著。然而，觀察到的色素過多沉著只局限于異種移植物，并不延伸到宿主皮膚。
異種移植物樣本的顯微鏡分析揭示出與移植前相比，異種移植物中多巴陽性黑素細(xì)數(shù)量有顯著的增加。多巴陽性細(xì)胞是指存在功能性酪氨酸酶的細(xì)胞，因而能產(chǎn)生色素。雖然增加的程度有些不同，但是多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)目的增加至少有3倍，而且所有的樣本在移植后6周左右都出現(xiàn)一個峰值。從這點開始，多巴陽性黑素的細(xì)胞數(shù)目逐步下降，但在某些異種移植物中，遲至移植30周，仍會維持在略有增加的程度。
作為黑素生成活性的一種指示，也測定了黑素細(xì)胞體的大小。在所有的情形中，黑素細(xì)胞的大小比移植前樣品中觀察的要大一倍以上，同時細(xì)胞大小變化也顯示出一個峰值，隨之逐步減小。此外，異種移植物中黑素細(xì)胞樹突也顯著增加。樹突的增加一般會導(dǎo)致皮膚色素沉著的增加，因為樹突負(fù)責(zé)運輸黑素至表皮。雖然色素過多沉著的程度并不總是與多巴陽性黑素細(xì)胞的數(shù)目相關(guān)，但的確傾向于與黑素細(xì)胞樹突相關(guān)。這似乎表明，觀察到的色素過多沉著與其說是黑素細(xì)胞實際數(shù)目增加的結(jié)果，不如說是黑素生成活性增加的結(jié)果。
為了確定低分子量和高分子量蛋白質(zhì)區(qū)是否存在任何差別，對移植前和移植后的人皮膚提取液進(jìn)行了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。雖然在移植后不同時間取樣的樣品間，蛋白質(zhì)電泳帶型沒有任何明顯的差異，但是，在移植后異種移植物樣品中，獨特地顯示出一條表觀分子量大約為13到14千道爾頓(KDa)的蛋白質(zhì)帶，而在移植前皮膚中沒有發(fā)現(xiàn)此帶。在趣的是，在裸鼠皮膚提取物中也發(fā)現(xiàn)了一種具有類似分子量的蛋白質(zhì)。該13到14KDa蛋白質(zhì)帶早至移植后二周就出現(xiàn)，并持續(xù)出現(xiàn)到移植14周以后。
在下面的實施例中，不同的蛋白質(zhì)級分和純化的蛋白質(zhì)被用于幾種不同類型的細(xì)胞，以確定提取自移植前和移植后的皮膚中的蛋白質(zhì)對色素作用的影響，如果有的話。移植前皮膚僅指正常人皮膚，而移植后皮膚指由裸鼠支持的活的異種移植物。這種試驗的最終結(jié)果就是從上面提到的13到14KDa帶中分離出單一的黑素生成抑制因子(MI)蛋白質(zhì)。雖然申請人并不能確定MI蛋白質(zhì)如何影響黑素生成和選擇性地殺滅黑素瘤細(xì)胞，但是沒有任何理由相信這些作用是通過MSH和/或其受體引起的。
實施例1采用的第一種細(xì)胞類型是克勞德曼(Cloudman)S91黑素瘤。這是一種中等程度鼠黑素沉著病細(xì)胞，已廣泛用于研究黑素生成和色素細(xì)胞生長。黑素瘤細(xì)胞以單層培養(yǎng)物形式保存于Ham F-10培養(yǎng)基(購自Gibco Laboratories，Grand Insland，NY)，其中補(bǔ)充有10%熱激活小鼠血清，2.5%熱激活胎牛血清，100單位/毫升青霉素，及100微克/毫升鏈霉素，置于37℃含5%CO2的濕潤溫育器中。細(xì)胞每周傳代培養(yǎng)，并保存在培養(yǎng)物中僅10代，以避免表型漂移。從液氮中冷凍保藏的細(xì)胞重新獲取單層備用培養(yǎng)物(參見Zalfa Abdel-Malek et al.，Cancer Research 47∶3141-6(1987))。
通過除去皮下脂肪，然后將皮膚樣品切成小片，從移植前和移植后(移植12至15周之后)的皮膚樣品中制備蛋白質(zhì)提取物。用polytron勻漿器制皮膚勻漿，制備20-30%含1mM甲苯磺酰氟(PMSF)的磷酸鹽緩沖液(PBS)勻漿。2000×g離心20分鐘，取出粗抽提液，再于100，000×g離心1小時，獲得澄清可溶的上清部分。將上清液過濾滅菌，用Bio-Rad方法測定蛋白質(zhì)含量。
然后，用含EDTA的Tyrodes溶液取代培養(yǎng)基，收獲Cloudman S91黑素瘤細(xì)胞。將細(xì)胞按大約0.2×106/25cm2密度接種于每個瓶中。對于每個實驗組，接種三瓶，并做對照瓶。24小時后，用含不同濃度的按上法制備的移植前或移植后上清液的新鮮培養(yǎng)基替換老的培養(yǎng)基，溫育24小時。最后，加入含3H-酪氨酸(1微居里/毫升)和上清液(與前面所用濃度相同)的新鮮培養(yǎng)基，再溫育24小時。按照修改的Pomerantz活性炭吸附法(如Fuller，B.B.&Viskochil，B.H.，Life Sci.24∶2405-2416(1979)所述)，原位測定酪氨酸酶的酪氨酸羥化酶活性。此檢測是通過測定由酪氨酸酶將3H-酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)長-多巴后3H2O的釋放量來測定酪氨酸酶的活性，也是對黑素生成活性的一種顯著的指示，因為酪氨酸酶活性的降低將會導(dǎo)致相應(yīng)的黑素生成活性的降低(例如皮膚色素沉著的減輕)。
與對照相比，用25微克/毫升移植后蛋白質(zhì)提取物處理的黑素瘤細(xì)胞，其酪氨酸酶活性大約增加20%。濃度低于25微克/毫升不再會增加酪氨酸酶活性。然而，在較高濃度的移植后蛋白質(zhì)提取物時，黑素瘤細(xì)胞的酪氨酸酶活性以劑量依賴性方式降低。濃度為50微克/毫升時，酪氨酸酶活性大約降低20%，75微克/毫升降低30%，100微克/毫升降低50%。與此對照，用移植前皮膚蛋白質(zhì)提取物處理的黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，不顯示任何有統(tǒng)計學(xué)意義的酪氨酸酶活性的變化。因此，顯然當(dāng)人皮膚移植到活的宿主上時會誘導(dǎo)產(chǎn)生出一種強(qiáng)有力的黑素生成抑制因子，這種抑制因子存在于移植后皮膚的蛋白質(zhì)提取物中。
實施例2同樣，檢查了實施例1中的蛋白質(zhì)提取物對正常人黑素細(xì)胞的影響。先除去新生兒背側(cè)包皮皮下組織，而獲得正常黑素細(xì)胞。然后將組織培養(yǎng)在0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。接著用后工將表皮從真皮撕開，兩者均置于培養(yǎng)基中劇烈旋轉(zhuǎn)。然后取出上清液，轉(zhuǎn)移到一25平方厘米的組織培養(yǎng)瓶(步驟詳見Zalfa Abdel-Malek et al.，Journal of Cellular Physiology，150∶416-25(1992))。用于上述兩種提取物和保存細(xì)胞的培養(yǎng)基包含Ham F-10培養(yǎng)基，10-4M3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，5%熱失活胎牛血清，5%新生牛血清，5微克/毫升胰島素，2微克/毫升α-生育酚，2微克/毫升轉(zhuǎn)鐵蛋白，5納克/毫升TPA，20納克/毫升霍亂毒素，10，000單位/毫升青霉素，以及10，000微克/毫升鏈霉素。細(xì)胞仍于37℃保存在含5%CO2的濕潤的溫育器中。然后按0.15×106細(xì)胞/孔的密度將黑素細(xì)胞種于一起的6個孔中(表面積9.6平方厘米)。其余步驟，包括移植前和移植后(12至15周)皮膚蛋白質(zhì)抽提物的提取，同實施例1。
測定了不同濃度(25-100微克/毫升)蛋白質(zhì)抽提物處理的正常黑素細(xì)胞中的酪氨酸酶活性。依然觀察到了移植后蛋白抽提物低濃度處理酪氨酸酶活性的增加和隨后的較高濃度處理酪氨酸酶活性劑量依賴性的下降。觀察到的每種濃度下酪氨酸酶活性的變化與實施例1中記錄的黑素瘤細(xì)胞的結(jié)果大致相同，培養(yǎng)在100微克/毫升移植后蛋白質(zhì)抽提物中的細(xì)胞中酪氨酸酶活性下降50%。用移植前皮膚蛋白質(zhì)抽提物處理的細(xì)胞不表現(xiàn)任何統(tǒng)計上有意義的酪氨酸酶活性的變化。由此，存在于移植后皮膚蛋白質(zhì)抽提物中的黑素生成抑制因子對正常黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞兩者具有同等的抑制作用。
實施例3為了檢測移植前和移植后皮膚蛋白質(zhì)抽提物中所含的不同蛋白質(zhì)，進(jìn)行了單向0.1%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。電泳使用15%丙烯酰胺凝膠，采用Laemmli所述的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)(報道于Nature227∶680-5(1970))。用考馬斯亮蘭R-250染色顯示蛋白質(zhì)帶。對移植前和移植后粗抽提物(2000×g)和上清液(100，000×g)(按實施例1所述方法制備)都進(jìn)行了分析。此外，用TritonX-100抽提100，000×g離心后的沉淀物，以溶解任何顆粒部分，并同樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
在移植前粗抽提物和上清液蛋白質(zhì)電泳結(jié)果之間沒有觀察到明顯的差異。同樣，在移植后粗抽提物和上清液之間，也沒有明顯的差異。然而，在移植前和移植后蛋白質(zhì)電泳結(jié)果之間，存在顯著的差異。最顯著地是在移植后皮膚樣品中獨有地出現(xiàn)一條13至14KDa的雙帶。而且，用TritonX-100抽提沉淀所得部分不包含這條蛋白質(zhì)帶，表明這條帶含有可溶性蛋白質(zhì)。同時，將移植后皮膚真皮和表皮撕開，重復(fù)上述步驟。兩種樣品中都存在13至14KDa蛋白質(zhì)帶，但在表皮中顯示程度更強(qiáng)。
同樣，對在宿主上存在不同長短時間的移植后皮膚也進(jìn)行了上述分析。該13至14KDa蛋白質(zhì)帶早在移植后兩周就出現(xiàn)了，并且持續(xù)顯現(xiàn)超過移植后14周。在移植后2周和14周樣品之間，未記錄到蛋白質(zhì)帶型的任何明顯的差異。
實施例4為了確定該13至14KDa蛋白質(zhì)帶是否含多種蛋白質(zhì)，對移植前后兩者皮膚上清液進(jìn)行了雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳。不過先用DEAE-纖維素柱(15厘米×1.5厘米)對移植后皮膚上清抽提物(如實施例1所述方法得到)進(jìn)行離子交換色譜分析。將上清液(15毫升)加到色譜柱上，用磷酸鹽緩沖洗柱以洗脫未結(jié)合的蛋白質(zhì)。每5分鐘收集5毫升級分，并對每一收集的級分測定280納米光吸收。用磷酸鹽緩沖液洗柱直至洗脫級分光吸收近于可忽略不計。此后，用0至1.0M的鹽梯度(Nacl于磷酸鹽緩沖液中)洗脫柱中結(jié)合的蛋白質(zhì)。各級分光譜分析結(jié)果表明存在兩個分立的吸收峰(280納米處)。
接著，收集與兩吸收峰有關(guān)的級分，并對含0.02%疊氮鈉的重蒸餾水充分透析至少36小時。然后將透析峰樣品凍干過夜以獲取干粉。再將干粉溶于蒸餾水。并測定蛋白質(zhì)含量。然后將此兩峰級分分別進(jìn)行雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
為了進(jìn)行雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，將含700-800微克蛋白質(zhì)的兩峰級分小份樣品凍干。然后將兩份樣品溶于9M尿素，其中含2%CHAPS去垢劑(購自SigmaChemicalCo.)、2%兩性電解質(zhì)(pH3-10)和2%β-巰基乙醇，室溫下保溫2小時。14，000rpm離心15分鐘后，將樣品加樣于等電聚焦凝膠。用兩性電解質(zhì)(pH3-10)進(jìn)行等電聚焦電泳，700伏過夜(如Farrell，J.Biol.Chem.250∶4007-21，(1975)所述)。然后將凝膠用SDS-平衡緩沖液平衡至少15分鐘，再上樣至平板凝膠，用15%凝膠進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠用考馬斯亮蘭染色，以顯示不同的蛋白質(zhì)斑點。
在移植后皮膚上清液樣品中，第一吸收峰級分中的13至14KDa蛋白質(zhì)帶可分辨出四個蛋白質(zhì)斑點，其等電點pI值在6.5至7.5之間。然而，第二個吸收峰級分在此分子量范圍內(nèi)，沒有顯示任何蛋白質(zhì)。同樣，當(dāng)對移植前皮膚樣品重復(fù)上述步驟時，沒有顯現(xiàn)這些蛋白質(zhì)。由此可看出，在移植后皮膚中發(fā)現(xiàn)的13至14KDa蛋白質(zhì)帶實際上包含四種不同的蛋白質(zhì)。
實施例5為了分離和試驗13至14KDa蛋白質(zhì)帶中包含的四種蛋白質(zhì)，采用了電洗膠。移植后皮膚上清液經(jīng)實施例3步驟進(jìn)行單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將未染色凝膠與染色凝膠(作為標(biāo)記)并排放置，從未染色凝膠中切下該13至14KDa蛋白質(zhì)帶。然后將凝膠切碎，轉(zhuǎn)移到SchleicherandSchuell電洗脫裝置的電洗脫槽中(購自S.S.Inc.，Keene，NH)。加入含20mMTris、150mM甘氨酸和.05%SDS的緩沖系統(tǒng)，150伏電洗脫過夜。然后收集電洗脫級分，用Centricon-3濃縮器濃縮、透析(得自AmiconCorp.，divisionofW.R.Grace&Co.，Beverly，MA)，至體積約0.5毫升。最后，將此濃縮的13至14KDa蛋白質(zhì)混合物過濾滅菌，并測定蛋白質(zhì)含量。
按照實施例1的步驟，來檢測電洗脫蛋白質(zhì)對黑素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶活性的影響。將從移植后皮膚上清液中獲得的13-14KDa蛋白質(zhì)混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)物中，濃度范圍從0.25到1.0微克/毫升。為了保證觀察到的效應(yīng)的確是由于來自移植后皮膚的13-14Da帶中的蛋白質(zhì)混合物所致，也用移植前皮膚上清液進(jìn)行了同樣的步驟。
得自移植后皮膚的13-14KDa蛋白質(zhì)混合物引起了黑素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶活性相當(dāng)顯著的劑量依賴性下降。事實上，在蛋白質(zhì)濃度為1.0微克/毫升時，幾乎下降90%。作為對照，用相應(yīng)量的得自移植前皮膚上清液的溶液進(jìn)行試驗，結(jié)果只引起酪氨酸酶活性輕微的，不顯著的下降。
當(dāng)用正常人黑素細(xì)胞(按實施例2方法所得)重復(fù)同樣的試驗時，該13-14KDa蛋白質(zhì)混合物同樣引起酪氨酸酶活性下降。濃度為0.25微克/毫升時，觀察到酪氨酸酶活性大約下降37%;0.5微克/毫升時，觀察到下降約為53%。當(dāng)使用移植前皮膚抽提物時，觀察到酪氨酸酶活性下降非常小。這些結(jié)果表明，存在于移植后皮膚抽提取物中的黑素生成抑制因子包含在該13-14KDa蛋白質(zhì)混合物中。
實施例6通過檢測3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入(此為細(xì)胞中DNA合成速率的量度)，測定了移植前和后皮膚抽提物對細(xì)胞增殖的影響。很明顯，黑素細(xì)胞增殖的降低將會引起受觀察皮膚色素沉著的相應(yīng)降低，因為黑素細(xì)胞直接負(fù)責(zé)色素產(chǎn)生。將Cloudman黑素瘤細(xì)胞接種于一96孔平底培養(yǎng)板上，200微升/孔。使F-10生長培養(yǎng)基中的細(xì)胞附著，第二天用100微升新鮮培養(yǎng)基和選定量的皮膚蛋白質(zhì)抽提物替換一半體積的培養(yǎng)基。每一實驗組包含6孔。經(jīng)24小時處理后，再用新鮮培養(yǎng)基和皮膚蛋白質(zhì)抽提物替一半培養(yǎng)基。在后一處理期間，將細(xì)胞用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(1微居里/孔)脈沖標(biāo)記。
培育24小時后，用半自動PHD細(xì)胞收獲器(購自CambridgeTechnology)將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾膜上。濾膜于空氣中過夜干燥，分別轉(zhuǎn)移到閃爍小瓶中，用450微升Protosol組織和凝膠溶解液處理。然后將小瓶置于烘箱中，66℃保溫75分鐘，再冷卻。接著，第一小瓶中加入100微升冰醋酸和9.5毫升EconoFluor-2(一種非水性閃爍液)。小瓶置于冷凍閃爍計數(shù)器中冷卻24小時，然后測定每分鐘計數(shù)。
在使用13-14KDa蛋白質(zhì)混合物(如實施例5電洗脫)的樣品中，觀察到對黑素瘤細(xì)胞增殖劑量依賴性的抑制(與對照樣品比較)。蛋白質(zhì)混合物濃度為0.25微克/毫升時，這種抑制超過30%;濃度為0.50微克/毫升時抑制幾乎為50%。作為對照，用移植前皮膚抽提物處理的黑素瘤細(xì)胞只表現(xiàn)出輕微的不顯著的抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)用正常人黑素細(xì)胞重復(fù)這些試驗時，13-14KDa蛋白質(zhì)混合物對正常黑素細(xì)胞增殖抑制程度相同。同樣，移植前皮膚抽提物并不抑制正常黑素細(xì)胞的增殖。
為了研究其形態(tài)學(xué)，也用相差顯微鏡觀察了培養(yǎng)后的黑素瘤細(xì)胞。在沒有處理的細(xì)胞(對照)和用移植前皮膚抽提物處理的細(xì)胞樣品中，細(xì)胞看來是正常健康的，具有顯著延伸到細(xì)胞間并形成特征網(wǎng)絡(luò)的樹突。作為對照，用13-14KDa蛋白質(zhì)混合物處理的細(xì)胞是不健康的，有很多不附著的、漂浮的死細(xì)胞。事實上，僅有大約40%細(xì)胞存活，細(xì)胞密度下降很多。此外，從余下的細(xì)胞中，很少有樹突延伸出來，實際上所有細(xì)胞形狀都是圓的。這清楚地表明，黑素生成抑制因子不但抑制色素細(xì)胞增殖，而且對黑素瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。
實施例7為了確定從移植后的皮膚中分離的13-14KDa蛋白質(zhì)混合物是否只是一種一般代謝抑制劑，用正常人成纖維細(xì)胞重復(fù)了3H-胸腺嘧啶脫氧核苷細(xì)胞增殖試驗。正常人二倍體所生兒包皮成纖維細(xì)胞購自Clonetics Corporation，并在到貨后，在T-25瓶中，用加有10%胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)。37℃培育三天后，將成纖維細(xì)胞用胰蛋白酶處理，以每平方厘米3，000個細(xì)胞的密度接種到48孔微量滴定板上。然后37℃培育三天。接著，將培養(yǎng)基換成含0.2%血清的DMEM，細(xì)胞在這種環(huán)境保持四到五天，不加任何其他添加物。
進(jìn)行了兩種類型的試驗激動劑和拮抗劑。在激動劑試驗中，將不同濃度的移植后皮膚蛋白質(zhì)抽提液加入隨機(jī)選擇的孔中。用成纖難細(xì)胞生長因子(FGF)作為陽性對照。同時加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(以研究增殖)或3H-脯氨酸(以研究膠原產(chǎn)生)。細(xì)胞在此培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)二天(增殖)和四天(膠原產(chǎn)生)。然后移去培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞，然后用SDS溶解細(xì)胞。將1毫升溶解物加到9毫升閃爍液中并計數(shù)。拮抗劑試驗采用同樣的步驟，只是還將FGF加到含蛋白質(zhì)混合物的每個孔中，以確定是否混合物中的活性組分與FGF競爭并表現(xiàn)出3H-胸腺嘧啶脫氧核苷或3H-脯氨酸摻入的相應(yīng)降低。在激動劑或拮抗劑試驗中，蛋白質(zhì)抽提物對細(xì)胞增殖和膠原產(chǎn)生沒有顯示出任何效應(yīng)，無論其濃度如何。因此，明顯地，13-14KDa蛋白質(zhì)混合物的作用是對色素細(xì)胞特異的，而且該混合物中的黑素生成抑制劑也不僅僅是一種一般代謝抑制劑。
實施例8
實施例4所述的研究表明，起黑素生成抑制作用的13-14KDa蛋白質(zhì)混合物實際上包含四種不同的蛋白質(zhì)，因此，進(jìn)行了試驗以確定其中哪種蛋白質(zhì)與觀察到的效應(yīng)有關(guān)。用如實施例4的DEAE-纖維素離子交換柱將移植后皮膚上清液分級分離。收集合并與第一個峰相應(yīng)的級分(見實施例4)，再將此混合物透析、凍干。然后進(jìn)行雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(如實施例4所述)，以將此蛋白質(zhì)混合物分成前面發(fā)現(xiàn)的四種不同的蛋白質(zhì)。用考馬斯亮蘭將凝膠染色，分別從凝膠中切下四種蛋白質(zhì)“斑點”。然后將四種蛋白質(zhì)的每一種從凝膠中電洗脫下來(如前所述)并濃縮。再測定所得溶液的蛋白質(zhì)含量。這樣，獲得四種純化的蛋白質(zhì)(相互分離的)。
用前述的步驟研究Cloudman黑素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶活性和3-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入。這些試驗中采用蛋白質(zhì)濃度大約1.0微克/毫升的每一種純化蛋白質(zhì)，作為對照，實驗中包含了未處理的和α-MSH(10-7M)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物。用與第三種蛋白質(zhì)“斑點”對應(yīng)的純化蛋白質(zhì)處理的培養(yǎng)物，其酪氨酸酶活性大約下降40%。但是，用其余三種蛋白質(zhì)處理的培養(yǎng)物，未顯示酪氨酸酶活性的明顯下降。類似地，當(dāng)對應(yīng)于第三“斑點”的純化蛋白質(zhì)存在時，細(xì)胞增殖受到顯著的抑制(約45%)，但其他蛋白質(zhì)對細(xì)胞增殖沒有明顯影響。
根據(jù)這些試驗，顯然從第三種凝膠“斑點”電洗脫下來的蛋白質(zhì)是與前面觀察到的黑素生成抑制作用和細(xì)胞增殖抑制作用有關(guān)的。前面的雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，這種對應(yīng)于第三“斑點”的黑素生成抑制因子(“MI”)蛋白質(zhì)，其分子量約為14，000，等電點大約在7.2至7.5之間。
實施例9為了測定該13-14KDa蛋白質(zhì)混合物中所含四種蛋白質(zhì)的氨基酸順序，再對按前述方法分級分離的移植后皮膚抽提物進(jìn)行雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。將蛋白質(zhì)印跡到ImmobilonPSQ(一種聚二氟乙烯膜)，用酰胺黑染色顯示。然后從印跡處切下四種“斑點”，與碘乙酰胺反應(yīng)，再進(jìn)行順序測定。蛋白質(zhì)順序測定在AppliedBiosystems475A蛋白測序儀上按脈沖液相化學(xué)法進(jìn)行(Speicher，D.W.，(1989)，TechniquesinProteinChemistry，(T.E.HugliEd.)，AcademicPress，SanDiego，CA，pp.24-35)。
第一“斑點”部分N-端氨基酸順序分析表明，該蛋白質(zhì)與小鼠transthyretin或前清蛋白相同。Transthyretin是一種血清蛋白質(zhì)，分子量55KDa，但是它是由四種相同的亞基組成，亞基分子量約為14KDa。第二“斑點”順序分析表明，該蛋白質(zhì)與血紅蛋白一條鏈有很高的同源性。第四“斑點”的順序與已知蛋白質(zhì)只有很低或沒有同源性。
由于完整的MI蛋白質(zhì)(第三“斑點”)的N-端氨基酸順序分析表明，該蛋白質(zhì)N-端是封閉的，因此決定用蛋白酶將其消化成片段，然后對產(chǎn)生的肽段測序。將四個ImmobilonPSQ印跡點MI蛋白質(zhì)切下，還原，用碘乙酰胺烷化，再用內(nèi)切蛋白酶LysC消化(Stone，K.L.，M.B.LoPresti，J.M.Crawfrod，R.DeAngelisandK.R.Willims，(1989)，APracticalGuidetoProteinandPeptidePurificationforMicrosequencing，，(P.T.Matsudaira，Ed.)，AcademicPress，SanDiego，CA，pp.31047)。
MI蛋白質(zhì)蛋白酶解后，對其中第二峰的順序測定更為成功，并得到下列氨基酸順序
SEQIDNO1ThrGlnThrValXaaAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHis151015GlnGluXaaXaaGlyLys20“Xaa”表示的位點是指尚未確證或根本就沒能測定的位點。將第5位暫定為Cys，第19位暫定為Asp。有趣的是，該蛋白質(zhì)片段C-端12個氨基酸中有(個與小鼠脂肪酸結(jié)合蛋白(mFABP)的一個區(qū)域相對應(yīng)，但是該片段N-端沒有發(fā)現(xiàn)任何明顯的同源性。
得自MI蛋白質(zhì)的第三峰的順序測定如下SEQIDNO2LeuValValGluCysValMetAsnAsnValThrCysThrArgXaa151015TyrGluLys此外，將第15位暫定為Ile。此例中，該片段18個氨基酸的13個與mFABP一區(qū)域?qū)?yīng)，在第12，15和18位氨基酸處僅有保守的改變。
在此序列測定的基礎(chǔ)上，顯然MI蛋白質(zhì)與mFABP高度相關(guān)，雖然肯定不是相同的。小鼠脂肪酸結(jié)合蛋白屬于一個蛋白質(zhì)家族，其中包括脂肪酸結(jié)合蛋白、視黃酸結(jié)合蛋白、脂肪細(xì)胞分化蛋白質(zhì)和髓磷脂P2蛋白，而且，根據(jù)兩段已測定的順序，預(yù)計MI蛋白質(zhì)也是該家族的一員。這樣，由于該家族中大部分蛋白質(zhì)包含大約131個氨基酸，進(jìn)一步可以預(yù)計MI蛋白質(zhì)包含大約131個氨基酸。MI蛋白質(zhì)與已知的蛋白質(zhì)如mFABP有密切的同源性，這一事實也強(qiáng)有力地表明，如申請人的研究所示，它是一種生物學(xué)有關(guān)的分子。
實施例10為了測定MI蛋白質(zhì)的全順序，制備了針對MI蛋白質(zhì)的合適的寡核苷酸探針，如下所列5′-CAGCCCGCCCGCACC-3′5′-AAAAAAGAAAGAAACAGTATG-3′利用這些寡核苷酸對人皮膚RNA進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中人皮膚是按前述方法移植到裸鼠后所得。PCR反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的編碼MI蛋白質(zhì)的單一大小的DNA。然后將分離的DNA克隆到順序測定載體并按已知方法測定其順序。核酸序列如下所示(相應(yīng)的MI蛋白質(zhì)氨基酸順序與列于對應(yīng)的密碼子之下，數(shù)目表示MI蛋白質(zhì)中氨基酸的位置)SEQIDNO3ATGGCCACAGTTCAGCAGCTGGAAGGAAGATGGCGCCTGGTGMetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510GACAGCAAAGGCTTTGATGAATACATGAAGGAGCTAGGAGTGAspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GGAATAGCTTTGCGAAAAATGGGCGCAATGGCCAAGCCAGATGlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540TGTATCATCACTTGTGATGGTAAAAACCTCACCATAAAAACTCysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055
GAGAGCACTTTGAAAACAACACAGTTTTCTTGTACCCTGGGAGluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GAGAAGTTTGAAGAAACCACAGCTGATGGCAGAAAAACTCAGGluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ACTGTCTGCAACTTTACAGATGGTGCATTGGTTCAGCATCAGThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GAGTGGGATGGGAAGGAAAGCACAATAACAAGAAAATTGAAAGluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110GATGGGAAATTAGTGGTGGAGTGTGTCATGAACAATGTCACCAspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125TGTACTCGGATCTATGAAAAAGTAGAATAACysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135為簡明起見,整個MI蛋白質(zhì)順序如下所示:
SEQIDNO:4:
MetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510AspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025
GlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540CysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110AspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125CysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135為了證明SEQ ID NO4確實是MI蛋白質(zhì)，按熟知的方法從SEQ ID NO4重組表達(dá)出一種蛋白質(zhì)。然后通過檢測3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入速率(與實施列6方式類似)，測定該重組表達(dá)蛋白質(zhì)對黑素細(xì)胞增殖的效應(yīng)。結(jié)果觀察到顯著的對黑素細(xì)胞增殖的劑量依賴性抑制，這清楚表明，從SEQ ID NO4重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的確是MI蛋白質(zhì)。因此，MI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)便如SEQ ID NO4所示。如熟悉本領(lǐng)域人員所能認(rèn)識的，SEQ ID NO3也可用于熟知的方法，來證明根據(jù)申請人的的合成方法制備的任何產(chǎn)物的確是MI蛋白質(zhì)。
實施例11為了檢測MI蛋白質(zhì)對色素過多沉著的移植皮膚的體內(nèi)影響，將包含MI的完整13-14KDa蛋白質(zhì)混合物注射到按前述方法預(yù)先移植到裸鼠上的人皮膚中。在這些試驗中用了七只小鼠，而且試驗前這些小鼠已經(jīng)支持人皮膚移植物10至12個月。這些試驗的異種移植物中存在不同程度的色素過多沉著。
將用于試驗的小鼠進(jìn)一步分成一個實驗組(5只小鼠)和一個對照組(其余2只小鼠)。對照組小鼠不給予任何注射。實驗組中，按每周間隔，在人皮膚移植物左側(cè)進(jìn)行皮下注射，共注射5周。每次注射劑量為50微升溶液，其中包含2微克蛋白質(zhì)混合物，其余為生理鹽水。作為一種內(nèi)部對照，按同樣時間間隔在移植物右側(cè)注射50微升生理鹽水。在第一輪5次注射一周之后，重復(fù)進(jìn)行整個試驗方案。但是，第二輪5次注射時，注射部位改變了。在此期間，蛋白質(zhì)混合物注射到移植物背部區(qū)域，而生理鹽水(對照)注射到移植物腹部區(qū)域。
在一系列注射之前，第一輪5次注射之后一周(但在第二輪注射之前)以及最后注射之后分別對皮膚移植物進(jìn)行了活組織檢查。活檢部位取自注射蛋白質(zhì)級分和生理鹽水的位點附近。也對對照組進(jìn)行了活組織檢查。
對每一活檢中多巴陽性黑素細(xì)胞進(jìn)行了計數(shù)，試驗的總結(jié)果如下列于表1。多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)目是黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性的一種直接量度。示于表1的結(jié)果表明，含MI蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物能降低酪氨酸酶活性。多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)目的減少從9.0%到32.3%。對照組或?qū)嶒灲M注射生理鹽水部位的活檢結(jié)果，表明沒有任何明顯的減少。
表1多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)目的減少(%)小鼠蛋白質(zhì)混合物注射部位鹽水注射部位A32.32.5B29.01.3C24.60D9.00E10.12.0F-對照00G-對照00目視檢查小鼠表明，經(jīng)過僅兩次蛋白質(zhì)混合物注射之后，色素過多沉著明顯減少，特別是注射部位。在對照組或?qū)嶒灲M注射生理鹽水部位，沒有觀察到這種減少。
將幾個活檢切片還用蘇木精和曙紅染色，進(jìn)行顯微鏡觀察，以檢查由于蛋白質(zhì)混合物的注射引起的任何形態(tài)學(xué)變化。實驗組和對照組之間沒有什么差別，兩組都沒有表現(xiàn)出任何表皮或真皮損傷或毒性的跡象。由此，MI蛋白質(zhì)能夠減少色素過多沉著而不引起不希望產(chǎn)生的副作用。
實施例12為了檢測MI蛋白質(zhì)在預(yù)防或延緩移植后通常立刻發(fā)生的皮膚移植物色素過多沉著中的作用，將實施例11中使用的蛋白質(zhì)混合物也注射到剛剛支持人皮膚移植物2周的裸鼠上。采用實施例11中的方法，不過只進(jìn)行第一輪5次注射。將蛋白質(zhì)混合物注射到皮膚移植物背部，生理鹽水注射到腹部。在將要進(jìn)行第一次注射前，對多巴陽性黑素細(xì)胞進(jìn)行起始計數(shù)。
目視檢查小鼠揭示出在蛋白質(zhì)混合物注射部位色素過多沉著有些減少。更為重要的是，如表2所示，從蛋白質(zhì)混合物注射部位取樣活檢表明，多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)目又一次顯著減少。如所預(yù)料，作為對照，從對照組和實驗組生理鹽水注射部位取樣活檢，表明多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)目增加。增加范圍從190%到300%，而含MI的蛋白質(zhì)混合物引起的減少范圍從8.3%到31.6%。注射蛋白質(zhì)混合物的小鼠也無任何毒性跡象。這一結(jié)果證實，MI蛋白質(zhì)能防止或逆轉(zhuǎn)色素過多沉著，很可能是通過改變酪氨酸酶活性，而不是通過影響細(xì)胞生活能力。
表2多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)目的減少(%)小鼠蛋白質(zhì)混合物注射部位鹽水注射部位H-31.6+230I-17.5+300J-11.2+210K-27.5+190L-8.3+200M-對照>+200+240N-對照>+200+228實施例13另外也檢查了MI蛋白質(zhì)對色素正常的小鼠(C57BL/6)的體內(nèi)效應(yīng)。這種特殊類型的小經(jīng)證明對于研究色素沉著和毛發(fā)生長是有用的，因為這種小鼠軀干皮膚色素沉著起源于毛囊中而不是表皮中的黑素細(xì)胞。一旦將這些毛囊除去，下面的皮膚就由于黑素細(xì)胞的減少而變得色素減少。雖然毛囊除去后馬上又會長出來，但皮膚的色素沉著再發(fā)生要5到6天之后。這樣，這種小鼠是一種良好模型，用于檢查MI蛋白質(zhì)在延緩色素重新沉著中的作用。
使用5只C57BL/6小鼠，從背部左右兩邊小塊區(qū)域除去毛囊。將實施例11中所用的蛋白質(zhì)混合物(體積50微升，含2微克蛋白質(zhì)混合物)皮下注射到每只小鼠左背部除去毛囊區(qū)域。作為對照，將獲自正常人皮膚(在任何移植之前)的電洗脫13至14KDa蛋白質(zhì)級分注射到每只小鼠右背部區(qū)域。該正常人皮膚蛋白質(zhì)級分按前述相同方法獲得。每天注射1次，共5天。每天照相以監(jiān)測皮膚顏色變化，并從每只小鼠左右背部區(qū)域取樣活檢。
注射含MI蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物的左背部區(qū)域，在僅注射2次之后，就表現(xiàn)出皮膚顏色減淡，而右背部區(qū)域未觀察到皮膚顏色明顯減淡。此外，與右邊(對照)相比，左背部區(qū)域新毛囊的出現(xiàn)也延遲了。
對左右背部區(qū)域兩邊取樣進(jìn)行活檢，其蘇木精和曙紅染色圖象看來是正常的，兩者間也沒觀察到任何形態(tài)學(xué)差異。另外也沒有任何毒性跡象，但是注射了含MI蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物的左背部區(qū)域的活檢結(jié)果顯示出毛囊中黑色素染色減少(如多巴染色所示)。B.藥用和化妝品組合物及方法如本文中所用，“局部施用”指直接敷于或涂布于皮膚外部;“皮膚注射”指通過皮下注射針將物質(zhì)引入皮下或皮膚中;“包含”、“包括”(comprising)指可以加入不影響最終結(jié)果的其它步驟和其它成分。這最后一個術(shù)語就包含了“由…組成”和“基本由…組成”。
本發(fā)明還涉及到一種組合物，包含a)一種抑制色素細(xì)胞中黑素生成的足夠純的蛋白質(zhì)，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或類似物，所述蛋白質(zhì)分子量約為14，000，等電點大約在7.2到7.5之間，以及具有SEQIDNO4的氨基酸順序;和b)一種化妝用或藥用可接受的載體。在本發(fā)明的一項實施方案中，該載體是一種可注射的載體。在本發(fā)明的另一項實施方案中，該載體是一種局部應(yīng)用的載體。
本發(fā)明的組合物包括固體的，半固體的，或液體的在化妝品方面和/或生理學(xué)上可接受的載體，以使MI蛋白質(zhì)，或其活性片段、衍生物或類似物能夠以合適的濃度釋放到所需靶部位。載體本身可以是惰性的或者可以具有生理的或藥用的價值。載體的性質(zhì)將由所選擇的該組合物的用法所決定。安全有效的載體的量比較好的是占組合物的約50%到約99.9999%，更好是約90%到約99.9%。這些載體配方的變化將會導(dǎo)致產(chǎn)生大量不同的產(chǎn)品，它們都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。MI蛋白質(zhì)或其活性片段、組合物的用法可以從體內(nèi)給藥法如注射到局部外用法。
MI蛋白質(zhì)或其活性片段較好的給藥法是通過皮膚注射。這種給藥法的輔助載體較好的是包括水或鹽溶液，理想的是等滲鹽溶液。
MI蛋白質(zhì)或其活性片段更好的用法是局部施用。本發(fā)明的局部藥用組合物可以制成大量不同類型的產(chǎn)品。包括(但不局部于)洗劑、冷霜類、防曬油類、凝膠、粘劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、摩絲和化妝品。這些產(chǎn)品種類可以包括幾種類型的載體系統(tǒng)，包括(但不局限于)溶液、乳劑、凝膠和固體。
本發(fā)明的局部藥用組合物還包含一種局部藥用可接受的潤膚劑，含量從約2%到約50%。如本文中所用，“潤膚劑”指用于預(yù)防或減輕皮膚干燥及保護(hù)皮膚的物質(zhì)。已知大量合適的潤膚劑可以用于此處。Sagarin，Cosmetics，ScienceandTechnology，2ndEdition，Vol.1，pp32-43(1972)(結(jié)合于此作為參考)包含大量合適物質(zhì)的例子。特別有用的具有護(hù)膚作用的潤膚劑為甘油、己三醇、丁三醇、乳酸及其鹽、尿素、吡咯烷酮羧酸及其鹽、氨基酸類、胍、雙甘油和三甘油。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種抑制哺乳動物皮膚和/或毛發(fā)中黑素生成的方法。該方法包括用安全有效量的MI蛋白質(zhì)或其活性片段、衍生物或類似物處理皮膚和/或毛發(fā)。根據(jù)受試者已經(jīng)存在的色素沉著和/或黑素生成水平以及所希望的黑素生成抑制程度，所用的MI蛋白質(zhì)或其活性片段的劑量和處理頻度將有廣泛變動。
較好的處理皮膚和/或毛發(fā)的方法是經(jīng)皮注射安全有效劑量的MI蛋白質(zhì)或其活性片段來抑制哺乳動物皮膚和/或毛發(fā)中的黑素生成。MI蛋白質(zhì)或其活性片段注射所用的載體較好的是包括水或鹽溶液。根據(jù)個人需要，皮膚注射的MI蛋白質(zhì)或其活性片段的量及注射頻度可有很大變動。作為皮膚注射處理的一個例子，建議將包含MI蛋白質(zhì)或其活性片段的適于皮膚注射的組合物按每天一次到每六個月一次進(jìn)行皮膚注射，較好的是從每周三次到第月一次，更好是每周一次到每月兩次。用于皮膚注射的組合物可包含約0.0001%到約10%，較好的是約0.001%到約5%，更好的是0.01%到1%的MI蛋白質(zhì)。注射期可以為約一個月到約十年，較好的是約三個月到約兩年，更好是的約六個月到約一年，從而對哺乳動物皮膚和/或毛發(fā)黑素生成產(chǎn)生抑制作用。
更好的一種處理皮膚和/或毛發(fā)的方法是通過局部施用安全有效量的MI蛋白質(zhì)或其活性片段來抑制哺乳動物皮膚和/或毛發(fā)中的黑素生成。根據(jù)個人需要，MI蛋白質(zhì)或其活性片段的量以及局部施用于皮膚和/或毛發(fā)的頻度可變化很大，但作為一個例子，建議局部施用可從約每周一次到約每天十次，較好是約每周兩次到約每天四次，更好是每周三次到每天兩次，最好是約每天一次。局部施用組合物可包括約0.001到約20%、較好為約0.01%到約10%、更好為約0.1%到約5%的MI蛋白質(zhì)或其活性片段、衍生物或類似物。局部施用期較好是從約一個月到約十年，更好為約三個月到約兩年、再好些為約六個月到約一年，從而對哺乳動物皮膚和/或毛發(fā)中的黑素生成產(chǎn)生抑制作用。
下面的實施例進(jìn)一步描述和論證本發(fā)明范圍內(nèi)某些較好的具體實施方案。給予實施例僅為了說明起見，而不能認(rèn)為是對本發(fā)明的限制，因為它們的很多變化是可能的，而不會違背本發(fā)明的精神實質(zhì)和范圍。這些實施例僅僅用來證實可以怎樣使用本發(fā)明的黑素生成抑制劑。
實施例14利用常規(guī)混合技術(shù)，將下列組分合并制成一種水包油乳劑。
組分占組合物的重量百分比去離子水足夠量甘油3羥苯甲酸甲酯0.2MI蛋白質(zhì)0.1Steareth20(Brij78R)1單硬脂酸甘油酯和PEG1000.5(Arlacel165R)Carbopol940(B.F.Goodrich，0.2Cleveland，OH)99%三乙醇胺0.2十六烷醇1.0十八烷醇1.0羥苯甲酸丙酯0.1Diisiopropyldimerate2.0C12-C15醇苯甲酸酯 6.0咪唑烷醇尿素0.3該組合物局部施用抑制皮膚和/或毛發(fā)中的黑素生成是有用的。使用組合物的量為足以使皮膚和/或毛囊沉積MI蛋白質(zhì)約0.01毫克/平方厘米的量。該組合物每天施用一次，可終身使用。
實施例15利用常規(guī)混合技術(shù)合并下列組分制成一種透明凝膠。
組分占組合物的重量百分比去離子水足夠量Carbopol980(B.F.Goodrich，0.5Cleveland，OH)EDTA-2Na0.02SEQIDNO10.599%三乙醇胺0.5丙二醇3.0羥苯甲酸甲酯0.2該組合物局施用抑制皮膚和/或毛發(fā)中的黑素生成是有用的。使用組合物的量為足以使皮膚和/或毛囊中沉積的MI蛋白質(zhì)活性片段約0.01毫克/平方厘米的量。該組合物每天施用三次，使用六個月。
實施例16利用常規(guī)混和方法合并下列組分制成一種水包油聚合物乳劑。
組分占組合物的重量百分比去離子水足夠量Carbopol980(B.F.Goodrich，0.2Cleveland，OH)PemulenTR-2(B.F.Goodrich，0.15Cleveland，OH)甘油3.0SEQIDNO20.7599%三乙醇胺0.35棕櫚酸鯨蠟酯2.0二氧代硬脂酰三甲基硅烷和1.0十八烷醇角鯊?fù)?.0羥苯甲酸丙酯0.1
羥苯甲酸甲酯0.2咪唑烷醇尿素0.3該組合物局部施用抑制黑素生成是有用的。用量為足以使皮膚和/或毛囊沉積的MI蛋白質(zhì)活性片段達(dá)0.1毫克/平方厘米的量。該組合物每周施用一次，使用一年。
實施例17利用常規(guī)混合技術(shù)合并下列組分制成一種水包油微乳狀液。
組分占組合物的重量百分比去離子水足夠量MI蛋白質(zhì)1.0PEG4脫水山梨醇單月桂酸酯22.5PEG5脫水山梨醇單油酸酯2.5Cetearyl，octanoate25.0DMDM乙內(nèi)酰脲和3-碘-2-0.2丙炔基丁基氨基甲酸酯(glydantplus)該組合物局部施用抑制黑素生成是有用的。用量為足以使皮膚和/或毛囊中沉積的MI蛋白質(zhì)達(dá)0.4毫克/平方厘米的量。該組合物每周施用三次，使用五年。
可以理解，能進(jìn)行修改而不違背本發(fā)明的精神實質(zhì)。這樣，可以理解申請人的發(fā)明不僅包括完整MI蛋白質(zhì)及其使用和制備的方法，而且包括MI蛋白質(zhì)的活性片段。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制備MI蛋白質(zhì)的衍生物和類似物，例如對MI順序中一個或多個氨基酸進(jìn)行保守改變。此外，非肽類模擬物也可以按照MI蛋白質(zhì)的活性片段而模仿出來，這樣，這些模擬物并不違背本發(fā)明的精神實質(zhì)。相應(yīng)地，本發(fā)明的范圍應(yīng)該按下列權(quán)利要求書考慮，而且可以理解，它并不局限于說明書中所顯示和描述的。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生抑制色素細(xì)胞黑素生成的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括下列步驟(a)將哺乳動物皮膚移植到活的宿主上；(b)使所述哺乳動物皮膚在所述活的宿主上保持預(yù)定的一段時間；(c)從所述宿主移去所述哺乳動物皮膚；和(d)從所述皮膚中提取所述蛋白質(zhì)。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征還在于，所述宿主是裸鼠。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其特征還在于，哺乳動物皮膚是人皮膚。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征還在于，使所述人皮膚在所述宿主上至少保持兩周。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的所述提取包括下列步驟(a)用生理鹽水從所述皮膚提取一種皮膚蛋白質(zhì)抽提物;(b)通過離子交換色譜法將所述皮膚蛋白質(zhì)分級分離成至少兩種溶液，其中至少一種所述溶液包括所述蛋白質(zhì);(c)將包含所述蛋白質(zhì)的一種所述溶液進(jìn)行雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以在聚丙烯酰胺凝膠上將所述蛋白質(zhì)分離成一個斑點;和(d)從所述斑點電洗脫所述蛋白質(zhì)。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其特征還在于，所述蛋白質(zhì)具有下列氨基酸順序SEQIDNO4。
7.一種抑制色素細(xì)胞黑素生成的足夠純化的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有下列氨基酸順序SEQIDNO4，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或類似物。
8.一種抑制色素細(xì)胞黑素生成的足夠純化的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有下列氨基酸順序SEQIDNO4。
9.一種控制色素細(xì)胞黑素生成的方法，其特征在于包括下列步驟(a)提供有效量的黑素生成抑制劑，它包括黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或類似物，所述蛋白質(zhì)具有下列氨基酸順序SEQIDNO4;(b)將所述黑素生成抑制劑與合適的載體合并;和(c)將所述合并的黑素生成抑制劑施用于要控制的色素細(xì)胞。
10.按照權(quán)利要求9的方法，其特征還在于，所述施用步驟是通過注射進(jìn)行的。
11.按照權(quán)利要求9的方法，其特征還在于，所述施用步驟是通過局部施用而進(jìn)行的。
12.按照權(quán)利村注11的方法，其特征還在于所述色素細(xì)胞是皮膚色素細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征還在于，所述色素細(xì)胞是毛發(fā)色素細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征還在于，所述黑素生成抑制劑是所述黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征還在于，所述黑素生成抑制劑是所述黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)。
16.一種選擇性消滅黑素瘤細(xì)胞的方法，其特征在于，包括下列步驟(a)提供有效量的黑素生成抑制劑，它包括黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或類似物，所述蛋白質(zhì)具有下列氨基酸順序SEQIDNO4。(b)將所述黑素生成抑制劑與合適的載體合并;和(c)將所述合并的黑素生成抑制劑施用于要消滅的黑素瘤細(xì)胞。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其特征還在于所述黑素生成抑制劑是所述黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其特征還在于，所述施用步驟是通過注射進(jìn)行的。
19.按照權(quán)利要求17的方法，其特征還在于，所述施用步驟是通過局部施用進(jìn)行的。
全文摘要
一種純的天然黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)，能抑制色素細(xì)胞黑素生成，氨基酸順序為SEQIDNO:4。一種產(chǎn)生黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)的方法，包括將哺乳動物皮膚移植于活宿主，保持預(yù)定時間后移去此皮膚，并從中提取該蛋白質(zhì)?？刂粕丶?xì)胞黑素生成或選擇性消滅黑素瘤細(xì)胞的方法，包括將有效量黑素生成抑制因子蛋白質(zhì)或其活性片段、衍生物或類似物與合適載體混合，將此混合物施用于色素細(xì)胞或黑素瘤細(xì)胞。
文檔編號C07K14/47GK1092294SQ9311483
公開日1994年9月21日 申請日期1993年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月24日
發(fā)明者J·J·諾德倫德, J·Z·法魯奎 申請人:辛辛納提大學(xué)